2.4.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif merupakan salah satu metode pemisahan

dengan menggunakan peralatan sederhana. Ketebalan penjerap yang sering dipakai adalah 0,5 - 2

mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran

plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif.

Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel.

Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut.

Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan jarak sesempit mungkin karena pemisahan tergantung

pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol

otomatis. Pelarut yang baik untuk melarutkan cuplikan adalah pelarut yang atsiri. Pengembangan

plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana

dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang diletakkan

berdiri disekeliling permukaan bagian dalam bejana (Hostettmann, et al, 1995).

Kebanyakan Penjerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu

mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet. Untuk

mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet yaitu dengan cara menutup plat

dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi dengan penyemprot (Hostettmann, et al,

1995).

Setelah pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak maka senyawa yang tidak berwarna

dengan penjerap dikerok dari plat kaca. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran beberapa

senyawa sehingga diperoleh senyawa murni (Gritter, et al, 1991).

KLT Preparatif

KLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah gram, namun

sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram (Kristanti, 2008). Seperti halnya KLT

secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya

adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat

dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau aluminium

oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya

sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling

umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel (Kristanti, 2008).

Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam

sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, misalnya n-heksana,

diklorometana atu etil asetat. Karena jika pelarut yang digunakan tidak mudah menguap, maka

akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang

ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga

bergantung pada lebarnya pita (Kristanti, 2008).

Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok

dari plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben dengan pelarut yang sesuai (5 ml

pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan untuk menggunakan pelarut yang paling nonpolar

yang mungkin. Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka

makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak yang

diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan membran.

Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang digunakan murah dan

memakai peralatan paling dasar. Sementara kekurangannya antara lain : adanya kemungkinan

senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa beracun, waktu yang diperlukan dalam proses

pemisahan cukup panjang ,adanya pencemar setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan

biasanya rendemen yang diperoleh berkurang dari 40%-50% dari bahan awal (Kristanti, 2008).

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi

serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran

eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka

komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang

menyebabkan pemisahan (Wijayakusuma, 1996).

KLT preparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil (50 mg – 1

gram) dari senyawa yang kurang atsiri. KLT sebenarnya dapat dipakai untuk masalah

preparative dengan 2 cara.

1. KLT preparative yabg sebenarnya.

2. Pemakainan KLT untuk memnadu kondisi untuk kromatografi kolom atau KCKT.

Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada

salah satu sisi plat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan

sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara

yang tidak merusak jika senyawa itu tahan warna, dan penjerap yang mengandung pita

dikerok dari plat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penjerap dengan pelarut polar. Cara

ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk

telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang

lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang

murni untuk mengkalibrasi KLT kuantitatif. (Sastrohamidjojo, 1985).

d.3. KLT preparatif Senyawa aktif yang terdapat dalam fraksi diisolasi dengan menggunakan KLT preparatif

dengan fase diam silika gel PF254, tebal 0,5mm. Plat yang telah ditotol dimasukkan ke dalam bejana

yang berisi larutan pengembang. Setelah pengembangan selesai, plat dikeluarkan dan dibiarkan

hingga fase geraknya menguap. Untuk mengetahui bercak pita yang akan dikerok, plat diamati di

bawah lampu UV254 dan langsung ditandai bagian-bagian yang akan dikerok. Serbuk hasil kerokan

dilarutkan dalam pelarut kloroform, diaduk dengan pengaduk magnetik (stirrer), kemudian disaring

dengan penyaringan vakum. Hasil penyaringan ini diuapkan dan diperoleh isolat (filtrat) yang kering.

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben

terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.

2.8. Kromatografi lapis tipis preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan memakai

peralatan sangat sederhana ialah kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).Walaupun KLTP

dapat memisahkan dalam jumlah gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram.

KLT preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai pengganti

lapisan penyerap yang tipis (Harborne, 1987)

Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa

garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis

cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara

yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita

dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini

berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah

pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya

berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk

mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif (Gritter, 1991)

Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat

menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara

pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan

penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian (Hostettman, 1995)