Hal. 1 dari 4

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM

Dokumen nomor : CCRC-02-008-00 Tanggal : Mengganti nomor : - Tanggal : -

DAFTAR ISI

HALAMAN

DAFTAR ISI 1

A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN 2 B. TUJUAN 2

C. PENDAHULUAN 2 D. OPERASIONAL 2

I. Alat 2

II. Bahan 2

III. Prosedur Kerja 3 IV. Cara Perhitungan 4

URAIAN DIBUAT OLEH DIPERIKSA OLEH DIPERIKSA OLEH DISETUJU OLEH Jabatan Staf CCRC Staf CCRC Supervisor CCRC Pimpinan CCRC Paraf

Nama Sendy Junedi Adam Hermawan Muthi Ikawati Edy Meiyanto Tanggal

PROSEDUR TETAP

PERHITUNGAN SEL

Hal. 2 dari 4

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM

Dokumen nomor : CCRC-02-008-00 Tanggal : Mengganti nomor : - Tanggal : -

A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN

No Dokumen

Tanggal Dibuat oleh Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh

- Endah P Septi Riris Istighfari J Edy Meiyanto Staff

CCRC Supervisor

CCRC Pimpinan

CCRC Isi Menggunakan format lama

Belum ada penomoran dokumen No

Dokumen Tanggal Dibuat oleh Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh

CCRC-02-008-00

Adam Hermawan

Aditya Fitriasari

Muthi Ikawati

Edy Meiyanto

Staff CCRC

Staff CCRC

Supervisor CCRC

Pimpinan CCRC

Isi Menggunakan format baru Sudah ada penomoran dokumen

B. TUJUAN Memberikan panduan secara bertahap dan detail mengenai cara perhitungan sel.

C. PENDAHULUAN Sel yang akan digunakan untuk uji dengan out put data melibatkan jumlah sel (misal uji sitotoksik, flowcytometri dan doubling time) harus memiliki jumlah tertentu dan antar kelompok perlakuan harus homogen. Perhitungan sel tersebut dapat dilakukan dengan hemositometer dibawah mikroskop. Syarat penghitungan sel dengan metode hemositometri adalah sel harus berdiri sendiri-sendiri/ tidak menggerombol.

D. OPERASIONAL I. Alat

1. Pipet Pasteur steril 2. Mikropipet 1 ml, 200 L 3. Blue tip steril 4. Yellow tip steril 5. White tip 6. Conical tube 14 mL 7. Mikroskop inverted/cahaya 8. Hemositometer 9. Counter

II. Bahan 1. Phosphat Buffer Saline 1x 2. Tripsin-EDTA 1x (Tripsin 0,25%) 3. Media Kultur (DMEM/RPMI)

Hal. 3 dari 4

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM

Dokumen nomor : CCRC-02-008-00 Tanggal : Mengganti nomor : - Tanggal : -

III. Prosedur Kerja

No Prosedur Kerja Perhatian 1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel.

Pastikan panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen.

2. Buang media dengan menggunakan pipet pasteur steril.

Lakukan secara aseptis dan hati-hati

3. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + volume media awal).

Misal volume media 7 ml, maka PBS yang dibutuhkan adalah 3,5 ml

4. Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam inkubator selama 3 menit.

Untuk dish diameter 10 cm, tripsin-EDTA 1x = 450 l, untuk flask= 300 l; dekantir tripsin yang berlebih. Tripsin-EDTA digunakan untuk melepaskan sel dari matrik.

5. Tambahkan media kurang lebih 2-3 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

Pastikan sel sudah terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

6. Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol.

-

7. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Tambahkan MK kurang lebih 2-3 ml. Resuspensi sel.

Pastikan conical yang digunakan sudah steril.

8. Ambil 10 l panenan sel dan pipetkan ke hemasitometer.

Hemositmeter 9. Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau

mikroskop cahaya) dengan counter. Lihat prosedur penghitungan sel dibawah.

counter 10. Sisa sel pada conical (no 7) dilakukan

cryopreservation, atau dilakukan sub kultur.

11. Untuk sel yang akan ditanam (untuk perlakuan) lakukan transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK sesuai dengan konsentrasi yang dikehendaki.

Lihat cara perhitungan sel

Hal. 4 dari 4

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM

Dokumen nomor : CCRC-02-008-00 Tanggal : Mengganti nomor : - Tanggal : -

IV. Cara Perhitungan

Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung. Setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak.

1. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer. Sel yang gelap (mati) dan sel yang berada dibatas luar di sebelah atas dan di sebelah kanan tidak ikut dihitung. Sel di batas kiri dan batas bawah ikut dihitung.

2. Hitung jumlah sel per mL dengan rumus dibawah.

sel kamar A + sel kamar B + sel kamar C + sel kamar D Jumlah sel terhitung /mL= x 104 4

3. Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misal untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 5x103/sumuran x 100 sumuran (dibuat lebih) = 5x 105

4. Hitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus seperti di bawah ini

Jumlah total sel yang diperlukan Volume panenan sel yang ditransfer = Jumlah sel terhitung /mL

5. Ambil volume panenan sel transfer ke conical tube baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukan. Perhitungan volume yang diperlukan adalah setiap sumuran akan diisi 100 l MK berisi sel, maka total volume yang diperlukan untuk menanam sel = 100 l x 100 sumuran = 10 mL.