Uji Toksisitas menggunakan Mikroorganisme

Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

Pendahuluan ►Akibat revolusi industri, penggunaan bahan

kimia baik sintetik maupun bahan alam di lingkungan industri semakin tinggi, sehingga masalah ekologi dan toksikologi menjadi muncul dan semakin bermasalah.

► Penyebab utama adalah polutan industri (industrial effluents) misalnya: herbisida, insektisida, fertilizer (pupuk), polusi kendaraan (asap knalpot), asap pabrik (hasil pembakaran, dsb)

►Toksisitas umumnya diuji untuk Bahan Baku Obat, Eksipien, Pengawet, dan Bahan Kimia lain.

►Toksisitas dapat terjadi terhadap : Host (manusia, hewan), atau mikroorganisme (parasit dan non-parasit)

Skrining toksisitas

► Uji “efek terhadap kesehatan” secara in-vitro

► Uji “efek terhadap ekologi atau lingkungan” secara in-vitro

Uji “efek terhadap kesehatan” secara in-vitro

►Uji ini berdasarkan penggunaan komponen sub-selular (mis.enzim, DNA, RNA), atau sel-sel yang diisolasi (kultur sel, sel darah merah,dll), atau potongan jaringan , atau seluruh organ yang diisolasi.

►Uji-uji ini terdiri atas : Penetapan viabilitas sel : uji inklusi pewarna

utama, efisiensi plating, pembentukan koloni Reproduksi sel Biosintesis makromolekul

Uji “efek terhadap ekologi/lingkungan” secara in-vitro

►Uji ini dilakukan untuk mengukur terutama toksisitas akut bahan-bahan kimia terhadap organisme air.

►Organisme air mewakili berbagai tingkat rantai makanan tropis. Uji ini membantu memperkirakan toksisitas kimia di alam dan di dalam ekosistem yang telah diubah oleh manusia.

►Bakteri, Algae, zooplankton, invertebrate, dan ikan, digunakan di dalam uji2 ini.

Uji menggunakan bakteri dan enzim

► Bakteri dan enzim sering digunakan untuk uji berbagai senyawa toksik, organik dan in-organik yang terdapat di air alam, tanah, dan proses-proses pengolahan limbah.

► Nasib senyawa uji (toksikan) dapat terjadi 2 hal : dimetabolisme menjadi metabolit yang non-toksik, atau melakukan aktivitas toksik terhadap suatu populasi mikroba.

► Konsentrasi /kadar sangat berpengaruh terhadap besarnya aksi atau kerja toksikan, misalnya Fenol pada konsentrasi rendah dapat dimetabolisme oleh bakteri, tetapi pada konsentrasi tinggi bersifat toksik.

Efek toksikan terhadap mikroorganisme

► Toksikan dapat menyebabkan kerusakan materi genetik atau dapat menyebabkan denaturasi protein (mis. halogen)

► Merusak membran sel bakteri (mis.senyawa fenol atau ammonium kuartener) sehingga dapat menyebabkan kerusakan pada DNA, RNA , protein dan bahan organik lain

► Mengganti kation-kation (mis.Na+ atau Ca+) dari tempat adsorpsinya pada sel bakteri (mis.asam dan basa)

► Menghambat kemoreseptor bakteri, sehingga terjadi inhibisi dekomposisi organik dan proses pemurnian-sendiri (self-purification) pada pabrik pengolahan limbah dan pada air-air yang terkena bahan2 fekal

Faktor penting dalam aktivitas toksisitas terhadap bakteri

► Aktivitas enzim► Faktor fisiko-kimia (ada tidaknya kation

lain, pH, potensial redoks, suhu, senyawa organik, mineral tanah, dll)

Efek terhadap bakteri dapat diukur melalui uji biokimia

► Mengukur aktivitas enzim► Kandungan ATP► Bioluminesens

Beberapa indikator biokimia (mis. ATP, LPS, asam muramat) digunakan untuk penentuan biomasa mikroba di dalam sampel dari alam.

UJI BIOKIMIA► Enzim memegang peran penting dalam reaksi2

metabolisme di dalam sel mikroba, tanaman dan hewan, sehingga inhibisi terhadap enzim dapat menyebabkan kerusakan pada sel.

► Efek toksik polutan atau toksikan yang menggangu aktivitas enzim kebanyakan terhadap enzim dehidrogenase.

► Enzim dehidrogenase mengkatalisis oksidasi substrat dengan cara transfer elektron melalui sistem transpor elektron (ETS) yaitu : suatu rantai kompleks intermediate (flavoprotein, sitokrom, dll) yang men transport elektron dari sumber nutrisi ke oksigen (sebagai akseptor elektron)

►Bahan pewarna (dyes) yang spesifik dapat digunakan sebagai indikator aktivitas ETS. Dyes bekerja sebagai akseptor hidrogen palsu dan akan berubah warna setelah terjadi reduksi. Jadi aktivitasnya dapat dengan mudah diukur secara spektrofotometri. Pewarna yang banyak digunakan misalnya metilen biru, TTC (Trifenil Tetrazolium Chlorida), tetrazolium biru, dll.

►Uji Toksisitas berdasarkan pada reduksi pewarna ini misalnya pada percobaan pengukuran aktivitas enzim (ATP ase, urease, esterase, dll)

ATP Assays►ATP adalah produk reaksi katabolisme,

paling umum pada seluruh protista, sel hewan, dan sel tanaman

►ATP mudah rusak setelah sel mati, oleh karena itu hal ini merupakan salah satu cara yang tepat untuk membedakan sel hidup dan sel yang mati

►Metode : mengukur radiasi yang dipancarkan setelah mereaksikan senyawa luciferin dengan ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh luciferase dan Mg 2+

ATP assayLuciferin + Luciferace + ATP

Luciferin-Luciferace-AMP + PP + O2

Oxyluciferin-Luciferase-AMP + H2O

Oxyluciferin + Luciferase + AMP + hµ (560nm)

UJI MENGGUNAKAN BAKTERI► Bakteri terlibat terutama dalam mineralisasi substrat

organik dan di dalam re-siklisasi nutrisi mineral. ► Aktivitasnya penting untuk proses self-purification di

lingkungan air. Siklus hidupnya pendek dan cepat bereaksi terhadap perubahan di dalam lingkungan.

► Bakteri cukup stabil dan mudah dipelihara serta murah biayanya.

► Bakteri sangat sesuai digunakan untuk menapis toksikan yang ada di lingkungan air.

► Tiga kategori utama assay menggunakan bakteri : berdasarkan luminesensi, viabilitas atau pertumbuhan bakteri spesifik, dan assay efek ekologi.

Assay berdasarkan luminesensi bakteri

Bakteri yang dapat berluminesensi kebanyakan adalah bakteri laut antara lain : Photobacterium (vibrio) fisheri, P.Phosphoreum, dan Beneckea harveyiDari segi biokimia, sistem bioluminesensi

dianggap sebagai bagian dari sistem transport elektron dimana enzim luciferase mengkatalisis oksidasi FMNH (flavin mononukleotida tereduksi) dan suatu aldehid dihasilkan dari produksi FMN, asam dan cahaya.

FMNH2 + O2 + RCHO FMN + H2O + RCOOH + cahaya

Microtox®assay : berdasarkan pada pengukuran bioluminesen bakteri

Assay berdasarkan pengukuran inhibisi pertumbuhan, respirasi dan

viabilitas sel bakteri► Beberapa mikroorganisme pada daerah pembuangan

(sewage) adalah dari genus Pseudomonas, Klebsiella, Aeromonas, atau Citrobacter.

► Salah satu mikroba yang khusus yaitu Nitrobacter yang memiliki kemampuan nitrifikasi pada proses pengolahan limbah pabrik. Mikroba ini digunakan untuk mengukur toksisitas logam berat dan limbah industri. Hilangnya nitrit atau pembentukan nitrat merupakan indikator dalam assay tersebut. Konsentrasi toksikan (ED50) yang menyebabkan 50% inhibisi konversi nitrit menjadi nitrat dapat ditentukan melalui kurva antara laju metabolik relatif Nitrobacterterhadap konsentrasi toksikan.

Bioassay lain

►Uji menggunakan Spirillum volutans berdasarkan hilangnya koordinasi dan mobilitas mikroba tsb dengan adanya toksikan.

►Cara respirometri : berdasarkan kemampuan pengambilan oksigen (oxygen uptake rate)

Uji efek ekologi

►Uji ini memberikan informasi terhadap efek merugikan toksikan pada alam dan ekosistem buatan manusia.

►Uji mencakup : evaluasi efek polutan terhadap siklus nutrisi, dekomposisi bahan organik, transformasi nitrogen (amonifikasi, nitrifikasi) dan reduksi sulfat.

Uji Menggunakan Algae

►Algae digunakan untuk uji tosikan pada lingkungan air.

►Algae lebih mudah ditangani dibandingkan ikan atau invertebrata

►Uji dilakukan terhadap suatu parameter , misalnya : Jumlah sel, fluoresensi in-vivo, asimilasi C14, aktivitas nitrogenase, muatan energi adenilat

Uji Menggunakan Fungi Dan Ragi

► Fungi dan ragi memegang peranan penting dalam dekomposisi bahan organik di dalam tanah dan lingkungan air, juga di dalam proses industri.

►Uji menggunakan fungi atau ragi berdasarkan pada : pengukuran laju pertumbuhan radial pada media padat, inhibisi pertumbuhan dalam media cair, uji germinasi spora, metode difusi agar, respirometri, aktivitas ETS , pengukuran pelepasan K+ setelah terpapar oleh toksikan, dll.