3. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap. Tahap preparasi dan pembuatan

sosis fermentasi ikan patin (formula dan reformulasi bahan) dilakukan di

Laboratorium Preparasi dan Diversifikasi Pengolahan Hasil Perairan, Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK). Tahap pembuatan kultur starter bakteri

asam laktat L. plantarum 1B1 dilakukan di Laboratorium Produksi dan

Mikrobiologi Ruminansia Besar Fakultas Peternakan (LARUMBA) Fakultas

Peternakan (FAPET). Tahap analisis sosis fermentasi ikan patin terdiri dari

pengujian mikrobiologi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi FAPET,

Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan FPIK dan Laboratorium Mikrobiologi

Pangan Fakultas Teknologi Pertanian (FATETA). Pengujian pH dan aw

3.2 Bahan dan Alat Penelitian

,

dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan FPIK dan Laboratorium

Kimia Pangan FATETA. Pengujian sensori dilakukan di Laboratorium Sensori

Teknologi Hasil Perairan FPIK. Pengujian asam amino dan asam lemak dilakukan

di Laboratorium BALITBANG Pascapanen Pertanian, Kementerian Pertanian,

Cimanggu. Pengujian asam amino bebas dilakukan di Laboratorium Biokimia

Terpadu, Institut Pertanian Bogor (IPB). Waktu penelitian berlangsung dari bulan

November 2009-bulan Juli 2010.

3.2.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam pembuatan kultur starter bakteri asam laktat L.

plantarum diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi FAPET, susu skim steril,

sukrosa, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Broth, de Man Rogosa Sharpe (MRS)

Agar dan aquades. Bahan baku untuk pembuatan sosis fermentasi adalah ikan

patin, selongsong, gula, es batu, minyak nabati (jagung), tepung tapioka,bakteri

asam laktat L. plantarum 1B1, lada, bawang putih, bawang bombay, garam

(NaCl), angkak, Isolate Soy Protein (ISP) dan karagenan jenis SR.EC.01

(produksi CV. Ocean Fresh). Bahan pengasapan terdiri dari serbuk gergaji,

tempurung kelapa dan sabut kelapa. Bahan untuk analisa proksimat terdiri atas

aquades, K2SO4, HgO, H2SO4, NaOH 30%, H3B03, indikator tashiro, HCl 0,02

38

N, kloroform, petroleum eter, NaCl jenuh, HCl 6 N, es kering-aseton, HCl 0,01 N,

n-oktil alkohol, buffer kalium borat, peraksi OPA, asam sulfosalisilat 5%, NaOH

0,5 N-metanol, pikoiotiosianat, trimetilamin, natrium asetat 1 M, bourtiflourid-

metanol, heksan, ninhidrin, etanol 95%, silika gel dan alkohol 95%. Bahan

analisis mikrobiologi terdiri atas Plate Count Agar (PCA), Buffered Peptone

Water (BPW) 0,1%, Butterfield’s phosphate-buffered water (KH2PO4

3.2.2 Alat

), sodium

klorida 0,85%, aquades, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Broth, de Man Rogosa

Sharpe (MRS) Agar, Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth, Escherichia Coli (EC)

Broth, Levine-Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar, Lactose Broth (LB),

Rappapport-Vassiliadis (RV), Tetrathionate (TT) Broth, Bismuth Sulfite (BS)

Agar, Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar, Hectoen Enteric (HE) Agar,

Triple Sugar Iron (TSI) Agar, Lysin Eisen (LI) Agar, Baird Parker Agar (BPA),

egg yolk tellurite emulsion, Potato Dextros Agar (PDA).

Alat yang digunakan dalam preparasi ikan patin dan pembuatan sosis

fermentasi meliputi pisau, talenan, wadah, kain saring, timbangan, grinder, food

processor, blender, stuffer, steamer dan smoke house. Alat yang digunakan untuk

kultur starter dan analisis mikrobiologi terdiri atas alat-alat gelas, pipet,

mikropipet, oven, inkubator, timbangan analitik, pemanas listrik, sudip, autoklaf,

bunsen, laminar, shaker, pipet ukuran 1 mL steril, jarum inokulasi, stomacher,

tabung Durham, stick hockey, kantong steril, slide kaca, mikroskop dan tabel Most

Probable Number (MPN). Alat analisis kimia terdiri atas cawan logam, cawan

porselin, vial (botol kaca), ampul, desikator, oven, timbangan analitik, pemanas

listrik, bunsen, steam bath, hot plate, tanur, destilator, buret, corong, pipet,

mikropipet, labu takar 50 mL, erlenmeyer 125 mL, labu soxhlet, extractor sochlet,

alat kondensor, pH-meter Orion 410 A, aw

-meter WA-360, kertas saring Whatman

no.40 (kertas milipore), freeze dryer, kromatografi gas, eppendrof, Flame

Ionization Detector (FID), mortar, parafilm, dan High Performance Liquid

Chromatogaphy (HPLC). Alat uji sensori terdiri dari lembar kerja (score sheet),

piring stearofoam dan kantong plastik steril.

39

3.3 Tahapan Penelitian

Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu tahap pendahuluan dan tahap

lanjutan. Tahap pendahuluan meliputi kultur bakteri asam laktat L. plantarum

1B1, preparasi ikan patin, pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula

bahan sosis A1, A2, A3 (formula bahan sosis pada Tabel 5). Tujuan pada tahapan

pendahuluan ini awalnya dilakukan kultur bakteri asam laktat L. plantarum yang

dilakukan penyegaran dalam susu skim steril sebagai kultur kerja yang telah

memenuhi syarat sebagai kultur starter, yakni 107 CFU/mL, selanjutnya tahap

preparasi ikan patin untuk mendapatkan daging lumat atau surimi mentah sebagai

bahan baku utama dalam pembuatan sosis fermentasi ikan patin. Hasil berupa

surimi mentah ikan patin disimpan dalam freezer untuk selanjutnya diolah. dan

pembuatan sosis fermentasi ikan patin ini dilakukan pada masing-masing formula

bahan sosis tersebut. Selanjutnya tahap pembuatan sosis fermentasi ikan patin

dengan formula bahan sosis A1, A2 dan A3

Tahap lanjutan meliputi pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan

reformulasi bahan dari formula bahan A

untuk memperoleh satu formula bahan

sosis terpilih.

1, A2 dan A3,

3.3.1 Tahap pendahuluan

bertujuan untuk

memperoleh satu formula bahan sosis terpilih dan pembuatan sosis fermentasi

hanya dilakukan pada satu formula bahan sosis tersebut. Selanjutnya sosis

fermentasi ikan patin dengan formula bahan terpilih dilakukan penyimpanan pada

suhu ruang dengan pengamatan hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12 dan hari ke-16 serta

dilakukan analisis. Analisis yang dilakukan meliputi analisis sensori rating

intensitas dan hedonik, mikrobiologi terdiri dari total koloni mikroba (TPC),

bakteri asam laktat, Escherichia coli, Staphylococcus sp, Salmonella sp, dan

kapang/khamir serta analisis kimia terdiri dari analisis proksimat, asam amino,

asam amino bebas dan asam lemak.

Tahap pendahuluan meliputi kultur bakteri asam laktat L.plantarum 1B1,

preparasi ikan patin dan pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula

bahan sosis A1, A2 dan A3

.

40

Kultur bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum 1B1

Tahap kultur bakteri asam laktat L. plantarum dilakukan sebelum tahap

pembuatan sosis fermentasi ikan patin. Bakteri tersebut diperoleh dari

Laboratorium Peternakan (FAPET) dan disegarkan lebih dahulu pada media

MRS-Broth (Lampiran 13). Penyegaran koloni bakteri asam laktat L. plantarum

1B1 dilakukan yaitu diambil sebanyak 1 mL dan diinokulasi ke dalam media

MRS Broth 9 mL selama waktu 24 jam dan diinkubasi pada suhu 37 oC. Hasil dari

penyegaran tersebut, diambil sebanyak 1 mL dan diinokulasi ke dalam larutan

susu skim steril 10% dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama waktu 48 jam yang

disebut sebagai kultur induk. Dengan metode yang sama dilakukan untuk

memperoleh kultur antara. Hasil kultur antara dengan metode yang sama

dilakukan untuk memperoleh kultur kerja. Hasil dari kultur kerja selanjutnya

ditumbuhkan pada media MRS Agar untuk memperoleh koloni bakteri asam

laktat L. plantarum. Kultur kerja dapat digunakan pada pembuatan sosis

fermentasi ikan patin apabila jumlahnya telah memenuhi syarat yakni mencapai

107 CFU/mL. Kultur starter bakteri asam laktat yang digunakan pada produk

pangan yakni 107-108

CFU/mL (Ishibashi & Shimamura (1993) ; Rebucci et al.

(2007) ; Adams & Moss (2008) ; Arief et al. (2008)). Diagram alir kultur bakteri

asam laktat disajikan pada Gambar 7.

Gambar 7 Diagram alir kultur starter bakteri asam laktat (Adams & Moss (2008 ; Arief et al. 2008).

Penyegaran pada media MRS Broth selama 24 jam, inkubasi pada suhu

37 oC

Kultur murni bakteri L. plantarum 1B1, diperoleh dari lab.Mikrobiologi

Fakultas Peternakan, IPB

Dihitung populasinya

ditumbuhkan pada media MRS Agar

Ditumbuhkan 1 mL dari kultur induk ke larutan susu skim 10%, di inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam (hasil

disebut kultur antara)

Ditumbuhkan 1 mL dari kultur antara ke larutan susu skim 10%, di inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam (hasil

disebut kultur kerja)

Ditumbuhkan 1 mL dari media MRS Broth ke dalam larutan susu skim steril

10%, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam (hasil disebut kultur induk)

41

Preparasi ikan patin

Preparasi ikan patin yang dilakukan meliputi pencucian ikan patin dengan

menggunakan air dingin bersih, penghilangan tulang, filleting, penggilingan fillet,

pencucian daging lumat dengan menggunakan air dingin suhu 0-5 o

Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan sosis A

C dan

dilakukan penyaringan sebanyak dua kali dengan menggunakan kain saring.

Setelah itu daging ikan patin lumat atau surimi mentah tersebut diletakkan dalam

wadah plastik steril dan ditimbang untuk selanjutnya digunakan pada tahap

pembuatan sosis fermentasi ikan patin.

1, A2 dan A Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan menggunakan bahan baku

daging ikan patin, tepung tapioka, minyak nabati (minyak jagung), garam, gula,

bumbu, L. plantarum 1B1, ISP, karagenan, angkak, susu skim dan es batu.

Penambahan bahan pada sosis fermentasi ikan patin ini juga berdasarkan hasil

penelitian terdahulu mengenai bahan sosis fermentasi daging sapi yang dilakukan

oleh Arief (2008) yang disajikan pada Tabel 4.

3

Tabel 4 Formula bahan sosis fermentasi daging sapi Bahan Formula

Daging sapi (g) Minyak nabati (mL) Tepung tapioka (g) Garam (g) Es batu (g) Bawang putih (g) Gula pasir (g) Kultur bakteri L.plantarum (mL) Lada halus (g)

1000 100 60 20 200 12,5 12,5 20 5

Sumber : Arief (2000).

Berdasarkan formula bahan sosis fermentasi daging sapi seperti pada Tabel

4, pada penelitian ini dilakukan modifikasi formula untuk memperoleh formula

sosis fermentasi dengan bahan baku ikan patin. Modifikasi formula yang

dilakukan yaitu dengan penambahan bahan sosis fermentasi berupa angkak,

Isolate Soy Protein (ISP), karagenan dan bumbu berupa bawang bombay.

Formula bahan sosis fermentasi ikan patin pada penelitian ini disajikan pada

Tabel 5.

42

Tabel 5 Formula bahan sosis fermentasi ikan patin

No Bahan Jumlah (A1)

Jumlah (A2)

Jumlah (A3)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13. 14.

Daging ikan (g) Minyak nabati (mL) Tepung tapioka (g) Garam (g) Bawang putih (g) Gula pasir (g) Bakteri L. Plantarum (mL) Lada halus (g) Isolat Soy Protein (g) Karagenan (g) Angkak (g) Susu skim (g) Bawang bombay (g) Es batu (g)

1000 150 100 35 100 40 10 2 - 20 5 50 100 100

1000 150 100 35 100 40 10 2 - 10 4 75 100 100

1000 150 125 35 100 40 10 2 2 - 3 50 100 100

Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dilakukan setelah dipersiapkan ketiga

formula A1, A2, A3 dan kultur starter bakteri asam laktat L. plantarum 1B1.

Daging lumat berupa surimi mentah ikan patin yang telah disiapkan digiling

menggunakan food processor dan ditambahkan berturut – turut garam, bawang

putih, bawang bombay, lada, gula, ISP, karagenan, susu skim, angkak, tepung

tapioka, minyak jagung dan terakhir kultur kerja bakteri L. plantarum 1B1 serta

dihomogenkan. Setelah itu, adonan tersebut dimasukkan ke dalam casing dengan

menggunakan stuffer dan diikat sepanjang 10 cm. Selanjutnya dilakukan

pengukusan dengan menggunakan steamer pada suhu 40 oC selama 30 menit.

Pengukusan bertujuan untuk pembentukan gel pada sosis fermentasi ikan patin

dengan melalui tahap gelasi myosin selama pemanasan yaitu melalui tahap

pertama pada suhu 4-41 o

Pada tahapan pengukusan, bakteri asam laktat L. plantarum 1B1 yang

terdapat dalam adonan sosis tersebut sesuai dengan suhu pertumbuhan yaitu suhu

optimum bakteri L. plantarum adalah 37

C.

oC dan maksimum adalah 45 o

Proses conditioning sosis fermentasi ikan patin setelah 24 jam, selanjutnya

dilakukan proses pengasapan di dalam smoke house. Proses pengasapan yang

dilakukan adalah pengasapan dingin pada suhu 30

C. Setelah

selesai pengukusan, kemudian dilakukan proses conditioning pada suhu ruang

selama waktu 24 jam. Semua proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin ini

dilakukan pada kondisi higienis.

oC selama 3 hari, masing –

43

masing 3 jam per hari. Setiap hari dilakukan pengasapan selama 3 jam. Sumber

asap berasal dari tempurung, sabut kelapa, dan serbuk gergaji. Pengaturan suhu

asap dingin dilakukan dengan cara dijauhkan dari sumber asap yang terdapat

dalam smoke house, dan diletakkan botol mineral berisi air yang telah dibekukan.

Skema proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8 Proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin formula terpilih.

Sosis fermentasi ikan patin berdasarkan formula A1, A2, A3

kemudian

dilakukan uji sensori rating intensitas dan hedonik. Hasil uji sensori rating

intensitas dan hedonik dengan nilai tertinggi, selanjutnya dilakukan reformulasi

bahan yang bertujuan untuk memperoleh sosis fermentasi ikan patin formula

terpilih.

Surimi mentah ikan patin

Digrinder Garam,bumbu,gula,ISP,susu skim, karagenan,

angkak, minyak jagung, tepung tapioka,

bakteri L. plantarum

Pengisian ke dalam selongsong (casing) sepanjang 10 cm, diikat

dengan benang kasur

Proses conditioning pada suhu ruang selama 24 jam

Pengasapan pada suhu 30 oC selama 3 hari masing – masing

3 jam (Sano et al. 1988)

Analisis sensori (uji rating intensitas dan uji hedonik) formula A1, A2 dan A3

Sosis fermentasi ikan patin

Sosis fermentasi ikan patin dengan formula terpilih

Disteam pada suhu 40oC selama 30 menit (Sano et al. 1988)

Pencampuran dan pengadukan adonan (formula A1, A2 dan A3)

Reformulasi bahan sosis formula bahan dengan nilai tertinggi (A1 dan A3)

44

3.3.2 Tahap lanjutan

Tahap lanjutan meliputi pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan

reformulasi bahan dari formula bahan A1, A2 dan A3, penyimpanan sosis

fermentasi ikan patin formula terpilih pada suhu ruang dan dilakukan analisis

yang meliputi analisis sensori hedonik, mikrobiologi (TPC), bakteri asam laktat L.

plantarum 1B1, bakteri E. coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp. dan

kapang/khamir), kimia (pH dan aw

Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan reformulasi bahan sosis A

) serta sosis fermentasi ikan patin dengan

penyimpanan terpilih dilakukan analisis kimia (asam amino, asam amino bebas

dan asam lemak).

1, A2 dan A Sosis fermentasi ikan patin berdasarkan hasil uji sensori rating intensitas

dan hedonik yang memiliki nilai tertinggi dari ketiga formula A

3

1, A2, A3

Tabel 6 Hasil reformulasi bahan formula terpilih sosis fermentasi ikan patin

meliput i

kategori tekstur, warna, aroma dan rasa dilakukan reformulasi bahan untuk

memperoleh formula terpilih. Reformulasi bahan yang dilakukan adalah tepung

tapioka, ISP, karagenan dan angkak. Hasil reformulasi bahan sosis fermentasi ikan

patin disajikan pada Tabel 6.

Bahan Jumlah Bahan

Daging ikan (g) Minyak nabati (mL) Tepung tapioka (g) Garam (g) Bawang putih(g) Gula pasir(g) Bakteri L. plantarum (mL) Lada halus(g) Isolat Soy Protein(g) Karagenan (g) Angkak (g) Susu skim (g) Bawang bombay (g) Es batu (g)

1000 150 125 25 100 60 10 2 2 20 5 50 100 100

Reformulasi bahan sosis fermentasi ikan patin juga dilakukan berdasarkan

kelebihan dan kekurangan dari ketiga formula (A1, A2, A3) untuk memperoleh

satu formula bahan sosis fermentasi ikan patin. Reformulasi bahan sosis

45

fermentasi ikan patin berupa satu formula bahan selanjutnya dilakukan uji sensori

hedonik secara keseluruhan (tekstur, warna, aroma dan rasa), untuk memperoleh

formula bahan terpilih.

Analisis selama penyimpanan suhu ruang dari sosis fermentasi ikan patin formula terpilih Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih selanjutnya disimpan pada suhu

ruang selama 16 hari. Selama penyimpanan, dilakukan analisis sensori (hedonik),

analisis mikrobiologi meliputi TPC, koloni bakteri asam laktat L plantarum 1B1,

E. coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp., dan kapang/khamir serta analisis

kimia (pH dan aw

Diagram alir sosis fermentasi ikan patin selama penyimpanan suhu ruang

disajikan pada Gambar 9.

). Hasil sosis fermentasi ikan patin penyimpanan terpilih

selanjutnya dilakukan analisis kimia yang meliputi asam amino, asam amino

bebas, asam lemak, dan proksimat (kadar air, kadar abu, protein, lemak).

Gambar 9 Diagram alir sosis fermentasi ikan patin formula terpilih selama

penyimpanan suhu ruang.

Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih

Proksimat

Analisis

Sensori

Penyimpanan suhu ruang selama 0, 4, 8, 12 dan 16 hari

Sensori (hedonik)

Mikrobiologi

pH

aw

Asam amino

Analisis

Sosis fermentasi ikan patin dengan waktu penyimpanan terpilih

Asam amino bebas

Asam Lemak

Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih

Proksimat

Disteam pada suhu 80 oC, 30 menit (Sano et al. 1988)

46

3.4 Prosedur Analisis

Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi analisis sensori (uji

rating intensitas dan uji hedonik), analisis mikrobiologi dan analisis kimia.

3.4.1 Analisis sensori

Uji sensori menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk menilai

mutu produk perikanan yang telah mengalami proses pengolahan. Uji sensori

yang dilakukan dalam penelitian produk sosis fermentasi ikan patin ini meliputi

uji rating intensitas (Meilgaard 1999) dan uji hedonik (SNI 01-2346-2006).

a) Uji rating intesitas (skala kategori) (Meilgaard 1999).

Uji rating intensitas bertujuan untuk menentukan suatu atribut sensori

tertentu yang bervariasi diantara sejumlah contoh (jumlah contoh bervariasi dari

3-6 contoh). Panelis diminta menilai intensitas atribut sensori tertentu pada skala

kategori dari beberapa contoh produk. Skala pengukuran yang dipakai adalah

skala 5-poin, 7-poin atau 9-poin. Data yang diperoleh dari skala pengukuran

kategori merupakan data ordinal. Data tersebut dianalisis dengan menstransfer

data kategori ke dalam angka 1 sampai 7 (misalnya menggunakan skala 7-poin).

Melalui penstransferan, data kategori dapat dianalisis dengan mengasumsikan

sebagai data interval, sehingga data dapat dianalisis dengan analysis of varians

(ANOVA). Panelis yang digunakan pada uji ini adalah panelis terlatih sebanyak

8-12 orang. Panelis diberitahukan terlebih dahulu untuk mengenal format

pengujian yang digunakan serta maksud dari skala nilai yang telah ditetapkan

(Lampiran 1).

b) Uji hedonik (SNI 01-2346-2006)

Uji hedonik digunakan untuk mengukur tingkat kesukaan terhadap produk

dengan menggunakan lembar penilaian. Panelis yang digunakan adalah panelis

non standar atau panelis yang tidak terlatih sebanyak 30 orang. Penilaian contoh

yang diuji berdasarkan tingkat kesukaan panelis. Jumlah tingkat kesukaan

bervariasi tergantung dari rentangan mutu yang ditentukan. Penilaian dapat diubah

dalam bentuk angka dan selanjutnya dapat dianalisis secara statistik non

parametrik dengan Kruskall Wallis, dilanjutkan dengan analisis sidik ragam

47

(ANOVA) untuk melihat perbedaan pada sampel. Jika berpengaruh nyata dapat

dilanjutkan dengan uji Duncan (Lampiran 2 & 3).

3.4.2 Analisis Mikrobiologi

a) Pengujian kuantitatif total koloni mikroba (Total Plate Count) (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009)

Media total koloni mikroba (TPC) yang digunakan adalah Plate Count Agar

(PCA) (Lampiran 4). Sampel diambil sebanyak 50 g, dilarutkan dengan 450 mL

Butterfield’s phosphate-buffered water (KH2PO4) steril. Hasil tersebut sebagai

sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Selanjutnya dipipet secara aseptik

sampel larutan pengenceran 10-1 sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam larutan

Butterfield’s phosphate-buffered water 9 mL steril. Hasil tersebut sebagai sampel

dengan larutan pengenceran 10-2. Metode yang sama dilakukan sampai pada

sampel larutan pengenceran 10-5. Selanjutnya dari setiap sampel larutan

pengenceran, diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan steril

secara duplo, kemudian ditambahkan media PCA steril sebanyak 15-20 mL

dengan suhu ±45 oC. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan

gerakan membentuk angka delapan dan didiamkan sampai media pada cawan

tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan telah padat, cawan dibalikkan

dan diinkubasi pada suhu 37 o

koloni/mL = rata – rata jumlah koloni x faktor pengenceran

C selama 24-48 jam. Selanjutnya dihitung jumlah

koloni bakteri. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung sebagai berikut:

atau /g b) Pengujian kuantitatif total bakteri asam laktat (Bacteriological

Analytical Manual (BAM) 2009)

Media tumbuh untuk bakteri asam laktat yang digunakan adalah de Man

Rogosa Sharpe (MRS) Agar (Lampiran 5). Sampel sebanyak 50 g dilarutkan

dengan 450 mL Butterfield’s phosphate-buffered water (KH2PO4) steril untuk

mendapatkan sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Hasil sampel larutan

pengenceran 10-1, dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan kedalam 9 mL larutan

Butterfield’s phosphate-buffered water (KH2PO4) steril. Hasil tersebut sebagai

sampel larutan dengan pengenceran 10-2. Demikian seterusnya dilakukan sampai

pada sampel larutan pengenceran 10-9. Selanjutnya sampel larutan dari

48

pengenceran yang dikehendaki (10-6 - 10-9) diambil sebanyak 1 mL dan diletakkan

ke dalam cawan steril dan dituangkan media MRS Agar steril sebanyak 15-20 mL

dengan suhu ± 45 oC. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan

gerakan membentuk angkak delapan. Cawan didiamkan sampai media dalam

cawan tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan tersebut sudah padat,

cawan dibalikkan dan diinkubasi pada suhu 37 o

c) Pengujian kualitatif bakteri Escherichia coli (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009)

C selama 24-48 jam. Selanjutnya

dihitung total koloni bakteri asam laktat, sama seperti penghitungan pada total

koloni mikroba.

Uji pendugaan coliform, fecal coliform dan Escherichia coli

Sampel sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam wadah steril. Selanjutnya

ditambahkan 450 mL larutan Butterfield’s phosphate-buffered water steril ke

dalam wadah yang berisi sampel, dihomogenkan dengan stomacher selama waktu

2 menit. Sampel larutan tersebut sebagai larutan pengenceran 10-1. Larutan

pengenceran 10-1 dipindahkan dengan pipet steril sebanyak 1 mL ke dalam 9 mL

larutan Butterfield’s phosphate-buffered water steril untuk memperoleh larutan

pengenceran 10-2. Metode yang sama dibuat untuk memperoleh larutan

pengenceran 10-3. Selanjutnya dipipet 1 mL dari setiap larutan pengenceran yang

digunakan (10-1-10-3

Uji konfirmasi fecal coliform dan Escherichia coli dengan Most Probable Number (MPN)

) ke dalam 3 seri tabung Durham yang berisi 9 mL larutan

Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB) steril (Lampiran 6) dan diinkubasi pada

suhu 35 °C selama 24±2 jam. Apabila setelah 24±2 jam belum terbentuk gas

(negatif), maka ditambahkan waktu inkubasi 24 jam menjadi 48±2 jam. Apabila

tabung tersebut telah terbentuk gas, maka tabung tersebut dinyatakan positif.

Sampel dalam tabung yang telah dinyatakan positif (uji pendugaan)

dipindahkan dengan menggunakan jarum inokulasi ke dalam tabung yang telah

berisi 9 mL Escherichia Coli Broth (ECB) steril (Lampiran 7) dan diinkubasi pada

suhu 45,5 °C selama 24 jam±2 jam. Apabila belum terbentuk gas (negatif), maka

dapat diinkubasi kembali selama 48 jam±2 jam. Hasil uji dinyatakan positif bila

49

pada tabung tersebut terbentuk gas. Selanjutnya dengan menggunakan tabel MPN

(Lampiran 8) untuk menentukan nilai MPN berdasarkan jumlah tabung ECB yang

positif sebagai jumlah E.coli/mL atau E.coli/g. Fecal coliform dan E.coli yang

terdapat dalam sampel tabung diinterpretasikan dengan mencocokkan kombinasi

jumlah tabung yang positif berdasarkan tabel MPN. Kombinasi yang diambil,

dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif

dan pada pengenceran berikutnya terdapat tabung yang negatif.

Uji bakteri Escherichia coli

Sampel larutan tabung ECB positif (uji konfirmasi) diambil sebanyak 1 mL

dan dimasukkan ke dalam cawan steril. Selanjutnya ditambahkan media Levine-

Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar steril sebanyak 15-20 mL (Lampiran 9), dan

digerakkan membentuk angka delapan agar media dan sampel larutan tersebar

merata pada cawan tersebut dan dibiarkan sampai padat. Setelah itu diiinkubasi

pada suhu 35 °C selama 18-24 jam. Koloni bakteri E. coli berdiameter 2-3 mm,

berwarna hitam atau gelap pada bagian pusat koloni, dengan atau tanpa metalik

kehijauan yang mengkilat pada cawan tersebut.

d) Pengujian kualitatif bakteri Salmonella sp. (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009)

Pra-pengayaan

Sampel sebanyak 25 g secara aseptik dimasukkan ke dalam wadah steril dan

ditambahkan sebanyak 225 mL larutan Lactose Broth (LB) steril (Lampiran 10)

dan dihomogenkan dengan stomacher selama waktu 2 menit. Hasil larutan berisi

sampel tersebut, dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril 500 mL dan diinkubasi

pada suhu 35 °C selama 24 jam±2 jam.

Pengayaan

Sampel dari hasil pra-pengayaan tersebut dihomogenkan dan dipindahkan

sampel tersebut masing – masing sebanyak 0,1 mL ke dalam media Rappaport-

Vassiliadis (RV) sebanyak 10 mL (Lampiran 11) dan 1 mL ke dalam media

Tetrathionate (TT) Broth sebanyak 10 mL (Lampiran 12). Selanjutnya sampel

dalam masing-masing media tersebut dihomogenkan. Sampel dengan dugaan

cemaran bakteri Salmonella sp. tinggi (a high microbial load), pada sampel yang

50

berisi media RV diinkubasi pada suhu 42° C ± 0,2 °C selama 24 jam±2 jam dan

pada sampel yang berisi media TT Broth diinkubasi pada suhu 43 °C±0,2 °C

selama 24 jam±2 jam. Sampel dengan dugaan cemaran bakteri Salmonella sp.

rendah (low microbial load), sampel yang berisi media RV diinkubasi pada suhu

42 °C±0,2 °C selama 24 jam±2 jam, dan sampel yang berisi media TT Broth

diinkubasi pada suhu 35 °C±2,0 °C selama 24 jam±2 jam.

Uji bakteri Salmonella sp.

Sampel pada media pengayaan RV dan TT Broth dihomogenkan, kemudian

sampel dalam media pengayaan TT Broth distreak (digores) dengan menggunakan

jarum inokulasi pada media Bismuth Sulfite (BS) Agar (Lampiran 13), Xylose

Lysine Desoxycholate (XLD) Agar (Lampiran 20) dan Hectoen Enteric (HE) Agar

(Lampiran 14). Metode tersebut diulangi lagi untuk sampel dalam media

pengayaan RV. Selanjutnya media Bismuth Sulfite (BS) Agar, Xylose Lysine

Desoxycholate (XLD) Agar dan Hectoen Enteric (HE) Agar yang telah distreak

masing – masing dengan sampel dalam media pengayaan RV dan TT Broth,

diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 jam ±2 jam.

Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp.

Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp. yaitu sebagai berikut:

a) koloni bakteri pada cawan media Bismuth Sulfite (BS) Agar berwarna

coklat, keabuan atau kehitaman, terkadang metalik. Di sekitar koloni bakteri

berwarna coklat, namun semakin lama waktu inkubasi koloni tersebut akan

berubah menjadi warna hitam, hasil tersebut dinamakan halo effect.

b) koloni bakteri pada cawan media Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar

berwarna merah muda dengan atau tanpa bintik hitam.

c) koloni bakteri pada cawan Hectoen Enteric (HE) Agar berwarna biru

kehijauan, biru dengan atau tanpa titik hitam.

Hasil koloni bakteri yang terlihat pada cawan BS agar setelah diinkubasi

selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 oC, selanjutnya diinokulasi ke media miring

Triple Sugar Iron (TSI) Agar (Lampiran 15) dan Lysine Iron Agar (LIA)

(Lampiran 16) dengan cara menusuk ke dasar media dan juga digores pada media

miring tersebut dan diinkubasi selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 °C. Koloni

51

bakteri Salmonella sp. pada media TSI Agar, menghasilkan koloni bakteri

berwarna merah (reaksi basa) pada media miring TSI Agar dan koloni bakteri

berwarna kuning pada dasar tabung (reaksi asam) dengan atau tanpa memproduksi

H2S (bertanda warna kehitaman) pada media TSI Agar tersebut. Koloni bakteri

Salmonella sp. pada media LIA, menghasilkan warna ungu (adanya reaksi basa)

pada dasar tabung media dan koloni bakteri warna kuning (adanya reaksi asam)

pada dasar tabung media tersebut menandakan terjadi reaksi asam (negatif).

Beberapa bakteri Salmonella sp. memproduksi H2

e) Pengujian bakteri Staphylococcus sp. (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009)

S pada media LIA.

Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan dalam wadah steril.

Selanjutnya ditambahkan 450 mL Butterfield’s phosphate-buffered water steril

dan dihomogenkan dengan stomacher selama 1-2 menit. Larutan tersebut sebagai

pengenceran 10-1. Selanjutnya dari larutan pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1

mL kemudian dimasukkan ke dalam larutan Butterfield’s phosphate-buffered

water steril sebanyak 9 mL dan dihomogenkan. Larutan tersebut sebagai larutan

dengan pengenceran 10-2. Metode yang sama dibuat untuk pengenceran 10-3

Pengujian dengan media Baird Parker Agar (BPA)

atau

sampai pada pengenceran yang dikehendaki.

Media yang digunakan pada pengujian ini adalah Baird Parker Agar (BPA)

(Lampiran 17). Media BPA sebanyak 58 gr dilarutkan ke dalam aquades 950 mL

yang telah ditambahkan egg yolk tellurite emulsion sebanyak 50 mL (Lampiran

18) dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan tersebut dituang pada cawan steril

sebanyak 15-20 mL dan didiamkan sampai media pada cawan tersebut menjadi

padat. Diambil 1 mL sampel larutan pengenceran yang diperlukan (10-1 -10-3

Larutan sampel yang telah terserap pada cawan tersebut, kemudian

diinkubasi pada suhu 35

) ke

atas permukaan media padat BPA dan diratakan dengan menggunakan hockey

stick. Cawan tersebut didiamkan sampai sampel larutan terserap.

oC selama 45-48 jam dengan posisi cawan terbalik.

Diseleksi cawan tersebut yang mengandung jumlah koloni bakteri yaitu 20-200

koloni. Untuk koloni bakteri S. aureus memiliki ciri koloni bakteri berbentuk

52

bundar, halus, cembung dengan diameter 2-3 mm di permukaan media, berwarna

keabuan sampai hitam pekat, terkadang dengan zona terang (off-white) di

sekelilingnya (zona opak) dengan atau tanpa zona terang (clear zone).

f) Pengujian kapang/khamir (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009)

Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan ke dalam wadah steril

kemudian ditambahkan 450 mL larutan Buffer Peptone Water (BPW) 0,1% steril

dan dihomogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Homogenat tersebut

sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Selanjutnya dipipet 1 mL larutan

pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam 9 mL Buffer Peptone Water (BPW)

0,1% steril untuk memperoleh larutan pengenceran 10-2. Dengan metode yang

sama tersebut, dilakukan untuk memperoleh larutan dengan pengenceran 10-3

sampai dengan larutan pengenceran 10-5

Sampel dari larutan pengenceran 10

. -1-10-5 dipipet sebanyak 1 mL dan

dimasukkan ke dalam cawan steril. Dilakukan secara duplo untuk setiap sampel

larutan pengenceran. Selanjutnya ditambahkan media Potato Dextros Agar (PDA)

steril (Lampiran 19) yang telah ditambahkan asam tartarat 10% yaitu 12-15 mL

yang telah didinginkan (suhu 45±1) oC ke dalam masing – masing cawan steril

yang sudah berisi sampel larutan pengenceran tersebut. Dilakukan gerakan cawan

membentuk angka delapan agar media dalam cawan tersebut tersebar merata.

Media dalam cawan tersebut didiamkan sampai padat dan selanjutnya diinkubasi

pada suhu 35 o

3.4.3 Analisis proksimat

C selama 48 jam±2 jam dengan posisi cawan terbalik. Setelah

diinkubasi koloni kapang/khamir dapat dihitung seperti pada penghitungan total

koloni mikroba.

a) Analisis kadar air (Association of Official Analitical Chemist (AOAC 2005))

Analisis kadar air dilakukan menggunakan metode oven. Cawan kosong

dikeringkan dalam oven suhu 100-102 oC selama 15 menit dan didinginkan dalam

desikator sampai mencapai suhu ruang dan ditimbang (A). Sampel sebanyak 5 g

diletakkan pada cawan tersebut (B). Cawan yang berisi sampel dikeringkan ke

53

dalam oven bersuhu 100-102 o

Kadar air ditentukan dengan rumus :

C selama 6 jam atau untuk produk yang tidak

mengalami dekomposisi dengan pengeringan yang lama, dapat dikeringkan

selama 1 malam (16 jam). Selanjutnya cawan dipindahkan ke dalam desikator

sampai beratnya konstan dan ditimbang (C).

Kadar Air % = B – C B – A

x 100%

Keterangan : A = Bobot cawan kosong B = Bobot cawan + contoh sebelum dikeringkan C = Bobot cawan + contoh sesudah dikeringkan. b) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Cawan pengabuan disiapkan, kemudian dibakar dalam tanur, didinginkan

dalam desikator dan ditimbang. Sampel sebanyak 5 g ditimbang dalam cawan

tersebut, diletakkan ke dalam tanur pengabuan, dibakar sampai diperoleh abu

berwarna abu atau sampai beratnya tetap. Pengabuan dilakukan selama dua tahap;

pertama pada suhu sekitar 400 oC dan kedua pada suhu 550 o

Kadar abu (%) =

C. Selanjutnya

sampel didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Penentuan kadar abu

menggunakan rumus :

berat abu (g) berat sampel (g)

x 100

c) Analisis kadar protein (AOAC 2005)

Penetapan kadar protein dengan metode Kjeldahl meliput i tiga tahap yaitu

dekstruksi, destilasi dan titrasi. Tahapan dekstruksi yakni sampel 0,1-0,2 g

dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 50 mL dan ditambah sebanyak 2,0 mg

K2SO4, 40 mg HgO dan 10 mL H2SO4. Kemudian di dekstruksi selama 30 menit

hingga larutan berwarna menjadi hijau jernih. Setelah dekstruksi, sampel

dibiarkan sampai dingin dan dipindahkan ke dalam labu takar 50 mL dan

diencerkan dengan aquades hingga batas tera. Selanjutnya dilakukan destilasi

yaitu dengan memasukkan sampel tersebut sebanyak 5 mL ke dalam destilator dan

ditambahkan 10 mL NaOH 30% sampai berwarna coklat kehitaman, dan

didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam Erlenmeyer 125 mL yang berisi

54

larutan 5 mL H3BO3

Kadar N dihitung berdasarkan rumus perhitungan kadar protein :

dan dititrasi dengan HCl 0,02 N hingga berwarna merah

jambu. Larutan blanko untuk koreksi adanya senyawa nitrogen (N) yang berasal

dari regensia yang digunakan dianalisis seperti sampel.

% kadar protein = 50/5 x (N x V) HCl W x 1000

x 14,007 x FK x 100%

Keterangan : Faktor 50 = Larutan contoh yang telah didekstruksi diencerkan 50 mL Faktor 5 = Banyaknya larutan contoh yang didestilasi N = Normalitas HCl yang digunakan V = volume HCl yang digunakan W = Berat sampel (mg) 14,700 = Berat atom Nitrogen FK = Faktor koreksi N-protein untuk ikan = 6,25. d) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)

Analisis kadar lemak menggunakan metode ekstraksi soxhlet. Labu soxhlet

kosong dikeringkan dalam oven suhu 105 oC selama 30 menit kemudian

didinginkan dalam desikator dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 5 g

dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan dalam labu soxhlet (B).

Selanjutnya kloroform atau petroleum eter sebanyak 150 mL dituangkan ke dalam

labu soxhlet berisi sampel dan selanjutnya dimasukkan ke dalam extractor sochlet

dan dipasang alat kondesor di atasnya dan labu lemak dibawahnya. untuk di

refluks pada suhu 600 oC selama minimum 5 jam sampai pelarut yang kembali

turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang tersisa dalam labu lemak di

destilasi, setelah itu dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 o

Kadar lemak dihitung dengan rumus :

C lalu didinginkan

ke dalam desikator dan ditimbang (C).

% kadar lemak = [ (C – A) / B] x 100 % Keterangan :

A = Bobot labu soxhlet kosong B = Bobot labu soxhlet + sampel sebelum diuapkan C = Bobot labu soxhlet + sampel sesudah diuapkan e) Analisis karbohidrat by-difference (AOAC 2005)

Analisis karbohidrat dilakukan dengan menggunakan metode by difference

yaitu dengan mengurangi nilai 100% dengan nilai kadar protein, kadar air, kadar

lemak dan kadar abu.

55

Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus :

Kadar karbohidrat (%) = 100% -% (abu+lemak+protein+air).

3.4.3 Analisis Kimia

a) Analisis pH (pH meter Orion 410 A)

Prinsip analisis pH berdasarkan gabungan elektroda gelas hidrogen sebagai

standar polimer dan elektroda kalomel referens, pasangan elektroda ini akan

menghasilkan perubahan tegangan 59,1 mV/pH unit pada suhu 25 o

b) Analisis a

C. Sampel

sebanyak 10 g diencerkan dengan ±100 mL aquades, elektroda dari pH meter

dicelupkan ke dalam sampel, nilai yang terbaca kemudian dicatat. Sebelumnya pH

meter dikalibrasi dengan buffer 4 dan 7.

w (Shibaura aw

Analisis a

meter WA-360)

w dilakukan dengan menggunakan aw-meter Shibaura WA-360.

Sebelumnya alat dikalibrasi dengan menggunakan larutan NaCl jenuh pada kertas

saring dan diletakkan pada cawan, kemudian nilai aw diset sampai dengan 0,7509.

Sampel dipotong dengan ketebalan 0,2 cm dan diletakkan dalam cawan pengukur,

setelah ditutup dan dikunci, alat dijalankan sampai menunjukkan tanda completed,

nilai aw

c) Analisis asam amino (Modifikasi AOAC 2005, Laboratorium Terpadu IPB)

dapat dibaca.

Tahap sebelumnya yaitu menentukan kadar protein dari sampel dengan

metode Kjeldahl. Hasil berupa protein dianalisis pada tahap selanjutnya. Tahap

hidrolisis asam amino yaitu 3 mg protein dimasukkan ke dalam ampul dan ditutup

kemudian ditambahkan 1 mL HCl 6 N dan dikocok hingga homogen. Sampel

larutan tersebut dibekukan dalam es kering aseton, yaitu freeze dryer

dihubungkan dengan pompa vakum. Untuk mengeluarkan udara yang ada dalam

sampel yang telah dibekukan, yakni dengan cara mengeluarkan penutup ampul

dari dalam es kering-aseton. Pada saat sampel larutan dalam ampul mencair, udara

yang terlarut dalam sampel larutan akan keluar. Jika gelembung udara terlalu

banyak, atau keluar terlalu cepat, dimasukkan kembali ampul yang berisi sampel

larutan ke dalam es kering-aseton dan divakum kembali. Cara ini diulangi sampai

udara yang ada dalam sampel larutan dapat keluar seluruhnya. Jika masih ada

gelembung udara, ditambahkan sebanyak 1 atau 2 tetes n-oktil alkohol sebagai

56

anti bubbling dan ampul tersebut divakum kembali selama 20 menit. Selanjutnya

ampul dimasukkan ke dalam oven bersuhu 100 o

Tahap pengeringan dilakukan dengan mengeringkan sampel menggunakan

freeze dryer dalam keadaan vakum, untuk mengubah sistein menjadi sistin.

Sampel larutan yang terdapat dalam labu evaporator, ditambahkan aquades

sebanyak 10-20 mL dan dikeringkan dengan freeze dryer. Proses pengeringan ini

diulangi sebanyak 2-3 kali. Selanjutnya ditambahkan 5 mL HCl 0,01 N ke dalam

sampel larutan yang telah dikeringkan.

C selama 24 jam. Kemudian

ampul tersebut didinginkan pada suhu ruang (telah dihidrolisis) dan setelah itu

sampel larutan dalam ampul dipindahkan ke labu evaporator 50 mL dan ampul

dibilas dengan 2 mL HCl 0,01 N. Cairan hasil bilasan tersebut dimasukkan ke

dalam labu evaporator.

Tahap derivatisasi yaitu sampel larutan yang telah dihidrolisis dalam 5 mL

HCl 0,01 N, disaring dengan kertas milipore. Ditambahkan buffer kalium borat

pH 10,4 dengan perbandingan 1:1. Sampel larutan sebanyak 10 µL dimasukkan ke

dalam vial/labu dan ditambahkan pereaksi OPA sebanyak 25 µL. Selanjutnya

dibiarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sampel larutan

diinjeksi ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µL dan ditunggu selama ±25 menit

sampai pemisahan semua asam amino selesai.

Perhitungan kadar asam amino (%) dengan menggunakan rumus :

Kadar asam amino (%) =

d) Analisis kualitatif asam amino bebas dengan pereaksi ninhidrin

(Wang 2006)

Uji kualitatif asam amino bebas dengan menggunakan pereaksi ninhidrin

untuk menentukan terdapatnya asam amino bebas dalam suatu bahan. Bila

bereaksi dengan gugus amino pada asam amino bebas membentuk senyawa

berwarna ungu, jika bereaksi dengan prolin dan hidroksiprolin akan berwarna

kuning. Pereaksi ninhidrin terdiri dari 0,35 g ninhidrin dalam 100 mL etanol

sebanyak 95%. Uji kualitatif yaitu sampel ditimbang sebanyak 1 g, ditambahkan

aquades sebanyak 2 mL dan dihaluskan. Larutan tersebut disentrifuge dengan

kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatan diambil 0,5 mL dan

57

dicampur pelarut ninhidrin sebanyak 0,5 mL, ditempatkan pada tabung reaksi dan

selanjutnya di homogenkan. Tabung ditutup rapat dengan parafilm, lalu

dipanaskan pada suhu 80-100 o

e) Analisis kuantitatif asam amino bebas (Modifikasi AOAC 2005, Laboratorium Terpadu IPB)

C selama 4-7 menit sampai berubah warna.

Larutan berwarna ungu menunjukkan adanya asam amino bebas. Untuk menguji

asam amino bebas secara kuantitatif dapat dilakukan melalui alat High

Performance Liquid Chromatogaphy (HPLC).

Sampel sebanyak 2 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer ditambahkan 50 mL

larutan asam sulfosalisilat 5% dan dikocok sampai homogen dan didiamkan

sampai terjadi endapan maksimal. Selanjutnya sampel larutan dipindahkan ke labu

50 mL dan disaring dengan kertas milipore dan ditambahkan buffer kalium borat

pH 10,4 dengan perbandingan 1:1. Setelah itu sampel larutan dimasukkan ke

dalam labu sebanyak 10 µL dan tambahkan 25 µL pereaksi OPA, didiamkan

selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sampel larutan diinjeksi

ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µL dan ditunggu selama ±25 menit sampai

pemisahan semua asam amino bebas selesai.

Perhitungan kadar asam amino bebas (%) dengan menggunakan rumus :

Kadar asam amino (%)=

f) Analisis kadar asam lemak (AOAC 2005)

Analisis kadar asam lemak dengan menggunakan metode kromatogafi gas.

Kadar lemak sampel diperoleh dari metode Sokhlet untuk dilakukan analisis kadar

asam lemak. Prosedur kadar asam lemak yaitu :

Preparasi sampel (hidrolisis dan esterifikasi) :

Kadar lemak sampel ditimbang sebanyak 20-30 mg dan dimasukkan ke

dalam tabung bertutup teflon. Selanjutnya ditambahkan 1 mL NaOH 0,5 N-

metanol dan dipanaskan dalam tangas air selama 20 menit, suhu 80 oC, selanjtnya

diangkat dan dibiarkan hingga dingin. Sampel tersebut ditambahkan 2 mL

bourtiflourid-metanol dan dipanaskan pada suhu 80 oC selama 20 menit dan

didinginkan. Selanjutnya sampel tersebut ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dalam

58

1 mL heksan dan dihomogenkan. Lapisan heksan dipindahkan dengan pipet tetes

ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 g Na2SO4

2-5 µL dan selanjutnya diinjeksi ke dalam alat kromatografi gas.

anhidrat dan didiamkan selama

15 menit. Fase cair dipisahkan dengan cara dipipet lapisan tersebut sebanyak

Analisis komponen asam lemak, sebagai Fatty acid Metil Ester (FAME) :

Sampel larutan diinjeksi sebagai FAME masing – masing sebanyak 1 µL

secara terpisah, sehingga diperoleh 2 kromatogram dari sampel dan standar.

Selanjutnya dibandingkan waktu retensi standar dan sampel untuk mendapatkan

jenis asam lemak.

Kadar asam lemak tertentu dihitung menggunakan rumus 1:

Asam lemak (%) = x 100%

Kadar asam lemak tertentu dihitung menggunakan rumus 2:

Asam lemak (%) = 100 – konsentrasi pelarut standar asam lemak

Asam lemak (% = x 100%

3.5 Rancangan dan Analisis Data

Percobaan satu faktor adalah percobaan yang dirancang dengan hanya

melibatkan satu faktor dengan beberapa taraf sebagai perlakuan. Rancangan

percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL) faktor tunggal atau satu faktor dengan asumsi kondisi unit percobaan

relatif homogen. Faktor tunggal adalah perlakuan waktu hari penyimpanan.

Variabel yang diamati adalah waktu penyimpanan hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12 dan

hari ke-16, yang disimpan pada suhu ruang dan dilakukan sebanyak 3 kali

ulangan.

Model rancangan tersebut adalah :

Yij = µ + τ i + ε ij atau Yij = µ i + ε Dimana : i = 1,2,…,t dan j = 1,2,…,r

ij

Yij µ = Rataan umum

= Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

τ i µ

= Pengaruh perlakuan ke-i i

ε - µ

ij

= Pengaruh perlakuan ke-i

59

Hasil uji dilakukan dengan analisis ragam (ANOVA). Apabila hasil uji yang

dilakukan berbeda nyata dimana jika F hitung > F tabel α pada taraf nyata 0,05

Bentuk persamaannya adalah :

maka

dilakukan uji lanjutan yaitu uji Duncan (Matjik & Sumertajaya 2006).

Rp = rαp;dbg

atau 1/rh

=

Dimana r αp ; dbg adalah nilai tabel Duncan pada taraf nyata α, jarak

peringkat dua perlakuan p dan derajat bebas galat sebesar dbg

Uji sensori rating intensitas menggunakan Rancangan Blok Acak Lengkap

(Randomized Complete Block Design) dan analisis data menggunakan analisis

ragam (ANOVA). Apabila data signifikan (berbeda nyata) dari hasil analisis

ragam, dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Test yang dapat menyatakan

perbedaan diantara masing – masing perlakuan (Meilgaard (1999). Semua data

sensori rating intensitas menggunakan progam SPSS 16,0.

.

Uji sensori hedonik secara keseluruhan (tekstur, warna, aroma dan rasa)

pada penelitian ini menggunakan statistik non parametrik metode Kruskal Wallis

(SNI 01-2346-2006). Statistik non parametrik metode Kruskal Wallis merupakan

alternatif bagi uji F untuk pengujian kesamaan beberapa nilai tengah dalam

analisis ragam untuk menghindar dari asumsi bahwa contoh diambil dari populasi

normal (Walpole 1995). Hasil data dilanjutkan dengan menggunakan Multiple

Comparison untuk data analisis ragam (ANOVA). Jika hasil data diperoleh

signifikan (berbeda nyata), maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan Multiple

Test. Semua data sensori hedonik diolah secara statistik menggunakan program

SPSS 16.0.