UJI TOKSISITASParacelcus

The dose makes the poisonGaram meja • Diperlukan oleh tubuh →

sedikit• Banyak→sakit

Mekanisme dalam menurunkan efek toksik

Degradasi Metabolik dan EkskresiMekanisme perbaikan kerusakan

Degradasi metabolik dan ekskresi

Sistem Ensimatik:Ensim menurunkan efek toksikMamalia: terletak di hati

Ekskresi:Eliminasi dari tubuh melalui proses ekskresi

Molekul volatil: CO2, HCN dan keton ekskresi melalui sistem pernafasan

Garam dan senyawa lain berlebih keringatSenyawa/bahan terlarut fungsi ginjal urin

Akumulasi senyawa toksik: Kerusakan sistem vital: ginjal, lambung, usus

Mekanisme perbaikan

Perbaikan kerusakan pada individual sel sampai DNA atau protein pada tingkat molekular, jaringan dan organ.

Jika suatu sel terpapar secara teratur oleh senyawa toksik mekanisme perbaikan.

Kulit, lapisan epitel saluran pencernaan, pembuluh darah, paru2: laju reproduksi selular tinggi utk mengganti sel rusak pertumbuhan tdk terkendali

kanker/tumor

Pendahuluan

Uji toksisitas dapat dilakukan dengan 2 cara :a) Kualitatif

Biasanya dilakukan atas dasar gejala penyakit yang timbulAkibat tidak spesifiknya gejala/penyakit akibat keracunan (tidak ada/belum didapat gejala yang khas / “pathognomonik” bagi setiap keracunan

b) Kuantitatif

Uji toksisitas

2 Cara2 Cara

KuantitatifKuantitatif

KualitatifKualitatif • Berdasar atas gejala yang timbul

• Respon tubuh terhadap racun tidak spesifik karena belum ada yang khas (Pathognomonik)

• Berdasar atas gejala yang timbul

• Respon tubuh terhadap racun tidak spesifik karena belum ada yang khas (Pathognomonik)

• Uji toksisitas terhadap hewan uji

• Penelitian epidemiologi

• Uji toksisitas terhadap hewan uji

• Penelitian epidemiologi

Uji KualitatifGejala Keracunan & Penyebabnya

Gejala Penyebab

Fibrosis SiO2, Fe, Asbest, CO, Co, dllGranuloma Be, Bakteri, Fungi,dllDemam Mn, Zn, Co, Pb, dllAlergi Ni, TDI, Cr, berbagai zat organik, dll Asfiksia CO, H2S, CO2, SO2, NH3, CH4

Mutagenesis Radiasi pengion, benzene, metil HgKarsinogenesis Aminodifenil, Asbest, benzidine, vinilklorodaTeratogenesis As, F, metil Hg, TEL, benzeneKeracunan sistemik* Pb, Cd, Hg, F, Va, P, Bo, Ti, TEL*) keracunan sistemik, dengan racun yang sengaja dibuat untuk meningkatkan ekonomi,

disebut racun ekonomi (pestisida)

Granuloma (Be)Fibrosis

Afiksia

Senyawa karsinogenik dalam kopi

• Acetaldehyde• Benzaldehyde• Benzene• Benzofuran• Benzo[a]pyrene• Caffeic acid• Catechol• 1,2,5,6 Dibenzanthracene• Ethanol

• Ethylbenzene• Formaldehyde• Furan• Furfural• Hydrogen peroxide• Hydroquinone• Limonine• Styrene• Toluene• Xylene

Toksik: 100 cangkir kopi LD kafein

Teratogenesis

Hewan Manusia

Mutagenesis Analisis Kuantitatif

Sebelum melakukan uji kuantitatif :

Kenali sifat kimia-fisika xenobiotik

Untuk menentukan :

• Portal entri dalam uji toksisitas• Hewan uji yang akan digunakan

Untuk menentukan :

• Portal entri dalam uji toksisitas• Hewan uji yang akan digunakan

Penting !!!

Dapat berupa :• Uji toksisitas di laboratorium terhadap hewan uji• Penelitian epidemiologi

Tujuan :• Mencari dosis yang aman bagi manusia • Mencari kriteria untuk standarisasi kualitas lingkungan• Melakukan pencegahan dan/atau pengobatan dengan

lebih baik lagi

Analisis Kuantitatif

Istilah untuk menyatakan toksisitas suatu zat :Dosis Letal (LD)• Jumlah zat yang betul – betul masuk ke dalam tubuh organisme uji

yang menyebabkan respons berupa kematian organisme uji• Untuk mencari dosis aman

menggunakan LD50 (dosis yang mematikan 50% organisme uji)

Konsentrasi Letal (LC)• Konsentrasi zat yang berada di luar tubuh organisme yang

menyebabkan respons berupa kematian organisme uji• Mempermudah menentukan konsentrasi zat yang aman

yang boleh ada di lingkungan

Analisis Kuantitatif

Istilah toksisitas yang lain untuk menentukan dosis aman :

NOEL (no observed effect level)

NOAEL (no observed adverse effect level)

Analisis Kuantitatif

NOEL

NOAEL

9/16/2008 Dwina Roosmini 21

Dosis - Respons

Dose (mg/kg-day)

LOAELNOAELRfD

RfD: Reference Dose: Dosis dimana paparan harian tdk akan menimbulkan resiko merugikan selama hidup manusia

NOAEL: Non Observed Adverse Efect Level scr statistik tdk menimbulkan efek

merugikan

LOAEL: Lowest Observed Adverse Effect Level dosis terendah yg scr statistik menimbulkan efek

Analisis Kuantitatif

Tujuan :Memprediksi perginya racun apabila racun memasuki lingkungan tertentu

zat yang terakumulasi di dalam organisme tentunya akan terakumulasi pula di organisme dengan tingkat trofis yang lebih tinggi

Uji toksisitas dilakukan berurutan dengan

melihat tingkat trofis

organisme uji

Penting untuk mengenal rantai makanan :

Analisis KuantitatifGambar Rantai Makanan, Ukuran dan Tingkat Trofis

Uji ToksisitasTujuan :

Menilai efek akut, sub akut & kronis

Uji dilakukan berdasarkan waktuMerupakan kendala utama

3 (tiga) kelompok uji toksisitas :1) Uji Akut / Uji Tingkat I Uji jangka pendek

2) Uji Sub kronis / Uji Tingkat II

3) Uji Kronis / Uji Tingkat III

0

1-

2-

3-

4-

5-

6-

LD50, LC50, dermal dan iritasi mataUji mutagenisitas/karsinogen tk. 1Sensitivitas kulit

Uji 90 hari – tikus, mencit

Metabolisma/farmakokinetika pada hewan

Teratologi

Uji mutagenisitas/karsinogen tk. 2

Studi 90-180 hari pada anjing atau monyet

Reproduksi

Uji mutagenitas tk 3

Toksisitas kronis-tikus, mencit

Skema Uji Toksisitas Secara lengkap :

Uji Tingkat ITerdiri atas :• Uji dosis-respons untuk mencari LD/LC dan kemungkinan

kerusakan berbagai organ• Uji iritasi mata dan kulit• Screening pertama terhadap mutagenisitu (SAL, MOLY, ABS

dan SCE)

SAL = Ames Salmonella/microsome mutagenesis assayABS = Assay for chromosome abberationSCE = Sister chromated exchange inductionMOLY = Mouse lymphoma L5178Y cell mutagenesis assay

Uji Tingkat IUji Dosis – Respons untuk mencari LD/LC :

Dilakukan sesuai :• sifat fisis kimiawi xenobiotik, • pemilihan organisme (derajat rendah) yang paling relevan

berdasarkan portal entri

Lama pengujian : 24 – 96 jam

Tahapan : • Tahap I :

untuk perkiraan kasar letak rentang dosis LD/LC 50/100 yang dicari dengan cara Least Square atau Metode Probit

Uji LD 50 Uji LC50

Uji Tingkat I

Uji Iritasi Mata & Kulit :

Dikenal sebagai : Draize Test

Uji iritasi mata :zat yang akan diuji dimasukkan pada salah satu matanya, mata yang lain sebagai kontrol

• Jenis hewan uji : kelinci albino

• Waktu pemantauan : setelah 24 jam, 48 jam & 96 jam

• Hasil dinilai dari gejala yang timbul pada mata :edema, kekeruhan kornea, reaksi terhadap cahaya, pelebaran vaskuler dan kemerahan

Uji Tingkat I

Uji Iritasi Kulit :

Bisa dilakukan langsung pada kulitTujuan :• Untuk mencari iritasi primer, sensitisasi kulit, foto-toksisitas dan foto

sensitisasi

A. Uji iritasi primer :

• dilakukan pada kulit punggung, kulit telinga atau mencelupkan seluruh tubuh hewan kedalam cairan uji (2 uji terakhir sudah tidak digunakan lagi)

• hewan uji : kelinci albino

• evaluasi : setelah 24, 48 & 96 jam

• skor keparahan secara numerik

B. Uji sensitisasi kulit :

• untuk mengetahui apakah xenobiotik menggangu sistem imunitas

• hewan uji : mencit (guinea pig)

• hewan uji diberi xenobiotik 3 hari sekali selama 2 minggu, dengan selang istirahat 2minggu

• evaluasi : setelah 24, 48 & 96 jam

Uji Tingkat I

Uji Iritasi Kulit :

C. Uji Fototiksiti & Fotosensitisasi:

• untuk melihat efek dari kombinasi xenobiotik dengan cahaya, terutama sinar UV

• merupakan modifikasi dari uji sebelumnya (setelah aplikasi xenobiotik, dilakukan penyinaran dengan UV)

• hewan uji : mencit (guinea pig); kelinci albino

•evaluasi : setelah 24, 48 & 96 jam

D. Uji Mutagenisitas :

• dilakukan dengan uji SAL, ABS, SCE & MOLY

• SAL (Ames test) bersifat reverse mutation testhewan uji : Salmonella typhmurium

• Uji essei untuk aberasi kromosom : Uji ABS, SCE & MOLYmekanisme aberasi setiap test berbedayang dicari : - kromosom terputus (breaks),

- terjadi pertukaran antar bagian kromosom (sister chromatid)

• hewan uji : sel hidup sel sumsum tulang tikus, sel limfosit tikus penderita kanker,dsb

Uji Tingkat I

Uji akut dan khronis telah terlaksana dalam tahun ke-1

uji ini dilakukan pada sel derajat rendah

tidak dapat mewakili uji jangka panjang

PENTING !!!

Terutama jika data ujiakan diekstrapolasikan

pada manusia

Mewakili uji subkronisWaktu essei : • Aplikasi pada kulit : 30 hari• Studi inhalasi : 30 – 90 hari• Uji oral : 90 hari

Tujuan : mendapatkan nilai NOEL atau NOAEL, dstDosis yang diujikan divariasikan 3-4 variasi :• Dosis tinggi menyebabkan kematian• Dosis ringan menunjukkan NOEL

Hewan uji : tikus, anjing atau kera ; (jantan : 10-20 ekor & betina : 10-20 ekor pada setiap level dosis yang diberikan)Observasi yang dilakukan terhadap:

setiap organ tubuh, mortalitas, morbiditas, mata, konsusmsi makanan, berat badan, respons neurologis, perilaku tidak normal,respirasi, elektro kardiogram (EKG), elektro-encefalogram (EEG), hematologi, biokimia darah, analisis urin & tinja, kerusakan orgn makroskopis

Uji Tingkat II Uji Tingkat IITujuan Observasi yang dilakukan :

Skrining kedua terhadap mutagenisitiUji teratologi & uji reproduktifUji farmakokinetikUji perilakuUji interaksi, seperti sinergisme, antagonisme dan aditivisme

semuanya diselesaikan dalam waktu dua-setengah tahun

Uji Tingkat III/Uji KronisDilakukan dalam jangka panjangMewakili separuh usia hidup hewan uji, bahkan lebih dari satu generasiYang dilihat : rentang dosis yang menyebabkan efek ringan dan berat

• Bila rentang sempit zat berbahaya• Bila rentang lebar zat tidak/kurang berbahaya• Contoh :

- Rentang CO : (100 – 250) mg/m3

- Rentang kafein : (100 mg – 10 gr)/m3

kafein dianggap kurang berbahayaUji terpenting : Uji karsinogenitas, teratogenitas & reproduksi

Uji Tingkat III/Uji KronisTujuannya untuk menguji :

Mutagenisiti pada mamaliaKarsinonegisiti pada tikus selama 2 tahunFarmakokinetika pada manusia bila relevanKlinis pada manusiaData epidemiologis untuk efek terhdap eksposur akut dan kronisPengujian suatu zat, tergantung pada penggunaannya dan kemungkinan eksposur yang dapat diterima manusia/masyarakat

Uji Tingkat III/Uji KronisDalam uji tingkat III :• Cari spesies yang cukup

sensitif• Ambil spesies dengan

mutasi spontan yang moderat (1,5%)

Uji Mutagenisitas :Mendasari semua proses perubahan genetikHasil akhir : mutasi pada • sel genetik terjadi mutan• sel somatik terjadi

kanker• Sel embrio terjadi

monster atau cacat bawaan

Uji teratogenitas :pada mamalia & jenis

pakis/ ferns

Uji karsinogenitas : pada mamalia

(jantan & betina)

pada berbagai fase pertumbuhan

dan berbagai portal entri

Organ Diperiksa Secara Patologi pada Uji Subkhronis& Khronis

AdrenalSumsum Tulang, TulangCaecumColonDuodenumEsofasgusMataKandung empeduIleum/usus halusJejunum/usus halusGinjal

LaringHatiParu-paru, bronkhiKelenjar limfeKelenjar susuRahang bawahRonga hidungIndung telurParatiroidPituitariProstatRektum

Kelenjar ludahSaraf skiatikaVesika seminalesKulitLimpaSaraf spinalesLambungTestesOtot pahaTimusKandung kencingUterus, dll

Uji Toksisitas & Rantai MakananHakekat uji toksisitas : berdasarkan uji pada taraf trofis dari yang terendah sampai yang tertinggi

Hewan uji dari berbagai tingkat trofis berbeda dengan lokasi geografis dipilih atas dasar hewan dan/atau tanaman yang ada

Contoh hewan uji :• Untuk perairan : dapat dilihat di buku Standard Method for the

Examination of Water & Waste Water (APHA, 1975)

• Untuk toksin terestrial : digunakan hewan mulai dari cacing (Eiseina foetida), sampai mamalia seperti tikus, anjing, kera, dll.

Contoh Rantai Makanan Contoh Rantai Makanan

NIlai LD50 Untuk Cypermetrin Pada Berbagai Hewan Uji (tidak sama)

Hewan Uji LD50 (mg/kg)Tikus besar (rat)TikusHamster SiriaHamster CinaAnak SapiAnak BabiKambing

2518400203500142-284>600

Sensitivitas populasi

Anatomi

Luas permukaan hewan kecil >>hewan besar

PENTING !!

Dalam interpolasi dosis aman

bagi manusia

Anatomi

Metabolisme : Semakin besar hewan ∑ makanan yang

diperlukan >>>

Karakteristik membran antara otak dan sirkulasi

Contoh : - Membran hamster sulit ditembus DDT

LD50 oral : 5000 mg/kg BB- Membran mencit mudah ditembus DDT

- LD50 oral : 100-200 mg/kg BB

Fisiologi / FaalTumbuhan hijau :

dapat berfotosintesa & tidak mempunyai syarafHewan petelur (itik) :

biasa mengerami telurnya dalam keadaan relatif puasadalam fungsinya : berat badan itik betina akan turun dengan 25 – 30% lemak yang ada digunakan untuk keperluan energinyaterjadi pelepasan insektisida dari lemak, masuk sirkulasi dan kemungkinan itik akan keracunan dan mati

Hewan berdarah dingin :enzim biotransformasinya mempunyai aktivasi yang rendahsehingga insidensi kanker pada ikan rendah (karsinogen perlu enzim biotransformasi untuk membentuk metabolit yang karsinogenik)

Kelinci : mempunyai enzim atropin esterase tidak peka terhadap atropinjika dipakai sbg hewan uji untuk atropa belladona tidak timbul efek

C

O

N

T

O

H

Tumbuhan hijau : dapat berfotosintesa & tidak mempunyai syaraf

Hewan petelur (itik) :biasa mengerami telurnya dalam keadaan relatif puasadalam fungsinya : berat badan itik betina akan turun dengan 25 – 30% lemak yang ada digunakan untuk keperluan energinyaterjadi pelepasan insektisida dari lemak, masuk sirkulasi dan kemungkinan itik akan keracunan dan mati

Spesies Kepekaan spesies terhadapkarsinogen berbeda-beda

Ca paru-paru PAH + enzim biotransformasi (aril hidrokarbon hidroksilase) akan membentuk metabolit yang karsinogenikBakat alergi dan lain-lain penyakit tergantung dari spesiesMutasi spontan pada berbagai spesies hewan akan berbeda-beda

dalam uji karsinogenisitas biasanya diambil bakat mutasinya yang sedang saja

Contoh

ResponsRespons yang dilihat :

respons sangat ringan sampai pada yang parah (kematian)

Yang penting :• respons dapat diukur secara kuantitatif• Respons yag diteliti akan memperlihatkan korelasi matematis

yang konsisten• Terdapat variasi respons antar spesies

Respons yang sering dilihat : kematiankarena kesulitan dalam menentukan hewan uji mati atau immobil saja perhatikan periode waktu observasi sehingga waktu terjadi kematian diketahui

Perioda EksperimenPeriode eksperimen : jam, hari, minggu dan tahun

ada uji jangka pendek (Short Term Test/STT)ada uji jangka panjang (Long Term Test/LTT)

Perhatikan juga : • interval waktu eksposur, • konsentrasi zat pemapar, • lamanya observasi setelah dipapari

PENTING

dalam perhitungan mencari dosis aman

Faktor yang mempengaruhi toksisitas suatu xenobiotik :

Komposisi kimiawi – fisis suatu zatKonsentrasi, jenis eksposur, lamanya eksposur, sringnya eksposur, dllStatus imunologis seseorang, status nutrisi, status hormonal, usia, jenis kelamin, kesehatan atau penyakit yang dideritaFaktor lingkungan seperti suhu, tekanan partial, wujud media transmisi seperti air, udara atau padatan, adanya zat kimia-fisika lain. Metoda handling xenobiotik, peralatan keamanan yang digunakan, dll.

InteraksiInteraksi yang dapat terjadi :• Interaksi Kimia

Interaksi karena reaksi kimiawi yang menimbulkan senyawa baru yang bersifat lebih toksis

• Interaksi Biologisinteraksi yang terjadi dengan tubuh organisme yang menimbulkan efek berlebih maupun berkurang

Interaksi sangat dipengaruhi oleh dosis xenobiotikInteraksi antar xenobiotik dapat menimbulkan efek :• Aditif• Sinergistik• Antagonistik

InteraksiInteraksi AditifTerjadi apabila efek kombinasi dua atau lebih xenobiotik merupakan pertambahan dari efek masing-masing zat

Dapat terjadi apabila mekanisme efek sama, identikal, ataupun berbeda

Misalnya : 2 jenis organofosfat diberikan serentak

terjadi efek aditif

Interaksi SinergistikTerjadi apabila efek kombinasi dua atau lebih xenobiotik memberikan efek yang lebih dari pertambahan masing-masing zat

Dapat terjadi apabila :- xenobiotik memberikan efek

pada organ yang sama- salah satu zat tidak tidak

menimbulkan efek bila diberikan sendiri, tetapi dapat meningkatkan efek daripada zat lain

Misalnya : etanol yang meningkatkan toksisitas karbon tetraklorida atau kloroform terhadap hati

InteraksiInteraksi Antagonistik :

Terjadi apabila dua atau lebih kombinasi zat menimbulkan efek yang kurang dari pertambahan masing-masing zat

Dapat terjadi apabila :• Zat yang satu menetralisasi efek zat yang lain• Terjadi reaksi kimiawi antar zat dan menimbulkan senyawa baru

yang krang toksik• Terjadi efek yang memodifikasi reaksi dengan enzim, sehingga

biotransformasi menjadikan zat yang toksis menjadi efektif• Terjadi kompetisi dalam untuk bergabung dengan reseptor yang

sama, sehingga terjadi blokade

Misalnya : CO dan O2 terhadap Hb

Ekstrapolasi Bioessei Ke Manusia

Tujuan uji bioessei : • Mencari dosis aman bagi manusia • Membuat standar kualitas lingkungan

Ekstrapolasi hasil bioessei ke manusia ditentukan oleh 2 sifat xenobiotik sbb :• Zat yang bersifat karsinogenik• Zat yang bersifat tidak karsinogenik

Ekstrapolasi didasarkan pada : • Berat badan atau luas permukaan• Atau atas dasar farmakokinetika Physiologically based

pharmacokinetic model (PBPM)

Ekstrapolasi Bioessei Ke Manusia

Klasifikasi Karsinogenitas menurut International Agency Reseach on Cancer (IARC) :

Kategori Bobot buktiKarsinogenik bagi manusia

Mungkin sekali karsinogen bagi manusia

Mungkin karsinogen bagi manusia

Tidak dapat diklasifikasi

Mungkin bukan karsinogen bagi manusia

Ada data pada manusia

Data manual terbatas, data hewan cukup

Data pada manusia dan hewan terbatas

Data tidak cocok untuk kedua kategori

Tidak ada data pada hewan & manusia

Ekstrapolasi Zat Tidak Karsinogenik

Berdasarkan atas berat badan (BB) dengan memasukkan berbagai faktor keamanan (safety factors), sbb

Thd00 (mg/kg/h) x 70 kg• Safe Human Dose = -----------------------------

(SHD) SF

• THD = dosis threshold/ ambang, tanpa ada efek yang nyata• SF : 10---1000

Ekstrapolasi Zat Tidak Karsinogenik

SHD inhalasi:(α )(BR)(C)(t)

SHD = ------------------mg/kgBB

• α = % zat yang diabsorpsi paru-paru (= 100% bila tdk diketahui)

• BR = breathing rate• t = waktu paparan• br x t = 30 m3/h = 24 jam• BB : 70 kg bagi laki-laki dan 60 kg bagi wanita

Ekstrapolasi Zat Karsinogenik

Semua zat yang dianggap karsinogenik, dalam analisis ini dianggap tidak mempunyai ambang aman

Dalam ekstrapolasi diambil angka yang diperkirakan dapat diterima oleh masyarakat

Misalnya : apakah orang dapat menerima atau mentolerir pertambahan satu orang penderita kanker dalam 100.000 penduduk atau satu orang per 10.000.000 penduduk

Maka SHD dapat dituluskan sbb :

SHD = … x 10-5 – 10-7 Artinya : Eksposur seumur hidup akan

menambah satu penderita kanker per 100.000 dan/atau 10.000.000

penduduk

Permasalahan Uji Toksisitas

Adanya berbagai Kontroversi & Argumentasi dari berbagai pihak :

• Organisme berbeda jauh dari manusia• Masyarakat penyayang binatang sangat

menentang uji toksisitas sdemikian• Keadaan laboratorium berbeda dengan realitas

Masalah Organisme PercobaanHasil uji dengan menggunakan organisme percobaan yang sedapat mungkin sensitivitasnya menyerupai/ mendekati manusia Tidak sempurna• Contoh : obat penenang ibu hamil Thalomide yang pada uji

toksisitas hewan tidak didapat efek jelek, tetapi pada manusia terjadi focomelia

Dosis yag didapat dari percobaan (NOEL, NOAEL,LOEL,LOAEL) merupakan fungsi dari berbagai faktor :• Spesies, patologi, jumlah sampel, rute eksposur, usia

pertama mendapat eksposur, perioda eksposur, lamanya observasi (dari awal sampai akhir eksperimen)

Perbedaan Lingkungan Alamiah & Lingkungan Laboratorium

Laboratorium Alam/Riil

Dapat dibuat bebas patogenKeadaan sterilCahaya buatanEksposur konstanPopulasi homoogenZat racun murni

Tidak dapat dibuat bebas patogenTidak dapat disterilkanCahaya alamiah tidak terkontrolEksposur tidak jelasPopulasi heterogenRacun campuran

PemantauanLatar belakang : banyak sekali racun di dalam lingkungan yang belum diketahui efeknya

perlu pemantauan secara kontinyu

Pemantauan dilakukan pada :• Aspek lingkungan• Kesehatan masyarakat

Menentukan efektifitas pemantauan masyarkat untuk berbagai xenobiotik : BEI (Biological Effect Indicators)

menetukan jaringan tubuh tertentu yang paling efektif dipantau dan telah pula ditentukan kadar normal bagi xenobiotik tsb di dalamnyadaftar dapat dilihat pada standar lingkungan kerja yang dibuat oleh

Govermental Industrial Hygienist (ACGIH)jaringan yang dipantau : darah, urin, cairan cerebro-soinalis, kuku, rambut, enzim, protein dalam serum, elektolit, DNA, perilaku, alat reproduksi, dll

Pemantauan

Pemantauan perlu dilakukan terhadap Flora & Fauna :

terdapat katak-katak yang cacat, seperti bermata satu, berkaki tiga, dst (mengindikasikan ada zat pencemar mutagenik)perubahan biomassa, populasi berbagai fauna dan flora di alam bebas