PERBANDINGAN METODE KROMATOGRAFI GAS DAN BERAT JENIS PADA PENETAPAN KADAR ETANOL DALAM MINUMAN

ANGGUR

Mardoni, M.M.Yetty Tjandrawati Fakultas Farmasi USD

Intisari

Etanol dalam minuman anggur dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan metode kromatografi gas dan berat jenis. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan metode kromatografi gas dan berat jenis pada penetapan kadar etanol dalam minuman anggur. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola satu arah. Parameter yang digunakan untuk membandingkan validitas kedua metode adalah recovery, kesalahan sistematik, dan kesalahan acak (CV) dengan menggunakan uji T sample independen. Pada penetapan kadar minuman anggur dengan kedua metode perlu dilakukan destilasi sampel untuk memisahkan etanol dari komponen-komponen lain dalam minuman anggur. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa recovery, kesalahan sistematik, dan kesalahan acak (CV) metode kromatografi gas dan berat jenis berbeda tidak bermakna.

BAB I. Pendahuluan

Alkohol merupakan istilah umum dari etanol mempunyai efek yang

menguntungkan dan merugikan bagi manusia. Etanol pada kadar rendah dan

sedang berperan sebagai stimulan. Konsumsi etanol dalam jumlah sedang

mempunyai efek protektif terhadap penyakit jantung iskemik. Konsumsi etanol

yang berlebihan bisa menyebabkan kerusakan banyak organ, terutama otak dan

hati (Anonim, 1999).

Menurut keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia nomor

1516/A/SK/V/81, pasal 1: “Anggur, arak dan sejenisnya termasuk dalam jenis

minuman keras dan harus memenuhi peraturan perundang-undangan yang berlaku

untuk minuman keras”. Minuman keras menurut menteri Kesehatan RI nomor

86/Menkes/Per/IV/77 adalah “semua jenis minuman beralkohol tetapi bukan obat,

meliputi minuman keras golongan A, minuman keras golongan B, dan minuman

162

keras golongan C”. Minuman anggur termasuk dalam minuman keras golongan B

(kadar etanol 5 – 20 %v/v).

Minuman anggur dibuat dari fermentasi buah anggur atau jus buah

anggur dengan Saccharomyces ellipsoideus. Buah-buah anggur itu dipanen ketika

kandungan substrat yang bisa difermentasi, yaitu “gula anggur” atau glukosa

berada pada kadar yang tinggi. Material yang disiapkan dari buah anggur sebelum

fermentasi disebut must. Prosesnya tidak lain menghancurkan buah yang sudah

matang dan menunggu hingga etanol yang dihasilkan sudah cukup dan tidak

beracun (Bowman dan Rand, 1980)

Etanol yang nama lainnya alkohol, aethanolum, etil alcohol, adalah

cairan yang bening, tidak berwarna, mudah mengalir, mudah menguap, mudah

terbakar, higroskopik dengan karakteristik bau spiritus dan rasa membakar, mudah

terbakar dengan api biru tanpa asap. Campur dengan air, kloroform, eter, gliserol,

dan hampir semua pelarut organic lainnya. Penyimpanan pada suhu 8-15°C, jauh

dari api dalam wadah kedap udara dan dilindungi dari cahaya, serta mempunyai

rumus struktur sebagai berikut :

CO

H

C

HH

H

H H Gambar 1. Struktur etanol

Metode yang dapat digunakan untuk menetapkan kadar etanol antara lain

metode berat jenis yang merupakan metode konvensional dan kromatografi gas

yang merupakan metode instrumental. Masing-masing metode mempunyai

kelebihan dan kekurangan. Oleh karena itu, dilakukan perbandingan validitas

kedua metode, apakah validitas kedua metode berbeda bermakna atau tidak.

Kromatografi gas adalah teknik kromatografi yang bisa digunakan untuk

memisahkan senyawa organik yang mudah menguap. Senyawa-senyawa yang

dapat ditetapkan dengan kromatografi gas sangat banyak, namun ada batasan-

batasannya. Senyawa-senyawa tersebut harus mudah menguap dan stabil pada

temperatur pengujian, utamanya dari 50 – 300°C. Jika senyawa tidak mudah

163

menguap atau tidak stabil pada temperatur pengujian, maka senyawa tersebut bisa

diderivatisasi agar dapat dianalisis dengan kromatografi gas.

Berat jenis untuk penggunaan praktis lebih sering didefinisikan sebagai

perbandingan massa dari suatu zat terhadap massa sejumlah volume air yang sama

pada suhu 4° atau temperatur lain yang tertentu. Notasi berikut sering ditemukan

dalam pembacaan berat jenis: 25°/25°, 25°/4°, dan 4°/4°. Angka yang pertama

menunjukkan temperatur udara saat zat ditimbang, angka yang berikutnya

menunjukkan temperatur air yang digunakan (Martin dkk., 1983).

Berat jenis larutan etanol dapat diukur dengan piknometer. Berat jenis

larutan etanol semakin kecil, maka kadar etanol di dalam larutan tersebut semakin

besar. Hal ini dikarenakan etanol mempunyai berat jenis lebih kecil daripada air

sehingga semakin kecil berat jenis larutan berarti jumlah / kadar etanol semakin

banyak. Konversi berat jenis menjadi kadar etanol (v/v) disajikan pada tabel I di

bawah ini: Tabel I. Konversi berat jenis – kadar etanol (v/v)

Berat jenis larutan etanol

Kadar etanol

(% v/v)

Berat jenis larutan etanol

Kadar etanol

(% v/v)

Berat jenis larutan etanol

Kadar etanol

(% v/v) 1,000

0,9999 0,9998 0,9997 0,9996 0,9995 0,9994 0,9993 0,9992 0,9991 0,9990 0,9989 0,9988 0,9987 0,9986 0,9985 0,9984 0,9983 0,9982 0,9981 0,9980 0,9979

0,00 0,07 0,13 0,20 0,26 0,33 0,40 0,46 0,53 0,60 0,66 0,73 0,80 0,87 0,93 1,00 1,07 1,14 1,20 1,27 1,34 1,41

0,9978 0,9977 0,9976 0,9975 0,9974 0,9973 0,9972 0,9971 0,9970 0,9969 0,9968 0,9967 0,9966 0,9965 0,9964 0,9963 0,9962 0,9961 0,9960 0,9959 0,9958 0,9957

1,48 1,54 1,61 1,68 1,75 1,81 1,88 1,95 2,02 2,09 2,15 2,22 2,29 2,37 2,43 2,50 2,57 2,64 2,70 2,77 2,84 2,91

0,9956 0,9955 0,9954 0,9953 0,9952 0,9951 0,9950 0,9949 0,9948 0,9947 0,9946 0,9945 0,9944 0,9943 0,9942 0,9941 0,9940 0,9939 0,9938 0,9937 0,9936 0,9935

2,98 3,05 3,12 3,19 3,26 3,33 3,40 3,47 3,54 3,61 3,68 3,76 3,83 3,90 3,97 4,04 4,11 4,18 4,26 4,33 4,40 4,48

(Lees, 1975)

164

Validasi suatu metode analisis adalah proses yang dibuat, oleh studi

laboratorium, sehingga karakteristik pelaksanaan metode memenuhi persyaratan

aplikasi analisis yang diinginkan. Parameter-parameter validitas metode analisis

antara lain akurasi, presisi, linearitas, spesifisitas, range, detection limit, dan

quantitation limit (Anonim, 2005).

BAB II. Metode Penelitian

A. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : Minuman anggur

merek X, Etanol p.a (E. Merck), n-Butanol p.a (E. Merck), Aquadest,

B. Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah piknometer,

seperangkat alat kromatografi gas, neraca analitik, labu alas bulat, heating mantle,

labu takar 100 ml, mkropipet, seperangkat alat gelas.

C. Tata Cara Penelitian

Penelitian ini menggunakan sampel salah satu merk minuman anggur

yang beredar di pasaran di Yogyakarta. Sampel yang diambil sebanyak 20 botol

minuman anggur dengan volume 600 ml dan nomor batch yang sama. Dua puluh

botol sampel dicampur homogen kemudian diambil 100 ml untuk dipreparasi.

1. Preparasi Sampel

Diambil 100 ml sampel dengan menggunakan pipet volume dan

dimasukkan ke dalam labu alas bulat 250 ml kemudian ditambahkan 50 ml

akuades. Dilakukan distilasi dengan menggunakan pemanas mantel. Hasil distilasi

ditampung pada labu ukur 100 ml hingga volume 90 – 95 ml (Pearson, 1970).

Replikasi dilakukan 6 kali.

2. Validasi Metode Kromatografi Gas

a. Pembuatan seri larutan baku etanol. Disiapkan seri baku dengan

konsentrasi berikut:

165

Etanol p.a. (ml) n-butanol (ml) Konsentrasi akhir etanol % (v/v) 0,1 0,2 0,3 0,4

0,2 0,2 0,2 0,2

0,1 0,2 0,3 0,4

Etanol p.a. dan n-butanol dengan jumlah seperti tertulis di atas

dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Volume 100,0 ml dicapai dengan

penambahan akuades. Replikasi dilakukan 3 kali.

b. Pembuatan kurva baku etanol. Satu mikroliter (1μl) larutan baku dari

masing-masing konsentrasi disuntikkan ke dalam kolom. Luas puncak etanol dan

n-butanol dari kromatogram dihitung, kemudian dicari rasio luas puncak etanol/n-

butanol. Kurva baku dibuat dengan memplotkan rasio luas puncak etanol/n-

butanol vs kadar etanol (% v/v). Persamaan kurva baku dicari dengan regresi

linear.

c. Penentuan recovery, kesalahan sistemik dan kesalahan acak.

Diambil 1μl larutan etanol dengan kadar 0,1; 0,2; 0,3; dan 0,4 ml/100,0 ml

dan disuntikkan ke dalam kolom. Luas puncak etanol dan n-butanol dari

kromatogram dihitung, kemudian dicari rasio luas puncak etanol/n-butanol. Kadar

dihitung dengan persamaan regresi linier.

Recovery, kesalahan sistemik dan kesalahan acak dihitung dengan rumus

sebagai berikut:

Recovery = sebenarnyakadar

kurkadar teru × 100 %

Kesalahan sistematik = 100 % – recovery

Kesalahan acak = kurkadar terurata-rata

(SD) deviasistandar × 100 %

3. Pengukuran Kadar Etanol Dengan Metode Kromatografi Gas

Larutan sampel minuman anggur yang telah didestilasi masing-masing

diambil 1,0 ml menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50

ml, kemudian ditambahkan 0,1 ml n-butanol dan diencerkan dengan akuades.

Larutan ini masing-masing diambil 1μl dan disuntikkan ke dalam kolom melalui

tempat injeksi. Luas puncak etanol dan n-butanol dari kromatogram dihitung,

166

kemudian dicari rasio luas puncak etanol/n-butanol. Kadar etanol dalam minuman

anggur ditentukan menggunakan persamaan kurva baku.

4. Validasi Metode Berat Jenis

a. Pembuatan seri larutan baku etanol. Etanol p.a. diambil 1,0; 2,0;

3,0; dan 4,0 ml dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml.

Ditambahkan akuades hingga volume 100,0 ml. Replikasi dilakukan 3 kali.

b. Pengukuran larutan baku etanol. Piknometer dibersihkan secara

hati-hati dengan menggunakan aseton, kemudian dikeringkan dan ditimbang.

Akuades didinginkan sampai di bawah suhu percobaan (± 15°C). Piknometer diisi

dengan akuades secara hati-hati hingga penuh dan termometer dimasukkan. Suhu

akuades dalam piknometer ditunggu hingga mencapai suhu percobaan (20°C),

kelebihan akuades pada puncak pipa kapiler dibersihkan. Piknometer yang berisi

akuades segera ditimbang dan beratnya dicatat. Cara yang sama dilakukan untuk

larutan baku etanol. Berat jenis dihitung dengan rumus berikut:

Berat jenis sampel = piknometer dalam di akuadesberat

piknometer dalam di etanolbaku larutan berat

Kadar etanol dihitung dengan menggunakan tabel 1.

c. Penentuan recovery, kesalahan sistemik dan kesalahan acak. Larutan

baku etanol yang telah diukur dicari nilai recovery, kesalahan sistemik dan

kesalahan acaknya dengan rumus seperti pada metode kromatografi gas.

4. Pengukuran Kadar Etanol Dalam Minuman Anggur Dengan Metode

Berat Jenis

Cara kerjanya sama dengan pada pengukuran larutan baku etanol dengan

piknometer dan yang digunakan adalah larutan sampel.

5. Analisis Hasil

Data yang dianalisis adalah recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak

dari masing-masing metode. Analisis yang dilakukan adalah uji non parametrik

Kolmogorov-Smirnov dengan taraf kepercayaan 95% dan Independent Sample T-

Test dengan taraf kepercayaan 95%.

167

BAB III. Hasil dan Pembahasan

Sampel minuman anggur mempunyai banyak kandungan selain etanol.

Kandungan lain dalam minuman anggur antara lain: gula pasir, karamel, spirit

anggur, air, dan ekstrak kolesom. Pemisahan kandungan-kandungan lain dalam

minuman anggur dilakukan dengan cara distilasi. Distilat yang didapat berupa

azeotrop (95 % etanol – 5 % air).

Kelemahan metode distilasi biasa adalah tidak bisa memisahkan senyawa

dengan selisih titik didih sempit. Etanol (titik didih 78,3°C) dan metanol (titik

didih 64,5°C) tidak dapat dipisahkan dengan distilasi ini.

Parameter kromatografi gas yang digunakan dalam penelitian ini adalah

sebagai berikut: suhu injektor 250°C, suhu detektor 250°C, suhu kolom 200°C,

detektor FID, kolom DB-1 (30 m × 0,25 mm) fase diam dimetil polisiloksan,

kecepatan gas pembawa (N2) tidak terdeteksi, kecepatan gas H2 46,9 ml/menit,

kecepatan gas O2 487 ml/menit, range 4, dan attenuasi 0.

Hasil pembuatan kurva baku etanol dengan metode kromatografi gas

disajikan pada tabel II berikut ini:

Tabel II. Kurva baku etanol dengan standar internal n-butanol Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi etanol teoritis

(ml/100ml)

Rasio luas puncak etanol/ butanol

Konsentrasi etanol teoritis

(ml/100ml)

Rasio luas puncak etanol/ butanol

Konsentrasi etanol teoritis

(ml/100ml)

Rasio luas puncak etanol/ butanol

0,100 0,3306 0,100 0,3365 0,100 0,3387 0,200 0,6338 0,200 0,6733 0,200 0,6679 0,300 0,9822 0,300 1,0091 0,300 1,0407 0,400 1,2871 0,400 1,3436 0,400 1,3753 Keterangan: Replikasi I : A = 3,95 x 10-3; B = 3,2179; r = 0,9996 Replikasi II : A = 1,35 x 10-3; B = 3,3571; r = 0,9999

Replikasi III : A = - 0,015; B = 3,4826; r = 0,9997 Persamaan kurva baku yang dipilih untuk perhitungan recovery,

kesalahan sistematik, kesalahan acak dan penetapan kadar adalah persamaan

kurva baku replikasi II karena nilai r paling mendekati 1 dan intersepnya paling

kecil.

168

Hasil penentuan recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak

disajikan pada tabel III. Recovery dan kesalahan sistematik adalah parameter

akurasi sedangkan kesalahan acak adalah parameter presisi. Tabel III. Hasil perhitungan recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak metode

kromatografi gas Kadar etanol teoritis

(ml/100ml) Rata-rata recovery

(%) n = 3 Rata-rata kesalahan sistematik (%) n = 3

Kesalahan acak (CV) (%)

0,100 100,27 1,53 2,05 0,200 96,26 3,74 1,85 0,300 99,13 3,00 3,57 0,400 99,53 2,37 3,42

Berdasarkan tabel III nilai recovery untuk seri kadar 0,1; 0,3; dan 0,4

ml/100 ml berada dalam rentang recovery yang baik, yaitu 98 – 102 %. Nilai rata-

rata kesalahan sistematik untuk seri kadar 0,1 ml/ 100,0 ml < 2 %, berarti

memenuhi syarat kesalahan sistematik yang bisa diterima. Seri kadar 0,2 ml/100,0

ml memiliki nilai CV < 2 % berarti memenuhi kriteria presisi yang baik.

Faktor yang menyebabkan adanya hasil perhitungan recovery, kesalahan

sistematik, dan kesalahan acak yang menyimpang adalah perhitungan luas puncak

kromatogram dilakukan secara manual dan pengukuran dilakukan dengan

penggaris biasa berhubung alat integrator belum bisa digunakan.

Hasil penentuan recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak

metode berat jenis disajikan pada tabel IV. Tabel IV. Hasil perhitungan recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak metode

berat jenis Kadar teoritis (ml/100ml)

Rata-rata recovery (%) n = 3

Rata-rata kesalahan sistematik (%) n = 3

Kesalahan acak (CV) (%)

1 104,9 4,9 3,53 2 97,97 2,03 1,79 3 98,79 2,48 2,77 4 98,725 2,64 3,14

Berdasarkan tabel IV di atas menunjukkan bahwa rata-rata recovery

untuk seri kadar 3 dan 4 ml/ 100,0 ml berada dalam rentang recovery yang baik

untuk bahan baku, yaitu 98 – 102 %. Nilai rata-rata kesalahan sistematik semua

seri kadar > 2 %. Kadar 2 ml/100,0 ml yang menunjukkan presisi yang baik

karena memiliki nilai CV < 2 %.

Faktor yang menyebabkan hasil yang menyimpang pada metode berat

jenis terutama adalah suhu ruangan yang lebih tinggi daripada suhu percobaan.

169

Hal ini dapat menyebabkan terjadinya perbesaran volume cairan, sehingga ada

cairan yang terbuang secara tidak sengaja saat percobaan. Volume cairan yang

terbuang ini tidak dapat diprediksi jumlahnya dan dapat mempengaruhi ketepatan

dan keterulangan hasil pengukuran.

Berdasarkan hasil uji Kolmogorov-Smirnov semua data recovery,

kesalahan sistematik, dan kesalahan acak terdistribusi normal. Hal ini dapat dilihat

dari nilai signifikansi uji Kolmogorov-Smirnov yang lebih besar dari nilai

signifikansi untuk taraf kepercayaan 95 %, yaitu 0,05. Contoh hasil uji

Kolmogorov-Smirnov disajikan pada tabel V di bawah ini.

Tabel V. Hasil uji distribusi data recovery One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Recovery (kromatografi gas) Recovery (berat jenis)

N 4 4 Normal Parameters(a,b) Mean 98.7975 100.0975 Std. Deviation 1.75635 3.22335 Most Extreme Differences Absolute .325 .407 Positive .201 .407 Negative -.325 -.255 Kolmogorov-Smirnov Z .650 .815 Asymp. Sig. (2-tailed) .792 .520 a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

Validitas kedua metode diuji dengan membandingkan nilai recovery,

kesalahan sistematik, dan kesalahan acak masing-masing metode menggunakan

uji T sampel independen. Hasil uji menunjukkan bahwa nilai signifikansi semua

data yang diperoleh dengan metode kromatografi gas dan berat jenis lebih besar

daripada nilai signifikansi untuk taraf kepercayaan 95 %, yaitu 0,05. Makna hasil

uji ini adalah bahwa validitas kedua metode berbeda tidak bermakna. Contoh hasil

uji T sampel independen disajikan pada tabel VI:

170

Tabel VI. Hasil uji T sampel independen untuk recovery

Independent Samples Test

1.409 .280 -.708 6 .505 -1.30000 1.83540 -5.79105 3.19105

-.708 4.637 .513 -1.30000 1.83540 -6.13129 3.53129

Equalvariancesassumed

Equalvariances

notassumed

Recovery

F Sig.

Levene'sTest for

Equality ofVariances

t df Sig.(2-tailed)

MeanDifference

Std. ErrorDifference

Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means

Hasil pengukuran kadar menggunakan metode kromatografi gas dan

berat jenis disajikan pada tabel VII: Tabel VII. Kadar etanol terukur dengan metode kromatografi gas dan berat jenis

Sampel Kromatografi gas(ml/100ml) Berat jenis (ml/100ml) 1a 14,635 13,26 1b 14,04 14,2 2a 15,115 13,41 2b 15,12 14,62 3a 14,615 15,11 3b 14,96 14,41 4a 14,825 15,495 4b 14,845 14,06 5a 13,52 13,745 5b 14,095 14,83 6a 13,19 14,655 6b 14,54 15,145

Kadar etanol dalam minuman anggur yang terukur dengan metode

kromatografi gas adalah 14,46 ± 0,62 % v/v sedangkan dengan metode berat jenis

adalah 14,41 ± 0,70 % v/v.

BAB IV. Kesimpulan dan Saran

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas dapat disimpulkan hal-hal

sebagai berikut:

1. Metode kromatografi gas dan berat jenis mempunyai validitas yang berbeda

tidak bermakna.

171

2. Kadar etanol dalam minuman anggur yang terukur dengan metode

kromatografi gas adalah 14,46 ± 0,62 % v/v sedangkan dengan metode berat

jenis adalah 14,41 ± 0,70 % v/v.

Daftar Pustaka Anonim, 1999, Martindale The Complete Drug Reference, 1099-1101, 32nd

Edition, edited by Kathleen Parfitt, Pharmaceutical Press, London, UK. Anonim, 2005, United State Pharmacopeia 28, 2749 - 2751, United State

Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville. Bowman, W. C. and Rand, M.J., 1980, Textbook of Pharmacology, Second

Edition, 42.3, Blackwell Scientific Publications, United Kingdom. Martin, A., Swarbrick, J., dan Cammarata, A., 1983, Farmasi Fisik, edisi ke-3, 8,

penerjemah Yoshita, UI Press, Jakarta. Mulja, M. dan Hanwar, D., Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang Baik,

Majalah Farmasi Airlangga, III, 71 – 72. Skoog, D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, Edisi III, 22, 163-165,

188, Saunders College Publishing, Japan.

172