universitas udayana juni 2015 · ii halaman pengesahan judul penelitian: lama waktu kolonisasi...
TRANSCRIPT
i
Kode/Nama
Rumpun Ilmu
: 362 / Bidang Kesehatan Umum
Lain yang belum tercantum
Tema : Kesehatan, penyakit tropis, gizi
dan obat-obatan
LAPORAN KEMAJUAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL
LAMA WAKTU KOLONISASI LACTOBACILLUS SP F213 PADA
SALURAN PENCERNAAN DIANALISIS MENGGUNAKAN
SIDIK DNA MIKROBIOMIK FESES DALAM PENGEMBANGAN
PROBIOTIK UNTUK MENURUNKAN KOLESTEROL
Ketua/Anggota Tim
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D. NIDN: 00312 6651 (Ketua) Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. NIDN: 0022106401 (Anggota) Ir. K. Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc. NIDN: 0008036801 (Anggota)
UNIVERSITAS UDAYANA
Juni 2015
ii
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Penelitian : Lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran
pencernaan dianalisis menggunakan sidik DNA
mikrobiomik feses dalam pengembangan probiotik untuk
menurunkan kolesterol
Tema Isu Stragtegis Nasional : Kesehatan, Penyakit Tropis, Gizi dan Obta-obatan (Health,
Tropocal Diseases, Nutrition and Medicine)
Kode/Nama Rumpun Ilmu : 363/Bidang Kesehatan Umum Lain yang Belum Tercantum
Peneliti / Pelaksana
Nama Lengkap : Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.P.hD.
NIDN : 0031126651
Jabatan Fungsional : Lektor Kepala
Program Studi : Ilmu Kesehatan Masyarakat
Nomor HP : 081338661516
Surel (e-mail) : [email protected]
Anggota Peneliti (1)
Nama Lengkap : Dr., Drs Yan Ramona, M.App.Sc
NIDN : 0022106401
Perguruan Tinggi : Universitas Udayana
Anggota Peneliti (2)
Nama Lengkap : Ir. Komang Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc
NIDN : 0008036801
Perguruan Tinggi : Universitas Udayana
Institusi Mitra (jika ada)
Nama Institusi Mitra : --
Alamat : --
Penanggung Jawab : --
Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Biaya Tahun Berjalan : Rp. 81.250.000
Biaya Keseluruhan : Rp. 200.000.000
Denpasar, 29-6-2015
Mengetahui,
Ketua LPPM
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gede Antara, M.Eng.
NIP/NIK : 196408071992031002
Ketua Peneliti
Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.Ph.D.
NIP/NIK196612311993111002
iii
RINGKASAN
Penaykit tidak menular akibat pola makan dan gaya hidup seperti penyakit jantung
koroner (PJK) dan tekanan darah tinggi semakin meningkat di Indonesia.
Diperkirakan sebanyak 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK.
Oleh karena itu diperlukan upaya-upaya pemanfaatan biodivesitas Indonesia guna
menurunkan PJK. Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengembangkan
probiotik endogen Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau
pengendalian kandungan kolesterol darah. Secara khusus, pada tahun pertama
penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan sistem deteksi spesifik untuk
melancak kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan
manusia, melalui pendekatan berbasis DNA mikrobiomik pada feses. Pengembangan
sekuen pelacak khusus Lactobacillus sp F213 didasarkan pada susunan nukleotida
pada bagian intrageneic spacer region (IGS) pada rDNA Lactobacillus sp F213 dan
dari sekuan pita khusus yang diperoleh dari random amplified DNA polymorphism
(RAPD).
Pada tahap pengembangan pendeteksi khusus ini dilakukan PCR terhadap IGS
Lactobacillus sp F213 yang dibandingkan dengan Lactobacillus rhamnosus,
Pediococcus spp, serta strain dari golongan non-bakteri asam laktat. Hasil penelitian
menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunyai panjang IGS yang spesifik,
berbeda dengan L rhamnosus, Pediocoocus serta strain non-BAL, namun demikian IS
Lactobacillus sp F213, L rhamanosus, dan Pediococcus spp menunjukkan pita
ganada (mempunyai 2 buah IGS dengan panjang yang berbeda). Pita IGS ini sudah
berhasil dipisahakan menjadi pita tunggal dan akan dilakukan sekeunsing dan
selanjutnya merancang primer dan oligo probe specific untuk Lactobacillus sp F213.
iv
PRAKATA
Puji syukur kami panjatkan, karena atas rachmat-Nya laporan kemajuan ini dapat
diselesaikan. Laporan kemajuan ini meruapakan capaian sementara dari serangkaian
rencana penelitian pada tahun 2015. Tim peneliti mengucapkan terimakasih kepada
Dirjen DIKTI melalui Litabmas, yang telah membiayai penelitian ini, Ketua Lembaga
Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Univ Udayana yang telah
memfasilitasi dari pengususlan proposal sampai pada pencairan dana. Pada laporan
kemajuan ini, masih banyak hal yang belum tercapai, sehingga peneliti akan bekerja
keras untuk merampungakn penelitian tahun pertama ini sesuai kontrak yang etlah
disepakati.
Semoga laporan kemajuan ini bermanfaat bagi kita semua.
Bukit Jimbaran, 29 Juni 2015
Tim Peneliti
v
DAFATR ISI
Halaman
HAL PENGESAHAN ----------------------------------- ii
RINGKASAN ----------------------------------- iii
PRAKATA ----------------------------------- iv
DAFTAR ISI ----------------------------------- v
DAFTAR GAMBAR ----------------------------------- vi
DAFTAR TABEL ----------------------------------- vii
BAB I. Pendahuluan ----------------------------------- 1
BAB II. Tinjauan Pustaka ----------------------------------- 5
BAB III. Metode ----------------------------------- 12
BAB IV. Hasil ----------------------------------- 17
BAB V. Rencana Selanjutnya ----------------------------------- 23
BAB VI. Simpulan dan Saran ----------------------------------- 24
DAFTAR PUSTAKA ----------------------------------- 25
LAMPIRAN ----------------------------------- 29
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1 Peta jalan penelitian pengembangan probiotik (disesuaikan
dengan guide line pengembangan probiotic foods
FAO&WHO 2002)
11
Gambar 2 Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan
sistem deteksi molekuler Lactobacillus sp F213.
12
Gambar 3 Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS
Lactobacillus sp F213
14
Gambar 4A Morfologi koloni Lactobacillus sp F213 pada media MRS
agar
17
Gambar 4B Morfologi mikroskopik Lactobacillus sp F213 pada media
MRS both
17
Gambar 5 Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 18
Gambar 6A Hasil PCR IGS Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus
sp F213, Pedioccocus spp, dan non LAB (isolat B3).
29
Gambar 6B Optimasi PCR dengan termal gradient. 20
Gambar 7 Panjang IGS Lactobacillus sp F213, L. rhamnosus
SKG34 dan Pediococcus spp.
21
Gambar 8 Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik 22
Gambar 9 IGS dari Lactobacillus sp F213, L rhamnosus SKG34
dan hasil PCR pita tunggal dari Lactobacillus sp F213
dan L rhamnosus SKG34
22
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Primer yang dipergunakan untuk RAPD 15
Tabel 2 Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS
Lactobacillus sp F213
19
1
BAB I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Modernisasi memberikan andil pada pergeseran pola makan masyarakat dari
makanan tradisional berserat tinggi ke makanan gaya barat dengan lemak tinggi dan
rendah serat. Konsumsi makanan dengan kandungan asam lemak jenuh (asal hewani)
yang tinggi merupakan salah satu faktor resiko penyebab penyakit jantung koroner
(PJK), pembunuh nomor satu di dunia, sebagai akibat penimbunan kolesterol pada
pembuluh darah. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK
menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan
akan naik menjadi 11 juta jiwa. Dan di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam
10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon, 2008).
Pembentukan asam empedu merupakan mekanisme utama untuk
megekskresikan kolesterol dari tubuh. Garam empedu (tauro-kolat dan gliko-kokolat)
merupakan produk antara metabolisme kolesterol. Hidrolisis garam empedu oleh
mikroorganisme saluran pencernaan yang mempunyai enzim bile salt hidrolase
(BSH) menghasilkan taurin atau glisin serta asam empedu bebas. Asam empedu
bebas ini berisfat tidak larut dan tidak direabsorbsi tubuh sehingga akan
diekskresikan melalui feses (Kurdi et al., 2000). Semakin banyak asam empedu yang
dibuang melalui siklus enterohepatik semakin banyak pula kolesterol darah
digunakan untuk sintesis asam empedu baru (Brisson, 1981).
Penurunan kolesterol darah dilaporan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi
susu terfermentasi oleh Lactobacillus (Agerbaek et al., 1995; Bertolami et al, 1999;
Larsen et al, 2000; Schaafsma et al., 1998), walaupun secara mekanistik belum
diketahui secara pasti bagaiaman Lactobacillus berperan dalam proses ini di dalam
tubuh (De Rose dan Katan, 2000). Dari serangkaian hasil penelitian in vitro, diduga
bahwa mekanisme penurunan kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium
meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek (short chain fatty acids) dalam
saluran pencernaan (Kurdi et al, 2000; 2003), asimilasi kolesterol oleh Lactobacillus
dan Bifidobacterium (Klaver et al., 1993; Gilliland et a.l, 1985), pengikatan
2
kolesterol pada permukaan sel Lactobacillus dan Bifidobacterium (Lin dan Cheh,
2000) serta dekonjugasi enzimatis garam empedu oleh Lactobacillus dan
Bifidobacterium (Tahri et al., 1985; Tahri et al., 1996).
Mengingat bahaya dari kandungan kolesterol yang terlalu tinggi pada darah
sebagai penyebab utama penyempitan pembuluh darah dan PJK sementara di terapi
medis yang dilakukan dengan mempergunakan obat-obatan yang sangat mahal, maka
dipandang perlu dilakukan penelitian untuk menggali potensi mikrobial alam
Indonesia guna menanggulangi masalah kolesterol dan PJK. Probiotik merupakan
salah satu pilihan yang menjanjikan.
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan
secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro dari aspek ketahan pada kondisi saluran
pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 pH rendah, enzim pencernaan,
dan asam empedu. Dari aspek keamanan meliputi bahwa Lactobacillus sp F213 tidak
melakukan transformasi asam empedu primer (tidak memicu kolon kanker), tidak
menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan, sifat tidak beracun (tidak me-lisis
sel darah meras) serta Lactobacillus sp F213 tidak akut pada larva udang. Aspek
fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran
pencernaan mencit untuk mencegah diare dan stimulasi sistem imun serta
Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolsisi garam empedu sebagai potensi dalam
menurunkan kolesterol darah. Potensi in vitro telah teruji dalam penelitian in vivo
seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat apda saluaran pencernaan mencit
yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk
mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam
saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari
total kolesterol tikus (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia
menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik
feces, serta dapat menurunkan 6,29% kolesterol dan dapat menurunkan TNF alfa
sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian
Lactobacillus sp F213). Disamping itu pemberian Lactobacillus sp F213 dapat
3
meningkatkan kenyamanan buang air besar (mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,
2012, 2013).
Rumusan Masalah
Setelah melakukan serangkaian penelitian untuk mengembangankan Lactobacillus sp
F213 sebagai probiotik dengan potensi dapat menurunkan kolesterol, serta
berdasarkan persyaratan WHO bahwa probiotik adalah mikroorganisme hidup yang
dikonsusmsi dan dapat memberikan manfaat kesehatan bagi host, maka probiotik
harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencernaan. Oleh karena
itu, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
Apakah Lactobacillus sp F213 dapat tumbuh pada saluran pencernaan dan
berapakah populasi Lactobacillus sp F213 pada feses?
Berapa lamakah Lactobacillus sp F213 dapat berada pada saluran pencernaan
manusia sehat ?
Bagaimankan efek pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid
darah subjek yang diberikan Lactobacillus sp F213 ?
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum :
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia
dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan
kolesterol darah.
Tujuan khusus penelitian :
Untuk mengembangkan metode deteksi spesifik yang dapat diperguankan
untuk diagnostik Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan ?
Untuk mengetahui lama waktu kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213
pada saluran pencernaan (feses)?
Untuk mengetahui efek fungsional pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap
profile lipid darah.
4
Manfaat khusus:
Manfaat dari penelitian ini adalah, secara teoritis, dapat menjelaskan
bagaimana prilaku (aktivitas) dan pengaruh Lactobacillus sp F213 terhadap
kesehatan saluran pencernaan serta profile lipid pada darah.
Manfaat aplikasinya adalah dapat menjadi salah satu pilihan dalam terapi
biologis dalam penanggulangan masalah kolesterol darah dan berkontribusi
dalam menurunkan kejadian penyakit PJK di Indonesia.
5
BAB II. STUDI PUSTAKA
Kasus Penyakit Jantung Koroner
Penyakit jantung koroner (PJK) telah menjadi penyebab utama kematian di dunia
dewasa ini. Badan Kesehatan Dunia (WHO) mencatat lebih dari 7 juta orang
meninggal akibat PJK di seluruh dunia pada tahun 2002. Angka ini diperkirakan
meningkat hingga 11 juta orang pada tahun 2020. Di Indonesia, kasus PJK semakin
sering ditemukan karena pesatnya perubahan gaya hidup. Meski belum ada data
epidemiologis pasti, angka kesakitan/kematiannya terlihat cenderung meningkat.
Hasil Survei Kesehatan Nasional tahun 2001 menunjukkan 3 dari 10.000 penduduk
Indonesia menderita PJK (Anon., 2008).
Penyakit jantung koroner (PJK) terjadi karena penyempitan/ penyumbatan
pembuluh darah koroner yang berfungsi mendistribusikan darah dan oksigen ke otot
jantung. Penyumbatan (plak aterosklerosis) disebabkan tertumpuknya endapan lemak
(terutama kolesterol LDL), sel-sel otot polos pembuluh darah dan matriks
ekstraseluler lainnya di sepanjang dinding arteri sebagai hasil proses yang
berlangsung bertahun-tahun. Jika aliran darah berkurang secara bermakna, maka
penderita perlu segera mendapat tindakan medis. Karena pentingnya penyakit ini dan
kecendrungan peningkatan kasus dari tahun ke tahun maka telah diterbitkan pedoman
teknis penemuan dan penatalaksanaan penyakit hipertensi yang merupakan salah satu
faktor resiko dari PJK (Anon 2006, Depkes)
Kejadian PJK bervariasi antar negara dan lebih umum terjadi di negara-negara
industrialis sehingga penyakit ini juga dipandang sebagai akibat gaya hidup dan pola
makan. Western diet dengan kandungan lemak jenuh tinggi cenderung berasosiasi
pada PJK. Di Inggris (UK) ditemukan bahwa 27% kematin disebabkan oleh PJK serta
12% disebabkan oleh strok, walaupun mortality rate PJK bervariasi antar negara.
Mortality rate PJK ii Jepang dilaporkan sebesar 15 per 100.000 penduduk, sementara
di Finland sebanyak 198 per 100.000 penduduk (Marila-Sandholm dan Saarela, 2003).
Metabolisme kolesterol
6
Beberap studi epidemiologi menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara
kandungan kolesterol khususnya low dencity lippprotein (LDL) dengan PJK.
Akumulasi LDL pada plasma menyebabkan penumpukan kolesterol pada dinding
pembuluh darah arteri, proses yang berhubungan dengan oksidasi LDL. LDL
teroksidasi akan diambil oleh makrofag yang segera menjadi gelembung sel yang
merupakan plak awal. Sehingga diperkirakan setiap kenaikan 1% LDL kolesterol
setara dengan peningkatan 2-3% resiko PJK (Lovegrove dan Jackson, 2003). Tetapi
sebaliknya, high dencity lipoprotein (HDL) memberikan efek yang berlawanan
dengan LDL terhadap resiko PJK sehingga HDL dianggap sebagai kolesterol baik.
Kolesterol merupakan penyebab utama hipertensi dan PJK, oleh karena itu
dalam penatalaksanaan PJK dan hipertensi kadar kolesterol dalam serum menjadi
salah satu acuan. Individu dengan kandungan kolesterol darah 8.0 mmol/lt dan atau
triasil gliserol di atas 3.0 mmol/lt tidak hanya memerlukan modifikasi diit tetapi juga
disarankan mengkonsumsi obat penurun kandungan lemak dalam darah untuk
membantu menurunkan faktor resiko PJK dan hipertensi. Pemberian obat yang ada
efektif pada beberapa hal yaitu: menurunkan sintesis very low dencity lippprotein
(VLDL) dan LDL, meningkatkan penghilangan VLDL, meningkatkan penghilangan
LDL dan penghambatan enzim hidroksi metil glutaril CoA reduktase (Martilla-
Sandholm dan Saarela, 2003).
Sintesis dan metabolisme kolesterol merupakan jalur metabolik utama dalam
penaggulangan PJK. Kolesterol homeostatis dipelihara dalam tubuh mamalia melalui
pengaturan tiga jalur metabolisme. Dua jalur metabolik adalah bagaimana mensuplai
kolesterol ke dalam sel yang meliputi endogenus sintesis kolesterol dari prekursornya
(asetat) dan eksogenus sintesis dimana LDL yang merupakan pembawa kolesterol
pada darah (Ramirez et al., 1994). Ketiga jalur metabolik adalah konversi kolesterol
yang melibatkan konversi kolesterol menjadi asam empedu. Kelainan pada regulasi
metabolisme kolesterol berimplikasi pada penyakit karena jalur metabolisme utama
dalam ekskresi kolesterol pada mamalia adalah melalui pembentukan asam empedu.
Sehingga eliminasi kolesterol merupakan faktor kritis pada beberapa penyakit seperti
7
atherosclerosis, gallstone diseases, dan penyakit selain pada penyimpanan lemak
(Ramirez et al., 1994).
Empedu merupakan produk utama metabolisme kolesterol yang tersimpan di
dalam kantung empedu yang terdiri dari asam empedu, kolesterol, pospolipid dan
pigmen bilirubin. Empedu disintetsis dalam sel hati dan akan disekresikan ke usus
dua belas jari setelah adanya makanan yang masuk. Sehingga fungsi utama dari
empedu adalah sebagai detergent biologis dan pelarut lemak dalam tubuh. Empedu
juga berfungsi sebagai salah satu zat antimikrobial dalam tubuh (Begley et al., 2006).
Probiotik dan kolesterol
Persyaratan pengembangan probiotik baru
Probiotik didefinisikan sebagai bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam
jumlah yang memadai akan memberikan efek yang menguntungkan bagi yang
mengkonsumsinya (FAO-WHO, 2001). Pada awal perkembangan era probiotik,
L.casei strain Shirota (Yakult) serta L. rhamnosus GG, merupakan dua strain
lactobacilli yang mengawali (pionir) perkembangan probiotik bakteri. Seiring dengan
kemajuan teknologi, beberapa strain baru dikembangkan sebagai probiotik dengan
berbagai keunggulan spesifik pada aspek kesehatan yang diharapkan (Klaenhammer
dan Kullen, 1999).
Probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang
mengkonsumsinya. Beberapa aspek menyehatkan probiotik antara lain: ekslusi,
antagonis terhadp patogen, sebagai imun stimulator dan modulator, antikarsinogenik
dan mutagenik, peningkatan simpton laktosa intoleran, menurunkan kolestrol darah,
menurunkan tekanan darah, menghambat dan mencegah diare, mencegah vaginitis
dan memelihara integritas mukosa usus (Sanders, 1998; Tannock, 1999; Mattilla-
Shandholm et al., 1999). Adanya berbagai aspek menyehatkan tersebut, maka
memberi potensi baru dalam pengembangan makanan fungsional dan bahkan formula
makanan khusus untuk bayi dan manusia usia lanjut seperti yang telah dikembangkan
di Jepang melalui konsep FOSHU (food and ingredient for spesified health use).
8
Dalam pengembangan probiotik, strain yang dipergunakan sebaiknya telah
teridentifikasi dengan baik, umumnya dengan susunan gen 16S rDNA sudah
terdepositkan di bank data internasional. Adanya data genetik memungkinkan untuk
mengembangkan sistem monitoring untuk menentukan secara spesifik populasi
probiotik bakteri yang dikonsumsi di dalam saluran pencernaan agar efek fungsional
yang ditimbulkan bisa dijelaskan dengan lebih baik. Disamping identifikasi strain dan
sistem deteksi, ada beberapa kriteria yang diharapkan dalam pengembangan probiotik
baru seperti: (1) kecocokan (untuk probiotik konsumsi manusia sebaiknya diisolasi
dari saluran pencernaan manusia sehingga mengurangi resiko toksisitasnya); (2)
kecocokan dalam teknologi pengembangan/produksi dimana diharapkan mudah
diproduksi secara masal/skala besar, viabilitas yang tinggi, tidak mengganggu nilai
sensoris bahan pangan apabila diikutkan dalam bahan pangan tertentu, stabil secara
genetis dan memungkinkan dilakukan rekayasa genetika; (3) kemampuan bersaing
(competitiveness) seperti mampu bertahan dan berkembang biak di dalam saluran
pencernaan, tahan terhadap kondisi saluran pencernaan (asam empedu, pH rendah),
mampu bersaing dengan flora normal di dalam saluran pencernaan, dan mampu
melakukan adhesi pada sel epitel saluran pencernaan; (4) efek fungsional seperti
mampu menimbulkan dampak menyehatkan, antagonis terhadap patogen, produksi
zat antimikrobial, imunstimulator, anti karsinogenik dan anti mutagenik, produksi
bioaktif (enzyme, vaccines, peptida) (Klaemhammer dan Kullen, 1999).
Guna memahami peranan dari probiotik Lactobacillus sp F213 pada
kesehatan manusia dan marker biologi, merupakan hal penting untuk mengetahui
efeknya terhadap komunitas bakteria pada saluran pencernaan manusia yang
diberikan Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini perhatian difokuskan pada
deteksi Lactobacillus sp F213 dan lama waktu kolonisasinya pada saluran pencernan
yang dilihat dari DNA mikrobiomik feses serta pengaruh fungsional kesehatan yang
ditimbulkannya.
Probiotik dan mekanisme penurunan kolesterol
Hiperkolesterolemia (peningkatan kadar kolesterol di dalam darah) telah
diketahui sebagai salah satu pemicu PJK. Beberapa jenis obat-obatan telah tersedia
9
untuk mengobati PKJ, namun demikian masih dipandnag belum optimal karena
harganya yang relatif mahal serta adanya efek samping yang tidak diinginkan.
Konsumsi oral dari probiotik mampu menurunkan 22-33% dari total kolesterol darah
(De Smet et al. 1994:1998: Torano et al., 1998). Efek penurunan kolesterol ini dapat
disebabkan oleh aktivitas BSH (Kluver et al., 1993; Liong dan Saha, 2005). Asam
empedu yang telah mengalami dekonjugasi mempunyai kelarutan yang lebih rendah
dari pada bentuk garamnya sehingga menyebabkan ekskresi asam empedu bebas
lebih banyak dalam feses. Asam empedu bebas juga mempunyai kemampuan yang
kurang baik dalam melarutkan lemak serta kurang bisa diabsorbsi untuk
dipergunakan kembali (siklus enterohepatik). Dengan demikian dekonjugasi garam
empedu mempunyai peranan penting dalam menurunkan kolesterol di dalam darah.
Karakter inilah menyebabkan adanya BSH dalam strain probiotik memberikan
keuntungan ganda guna menurunkan kolesterol darah dan menjaga keseimbangan
bakteri saluran pencernaan.
Pemberian susu terfermentasi dengan mempergunakan Lactobacillus
menurunkan kolesterol darah dari pasukan Masai pria sebanyak 9.8% (Lovegrove dan
Jackson, 2003). Disamping itu, yoghurt yang difermentasi dengan mempergunakan
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus dapat menurunkan total
serum kolesterol dan LDL (Jasper et al., 1984). Hal ini menunjukkan bahwa probiotik
memberikan kontribusi dalam penurunan kolesterol darah.
Beberapa mekanisme telah diusulkan, yang meliputi efek fisiologis dari asam
lemak rantai pendek yang terbentuk akibat aktivitas probiotik, kolesterol asimilasi,
pengikatan kolesterol pada sel bakteri, serta aktivitas dekonjugasi garam empedu
(Lovegrove dan Jackson, 2003). Mekanisme lain yang diperkirakan erat kaitannya
dengan penurunan kolesterol darah adalah melalui transport kolat oleh Lactobacillus
dan Bifidobacterium (Kurdi et al., 2000:2003), dimana asam kolat dapat terakumulasi
di dalam sel dan kemudian ikut terbawa feses. Aktifitas fermentatif probotik
cenderung menyebabkan pH saluran pencernaan menjadi lebih asam. Asam empedu
umumnya mempunyai derajat disosiasi pada pH agak netral (pH 64-6,5, untuk asam
10
kolat dan deoksi kolat). Sehingga pada pH saluran pencernaan relatif rendah (lebih
rendah dari pH 6,4) maka asam empedu akan mengendap dan terbawa feses. Hal ini
akan menyebabkan penurunan kolestrol darah.
Studi pendahulaun dan Hasil yang sudah dicapai
Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan.
Penelitian in vitro dari aspek ketahanan pada kondisi saluran pencernaan meliputi
ketahan Lactobacillus sp F213 terhadap pH rendah di lambung, enzim pencernaan,
dan asam empedu. Dari aspek keamanan ditemukan bahwa Lactobacillus sp F213
tidak dapat mentransformasi asam empedu primer (sehingga diduga tidak memicu
kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan (histolgi
saluran pencernaan mencit), bersifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah) serta
tidak akut diuji menggunakan larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan
Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk
mencegah diare dan diduga dapat menstimulasi sistem imun. Ditemukan juga bahwa
Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolisis garam empedu dan berpotensi
menurunkan kolesterol darah.
Potensi in vitro tersebut di atas telah teruji dalam penelitian in vivo seperti
kemampuan berkompetisi untuk melekat (competetive exclusion) pada saluran
pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp
F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213
mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan
menurunkan 35% dari total kolesterol pada tikus hiperkolesteromik (Nursini et al.,
2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213
terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29%
kolesterol darah, serta menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi
0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Lebih jauh diperoleh
bahwa pemberian Lactobacillus sp F213 pada subjek manusia dapat meningkatkan
kenyamanan buang air besar (berpotensi untuk mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,
2012, 2013).
- 11 -
Output: Lactobacillus sp F213
4. Safety assesment a. Uji in vivo atau pada
hewan
Toksisitas pada larva
udang
Kerusakan salaruan
pencernaan mencit
b. Studi pada manusia
(Fase 1)
Stimulasi pertumbuhan
bakteri menguntungkan
Populasi dan durasi
Lactobacillus sp F213
pada sal. pencernaan
3. Karakterisasi fungsional
Uji in vitro
Bile salt hydrolase (penurun
kolesterol)
Adhesi pada epitel (mencegah
pelekatan patogen spt E coli dll)
Studi pada hewan
Menurunkan kolesterol
Menghalangi pelekatan E coli
O157
Output:
Probiotik
5. Double blind,
randomized, placebo-
controlled (DBPC) pengujian pada manusia atau
dengan desain lain untuk
mengetahui efikasi produk
(Fase 2)
6. Percobaan yang lebih
efektif, untuk
membandingkan probiotik
dengan standar terapi
dalam kondisi yang
spesifik (Fase 3)
Pelabelan :
Contents : penandaan
genus, spesies, strain
Jml. minimum
bakteri hidup
Kondisi penyimpanan
Layanan informasi
konsumen
Fase 4: Post Marketing 2. Identifikasi strain
Fenotip: API50 CHL
Genotif : Seq. 16S rDNA
Genus, spesies, strain
ISOLAT
Lactobacillus sp koleksi
UNUDCC
1. Skrining karakteristik
probiotik Ketahanan pada kondisi
saluran pencernaan : pH
rendah, asam empedu, enzim
pencernaan
Produksi zat antimikrobial
Ketahan terhadap antibiotika
Modifikasi asam empedu
primer
Output:
Probiotic
foods
2006 – 2011 (1-4a) 2012 – 2017 (fase 1. 4b)
Strain disimpan di
International Culture Collection
Penelitian yg
disusulkan
Sudah dilakukan
Gambar 1. Peta jalan penelitian pengembangan probiotik
(disesuaikan dengan guide line pengembangan probiotic
foods FAO&WHO 2002)
- 12 -
BAB III. METODE PENELITIAN
Usulan Tahun 1. Pengembangan metode deteksi Lactobacillus sp F213
Untuk mengembangkan metode diagnostik Lactobacillus sp F213 ada beberapa target
gen yang akan dipergunakan (Gambar 2).
Gambar 2. Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan sistem deteksi
molekuler Lactobacillus sp F213.
Pada ilustrasi Gambar 2 terlihat bahwa kemungkinan target adalah berdasarkan
variasi susunan basa nukleotida seperti variable region 1-3 pada 16S rDNA pada
Lactobacillus sp F213. Namun dalam penelitian sebelumnya 16S rDNA dari
Lactobacillus sp F213 menunjukan 99.9% homology dengan strain lain sehingga
pendekatan yang akan dipergunakan adalah bagian intragenik spacer region (IGS),
molekul 23S rDNA, 5,8S rDNA dan bahkan bagian tertentu dari keseluruhan DNA
genom Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini akan dicoba beberapa kemungkinan
yaitu (1) sekuensing IGS serta (2) pita spesifik yang diperoleh dengan Random
Amplified DNA Polymorpism (RAPD).
Strain dan kondisi pembiakan strain bakteri
Strain yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah Lactobacillus sp F213 yang
- 13 -
merupakan strain potensial probiotik. Selain strain Lactobacillus sp F213 juga
dipergunakan strain lain yang merupakan koleksi UNUDCC.
Strain Lactobacillu spp. dibiakkan dalam MRS broth, dalam keadaan anaerob
(menggunakan anaerobic OXOID gas pouch) dan diinkubasi selama 24-48 jam pada
suhu 37oC.
Isolasi Genomic DNA dari Lactobacillus sp F213
DNA diisolasi dengan mepergunakan Kit Isolasi DNA (Promega) sesuai petunjuk dalam
kit. Sebanyak 2 uL suspesi DNA dielektroforesis pada 1,2% agarose dan
divisualisasikan pada UV transiluminator untuk mengkonfirmasi keberhasia proses
isolasai DNA. Selanjutnya DNA dilarutkan dengan TE-buffer dan disimpan pada suhu -
20oC sampai dilakukan analisis selanjutnya.
PCR dan Sequencing IGS
Typing Lactobacillus sp dilakukan dengan sekuensing intragenic spacer region (IGS),
bagian rDNA dengan susunan nukleotida yang sangat variatif pada seluruh prokaryota
menggunakan primer: FGPS1490F- TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT dan
FGPS132R- CCG GGT TTC CCC ATT CGG (Laguere et al., 2006) dan primer lain
sesuai dneagn kebutuhan. Reaksi campuran PCR dilakukan pada total volume 12,5 μl
yang mengandung: 10 mM masing-masing dNTPs, primer 27F dan 520R (25 pmol), 1X
PCR Buffer II, 75 mM MgCl2, 0.45 U AmpliTaq, 1 μl DNA. Reaksi amplifikasi
dilakukan sebagai berikut: satu kali siklus pada 94oC selama 5 menit, diikuti dengan 35
kali siklus pada 94oC selama 20 detik, 55oC selama 2 menit, dan 72oC selama 30 detik.
Tahap akhir ditambahkan dengan satu kali siklus pada suhu 72oC selama 5 menit.
Produk PCR selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan 1% agarosa dengan 1X
TAE bufer, dilakukan pewarnaan dengan EtBr (50 ng/ml), divisualisasikan pada UV
iluminator dan difoto.
Produk PCR dimurnikan dengan menggunakan PCR SUPRECTM PCR (Takara
Biomedicals, Otsu, Japan) dan selanjutnya disekuen dengan menggunakan Big Dye
Primer Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) dengan
- 14 -
menggunakan sekuensing automatis 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems).
Untuk studi homologi, sekuen dilakukan di NCBI/GenBank.
Untuk men-desing primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp F213
dengan target IGS dilakukan dengan melalukan multiple alligment dari sequence IGS
dari Lactobacillus sp F213 dengan IGS strain species yang sama yang dapat di ambil
dari GenBank (NCBI/DDBJ). Dari multiple alligment akan diketahui sekuen nucleotida
yang paling berbeda diantara sekuen IGS yang ada. Selanjutnya sekuen yang berbeda
ini dapat dijadikan probe/dapat juga di pakai sebagai primer spesifik (ilustrasi Gambar
4)
Gambar 3. Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS Lactobacillus sp F213 setelah
di align dengan IGS dari Lactobacillus lain (misal: IGS Lb-1, IGS Lb-2,
IGS Lb-3 dst).
RAPD dan sekuensing pita spesifik
Tahapan RAPD dilakukan mengacu pada prosedur Ivanova et al., (2008). Campuran
reaksi RAPD dilakukan pada total volume 12,5µl dengan komposisi 6,25µl Master Mix
Solution Intron Biotechnology, 1,25µl primer (Tabel 2), 1µl DNA dan 4µl air steril
sehingga total volume reaksi 12,5µl. Amplifikasi dilakukan pada mesin Infinigen
thermocycler, dengan kondisi satu siklus pada 940C selama 5 menit, diikuti dengan 40
siklus pada 940C selama 20 detik, 400C selama 2 menit dan 720C selama 30 detik, dan
tahap akhir yaitu elongasi tambahan pada 720C selama 5 menit. Setelah reaksi selesai
sampel dikeluarkan dari mesin dan diambil sebanyak 5µl untuk dielektroforesis.
Target probe/primer
- 15 -
Tabel 1. Primer yang dipergunakan untuk RAPD
Primer Susunan primer (5´-> 3´)
OP-1 CAg gCC CTT C
OP-2 TgC CgA gCT g
OP-3 AgT CAg CCA C
OP-4 AAT Cgg gCT g
OP-5 Agg ggT CTT g
OP-6 ggT CCC TgA C
OP-7 gAA ACg ggT g
M13F CgA CgT TgT AAA ACg ACg
gCC AgT
M13R CAg gAA ACA gCT ATg AC
Gambar 4. Ilustrasi design
primer/probe spesifik dari
genom LbF213
Dari hasil RAPD dengan mempergunakan primer pada Tabel 1, akan dihasilkan pita
yang paling berbeda (ukuran panjang pita) dengan strain yang lainya yang dipakai
sebagai pembanding. Pita yang paling berbeda ini menunjukkan sesuan basa basa
nukleotida yang paling khas yang ada pada genom Lactobacillus sp F213. Selanjutnya
di pita pada gel di potong, dimurbikan dan disekuen untuk mendapatkan susunan
nuklotidanya yang dapat dijadikan primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp
F213 (Gambar 3).
Optimasi Primer
Primer didesign memeprgunakan susuan nukleotida specifi dari Lactobacillus sp F213,
yang kemungkinan terletak pada sesuan nukleotida IGS atau pita RAPD. Primer di-
design memeprgunakan software Primer express.
Optimasi dan spesifisitas primer dilakukan sesuai kondisi penelitian/percobaan yang
tergantung dari jenis reagent PCR yang dipakai. Dengan demikian optimasi spesificitas
PCR dilakukan dengan mengatur konsentrasi suhu annealing (pelekatan/hibridisasi)
DNA LbF213
PCR
Pita spesifik
Sekuens
Primer/probe
spesifik
- 16 -
primer dengan target sekeun pada DNA yang di-amplifikasi, serta dengan mengatur
stringency reaksi polimerasi dengan mangatur konsentrasi ion MgCl2 pada campuran
reaksi PCR (Innis et al., 1990).
Setelah didapatkan kondisi spesifik untuk Lactobacillus sp F213 maka selanjutnya
dilakukan PCR dengan mempergunakan DNA yang diisolasi dari feces yang sengaja
ditambahkan dengan Lactobacillus sp F213. Isolasi DNA feces dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi/populsi Lactobacillus sp F213 minimal di mana DNA
Lactobacillus sp F213 dapat di-recovery dengan protokol isolasi DNA yang
dipergunakan. Dengan demikian akan diketahui kosntrasi sel Lactobacillus sp F213 yang
ada pada feces yang mungkin dapat di deteksi deangan primer spesifik ini. Disamping itu
dilakukan pula optimasi dengan mempergunakan RT-PCR dengan pewarna cyber green
untuk mengetahui hubungan antara intenstitas flourisensi dengan kosnntrasi DNA/sel.
Dari langkah ini akan diketahui jumlah sel yang ada pada sampel berdasarkan tingkat
intensitas flouresensi dari cyber green.
Analisis data
Data dianalisis secara deskriptif berdasarkan ada tidaknya produk PCR yang dihasilkan
yang terlihat dari foto gel elektroforesis.
- 17 -
IV. HASIL YANG DICAPAI
Penyegaran strain Lactobacillus sp F213
Lactobacillus sp F213 disegarkan dari stok beku (-50oC). Strain di segarkan dalam
MRS broth dan diinkubasi dalam keadaaan anaerob selama 24 jam pada suhu 37oC.
Setelah tumbuah, strain di streak pada MRS agar dan koloni yang tumbuah (Gambar
4A) diisolasi secara tunggal (single colony isolation) untuk menjamin kemurnian
strain yang dipergunakan dalam penelitian ini. Konfirmasi strain dilakukan dengan
mengamati pembutukan gas pada MRS broth serta pengecatan Gram (Gambar 4B).
Gambar 4A. Morfologi koloni
Lactobacillus sp F213 pada media
MRS agar
Gambar 4B. Morfologi mikroskopik
Lactobacillus sp F213 pada media MRS
both
Isolasi Genomic DNA
Genomik DNA diisolasi dari 2,5 ml kultur Lactobacillus sp F213 (strain no 1 dan no
6). Dengan metode isolasi sekala kecil ini, diperoleh DNA yang masih mengandung
RNA, walaupun pita DNA genomik pada gel tidak tampak dengan jelas (Gambar 5),
tetapi hasil analisis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA Lactobacillus sp F213 (2)
dan Lactobacillus sp F213 (6) yang berhasil diperoleh sebanyak masing-masing 37,5
ng/ul dan 26,5 ng/ul.
- 18 -
Gambar 5. Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 (no 1 adalah
Lactobacillus sp F213 strain no 2); no 2 adalah Lactobacillus sp F213 strain
no 6. M : DNA ladder (100 bp). Pita DNA genom (ditunjukkan dengan tanda
panah, tidak begitu jelas pada foto gel), sementara RNA tampak seperti smear
pada bagian bawah gel.
Amplifikasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213
Primer yang dipergunakan dalam amflifikasi IGS Lactobacillus sp F213 dapat dilihat
pada Tabel 2.
1 2 M
RNA
DNA
- 19 -
Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS Lactobacillus sp F213.
Name Seq 5’->3’ Referensi
FGPS1490F TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT Laguere et al., 2006
FGPS132R CCG GGT TTC CCC ATT CGG
L1F GAA GTC GTAACA AGG Jensen et al., 1993
Lt1-R CAA GGC ATCCAC CGT
Nour 514F TGG ATC ACC TCC TTT CTA Nour, 1998(*)
Nour 601R GTG CGC CCT TTA TTA ACT T
(*) belum dilakukan karena primer sedang disintesis oleh suplier
Hasil PCR dengan primer FGPS1490F/FGPS132R terlihat bahwa
Lactobacillus sp. F213, Lactobacillus rhamnosus dan Pediococcus spp.,
menunjukkan pita ganda, sementara hanya non bakteri asam laktat (Isolat B3)
menunjukkan pita tunggal (Gambar 6A). Lactobacillus sp. F213 menghasilkan pita
dnegan ukuran 500bp dan 400 bp; Lactobacillus rhamnosumenghasilkan pita 500 bp
dan 350; Pediococcus spp. Menhasikan pita dengan ukuran 400 bp dan 350bp,
semantar non bakteri asam laktat (Isolat B3) menghasilkan pita tunggal dnegan
estimasi ukuran 700 bp.
Laguere et al 2003) juga menemukan pita ganda dan tunggal pada beberapa
species bakteri Rhyzobium yang diteliti. Dalam peleitian ini dilakukan konfirmasi
kembali khususnya optimasi suhu annealing guna menghindari terjadinya miss-
priming pada primer FGPS1490F/FGPS132R.
Peningkatan suhu annealing primer, denagn gradient 1oC, dari suhu tengah
55oC dari suhu 48oC sampai 62oC, denan 12 jenis suhu annealing dimuali dari: 48;
48,7; 49,8;51,1; 52,6;54,2;55,8; 57,5; 58,9; 60,2; 61,3; dan 62oC. Dari 12 jenis suhu
annealing ini dilakukan PCR Lactobacillsus sp F213 dilakukan pada suhu 55,8
sampai 62oC. Hasil gradient PCR menggunakan primer ini menujukkan bahwa
amplifikasi dengan primer FGPS1490F/FGPS132R semakin berkurang apabila suhu
annealing lebih dari 55oC (Gambar 6B). Hal ini menunjukkan bahwa suhu anneling
optimum primer FGPS1490F/FGPS132R adalah 55oC sesuai yang dilaporkan oleh
- 20 -
FGPS1490F/FGPS132R dimana produk IGS dari Lactobacillus sp F213 selalu
ditemukan dua pita. Hasil ini menujukkan bahwa dengan primer ini selalu diperoleh 2
pita IGS dari Lactobacillus sp F213.
Gambar 6 A. Hasil PCR IGS Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sp F213, Pedioccocus
spp, dan non LAB (isolat B3). M; 100 bp DNA ladder.
Gambar 6B. Optimasi PCR dengan termal gradient.
Keterangan gambar 6A : M: 100 bp DNA ladder. No.1 sampai 9: L rhamnosus; 10 :
F213 lama (DNA rusak); 11: Lactobacillus sp F213 (2); : Lactobacillus sp F213 (6);
13 dan 14; Pediocuccus sp; 15: Isolat B3 (non BAL).
Keterangan gambar 6B:M: 100 bp DNA ladder. No 1,2 3 4 5,6 adalah suhu
annelaing primer FGPS1490F/FGPS132R untuk amplifikasi DNA Lactobaciilus sp
F213 masing-masing 55,8oC; 57,4oC; 58,9oC; 60,2oC; 61,3oC; 62oC.
500 bp
500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
400 bp
M 1 2 3 4 5 6
500 bp
A
B
- 21 -
Konfirmaasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213
Untuk meyakinkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunayi 2 buah IGS yang
berbeda, dilakukan PCR dengan mempergunakan primer yang lain. Amplifikasi IGS
Lactobacillus sp F213 dengan primer L1-F (GAA GTC GTAACA AGG) / Lt1-R
(CAA GGC ATCCAC CGT) juga menghasilkan produk IGS dua pita dengan panjang
pita sekitar 500 bp dan 400 bp sementara L rahmnosus SKG34 dengan panjang pita
sekitar 500 bp dan 350 bp, serta Pediococcus sp dengan pajang pita IGS sekitar 400
bp dan 350 bp (Gambar 7). Hal ini menjukkan kembali bahwa IGS Lactobacillus sp
F213 terdiri dari dua buah pita. Hal ini memperkuat dugaan bahwa Lactobacillsus sp
F213, L rhamnosus SKG34, dan Pediococcus spp mempunyai 2 helai IGS dengan
panjang yang berbeda.
Gambar 7. Panjang IGS Lactobacillus sp F213, L. rhamnosus SKG34 dan
Pediococcus spp.
Adanya pita IGS ganda dengan ukuran panjang yang akan berbeda
menyebabkan kesulitan dalam direct sequencing, sehingga harus dicarikan alternatif
lain seperti subcloning masing-masing pita. Tetapi, kemungkinan pita IGS dapat
dimurnikan sehingga menjadi pita tungga yang dapat di PCR dan dilakukan Direct
Sequening PCR. Dalam penelitian ini dilakuakn amplifikasi dan direct sequencing
pita tunggal, sehingga yang dilakukan adalah dengan me-motong gel mengandung
500 bp
M 1 2 3 4 5
- 22 -
IGS selanjutnya DNA pada gel di murnikan atau di-elusi agar keluar dari gel. Dalam
penelitian ini dicoba dengan meng-elusi DNA dengan memberikan daya magnet di
mana DNA yang bermuatan positif di tarik dengan magnet kutub positif (Gambar 8)
Elusi dilakukan dengan merendam gel dalam 25 ul buffer TE dan diberikan magnet
pada satu sisinya. Elusi dilakukan pada suhu 5oC selama 12 jam dan selanjutnya
DNA yang dilepaskan di PCR dneagn memeprgunakan primer yang sama dengan
primer yang dipergunakan pada saat PCR (L1-F / Lt1-R (Gambar 9)
Hasil PCR dari DNA yang telah dielusi dari gel menujukkan hasil apda
Gambar 9. Hal yang belum diketahui terjadi ternyata setelah re-PCR justru
menghasilkan pita tunggal dengan ukuran yang lebih pendek (sekitar 350 bp). Belum
diketahui secara pasti eknapa hal ini terjadi dan akan dilakukan sequencing guna
memanstikan IGS dari Lactobacillus sp F213 dan IGS L rhamnosus SKG34.
Gambar 8. Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik.
Gambar 9. IGS dari Lactobacillus sp F213 (A), L rhamnosus (B) dan hasil PCR pita
tunggal dari LbF213(C dan D) dan L rhamnosus (E dan F). Terlihat PCR pita dengan
panjang 500 bp pada A dan B menghasilkan produk PCR dengan ukuran 300 bp (C
dan E).
M A B C D E F
500 bp
300 bp
(-) DNA
- 23 -
V. RENCANA TAHAP BERIKUTNYA
Untuk tahap berikutnya adalah :
1. Sekuensing IGS pada pita tunggal yang telah berhasil diperoleh dari
amplifikasi produk PCR
2. Komparasi dengan sekuen yang ada di data base (GenBank) sehingga dapat
dikembangkan primer atau probe spesifik
3. Dalam upaya pengembangan sistem deteksi Lactobacillus sp F213 ini juga
akan dilakukan amplfikasi random polymorphic DNA (RAPD) sehingga dari
pita spesifik dapat juga dikembangkan primer atau probe specifik
4. Optimasi primer/probe spesifik untuk mendeteksi Lactobacillus sp F213.
- 24 -
VI. SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan sementara dari hasil yang diperoleh pada tahao ini adalah :
1. Lactobacillus sp F213 merupakan strain probiotik yang unik yang mempunyai
2 buah Interagentic spacer regions (IGS) dneagn ukuran yang berbeda
dnegan L rhamnosus dan Pediococcus spp.
2. Intragenik spacer regions ini potensial dipakai untuk mengemabngakn
metode deteksi spesific.
Saran
Perlu dilakukan optimasi primer/probe spesifik dengan mempergunakan strain
dari species yang sama dengan Lactobacillus sp F213 dengan menggunakan
model feses manusia.
- 25 -
DAFTAR PUSTAKA
Agerbaek, M. Gerdes, L.U., Richeslsen, B. 1995. Hyphoschelesterolemic effect of a new
fermented milk product in healthy middle-aged men. Eur.J. Clin, Nutr., 49: 346-352.
Anonimous. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including
powder milk with live lactic acid bacteria, Food and Agriculture Organization for the
United Nations (FAO) and World Health Organization (WHO).
Anonimus. 2006. Pedoman teknis penemuan dan tatalaksana penyakit hipertensi.
Direcktoral Pegendalian Tidak Menular, Direktoral Jenderal PP dan PL, Departemen
Kesehatan Republik Indonesia.
Aryantini, P.D. 2008. Isolasi dan karakterisasi bifidobacterium dari feces bayi. PS Ilmu
Kesehatan Mayarakat. Univiersitas Udayana, Denpasar.Skripsi.
Artatai, LPSA. 2009. Karakteristik Probiotik dari Lactobacillus sp F212 dan F213 serta
kemampuan kompetisi pelekatannya dengan Eschericia coli O157 pada enterosit
Mencit. Skrip PS Farmasi, FMIPA Unud.
Begley, M., Hill, C., Gahan, C.G.M. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl.
Environ. Microbiol. 72: 1729-1738.
Bertolami, M.C., Faludi, A.A., Batlouni, M. 1999. Evaluation of the effect of a new
fermented milk product (Gaico) on rimary hypercholesterolemia. Eur.J. Clin, Nutr.,
53: 97-101.
Debruyne, P.R., Bruyneel, E.A., Li, X., Zimber, A., Gespach, C., Mareel., M.M. 2001.
The role of bile acids in carcigonesis. Mutation Res. 359-369.
De Smet, I., van Hoorde, I., De Saeyer, M., Vande, W.M., Verstraete, W. 1994. In vitro
study of bile salt hydrolase (bsh) activity of bsh isogenic Lactobacillus plantarum 80
strains and estimation of cholesterol lowering through enhanced BSH activity.
Microbiol. Ecol. Haelth Dis., 7:315-329.
De Smet, I., De Boever, P., and Versetraete, W. 1998. Cholesterol lowering in pigs
through enhanced bacterial bile salt hydrolase activity. Br. J. Nutr. 79:185-194.
De Rose, Nicole M and Martijin B. Katan. 2000. Effect of probiotic bacteria on diarrhea,
lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988
and 1998. Am J. Clin. Nutr. 71: 405-411.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2007. Isolasi dan karakterisasi bakteri
asam laktat dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn MAsyarakat Universitas
Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2008. Identifikasi bakteri asam laktat
dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn Masyarakat Universitas Udayana.
Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Gilliand, S.E., Nelso, C.R. and Maxwell, C. 1985. Assimilataion of cholesterol by
Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 49: 377-381.
Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. 1990. PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications. Academic Press. San Diego, New York.
- 26 -
Jasper, D.A., Massey,, L.K., and Luedecke, L.O. 1984. Effect of consuming yoghurt
prepared with three culture strains on human serum lipoproteins. J. Food Sci.,
49:1178-1181.
Jensen, M.A., Webstr, J.A., Straus, N. 1993. Rapid Identification of Bacteria on the Basisi
of Polymeras eChain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spaser Polymorphisms.
Appl. Environ. Microbiol. 59: 945-952.
Klaenhammer, T.R. and Kullen, M.J. 1999. Selection and design of probiotics. Int. J.
Food Microbiol. 50: 45-57.
Klaver, F.A.M. and van der Meer, R. 1993. The assume assiliation cholesterol by
lactobacilli dan Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugation
activity. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1120-1124.
Kurdi, P., Tanaka, H., van Veen, H., Asano, K., Tomita, F., Yokota, A 2003. Cholic acid
accumulation and its deminuation by short chain fatty acids in bifidobacteia.
Microbiology 149:2031-2037.
Kurdi, P., Van Veen, H, Tanaka, H., Mierau, I, Konings, W.N., Tannock, G.W., Tomita,
F., Yokota, A. 2000. Cholic acid is accumulated spontaneously, driven by membrane
▲pH, in many lactobacilli. J. Bact. 182:6525-6528.
Larson, L.A., Raben, A., Haulrik, N., Hansen, A.S., Manders, M., Astrop, A. 2000. Effetct
of 8 weeks intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular
diseases. Eur.J. Clin, Nutr., 54: 288-297.
Liong, M.T. and Saha, N.P. 2005. Bile slat deconjugation ability, bile salt hydrolase
activity and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains. Int. Dairy J.,
15:391-398.
Lovegrove, J. and Jackson, K. 2003. Coronary heart diseases. In: Mattila-Sandholm, T.
and Saarela, M. (Ed), Functional Dairy Products. Woodhead Pub.Limited,
Sambridge, Englan. Pp: 54-87.
Mattilla-Shandholm, T., Blum, S., Collins, J.K., Crittenden, R., de Vos, W., Dunne, C.,
Fonden, R., Grenov, G., Isolaury, E., Kiely, B., Marteau, P., Morelli, L., Ouwehand,
A., Reniero, R., Saarela, M., Salminen, S., Shanahan, F., Vaughan, E., von Wright,
A. 1999. Probiotics: towards demosntrating efficacy. Trend Food. Sci. Technol.,
10:393-399.
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2006. Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai
Galur Probiotik Untuk Bayi Alergi Susu Formula. Fakultas Teknologi Pertanian
Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan
Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2008. Identifikasi Lactobacilus sp. F16 dan
Lactobacillus sp. BY85 dan kemampuan adhesinya pada epitel saluran pencernaan
mencit. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Laporan Penelitian
Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.
Nocianitri, K.A., Aoyama, Y. 2001. Different response to choline deficiency of the serum
ornithine carbamoyltransferase activity in four strains of rats. J. Biosci. Biophysics
Biochem. 65: 935-938.
Nocianitri, K.A. Sakata, S., Kanno, T., Kikuchi, H., Kurasaki, M., Aoyama, Y. 2002.
Influence of dietary methionine level on the liver metallothionein mRNA level in
rats. J. Biosci. Biophysics Biochem. 66:2465-2470.
- 27 -
Nour, M. 1998. 16S-23S-5S intragenic spacer regions of Lactobacilli: nucleotide sequence,
secondary structure and comparative analysis. Res. Microbiol., 149: 433-448. Nursini, W., NP. Desy Aryantini, K.A. Nocianitri, Y. Ramona, W. Redi Aryanta and I N
Sujaya. Colonization of Lactobacillus sp. F2 in the Intestinal Tract and its Functional Effect to Reduce Blood Cholesterol Content of Rats (Rattus Norvegicus). The 2nd International Conference on Bioscience and Biotechnology, Udayana University, Bali, Indonesai, 23-24 Sept. 2010.
Ramirez, M.I., Karaoglu, D., Haro, D., Barrilas, C., Bashirzadeh, Gil, G. 1994.
Cholesterol and bile acid regulate cholesterol 7a-hydroxylase expression at the
ranscriptional level in culture and in transgenic mice. Mol. Cell. Biolog. 14: 2809-
2821.
Rayuda, M.A. 2006. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari berbagai sumber
alami. Jur. Biologi, FMIPA, Universiats Udayana. Denpasar. Skripsi.
Sanders, M.E. 1998. Overview of functional foods: emphasis on probiotic bacteria. Int.
Dairy J. 8: 341-349
Schaafsma, G., Meuling, W.J.A., van Dokkum, W., Bouley, C. 1998. Effect of a milk
product , fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructo-oligosaccharides
added, on blood lipid in male volunteers. Eur.J. Clin, Nutr., 52: 436-440.
Sugita, I.M., Wijaya, N.K., Sujaya, I N. 2007. Rekayasa Starter dan Pembuatan Tablet
Kunyah DAKULI , Untuk Menekan Pertumbuhan Kanker Dan Penurun
Kolesterol Darah.Ditjen Dikti, Penelitian Hibah Bersaing.
Sujaya, I N, Ramona, Y. , Widarini, NP., Suariani, NP, Dwipayanti, N.M.U, Nocianitri ,
K.A., Nursini, N.W. 2008a. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu
Kuda Sumbawa. J. Vet. 9:33-40.
Sujaya, I.N., Dwipayanti, N.M.U., Suariani, N.L.P., Widarini, N.P., Nocianitri, K.A.,
Nursini, N.W., 2008b. Uji in vitro ketahanan Lactobacillus spp. isolat susu kuda
Sumbawa pada model saluran pencernaan. J. Vet. 9:52-59.
Sujaya, I N. Amachi, S. Yokota, A. Asano, K. and Tomita, F. 2001. Identification and
characterization of lactic acid bacteria in ragi tape. W. J. .Microbiol. Biotechnol., 17:
349-357.
Sujaya, I N., D.M. Sukrama, K.J.P. Pinatih. 2006. Efek bifidogenik pisang secara in vitro
dalam usaha pengembangan probiotic bifidobacterium. Laporan hasil penelitian
Riset Pembinaan Ilmu dan Teknologi Kedokteran (RISBIN IPTEKDOK-2006)
(unpublished)
Sujaya, I N. 2010. Development of Probiotic for Diarrheagenic Pathogens. International
Symposium on Bioscinece and Biotechnology, Udayana University, 14-17 Sepet.
2010
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2012.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by
Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal
microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2013.
Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by
Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal
microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).
- 28 -
Tannock, G. 1999. Introduction. In: Tannock, G.W. (Ed).Probiotics: A Critical Review.
Horizon Scientific Press. Norfolkm UK. Pp:1-4.
Torano, M.P., Medici, M., Perdigon, G., Ruiz Holgado, A.P., Valdae, G.F. 1998.
Efidennce of hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in
hypercholesterolemic mice. J. Dairy Sci., 81:2336-2340.
Yustiantara, PS. 2009. Aspek Keamanan dari Lactobacillus sp F213 dalam
penegmabngannya sebagai probiotik endogen Indonesia. Skripsi PS Farmasi,
FMIPA Unud.
- 29 -
Lampiran: UNDNAGNA SEBAGAI PEMBICARA the 5th IC-ISLAB
Hasil penelitian ini akan dipresentasi dalam The 5th International Conference of Indonesian
Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Guest Speaker Invitation for The 5th International Conference of Indonesian Society for
Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Islab Islab
Dear Dr. I Nengah Sujaya,
Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (ISLAB) would like to organize its 5th International
Conference at Faculty of Agricultural Technology, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,
Indonesia in November 13-14, 2015, and now being proposed to be Scopus indexed.
During this conference we would like to invite you as a guest speaker in this conference.
However since we are limited in budget, we are truly sorry that we couldn't afford your airfare
from your country to Indonesia, but we will provide your local transportation and accommodation
during your stay in Yogyakarta.
We also would like to ask your permission to put your name as our guest speaker in the
conference's publication.
We are looking forward to your positive respond.
Thank you and I look forward to hearing from you.
CC: Prof. Dr. Endang S. Rahayu (Chairperson of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria)
With kind Regards,
Linda Windiarti
Organizing Committee
The 5th International Conference of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)
Faculty of Agricultural Technology, Gadjah Mada University,
Bulaksumur, Yogyakarta, 55281. Indonesia
Phone/Fax : +62-274-549650,
http://islab.tp.ugm.ac.id
Email: [email protected]