UJI A

PENETAPA

AKTIVITAS1,1-DIFE

AN KANDUETANOLI

Diaju

Memp

D

UN

S ANTIOKSENIL-2-PIKUNGAN FEIK DAUN S

ukan untuk M

peroleh Gela

Progra

Damianus L

NIM

FAKULNIVERSITA

YO

SIDAN MENKRILHIDRAENOLIK TOSELASIH (O

SKRIPSI

Memenuhi Sa

ar Sarjana Fa

am Studi Far

Oleh:

Listyanta Edh

M: 07811405

LTAS FARMAS SANATAGYAKART

2011

NGGUNAKAZIL (DPPHOTAL FRAOcimum san

alah Satu Sy

armasi (S. Fa

rmasi

hi Sambada

52

MASI A DHARMATA

KAN RADIKH) DAN

AKSI AIR Enctum L.)

yarat

arm.)

A

KAL

EKSTRAK

 

UJI A

PENETAPA

AKTIVITAS1,1-DIFE

AN KANDUETANOLI

Diaju

Memp

D

UN

S ANTIOKSENIL-2-PIKUNGAN FEIK DAUN S

ukan untuk M

peroleh Gela

Progra

Damianus L

NIM

FAKULNIVERSITA

YO

i

SIDAN MENKRILHIDRAENOLIK TOSELASIH (O

SKRIPSI

Memenuhi Sa

ar Sarjana Fa

am Studi Far

Oleh:

Listyanta Edh

M: 07811405

LTAS FARMAS SANATAGYAKART

2011

NGGUNAKAZIL (DPPHOTAL FRAOcimum san

alah Satu Sy

armasi (S. Fa

rmasi

hi Sambada

52

MASI A DHARMATA

KAN RADIKH) DAN

AKSI AIR Enctum L.)

yarat

arm.)

A

KAL

EKSTRAK

  

ii  

  

iii  

  

iv  

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Mereka masih ada. Mungkin akan tetap begitu. Tapi aku terbiasa abaikan mereka. Dan mereka akan menyerah.

Bukankah begitu juga dengan mimpi -mimpi buruk kita?” /’Tapi mereka menghantuimu.’/ “Mereka masa laluku.

Semua orang dihantui masa lalu.” Pembicaraan John Nash (penderita schizophrenia pertama peraih nobel tahun 1994)

dengan Hansen (rekan John Nash di Princeton University) dalam film Beautifull Mind.

“Segala perkara dapat kutanggung di dalam Dia yang memberi kekuatan kepadaku”, Filipi 4:13

 

“Jika yang lebih baik bagimu - masih mungkin, mengapakah

engkau berhenti pada yang cukup?” Disampaikan oleh

Mario Teguh dalam MT Golden Point:

MENUNTUT = MEMINTA + KESUNGGUHAN

 

“Rasa malas itu seharusnya digunakan untuk membangun

pribadi manusia yang lebih baik bukan semestinya untuk

menjatuhkan pribadi manusia, misal: malas membuang waktu yang

menjauhkan kita dari tujuan awal kita hidup,”

D. L. Edhi Sambada (28 September 2010)

 

Skripsi ini aku persembahkan kepada:

Ibu, Bapak, keluarga besarku (Sastro Tinoyo dan Hadi Sumarto)

sebagai ungkapan rasa hormat dan baktiku,

perempuan yang membuat aku yakin analogi semesta ini tak terbatas,

semua sahabat, teman, dan almamaterku.

  

v  

  

vi  

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan anugerah-Nya

penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

Menggunakan Radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan

Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Etanolik Daun Selasih

(Ocimum Sanctum L.)” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini penulis telah mendapat

banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak sehingga skripsi ini dapat

terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin

mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah

membimbing penulis baik dalam penelitian maupun dalam penyusunan

skripsi ini.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

3. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

  

vii  

5. Teman-teman dan sahabatku, Andy Kurniawan dan Yosafat Rubbyanto

Widodo, kelas B angkatan 2007, dan kelas FST A angkatan 2007, terima

kasih atas bantuan dan kerjasamanya beserta segala suka duka yang telah

dilewati bersama dalam penelitian ini.

6. Koleta Stefani Sarinastiti yang selalu mendoakan dan mendorong agar

skripsi ini cepat untuk diselesaikan.

7. Tim tenis Prambanan (Somatso), pemuda Karangnongko (SKS), dan Paroki

Kalasan, yang telah memberi dorongan agar skripsi ini cepat diselesaikan

serta membantu penulis di saat ingin meluapkan emosi di lapangan tenis.

8. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat

disebutkan satu-persatu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna

baik dalam hal isi, maupun bahasa. Oleh karena itu, saran dan kritik yang

membangun sangat penulis harapkan untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhir

kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan menjadi

sumbangan dalam perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Januari 2011

Penulis

  

viii  

  

ix  

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ......................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS .............. v

KATA PENGANTAR ...................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................... viii

DAFTAR ISI .................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xviii

INTISARI ........................................................................................................ xix

ABSTRACT ........................................................................................................ xx

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................. 1

A. Latar Belakang Masalah ............................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ..................................................................................... 4

C. Keaslian Penelitian ....................................................................................... 5

D. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 6

E. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 7

  

x  

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA................................................................. 8

A. Selasih .......................................................................................................... 8

1. Keterangan botani selasih (Ocimum sanctum Linn.) ............................... 8

2. Deskripsi .................................................................................................. 9

3. Kandungan kimia dan kegunaan selasih .................................................. 9

B. Senyawa Fenolik .......................................................................................... 11

C. Antioksidan .................................................................................................. 16

1. Radikal bebas ........................................................................................... 16

2. Definisi antioksidan ................................................................................. 17

3. Mekanisme antioksidan ........................................................................... 18

4. Penggolongan antioksidan ....................................................................... 19

5. Manfaat antioksidan ................................................................................ 21

6. Metode pengujian aktivitas antioksidan .................................................. 21

D. Metode DPPH .............................................................................................. 24

E. Ekstraksi ....................................................................................................... 25

F. Kesahihan Metode Analisis.......................................................................... 30

G. Kesalahan dalam Metode Analisis ............................................................... 32

1. Kesalahan sistemik .................................................................................. 33

2. Kesalahan tidak sistemik ......................................................................... 34

H. Landasan Teori ............................................................................................. 34

I. Hipotesis ....................................................................................................... 36

  

xi  

BAB III METODOLOGI PENELITIAN........................................................... 37

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................. 37

B. Variabel ........................................................................................................ 37

1. Variabel bebas ......................................................................................... 37

2. Variabel tergantung ................................................................................. 37

3. Variabel pengacau ................................................................................... 37

C. Definisi Operasional ................................................................................... 37

1. Ekstrak etanolik daun selasih .................................................................. 37

2. Fraksi air .................................................................................................. 37

3. Persen inhibition concentration (%IC) .................................................... 37

4. Persen inhibition concentration 50 (IC50) ............................................... 38

D. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................................ 38

1. Bahan penelitian ...................................................................................... 38

2. Alat penelitian .......................................................................................... 38

E. Tatacara Penelitian ....................................................................................... 39

1. Determinasi tumbuhan ............................................................................. 39

2. Pengumpulan bahan ................................................................................. 39

3. Preparasi sampel ...................................................................................... 39

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji ................................................. 40

5. Uji pendahuluan ...................................................................................... 40

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ............................................... 42

  

xii  

7. Uji aktivitas antioksidan .......................................................................... 42

8. Penetapan kandungan fenolik total .......................................................... 44

F. Analisis Hasil ............................................................................................... 46

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 48

A. Hasil Determinasi Tumbuhan ...................................................................... 48

B. Hasil Pengumpulan Bahan ........................................................................... 48

C. Hasil Preparasi Sampel ................................................................................ 50

D. Hasil Uji Pendahuluan ................................................................................. 56

1. Uji fenolik ................................................................................................ 56

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ..................................................... 57

E. Hasil Optimasi Metode Uji Antioksidan ...................................................... 58

1. Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan ...................................... 59

2. Penentuan λ maksimum metode uji aktivitas antioksidan ....................... 60

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ....................................... 62

1. Akurasi metode uji aktivitas antioksidan ................................................. 64

2. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ................................................... 66

3. Linearitas metode uji aktivitas antioksidan ............................................. 66

4. Spesifisitas metode uji aktivitas antioksidan ........................................... 67

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ..................... 67

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ..................... 73

1. Penentuan OT penetapan kandungan fenolik total .................................. 73

2. Penentuan λ maksimum penetapan kandungan fenolik total ................... 74

  

xiii  

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ...................... 74

1. Akurasi penetapan kandungan fenolik total ........................................... 75

2. Presisi penetapan kandungan fenolik total ............................................. 76

3. Linearitas penetapan kandungan fenolik total........................................ 77

4. Spesifisitas penetapan kandungan fenolik total ..................................... 77

J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total .................................................... 77

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 81

A. Kesimpulan .................................................................................................. 81

B. Saran ............................................................................................................. 81

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 82

LAMPIRAN ....................................................................................................... 89

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 108

  

xiv  

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Mayoritas golongan senyawa fenolik pada tumbuhan (Mann,

et al., 1994) ......................................................................................... 12

Tabel II. Beberapa macam Reactive Oxygen Species (ROS) dan

antioksidan yang menetralkannya (Percival, M., 1998) ...................... 17

Tabel III. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH ......................... 25

Tabel IV. Rentang akurasi yang masih dapat diterima........................................ 31

Tabel V. Rentang KV yang masih dapat diterima ............................................. 32

Tabel VI. Hasil %Recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin ................. 65

Tabel VII. Hasil %Recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air .......... 65

Tabel VIII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH ................................... 69

Tabel IX. Hasil %IC fraksi air ekstrak etanolik daun selasih

menggunakan radikal DPPH ............................................................. 69

Tabel X. Hasil nilai IC50 fraksi air ekstrak etanolik daun selasih dan

rutin .................................................................................................... 70

Tabel XI. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan rutin dan fraksi

air ekstrak etanolik daun selasih ........................................................ 72

Tabel XII. Hasil %Recovery dan %CV penetapan kandungan fenolik

total .................................................................................................... 76

  

xv  

Tabel XIII. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat ...................... 79

Tabel XIV. Hasil absorbansi fraksi air ................................................................. 80

Tabel XV. Hasil kandungan fenolik total fraksi air ............................................ 80

  

xvi  

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi pembentukan dan penggabungan radikal fenoksil (a,

b, c, dan d adalah radikal fenoksil) (Bruneton, 1999) ....................... 13

Gambar 2. Oksidasi rutin (dos Santos, Mazo, dan Cavalheiro, 2008) .................. 15

Gambar 3. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH

dengan antioksidan (Witt , Lalk, Hager, dan Voigt, 2010) ............... 25

Gambar 4. Skema jalannya penelitian ................................................................. 47

Gambar 5. Hasil uji fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = kontrol

positif [asam galat], dan C = larutan uji [fraksi air ekstrak

etanolik daun selasih]) ....................................................................... 57

Gambar 6. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol

negatif, B = kontrol positif [rutin], dan C = larutan uji [fraksi

air ekstrak etanolik daun selasih]) ..................................................... 57

Gambar 7. Grafik penentuan OT rutin ................................................................. 59

Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi air .......................................................... 60

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH ............................................ 61

Gambar 10. Spektra panjang gelombang maksimum DPPH pada tiga seri

konsentrasi (keterangan: konsentrasi A = 0,080 mM; B =

0,048 mM; C = 0,016 mM)................................................................ 62

Gambar 11. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

rutin .................................................................................................... 63

  

xvii  

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi

air ekstrak etanolik daun selasih ........................................................ 64

Gambar 13. Struktur rutin (dos Santos, et al., 2008) ........................................... 68

Gambar 14. Donasi proton senyawa antioksidan ke radikal DPPH

(Prakash, et al., 2010) ...................................................................... 70

Gambar 15. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolik total ................. 73

Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum senyawa berwarna

biru pada tiga seri konsentrasi asam galat (keterangan:

konsentrasi asam galat A = 50 µg/mL; B = 100 µg/mL; C =

150 µg/mL) ...................................................................................... 74

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linear antara konsentrasi asam

galat dengan absorbansi ................................................................... 75

Gambar 18. Struktur asam galat (Eslami, Pasanphan, Wagner, dan

Buettner, 2010) ................................................................................. 78

Gambar 19. Reaksi senyawa fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu ................... 79

  

xviii  

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman selasih .............................. 89

Lampiran 2. Gambar tanaman selasih dari daerah goa Selarong

(Yogyakarta) ................................................................................... 90

Lampiran 3. Perhitungan rendemen .................................................................... 90

Lampiran 4. Data penimbangan bahan ................................................................ 91

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding,

dan larutan uji ................................................................................ 92

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi ..................................................................... 94

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ...................................... 99

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH .................. 101

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak etanolik daun

selasih dan rutin .............................................................................. 102

Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan

PASW Statistics 18 .......................................................................... 103

Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total ......................... 104

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total .............................. 104

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total .............................................. 106

  

xix  

INTISARI

Antioksidan merupakan senyawa yang menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Selasih diketahui memiliki senyawa fenolik. Senyawa tersebut beraktivitas antioksidan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksi dan serta kandungan fenolik total fraksi air ekstrak etanolik daun selasih. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH memiliki λ maksimum di 515,5 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi air). Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru. Larutan tersebut memiliki λ maksimum di 750 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi air ekstrak etanolik daun selasih mempunyai aktivitas antioksidan kuat dengan nilai IC50 sebesar 50,93±0,76 µg/mL. Kandungan fenolik total sebesar 5,04±0,03 mg ekivalen asam galat per g fraksi air.

Kata kunci: fraksi air ekstrak etanolik daun Ocimum sanctum L., antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total.

  

xx  

ABSTRACT

Antioxidants are compounds that inhibit oxidation reactions by binding free radicals. Consequently, cell damage by free radicals can be inhibited. Holy basil is known to have phenolic compounds. This research was conducted to determine the activity and content of phenolic antioxidants and total the water fraction from ethanolic extract of holy basil leaves. Tests for antioxidant activity using the radical DPPH, expressed as Inhibition Concentration 50 (IC50). The presence of antioxidant compound, will change colour of DPPH from purple to yellow. DPPH has a λ maximum at 515,5 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases as stochiometric. Total phenolics content determined by the Folin-Ciocalteu method, expressed as mg equivalent gallic acid per g of water fraction. Phenolics compound will oxidated by Folin-Ciocalteu reagent in alkaline conditions, formed blue solution. The solution has a maximum λ at 750 nm. The results showed that the water fraction from ethanolic extract of holy basil leaves have strong antioxidant activity with IC50 value of 50,93±0,76 µg/mL. Total phenolic content of 5,04±0,03 mg equivalent gallic acid per g water fraction.

Keywords: water fraction from ethanolic extract of Ocimum sanctum L. leaves, antioxidant, DPPH, total phenolic content

 

  

1  

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Tanpa disadari, dalam tubuh manusia terbentuk radikal bebas secara terus

menerus, baik melalui proses metabolisme sel normal maupun akibat respon

terhadap pengaruh dari luar tubuh, seperti paparan polusi lingkungan, ultraviolet,

dan asap rokok. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron

tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan

menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara

menyerang dan mengikat elektron molekul sekitarnya misalnya protein, asam

lemak tak jenuh, dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari

molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal

bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat

merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel

menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan

berlanjut pada pembentukan sel kanker (Salganik, 2001; Winarsi, 2007). Selain itu

radikal bebas dalam tubuh dapat memicu munculnya berbagai penyakit

degeneratif, seperti kardiovaskuler, penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010), dan

osteoporosis akibat dari perusakan sel secara oksidatif (Winarsi, 2007).

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau

reduktan. Dengan kata lain, antioksidan merupakan senyawa yang dapat

menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas.

2  

  

Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat (Winarsi,

2007). Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan juga efektif

mengurangi oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan

destruksi biomolekul makanan (Decker, 1998).

Sumber antioksidan dapat berasal dari alam maupun hasil sintesis.

Antioksidan alam seperti vitamin C, vitamin E, dan flavonoid terbukti aman

dikonsumsi oleh manusia (Winarsi, 2007), sedangkan antioksidan sintesis seperti

butyl hydroxy anisol (BHA), propil galat (PG), tert-butyl hydroquinone (tBHQ)

mempunyai efektivitas yang tinggi tetapi dapat menyebabkan kanker melalui

mutasi pada DNA (Malkinson, 1999; Gharavi, Haggarty, dan El-Kadi, 2007). Hal

inilah yang menyebabkan adanya penelitian eksplorasi sumber antioksidan alam

yang berasal dari tumbuhan.

Selasih digunakan bijinya oleh masyarakat Indonesia sebagai bahan

campuran minuman yang bersifat menenangkan (Solikhah, 2007). Selain itu,

selasih digunakan untuk mengirim bunga di kuburan yang disertakan dalam

rangkaian bunga pada adat Jawa. Di India selasih disebut sebagai “Queen of

Herbs.” Hal ini dikarenakan selasih di India telah lama digunakan dalam

pengobatan Ayurveda dan memiliki kemampuan adaptogen yang sangat poten

(Miller dan Miller, 2003). Peneliti sangat tertarik dengan selasih karena di India

selasih telah lama dimanfaatkan sebagai tanaman obat sedangkan di Indonesia

belum ditemukan penelitian tentang potensi selasih dalam pengobatan.

3  

  

Kandungan senyawa fenolik selasih berupa eugenol, cirsilineol,

isothymusin, isothymonin, asam rosmarinat, orientin, dan vicenin. Akan tetapi

tetap terdapat perbedaan komposisi maupun jumlah senyawa bioaktif dalam

selasih sebagai akibat pembibitan pada daerah yang berbeda (Wangcharoen dan

Morasuk, 2007 a). Dalam suatu penentuan aktivitas antioksidan telah diketahui

bahwa senyawa yang menyebabkan aktivitas antioksidan berupa senyawa fenolik.

Kesimpulan ini diperoleh karena terdapat hubungan yang langsung antara

aktivitas antioksidan suatu tumbuhan dengan kandungan total fenoliknya (Aqil,

Ahmad, dan Mehmood, 2006). Oleh karena adanya kandungan senyawa fenolik

pada selasih, maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan

dan kandungan total senyawa fenolik dari selasih.

Mayoritas senyawa fenolik mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak

tersulih, atau terhubung dengan suatu gula. Oleh karena itu senyawa tersebut

merupakan senyawa polar sehingga larut dalam pelarut polar seperti etanol,

metanol, n-butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain-lain

(Markham, 1988). Pemilihan penggunaan ekstrak etanolik (76%) didasarkan dari

adanya senyawa fenolik yang lebih larut dalam pelarut polar, dari keamanan

ekstrak etanolik yang dihasilkan daripada menggunakan penyari metanol, dan dari

penelitian Wangcharoen dan Morasuk (2007 a & b). Penelitian tersebut

menggunakan penyari etanol 76% untuk menghasilkan aktivitas antioksidan yang

efektif dan efisien dari daun selasih. Pemilihan fraksi air didasarkan pada

keamanan konsumsi fraksi yang dihasilkan. Selain itu, didasarkan pada penelitian

sejenis oleh Widodo (2011) yang telah menentukan aktivitas antioksidan dari

4  

  

fraksi etil asetat daun selasih yang kepolarannya lebih rendah daripada air

sehingga peneliti ingin memperoleh informasi aktivitas antioksidan daun selasih

dari fraksi yang lebih polar daripada etil asetat.

Metode yang digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan dalam

penelitian ini adalah metode DPPH. Tujuan metode ini adalah untuk meneliti

parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan

(IC50). Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk

pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva,

van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller,

2010). Pada penentuan kandungan total fenolik digunakan metode Folin-

Ciocalteau. Metode ini umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan

fenolik total setara massa ekivalen asam galat pada uji aktivitas aktivitas

antioksidan sumber tumbuhan (Aqil, et al., 2006).

B. Perumusan Masalah

1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih

dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50?

2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi air ekstrak etanolik daun selasih yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

5  

  

C. Keaslian Penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan

menggunakan radikal DPPH dan penetapan kandungan fenolik total daun selasih

(Ocimum sanctum L.) pernah dilakukan oleh:

1. Aqil, et al., 2006, dengan judul “Antioxidant and Free Radical Scavenging

Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal.” Penelitian ini

menggunakan daun selasih dalam bentuk serbuk kering untuk diekstrak dengan

metanol 98%. Ekstrak metanolik inilah yang kemudian dijadikan bahan uji.

2. Wangcharoen dan Morasuk, 2007 a, dengan judul “Antioxidant Capacity

and Phenolic Content of Holy Basil.” Penelitian ini menggunakan daun selasih

dari pasar di Chiangmai (Thailand) dan diolah menjadi ekstrak etanolik (60%)

dari daun selasih sebagai bahan ujinya.

3. Wangcharoen dan Morasuk, 2007 b, dengan judul “Antioxidant Capacity

and Phenolic Content of Some Thai Culinary Plants.” Penelitian ini menggunakan

ekstrak etanolik (18%, 36%, 57%, 76%, dan 95%) daun selasih sebagai bahan

ujinya.

4. Veeru, Kishor, dan Meenakshi, 2009, “Screening of Medicinal Plant

Extracts for Antioxidant Activity.” Penelitian ini menguji ekstrak metanolik daun

selasih.

6  

  

5. Widodo, 2011, dengan judul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan

Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik

Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Selasih (Ocimum sanctum L.).”

Penelitian ini menguji fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun selasih.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah

bahwa pada penelitian ini daun selasih dipanen dari daerah Goa Selarong,

Yogyakarta (RT 1/RW 3 Pedukuhan Kentolan Lor, Kelurahan Gowasari,

Kecamatan Pajangan, Kabupaten Bantul) dan dalam keadaan segar diolah untuk

didapatkan fraksi air ekstrak etanolik (76%) daun selasih kemudian diuji aktivitas

antioksidan menggunakan radikal DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik

totalnya.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada

perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang

aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih dengan menggunakan

radikal DPPH dan kandungan fenolik total fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

2. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bagi penelitian

lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai aktivitas antioksidan alami dan

kandungan fenolik daun selasih.

7  

  

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Tujuan umum penelitian ini adalah menguji aktivitas antioksidan

menggunakan radikal bebas DPPH dan menetapkan kandungan fenolik total fraksi

air ekstrak etanolik daun selasih.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik daun

selasih dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

b. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi air ekstrak etanolik daun selasih

yang dinyatakan dalam massa ekivalen asam galat.

  

8  

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Selasih

1. Keterangan botani selasih (Ocimum sanctum Linn.)

Tumbuhan selasih termasuk dalam familia Lamiaceae (Kartesz, 2010).

Sinonim: O. tenuiflorum L., Geniosporum tenuiflorum (L.) Merr.

Moschosma tenuiflorum (L.) Heynhold, Ocimum album Blanco, O. anisodorum

Muell., O. brachiatum sensu Hasskarl (non Blume), O. flexuosum sensu Blanco,

O. frutescens sensu Burm. f. (non L.), O. gratissimum sensu Lour (non L.), O.

hirsutum Benth., O. inodorum. Burm. f., O. monachorum L., O. nelsonii, Zipp ex

Span., O. sanctum L. var. hirsute (Benth.) Hook.f., O. villosum Roxb., O.

virgatum Blanco , O. virgatum, O. tomentosum Lam., Lumnitzera tenuiflora (L.)

Spreng., Plectranthus monachorum (L.) Spreng., P. striatus sensu Meschler et

Hosseus. (non Benth.) (Anton, et al., 2009).

Nama daerah: Sumatera: selaseh. Jawa: telasih, solasih, atau selasih.

Sulawesi: kukuru atau amping (Wijayakusuma, 2005).

Common name: Inggris: holy basil, sacred basil, monks basil, Perancis:

basilic sacré, basilica thailandais, Jerman: heiliges basilikum, königsbasilikum,

indisches basilikum, dan Italia: basilico sacro (Anton, et al., 2009).

9  

  

2. Deskripsi

Selasih merupakan tanaman semusim yang tumbuh tegak, bercabang

banyak dibagian atas dan berbau harum. Batang tumbuhan ini berwarna

kecoklatan, bersegi empat. Daunnya tunggal, letaknya berhadapan, bertangkai

yang panjangnya 0,5-2 cm. Helai daunnya berbentuk bulat telur sampai

memanjang, permukaan daunnya berambut halus dengan bintil-bintil kelonjar,

tulang daunnya menyirip, tepi daunnya bergerigi, panjangnya 3,5-7,5 cm dan

lebar 1,5-2,5 cm, warnanya hijau tua. Bunganya berwarna putih atau lembayung,

tersusun dalam tandan yang panjangnya 5-30 cm, keluar diujung percabangan.

Bijinya keras, berwarna coklat tua, dan bila dimasukkan ke dalam air akan

mengembang seperti selai. Tinggi tumbuhan itu mencapai 50-80 cm, tumbuh baik

di tempat yang lembab dan teduh. Selasih tumbuh liar di tepi-tepi jalan, sawah

kering, hutan jati, dan tepi ladang atau dapat juga ditanam di pekarangan rumah.

Tumbuhan ini dapat ditemukan di daerah dataran rendah sampai ketinggian 450

meter, kadang-kadang ditanam sampai 1.100 meter diatas permukaan laut

(Wijayakusuma, 2005).

3. Kandungan kimia dan kegunaan selasih

Selasih telah lama digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai bahan

campuran minuman yang bersifat menenangkan (Solikhah, 2007).

Aktivitas antioksidan dari komponen dalam selasih merupakan alasan

utama kenapa selasih mempunyai aktivitas farmakologi. Senyawa fenolik yang

terdapat dalam selasih adalah fenolik berupa eugenol, cirsilineol, isothymusin,

isothymonin, asam rosmarinat, orientin, dan vicenin. Dalam selasih juga

10  

  

terkandung zinc yang dapat berperan juga sebagai antioksidan yang berasal dari

mineral. Bagaimanapun juga wajar bila terdapat perbedaan komposisi maupun

kandungan senyawa bioaktif dalam selasih sebagai akibat pembibitan pada daerah

yang berbeda (Wangcharoen dan Morasuk, 2007 a). Laporan penelitian Aqil, et al,

(2006) bahwa yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan ekstrak metanol

daun selasih adalah senyawa fenol, glikosida, dan saponin. Ramesh dan Satakopan

(2010), melaporkan bahwa dalam ekstrak 50% hidroalkoholik daun selasih

mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, glikosida, fenol, tanin, senyawa thiol,

dan terpenoid.

Selasih juga memiliki kandungan asam ursolat yang memiliki peran

sebagai antiinflamasi dan anti tumor (Aggarwal, Danda, dan Bokyung, 2008).

Tumbuhan ini telah lama digunakan orang-orang di benua Asia dalam pengobatan

tradisional, misalnya untuk mengobati penyakit maag, diare, sakit kepala, dan

batuk (Wangcharoen dan Morasuk, 2007 a).

Dalam fraksi n-butanol ekstrak etanolik daun selasih telah ditemukan 3

senyawa baru, yaitu ocimarin, ocimumosida A, dan ocimumosida B.

Ocimumosida A dan ocimumosida B memiliki aktivitas antistres (Maurya,

Akanksha, Gupta, Singh, Srivastava, dan Palit, 2007; Henson, 2008). Selama

situasi stres, kebutuhan energi suatu organisme meningkat, sehingga dapat

menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas dapat menyebabkan oksidasi dari

asam nukleat dan protein. Radikal bebas juga dapat merusakkan biomembran,

hasil dari peningkatan peroksidasi lipid. Selama proses ini, stres oksidatif dapat

11  

  

diminimalkan dengan senyawa adaptogen atau antioksidan (Kenjale, Shah, dan

Sathaye, 2007).

Wangcharoen dan Morasuk (2007a) melaporkan bahwa kandungan fenolik

total fraksi air ekstrak etanolik (57%) daun selasih sebesar 12,60±1,02 mg untuk

selasih putih dan 19,46±1,97 mg untuk selasih merah ekivalen asam galat per g

fraksi air.

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik adalah substansi organik yang terdiri dari senyawa

aromatik dengan substituen hidroksil. Senyawa induk adalah fenol tetapi

kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol. Sumber senyawa fenolik

sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat melimpah pada sumber

tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan yang diketahui, golongan

yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson, Hobbs, Banthorpe, dan

Harborne, 1994).

12  

  

Tabel I. Mayoritas golongan senyawa fenolik pada tumbuhan (Mann, et al., 1994)

Jumlah atom

karbon

Rangka dasar Golongan Contoh

6 C6 Fenol Catechol Benzokuinon 2,6-Dimetoksibenzokuinon

7 C6-C1 Asam Fenol p-Hidroksibenzoat 8 C6-C2 Asetofenon 3-Asetil-6-metoksibenzaldehid

Asam fenilasetat p-Hidroksifenilasetat 9 C6-C3 Asam hidroksisinamat Kafeat

Fenilpropen Eugenol Kumarin Aeskuletin Isokumarin Bergenin Kromon Eugenin

10 C6-C4 Naftokuinon Plumbagin 13 C6-C1-C6 Xanton Mangiferin 14 C6-C2-C6 Stilben Asam lunularat

Antrakuinon Emodin 15 C6-C3-C6 Flavonoid Kuersetin

Isoflavonoid Genistein 18 (C6-C3)2 Lignan Podofilotoksin 30 (C6-C3-C6)2 Biflavonoid Amentoflavon n (C6-C3)n Lignin

(C6)n Catechol melanin (C6-C3-C6)n Flavolan

Sejauh ini senyawa fenolik tumbuhan merupakan golongan mayoritas

senyawa yang bertindak sebagai antioksidan atau penangkap radikal bebas. Hal ini

menjadikan sangat beralasan untuk mendeterminasikan jumlah kandungan total

fenolik pada ekstrak tanaman yang telah dipilih (Veeru, et al., 2009).

13  

  

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman

digunakan sehingga menjadi senyawa bioaktif dari suatu tumbuhan. Oleh karena

itu, perhatian peneliti telah tertuju pada identifikasi tumbuhan yang memiliki

aktivitas antioksidan yang dapat digunakan untuk konsumsi manusia sehari-hari

(Ebrahimzadeh, Pourmorad, dan Hafezi, 2007). Aktivitas antioksidan dari

senyawa fenolik didapatkan dengan cara mereduksi radikal untuk tidak terjadinya

reaksi samping yang merugikan. Mekanismenya melalui kemampuan gugus fenol

menangkap radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya melalui proses

transfer elektron, sehingga senyawa fenolik berubah menjadi radikal fenoksil.

Radikal fenoksil ini terstabilkan oleh adanya efek resonansi (Bruneton, 1999;

Marxen, Vanselow, Lippemeier, Hintze, Ruser, dan Hansen, 2007).

R

OH

-e, -H+R

O

a b c d

R

O

R

O

R

O

c+ d

R

O

R

O

O

R

HO

R

H

OH

R

OH

R

Gambar 1. Reaksi pembentukan dan penggabungan radikal fenoksil (a, b, c,

dan d adalah radikal fenoksil) (Bruneton, 1999)

14  

  

Sifat kimiawi dari senyawa fenolik alam sangat rumit. Faktanya sebagian

besar senyawa tersebut berbentuk konjugat dalam tumbuhan, prinsip konjugasinya

dengan residu gula yang terhubung dengan satu atau lebih senyawa fenolik.

Mayoritas senyawa fenolik dapat diekstraksi dengan metanol atau kloroform

(Mann, et al., 1994). Golongan yang terbanyak dari senyawa fenolik adalah

flavonoid. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau

suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar. Pada umumnya flavonoid larut

dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida,

dimetilformamida, air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoid

(bentuk umum yang ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah

larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air

merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang

kurang polar seperti isoflavon, flavon, dan flavonol yang termetoksilasi cenderung

lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).

Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif dapat

ditentukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Veeru, et al., 2009). Metode ini

memakai reagen fenol asam fosfomolibdat-fosfotungstat yang biasa disebut

reagen fenol Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah dengan adanya senyawa

yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan menyebabkan terbentuk

senyawa yang berwarna biru. Intensitas warna biru yang terbentuk proporsional

dengan jumlah senyawa yang dapat mereduksi dan dapat dideteksi dengan

spektrofotometer dengan rentang panjang gelombang 500-750 nm (Abul-Fadl,

1949).

15  

  

Contoh senyawa fenolik yang sering diteliti adalah rutin dan asam galat.

Rutin sering digunakan sebagai pembanding aktivitas antioksidan bahan

tumbuhan karena telah banyak diteliti tentang aktivitas antioksidannya (Armala,

2009; Sunardi, 2007).

Gambar 2. Oksidasi rutin (dos Santos, Mazo, dan Cavalheiro, 2008)

Sedangkan asam galat sering digunakan dalam berbagai jurnal ilmiah

pengujian kandungan fenolik total sebagai ekivalen terhadap kandungan fenolik

total bahan tumbuhan yang diuji (Javanmardi, Stushnoff, Locke, dan Vivanco,

2003; Wangcharoen dan Morasuk, 2007 a&b; Dehpour, et al., 2009; Inglett, Rose,

Chen, Stevenson, dan Biswas, 2009; Veeru, et al., 2009).

Rutin (3’,4’,5,7-tetrahidroksiflavon-3β–D-rutinosida) atau vitamin P

merupakan senyawa fenolik yang tergolong dalam flavonoid. Gugus O-dihidroksi

pada cincin B, diasosiasikan dengan aktivitas antioksidan rutin (Lopez, Martinez,

Del-Valle, Ferrit, dan Luque, 2003). Rutin diaplikasikan untuk mengobati tekanan

Rutin Produk teroksidasi

16  

  

darah tinggi dan penyakit yang berkaitan dengan vaskuler (dos Santos, et al.,

2008). Nilai IC50 rutin dari penelitian aktivitas antioksidan yang dilakukan oleh

Armala (2009) sebesar 7,909 µg/mL, sedangkan oleh Sunardi (2007) sebesar

7,000 µg/mL. Semakin kecil nilai IC50 suatu bahan uji maka semakin efektif

bahan uji tersebut berperan sebagai antioksidan. Penelitian aktivitas antioksidan

yang dilakukan Wangcharoen dan Morasuk (2007a) dengan bahan uji berupa

ekstrak etanolik (60%) dari daun selasih, IC50 sebesar 554±17 µg/mL untuk

selasih putih dan 333±13 µg/mL untuk selasih merah.

Asam galat (asam 3,4,5-trihidroksibenzoat) merupakan senyawa fenolik

yang bukan tergolong dalam flavonoid, secara luas tersebar dan terdapat dalam

berbagai macam tumbuhan. Asam galat termasuk antioksidan alami yang sering

digunakan sebagai pengawet makanan. Gugus fungsi dalam struktur asam galat

yang bertanggungjawab memberikan aktivitas antioksidan adalah 3 gugus

hidroksil (Lopez, et al., 2003).

C. Antioksidan

1. Radikal bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak

berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan

menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara

menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Target

utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta

unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul-molekul target tersebut, yang

paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh.

17  

  

Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda

pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA

sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel

kanker (Winarsi, 2007).

Tabel II. Beberapa macam Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan yang menetralkannya (Percival, 1998)

ROS Neutralizing Antioxidants Radikal Hidroksil Vitamin C, glutation, flavonoid, asam lipoat Radikal Superoksida Vitamin C, glutation, flavonoid, superoksida

dismutase Peroksida Hidrogen Vitamin C, glutation, flavonoid, beta karoten,

vitamin E, asam lipoat Peroksida Lipid Vitamin E, beta karoten, ubikuinon, flavonoid,

glutation peroksidase

Kemiripan sifat antara radikal bebas dan oksidan terletak pada agresivitas

untuk menarik elektron di sekelilingnya. Berdasarkan sifat ini, radikal bebas

dianggap sama dengan oksidan. Tetapi perlu diketahui, bahwa tidak setiap

oksidan merupakan radikal bebas. Radikal bebas lebih berbahaya dibandingkan

dengan senyawa oksidan non-radikal (Winarsi, 2007).

2. Definisi antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau

reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil tetapi mampu menginaktivasi

berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal.

18  

  

Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi

oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya kerusakan sel dapat dihambat

(Winarsi, 2007).

Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai

pengawet dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk

makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak

diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi). Pengertian antioksidan yang

lebih relevan secara biologis ialah senyawa alami atau sintetik yang ditambahkan

ke dalam produk untuk mencegah atau menunda kerusakan yang disebabkan oleh

udara (Huang, Ou, dan Prior, 2005).

3. Mekanisme antioksidan

Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat

dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim

yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoksida dismutase, katalase,

glutation peroksidase, dan glutation reduktase (Winarsi, 2007).

Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara,

yaitu sebagai berikut:

a. penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E,

b. pengkelat logam transisi, misalnya EDTA,

c. inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen, dan

d. kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation

peroksidase (Huang, et al., 2005).

19  

  

Aktivitas senyawa polifenol sebagai antioksidan meliputi tiga mekanisme

sebagai berikut.

(a) Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS)

ataupun radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R’, RO’ dan

ROO’ dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen,

(b) mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti

reaksi melalui khelasi metal, dan

(c) interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan

dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000; Winarsi, 2007;

Pereira, Valentão, Pereira, dan Andrade, 2009).

4. Penggolongan antioksidan

Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam,

yaitu antioksidan sintetik dan alami (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, dan

Kufrevioglu, 2004).

a. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui sintesis

secara kimia, contohnya: ter-butyl hidroquinone (tBHQ), butylated

hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), dan propil galat (PG)

(Gulcin, et al., 2004). Konsentrasi rendah dari antioksidan tBHQ dan BHA telah

lama digunakan untuk mencegah oksidasi dari produk makanan sehingga dapat

menstabilkan produk tersebut (nutrisi, rasa, maupun warna). Dalam konsentrasi

yang tinggi, tBHQ dapat menyebabkan kanker. Penyebabnya adalah metabolit dari

oksidasi tBHQ, yaitu 2-tertbutyl-1,4-benzoquinone (tBBQ) dan ROS (Gharavi,

20  

  

Haggarty, dan El-Kadi, 2007). Peters, Rivera, Jones, Monks, dan Lau pada tahun

1996 melaporkan bahwa antioksidan sintetik, yaitu tBHQ dan 3-tert-butyl-4-

hydroxyanisole dapat mempromosi karsinogenesis renal dan kandung kemih pada

tikus. Walaupun dalam penelitian tersebut tidak diketahui secara pasti mekanisme

karsinogenesisnya. Begitu pula dengan BHA dan BHT, dalam konsentrasi tinggi

dan penggunaan yang lama, BHA dapat menginduksi tumor pada perut hewan uji

sedangkan BHT dapat menginduksi tumor pada liver hewan uji. Semua publikasi

juga setuju dengan fakta tersebut. Lain halnya vitamin E yang merupakan

antioksidan alami tidak memiliki sifat karsinogenik (Parke dan Lewis, 1992; Kahl

dan Kappus, 1993). BHT yang diadministrasikan secara kronis terhadap mencit

menyebabkan menurunnya konsentrasi alpha isozyme of protein kinase C (PKCa)

dalam paru-paru sehingga dapat menginisiasi terjadinya tumor (Kahl, 1984; dan

Malkinson, 1999).

b. Antioksidan alami

Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung oleh

tanaman maupun tubuh, contohnya: senyawa polifenol flavonoid, tanin, katalase

dan glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2 menjadi H2O dan

O2, sedangkan superoksid dismutase bekerja dengan cara mengkatalisis reaksi

dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi H2O2 (Percival, 1998; Gulcin, et

al., 2004; Winarsi, 2007 ).

21  

  

5. Manfaat antioksidan

Antioksidan bermanfaat dalam mencegah kerusakan oksidatif yang

disebabkan radikal bebas dan ROS sehingga mencegah terjadinya berbagai macam

penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, jantung koroner (Ames, 1983; Mbata,

2010), kanker (Salganik, 2001) serta penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010).

Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan, juga efektif mengurangi

oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan destruksi

biomolekul yang ada dalam makanan (Decker, 1998).

6. Metode pengujian aktivitas antioksidan

Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara

kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu

senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode

kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini

dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun.

Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat

kelompok, yaitu sebagai berikut.

(a) Senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium

permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat);

(b) senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa diazo,

pereaksi diazo, magnesium sulfat, aldehid aromatic-anisaldehid, vanillin dan

pereaksi Gibbs yang membentuk indofenol (akan membentuk garam

berwarna dalam kondisi basa);

22  

  

(c) radikal bebas stabil yang menerima radikal hidrogen dari antioksidan

(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil); dan

(d) senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna

(palladium klorida dan pentadium klorida) (Davidek, 1997).

Pada tahun 2005, Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar, dan Lakshman

melaporkan bahwa uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara

spektrofotometri. Uji tersebut dilakukan secara in-vitro.

i. Metode conjugated diene

Metode ini mengukur absorbansi konjugasi dari diena sebagai hasil dari

oksidasi asam lemak tak jenuh pada panjang gelombang UV 234 nm. Prinsip

metode ini adalah selama oksidasi asam linoleat, ikatan rangkap terkonversi ke

bentuk ikatan rangkap terkonjugasi, yang dikarakterisasi dengan absorpsi kuat

pada panjang gelombang UV 234 nm. Aktivitasnya diekspresikan dengan istilah

inhibitory concentration (IC50).

ii. Metode penangkapan radikal hidroksil

Kapasitas penangkapan radikal hidroksil dari suatu ekstrak berhubungan

langsung dengan aktivitas antioksidannya. Metode ini memerlukan generation in-

vitro dari radikal hidroksil menggunakan Fe3+/ascorbate/EDTA/H2O2

menggunakan reaksi Fenton. Penangkapan radikal hidroksil sebagai tanda adanya

aktivitas antioksidan. Radikal hidroksil akan bereaksi dengan dimetil sulfoksida

(DMSO) untuk membentuk formaldehid. Formaldehid akan menghasilkan warna

23  

  

kuning dengan reagen Nash (2M ammonium asetat dengan 0,05M asam asetat dan

0,02M asetil aseton dalam air destilasi). Intensitas warna kuning diukur secara

spektrofotometri pada panjang gelombang 412 nm. Aktivitas antioksidan

diekspresikan dengan %penangkapan radikal hidroksil.

iii. Metode Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)

Aktivitas antioksidan diestimasi dengan mengukur peningkatan absorbansi

dari pembentukan ion-ion fero dari reagen FRAP yang mengandung 2,4,6-

tri(2-piridil)-s-triazin (TPTZ) dan FeCl3.6H2O. Absorbansi diukur secara

spektrofotometri pada 595nm.

iv. Metode Trapping Antioxidant Parameter (TRAP)

Metode ini didefinisikan sebagai pengukuran parameter total radikal yang

terjebak antioksidan. Fluororesen dari R-phycoerythrin yang dipadamkan oleh

2,2’-azo-bis (2-amidino-propan) hidroklorida (ABAP) sebagai generator radikal.

Reaksi pemadaman ini diukur sebagai adanya aktivitas antioksidan (Shivaprasad,

et al., 2005).

Selain metode-metode di atas, terdapat metode lain yang dapat digunakan

dalam uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan, yaitu metode

DPPH.

24  

  

D. Metode DPPH

Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan

tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas DPPH

(Shivaprasad, et al., 2005). Tujuan metode ini adalah mengetahui parameter

konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50).

Hal ini dapat dicapai dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari

metode tersebut (Molyneux, 2004). DPPH merupakan radikal bebas yang dapat

bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna

untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak

(Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).

Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara

stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Perubahan absorbansi

akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa

molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dinis, et al., 1994).

Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk

pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva,

van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller,

2010).

25  

  

Gambar 3. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)

Menurut Ariyanto cit. Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan

senyawa uji menggunakan metode DPPH dapat digolongkan menurut nilai IC50

(Tabel III).

Tabel III. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH

Intensitas Nilai IC50

Sangat kuat < 50 µg/mL

Kuat 50-100 µg/mL

Sedang 101-150 µg/mL

Lemah > 150 µg/mL

26  

  

E. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi

zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

selanjutnya pelarut diuapkan sampai semua atau hampir semua pelarut menguap

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat

aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari

sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan

bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari

semakin luas (Harborne, 1987).

Dalam memilih cairan penyari, seseorang harus mempertimbangkan

banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini.

(1) Murah dan mudah diperoleh,

(2) stabil secara fisika dan kimia,

(3) bereaksi netral,

(4) tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,

(5) selektif,

(6) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan

(7) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku (Anonim, 1986).

Golongan yang terbanyak dari senyawa fenolik adalah flavonoid.

Tumbuhan segar merupakan bahan awal yang ideal untuk menganalisis flavonoid,

walaupun cuplikan kering yang telah disimpan hati-hati selama bertahun-tahun

27  

  

mungkin masih tetap dapat memberikan hasil yang memuaskan. Tetapi, dalam

bahan tumbuhan yang sudah lama, ada kecenderungan glikosida diubah menjadi

aglikon karena pengaruh fungi, dan aglikon yang peka menjadi teroksidasi. Bila

menggunakan bahan tumbuhan segar, setelah cuplikan dipilih sebagai tanda bukti,

disarankan untuk mengeringkan sisanya cepat-cepat (untuk mencegah kerja

enzim). Seringkali merupakan tindakan yang bijaksana bila kita mengekstraksi

cuplikan bahan tumbuhan yang belum dikeringkan untuk kemudian dipakai pada

pemeriksaan secara kromatografi untuk melihat apakah proses pengeringan

mengubah susunan flavonoid atau tidak (Markham, 1988).

Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan

zat dari bahan yang akan disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi:

infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Anonim, 1986).

Infundasi merupakan proses penyarian yang umumnya digunakan untuk

menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Sari

yang dihasilkan tidak stabil dan mudah tercemari oleh kapang dan kuman. Oleh

karena itu, sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24

jam. Infundasi dibuat dengan cara menyari simplisia dengan air pada suhu 900C

selama 15 menit (Anonim, 1986).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan

penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan

pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang

28  

  

sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam

sel. Dapat dilakukan modifikasi terhadap teknik maserasi, misalnya teknik

remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk

simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan

diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Anonim, 1986).

Perkolasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah terbasahi. Cairan penyari akan

mengalir dari atas ke bawah melalui serbuk kemudian cairan akan melarutkan zat

aktif di dalam sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Serbuk simplisia

yang akan diperkolasi dibasahi terlebih dahulu dengan cairan penyari kemudian

dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat perkolasi (perkolator) sambil tiap

kali ditekan. Serbuk kemudian ditutup dengan kertas saring dan cairan penyari

dialirkan hingga di atas permukaan serbuk masih terdapat lapisan penyari.

Setelah 24 jam, kran dibuka dan diatur hingga kecepatan tetesannya adalah 1 mL

permenit. Akhir proses perkolasi ditentukan dengan pemeriksaan zat secara

kualitatif pada perkolat terakhir (Anonim, 1986).

Penyarian berkesinambungan merupakan gabungan antara proses untuk

menghasilkan ekstrak cair dan proses penguapan. Alat yang digunakan misalnya

soxhlet. Pada penyarian ini, cairan penyari dipanaskan hingga mendidih,

kemudian uap penyari akan naik ke atas kemudian akan mengembun karena

didinginkan oleh pendingin balik. Embun akan turun melalui serbuk simplisia

sambil melarutkan zat aktif sebuk simplisia (Anonim, 1986). Namun, metode

penyarian berkesinambungan juga memiliki kelemahan yakni membutuhkan

29  

  

waktu yang lama dan penggunaannya dibatasi untuk zat-zat yang tahan terhadap

pemanasan (Voigt, 1995).

Ekstraksi cair-cair merupakan suatu teknik dimana suatu larutan (biasanya

air) dibuat bersentuhan dengan suatu pelarut kedua (biasanya pelarut organik),

sehingga menimbulkan perpindahan satu atau lebih zat terlarut ke dalam pelarut

yang kedua. Pada prinsipnya, kedua pelarut yang digunakan tidak saling

tercampurkan. Metode ektrasksi cairan-cairan yang sering digunakan adalah

menggunakan alat corong pisah, dimana kedua pelarut yang tidak saling campur

dimasukkan ke dalam corong pisah dan dilakukan penggojogan selama beberapa

menit (Bassett, Denney, Jeffery, dan Mendham, 1991).

Keefektifan dari proses ekstraksi ini dinyatakan dalam suatu tetapan yang

dikenal dengan nama koefisien distribusi (KD). Menurut Nernst, KD dapat

dinyatakan sebagai rasio antara konsentrasi zat terlarut dalam pelarut pertama dan

konsentrasi zat terlarut dalam pelarut kedua, dengan syarat bahwa keadaan

molekulnya sama dalam kedua cairan dan temperaturnya adalah konstan (Bassett,

et al., 1991).

Terkait dengan ektraksi cairan-cairan, permasalahan baru muncul, yakni

menentukan cara yang paling efisien untuk memindahkan suatu zat ke pelarut

yang kedua. Dinyatakan bahwa satu ekstraksi tunggal sejumlah volume tertentu

pelarut pertama dengan menggunakan sejumlah volume tertentu pelarut kedua,

hasilnya kurang efisien bila dibandingkan dengan beberapa kali ekstraksi

menggunakan volume yang sama (Bassett, et al., 1991).

30  

  

Hal ini sesuai dengan rumus:

dimana D adalah koefisien distribusi antara dua pelarut, adalah bobot zat yang

tertinggal pada pelarut 1, adalah bobot zat yang terlarut pada pelarut 1, V

adalah volume pelarut 1, dan v adalah volume pelarut 2, serta n adalah banyaknya

ekstraksi yang dilakukan (n kali). Dari rumus tersebut, apabila jumlah ekstraksi

semakin banyak (nilai n semakin besar) maka nilai akan semakin kecil.

Dengan kata lain, bobot zat yang tertinggal pada pelarut 1 semakin kecil dan zat

lebih banyak yang tersari ke pelarut 2, yang artinya proses ekstraksi lebih efektif

bila dibandingkan dengan satu ekstraksi tunggal (Bassett, et al., 1991).

F. Kesahihan Metode Analisis

Kesahihan metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang

digunakan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut dapat memberikan

hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai.

Metode analisis instrumen merupakan metode yang terpilih dan memadai untuk

mengantisipasi persoalan analisis, yaitu sangat kecilnya kadar senyawa yang

dianalisis dan kompleksnya matriks sampel yang dianalisis (Mulja dan Suharman,

1995). Untuk itu diperlukan suatu pedoman mengenai kesahihan metode analisis

yang didukung oleh parameter-parameter akurasi, presisi, linearitas, dan

spesifisitas.

31  

  

Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan

dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.

Kriteria kecermatan sangat bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks

sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) (Harmita, 2004). Untuk penelitian

bioanalisis %recovery yang baik berkisar 80-120% (Mulja dan Hanwar, 2003).

Tabel IV. Rentang akurasi yang masih dapat diterima

Analit pada matrik sampel (%)

Rata-rata yang diperoleh (%)

100 98-102 >10 98-102 >1 97-103

>0,1 95-105 0,01 90-107 0,001 90-107

0,000.1 (1 ppm) 80-110 0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115 0,000.000.1 (1 ppb) 40-120

(Harmita, 2004).

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Presisi menunjukkan kesesuaian antara berbagai seri pengukuran yang

diperoleh dari suatu metode analisis di bawah kondisi operasi normal. Presisi dari

suatu prosedur analisis diekspresikan dalam standar deviasi atau koefisien variasi

32  

  

dari seri-seri pengukuran. Ripitabilitas merupakan presisi di bawah kondisi

operasional dalam periode waktu yang singkat (International Conference On

Harmonisation Expert Working Group, 2005).

Tabel V. Rentang KV yang masih dapat diterima

Analit pada matrik sampel (%) KV (%) >1 2,5

0,001 5 0,000.1 (1 ppm) 16

0,000.000.1 (1 ppb) 32

(Harmita, 2004).

Linearitas dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya (pada

rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional

dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Persyaratan data linearitas

yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan

Suharman, 1995). Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk

mengukur dengan akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel

potensial yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

G. Kesalahan dalam Metode Analisis

Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun

sumber kesalahan tetap harus ditekan seminimal mungkin. Kesalahan dalam

analisis kimia dapat dikategorikan menjadi 2 kelas utama.

33  

  

1. Kesalahan sistemik

Kesalahan sistemik adalah hasil analisis yang menyimpang secara tetap

dari harga kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis,

sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja dan Suharman,

1995).

Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu sebagai

berikut.

(a) Kesalahan personil dan operasi. Kesalahan ini disebabkan oleh cara

pelaksanaan analisis, bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat

fisis (bukan khemis), misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir

titrasi, kekeliruan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini

bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh ketrampilan analis dalam

melakukan pekerjaan analisis.

(b) Kesalahan alat dan pereaksi. Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang

kurang murni, alat yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat

walaupun alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet

ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis

mikro, dan sebagainya.

(c) Kesalahan metode analisis. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan

pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau

ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan.

34  

  

Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan cara sebagai

berikut.

(a) Mengkalibrasi instrument dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya

tiap bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat),

(b) memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi,

(c) memakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis,

(d) meningkatkan pengetahuan dan ketrampilan para analis,

(e) melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku, dan

(f) melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo) (Mulja dan Suharman,

1995).

2. Kesalahan tidak sistemik

Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari

hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari instrumen

yang dipakai. Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak dapat

dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (Mulja dan Suharman,

1995).

H. Landasan Teori

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak

berpasangan. Radikal bebas akan menstabilkan diri dengan cara menyerang dan

mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya sehingga dapat

menyebabkan kerusakan oksidatif sel yang berdampak menimbulkan berbagai

macam penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, kanker, dan penuaan dini.

35  

  

Oleh karena itu diperlukan senyawa antioksidan untuk menghambat reaksi

oksidasi radikal bebas. Sumber antioksidan dapat berasal dari hasil sintesis

maupun alam. Antioksidan sintesis seperti tBHQ, BHA, BHT, dan PG mempunyai

efektivitas yang tinggi tetapi dapat menyebabkan kanker melalui mutasi pada

DNA. Hal inilah yang menyebabkan adanya penelitian eksplorasi sumber

antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan.

Selasih telah lama digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai tanaman

obat, bahan campuran minuman yang bersifat menenangkan (sedatif), dan

kosmetika. Senyawa fenolik yang terdapat dalam selasih adalah fenolik berupa

eugenol, cirsilineol, isothymusin, isothymonin, asam rosmarinat, orientin, dan

vicenin. Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa

aromatik dengan substituen hidroksil. Aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik

didapatkan dengan cara mereduksi radikal bebas untuk tidak terjadinya reaksi

samping yang merugikan.

Aktivitas antioksidan dapat diuji dengan metode menggunakan radikal

bebas DPPH. Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara

stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning.

36  

  

Kandungan total fenolik ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu.

Adanya senyawa fenolik dalam sampel uji akan mereduksi asam fosfomolibdat-

fosfotungstat menjadi senyawa yang berwarna biru. Intensitas warna biru yang

dihasilkan bersifat sebanding dengan kandungan fenolik dalam sampel uji.

I. Hipotesis

Fraksi air ekstrak etanolik daun selasih mempunyai aktivitas antioksidan

menggunakan radikal bebas DPPH. Kandungan senyawa fenolik dalam fraksi air

ekstrak etanolik daun selasih mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan.

  

37  

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji

diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total

fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur tanaman, dan cara panen.

4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari dan cuaca.

C. Definisi Operasional

1. Ekstrak etanolik daun selasih adalah sari hasil proses maserasi daun selasih

dengan penyari etanol.

2. Fraksi air adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun selasih dengan

menggunakan air.

3. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih untuk menangkap radikal

DPPH.

38  

  

4. Persen inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi air

ekstrak etanolik daun selasih yang menghasilkan penangkapan 50% radikal

DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun selasih (Ocimum

sanctum L.) yang diambil dari daerah Goa Selarong (Yogyakarta); akuades

(Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma

Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan rutin;

bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan

kualitas teknis CV. General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec

SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin

Elmer Lamda 20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000µL; 1-10

mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

39  

  

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan

Determinasi tanaman selasih dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-

Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan van Steenis

(1981).

2. Pengumpulan bahan

Tanaman selasih diperoleh dari daerah Goa Selarong (Yogyakarta).

Pengumpulan pada musim kemarau bulan September tahun 2010. Pemanenan

dilakukan pada tanaman yang menjelang berbunga saat pagi hari.

3. Preparasi sampel

Daun selasih segar dicuci dengan air mengalir, diangin-anginkan, dan

ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan blender. Ketika

dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%).

Simplisia yang telah dihaluskan dituang ke dalam bejana maserasi, ditambah

etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran

dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui

penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan

etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan

dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu hasil

penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator hingga

diperoleh ekstrak etanol daun selasih.

40  

  

Ekstrak etanol daun selasih ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi

cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan

ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.

Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada

bagian atas.

Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air.

Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan

perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air

dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan pelarutnya dengan vacuum

rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik serta

aluminium foil lalu disimpan dalam eksikator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan

untuk dianalisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh

larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan

alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan pembanding

Sebanyak 2,5 mg rutin ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL.

Diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL larutan stok rutin, kemudian

ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan

standar rutin sebesar 12,5; 25,0; 37,5; 50,0; dan 62,5 µg/mL.

41  

  

c. Pembuatan larutan uji

i. Larutan uji untuk uji aktivitas antioksidan

Sebanyak 25,0 mg hasil fraksi air pada preparasi sampel ditimbang, lalu

ditambahkan metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0;

dan 5,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0; 150,0; 200,0; 250,0 dan

300,0 µg/mL.

ii.Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 7,5 mg hasil fraksi air pada preparasi sampel ditimbang, lalu

ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan

uji sebesar 750,0 µg/mL.

d. Pembuatan larutan asam galat

Dibuat larutan asam galat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam

akuades : metanol p.a. (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL

larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a. (1:1) sampai 10,0

mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100;

125; dan 150 µg/mL.

42  

  

5. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik

Sebanyak 0,5 mL metanol p.a, larutan pembanding asam galat 150,0

µg/mL, dan larutan uji 750,0 µg/mL dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi.

Lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan akuades (1:10; v/v). Larutan tersebut selanjutnya ditambahkan dengan 4,0

mL Na2CO3 1M. Setelah 10 menit, amati warna pada larutan tersebut.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga

tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan

pembanding rutin 37,5 µg/mL, dan larutan uji 200,0 µg/mL. Selanjutnya larutan

tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian

divortek selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time (OT) metode uji aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga

labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1 mL larutan pembanding

rutin 12,5; 37,5; dan 62,5 µg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan

dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek

selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel

pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk

larutan uji 100,0; 200,0; dan 300,0 µg/mL.

43  

  

b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maksimum) metode

uji aktivitas antioksidan

Pada tiga labu ukur 5 mL, dimasukkan masing-masing 0,2; 0,6; dan 1,0

mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda

batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,016; 0,048; dan 0,080 mM. Larutan

tersebut kemudian divortek selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan

scanning λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

400-600 nm.

7. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sesuai dengan penelitian Armala (2009).

a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol

Pada labu ukur 5 mL, dimasukkan sebanyak 1 mL larutan DPPH.

Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian

larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan λ maksimum. Pengerjaan

dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji

larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing lima

labu ukur 5 mL. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL larutan pembanding

dan uji pada berbagai seri konsentrasi larutan pembanding dan uji yang telah

dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga

tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30 detik dan diamkan

44  

  

selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada λ

maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi akurasi (%recovery), presisi

(%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitasnya (nilai r).

%Recovery =

100%

%CV =

100%

d. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin

dan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

8. Penetapan kandungan fenolik total

Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sesuai dengan penelitian Veeru, et al., (2009).

a. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

i. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL ditambahkan

dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10; v/v).

Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah itu

dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

750 nm selama 30 menit.

45  

  

ii. Penentuan λ maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10; v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium

karbonat 1M. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning λ maksimum dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

b. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10; v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat

1M. Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang

terdiri atas akuades : metanol p.a. (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan

natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total

Hasil dari prosedur 8 b, divalidasi akurasi (%recovery), presisi (%CV),

spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitasnya (nilai r).

d. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 750 µg/mL, lalu dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam

galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg

ekivalen asam galat per g fraksi air). Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

46  

  

F. Analisis Hasil

Uji aktivitas antioksidan menghasilkan aktivitas penangkapan radikal

DPPH yang dilaporkan sebagai %IC dihitung dengan rumus:

/

100%

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan

regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding

sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalis secara statistik untuk menentukan

ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding

dengan uji.

Penetapan kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam

galat per g fraksi air. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linear dengan

data kurva baku secara intrapolasi.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

47  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gambar 4. Skema jalannya penelitian

 

Determinasi tanaman

Pengumpulan bahan

Pembuatan ekstrak etanolik daun selasih

Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air

Fraksi wasbensin Fraksi air I

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Fraksi etil asetat Fraksi air II

Uji pendahuluan

Optimasi uji aktivitas antioksidan

Estimasi kandungan fenolik total

Estimasi aktivitas antioksidan

Analisis statistik dengan PASW Statistics 18

Optimasi metode penetapan kandungan

fenolik total

Validasi metode penetapan kandungan

fenolik total

Validasi metode uji aktivitas antioksidan

  

48  

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tumbuhan

Langkah awal yang dilakukan pada penelitian ini adalah determinasi

tanaman selasih. Tujuan determinasi tanaman tersebut adalah untuk mengetahui

kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian. Kebenaran

identitas tanaman tersebut digunakan untuk menghindari adanya kemungkinan

kesalahan dalam pengambilan sampel pada analisis fitokimia (Harborne, 1987).

Determinasi tanaman selasih dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal 24 September 2010

dengan acuan van Steenis (1981). Hasil determinasi tanaman selasih dapat dilihat

di lampiran 1 yang menyatakan kebenaran tanaman, yaitu Ocimum sanctum L.

atau selasih.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun selasih dipanen dari tempat budidaya tanaman selasih pada

tanggal 22 September 2010 di daerah Goa Selarong, Yogyakarta

(RT 1/RW 3 Pedukuhan Kentolan Lor, Kelurahan Gowasari, Kecamatan

Pajangan, Kabupaten Bantul).

Daun tersebut dipanen dengan kriteria-kriteria berikut ini, yaitu pada

musim kemarau, menjelang tanaman berbunga (sekitar umur tanaman selasih tiga

bulan), dan saat pagi hari. Hal ini dilakukan karena diduga pada saat kriteria-

49  

 

kriteria tersebut, jumlah metabolit sekunder dalam daun selasih maksimal.

Pemanenan pada musim kemarau (kelembaban rendah) dikarenakan menghindari

dan mencegah efek dari penguraian yang dipromosi oleh pertumbuhan

mikroorganisme yang pertumbuhannya meningkat seiring dengan naiknya tingkat

kelembaban. Alasan lainnya karena biosintesis senyawa fenolik akan lebih banyak

saat mendapatkan sinar matahari daripada tidak mendapatkan sinar matahari

terutama saat musim penghujan. Pemanenan menjelang tanaman berbunga

dimaksudkan agar metabolit sekunder dalam daun tanaman sebagai subjek uji

penelitian memiliki kandungan yang maksimal, sedangkan pada saat tanaman

berbunga kemungkinan besar, banyak metabolit sekunder yang ditransport

menuju bunga untuk kemudian menjadi buah sebagai cadangan makanan

tanaman. Pemanenan saat pagi hari dilakukan dengan tujuan agar metabolit

sekunder yang terdapat dalam tanaman belum diolah melalui fotosintesis menjadi

metabolit sekunder lainnya dan agar mempertahankan kesegaran tanaman saat

transport menuju laboratorium. Usaha pemanenan dengan kriteria-kriteria

tanaman di atas bertujuan untuk memaksimalkan kandungan metabolit sekunder

tanaman yang dapat diekstraksi oleh peneliti (World Health Organization, 2003).

Hasil pengumpulan daun selasih yang diperoleh langsung dibawa ke

laboratorium untuk secepatnya dipreparasi. Hal ini dilakukan agar menghindari

peristiwa browning atau blackening yang disebabkan karena adanya polifenol

oksidase tumbuhan yang menanggapi rangsang berupa luka pada jaringan

tumbuhan. Polifenol oksidase merupakan enzim ekstraseluler tumbuhan. Ketika

senyawa fenolik transport menuju permukaan sel tumbuhan akibat adanya luka

50  

 

sewaktu pemanenan, maka enzim tersebut dengan adanya oksigen akan mengubah

senyawa fenolik menjadi bentuk radikal dan akhirnya terjadi reaksi oksidasi

multistep yang membuat senyawa tersebut menjadi bentuk polimer (Evans dan

Hedger, 2001). Bentuk polimer tersebut berfungsi untuk menutup luka pada

jaringan tanaman. Adanya peristiwa tersebut, senyawa fenolik dioksidasi menjadi

senyawa yang kurang atau bahkan tidak memiliki aktivitas antioksidan.

C. Hasil Preparasi Sampel

Tujuan dari preparasi sampel adalah untuk mendapatkan fraksi air ekstrak

etanolik daun selasih yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa

fenolik. Sampel yang digunakan dalam preparasi sampel berupa daun selasih yang

masih segar. Menurut Markham (1988), alasan digunakan daun yang masih segar

sebagai sampel adalah untuk menjaga kestabilan senyawa flavonoid (termasuk

dalam golongan senyawa fenolik) dalam sampel karena bahan tumbuhan yang

telah dikeringkan mempunyai kecenderungan adanya perubahan susunan senyawa

flavonoid. Perubahan tersebut dapat berupa glikosida menjadi aglikonnya karena

potensi adanya pengaruh fungi. Bentuk aglikon tersebut dapat berubah menjadi

bentuk teroksidasinya dan terjadi reaksi oksidasi multistep yang akhirnya

terbentuk polimer. Dalam hal ini, peneliti mengekstraksi daun selasih segar

dengan etanol dengan tujuan agar fungi tidak tumbuh dalam ekstrak daun selasih.

Menurut Galati, McKay, dan Tan (2005) digunakan daun segar sebagai

sampel dalam suatu penelitian karena dalam proses pengeringan atau bentuk

dehidrasi bahan tumbuhan paska panen, potensi terjadinya peristiwa browning

51  

 

atau blackening cenderung lebih besar. Laporan dari Markham (1988) dan

Galati, et al., (2005) tersebutlah yang membuat peneliti berupaya untuk

mengantisipasi agar stabilitas senyawa fenolik dalam daun selasih terjaga.

Daun selasih yang diperoleh dicuci dengan air mengalir untuk

membersihkannya dari pengotor-pengotor yang menempel. Setelah itu, daun

selasih diangin-anginkan untuk menghilangkan air yang menempel dari proses

pencucian daun selasih. Lalu daun selasih diblender sebelum dimaserasi,

tujuannya adalah untuk memperkecil ukuran permukaan daun selasih sehingga

penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang kontak dengan

penyari semakin luas (Harborne, 1987).

Lalu dilakukan proses maserasi dengan penyari etanol 76% dan dibantu

dengan alat shaker. Penyarian dilakukan dengan cara maserasi karena peneliti

menghindari cara preparasi sampel yang banyak membutuhkan perlakuan

pemanasan terhadap sampel. Hal ini dilakukan untuk menjaga stabilitas dari

senyawa fenolik yang diekstraksi (Bruneton, 1999).

Penyarian dengan cara infundasi dan penyarian berkesinambungan

membutuhkan pemanasan, sedangkan cara perkolasi dan maserasi tidak

membutuhkan pemanasan. Dipilih cara maserasi daripada perkolasi karena pada

cara maserasi proses pengerjaannya lebih praktis daripada perkolasi. Dalam cara

perkolasi perlu diatur sedemikian rupa aliran tetesan perkolatnya dan hasil

penyariannya memiliki volume lebih besar. Oleh karena itu, dibutuhkan waktu

pembuatan ekstrak yang lebih lama (Arini, 2007). Selain alasan tersebut, sampel

yang digunakan berupa bahan segar sehingga lebih sesuai apabila menggunakan

52  

 

cara maserasi daripada perkolasi. Hal ini disebabkan karena dalam kondisi segar

yang diperkecil ukuran sampel dengan blender, akan didapatkan ukuran sampel

yang diperkecil dengan sifat polidispers. Ukuran yang demikian dapat menyumbat

aliran cairan perkolat dalam perkolator sehingga aliran cairan perkolat tidak

menetes. Lain halnya jika menggunakan serbuk yang telah diayak dengan derajat

kehalusan tertentu, cairan perkolat dapat mengalir akibat adanya pori-pori dalam

susunan serbuk sampel. Efek farmakologis yang diharapkan bersifat umum, yaitu

antioksidan sehingga pemilihan maserasi daripada perkolasi akan lebih

menguntungkan. Cara maserasi yang dilakukan oleh peneliti menggunakan alat

bantu berupa shaker yang digunakan untuk membantu proses maserasi agar

penyari lebih dapat kontak langsung dengan sel-sel dalam daun selasih daripada

hanya didiamkan saja. Hal ini membuat proses maserasi dapat secara efektif

mengekstraksi metabolit sekunder dalam daun selasih. Pada proses maserasi,

dilakukan pula remaserasi dengan tujuan untuk memaksimalkan proses penyarian

agar mendapatkan lebih banyak senyawa fenolik dibandingkan hanya digunakan

maserasi saja.

Etanol 76% digunakan dalam proses ini karena peneliti ingin

mengekstraksi senyawa fenolik dari daun selasih. Untuk mengekstraksi senyawa

fenolik dalam bahan tumbuhan dapat dilakukan dengan pelarut polar seperti

etanol, metanol, n-butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air

(Markham, 1988). Alasan tidak digunakan pelarut aseton, dimetilsulfoksida,

dimetilformamida, dan air adalah senyawa fenolik lebih larut dalam campuran

larutan alkohol dengan air daripada pelarut polar lainnya (Bruneton, 1999).

53  

 

Pelarut metanol tidak digunakan karena memiliki efek toksik yang lebih tinggi

daripada etanol (Armala, 2009). Pelarut n-butanol tidak digunakan karena

n-butanol lebih non polar serta struktur dari n-butanol lebih besar sehingga

n-butanol kurang begitu bisa masuk ke dalam sel-sel daun selasih daripada etanol.

Alasan digunakan campuran etanol dan air daripada hanya air adalah karena

campuran tersebut dapat melarutkan dengan optimal senyawa fenolik, agar

ekstrak yang dihasilkan tidak ditumbuhi mikroorganisme yang dapat merubah

susunan fisika-kimia senyawa dalam ekstrak, dan agar enzim dalam ekstrak yang

ikut tersari tidak aktif karena etanol mempunyai kecenderungan dapat

mendenaturasi enzim dengan cara menarik kandungan air dari enzim.

Pemilihan konsentrasi etanol sebesar 76% sebagai penyari merupakan

hasil dari penelitian Wangcharoen dan Morasuk (2007 b) yang melaporkan bahwa

pada ekstrak etanolik 76% daun selasih, secara lebih efektif dan efisien

menghasilkan aktivitas antioksidan dibandingkan dengan konsentrasi etanol 18%,

36%, 57%, dan 95%. Oleh karena itu, peneliti memilih etanol dengan konsentrasi

76% untuk mengekstraksi daun selasih.

Tujuan pemilihan penyaringan filtrat menggunakan corong Buchner yang

diintegrasikan dengan pompa vacuum daripada dengan penyaringan biasa adalah

untuk mempercepat proses penyaringan dan memperbanyak hasil penyaringan.

Setelah itu, untuk menguapkan pelarut hasil penyaringan filtrat, digunakan alat

vacuum rotary evaporator. Alat tersebut dapat menguapkan pelarut filtrat

dibawah titik didih (t.d.) pelarut filtrat, yaitu etanol. Etanol memiliki t.d. sebesar

78,50C (O'Neil, Smith, Heckelman, Obenchain Jr., Gallipeau, D'Arecca, et al.,

54  

 

2001). Hal ini dikarenakan alat tersebut memakai prinsip penurunan tekanan

udara dalam sistem vacuum sehingga titik didih larutan dapat diturunkan (Dave,

2010).

Setelah didapatkan ekstrak kental etanolik daun selasih, kemudian ekstrak

tersebut dilarutkan dengan air hangat. Digunakan air hangat agar dapat lebih

melarutkan ekstrak etanolik daun selasih. Fraksi air berada di bagian bawah,

sedangkan fraksi wasbensin berada di bagian atas. Hal ini dikarenakan berat jenis

(b.j.) air lebih besar daripada wasbensin. Air memiliki b.j. sebesar 0,996

sedangkan b.j. wasbensin sebesar 0,730 (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat

dan Makanan RI, 1995; Robin Laboratoire, 2009).

Dalam fraksi air pertama dari hasil pemisahan ekstrak etanolik daun

selasih dengan wasbensin, akan didapatkan senyawa fenolik yang lebih murni

karena air dan senyawa fenolik bersifat polar maka air dapat melarutkan senyawa

fenolik. Dalam fraksi wasbensin akan didapatkan zat-zat kimia yang tidak

diinginkan, yaitu senyawa-senyawa non polar seperti lipid dan klorofil sehingga

fraksi ini dapat dibuang.

Proses ekstraksi cair-cair ekstrak etanol daun selasih yang dilakukan

berulang sebanyak 3 kali sehingga dalam satu kali ekstraksi cair-cair volume total

larutan sebanyak 200 mL yang terdiri dari 100 mL air dan 100 mL wasbensin.

Dilakukan ekstraksi cair-cair berulang karena menyesuaikan hukum Nerst yang

prinsipnya, yaitu proses ekstraksi berulang akan lebih efektif bila dibandingkan

dengan ekstraksi tunggal (Bassett, et al., 1991).

55  

 

Setelah didapatkan fraksi air pertama dari hasil pemisahan ekstrak etanolik

daun selasih dengan wasbensin, maka fraksi air pertama tersebut diekstraksi cair-

cair lagi dengan etil asetat. Hal ini bertujuan untuk lebih memurnikan senyawa

fenolik yang didapatkan. Fraksi air kedua akan berada di bawah, sedangkan fraksi

etil asetat berada di atas. Hal ini dikarenakan b.j. air (0,996) lebih besar

dibandingkan b.j. etil asetat (0,898) (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995; O'Neil, et al., 2001). Fraksi air kedua inilah yang diuji

aktivitas antioksidannya dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya.

Pada umumnya bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar,

sedangkan bentuk aglikonnya lebih non polar, sehingga tidak menutup

kemungkinan adanya senyawa tersebut larut dalam air maupun etil asetat

(Bruneton, 1999). Dalam penelitian ini, peneliti tertarik untuk menguji aktivitas

antioksidan fraksi air kedua dibandingkan dengan fraksi etil asetat didasarkan

pada keamanan konsumsi dan keamanan penggunaan fraksi yang dihasilkan untuk

uji lainnya yang membutuhkan subjek uji hewan untuk melengkapi data penelitian

mengenai fraksi air ekstrak etanolik daun selasih. Selain itu, didasarkan pada

penelitian sejenis oleh Widodo (2011) yang telah menentukan aktivitas

antioksidan dari fraksi etil asetat daun selasih yang kepolarannya lebih rendah

daripada air sehingga peneliti ingin memperoleh informasi aktivitas antioksidan

daun selasih dari fraksi yang lebih polar daripada etil asetat. 

Fraksi air kedua yang didapatkan diuapkan pelarutnya dengan vacuum

rotary evaporator supaya tidak merusak kestabilan senyawa fenolik. Kemudian

fraksi air kedua tersebut dimasukkan dalam cawan porselen dan dilakukan

56  

 

pemanasan menggunakan waterbath dengan bantuan kipas angin. Pemanasan ini

bertujuan untuk untuk menguapkan pelarut yang masih terdapat dalam fraksi air

keuda sehingga didapatkan ekstrak kental air daun selasih.

Berat fraksi air kedua yang diperoleh dalam bentuk kental tersebut sebesar

24,0992 g dengan rendemen 2,41 %. Fraksi tersebut kemudian ditutup dengan

plastik serta aluminium foil lalu disimpan dalam eksikator. Hal ini dilakukan

untuk mengantisipasi adanya kerusakan senyawa fenolik dalam fraksi air kedua

tersebut dari pengaruh luar, misalkan cahaya, udara, maupun kelembaban.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji fenolik

Uji ini memakai prinsip reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Tujuan

uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif adanya kandungan senyawa

fenolik dalam fraksi air ekstrak etanolik daun selasih. Dalam suasana basa akibat

penambahan natrium karbonat, senyawa fenolik akan berubah menjadi ion

fenolat. Ion fenolat bersifat lebih reaktif terhadap adanya pereaksi fenol Folin-

Ciocalteu. Ion fenolat tersebut dioksidasi oleh asam dalam pereaksi fenol Folin-

Ciocalteu (asam fosfomolibdat-fosfotungstat) sehingga akan terbentuk larutan

dengan warna biru (Singleton dan Rossi, 1965). Pengujian menunjukkan hasil

positif dengan larutan uji berwarna biru (gambar 5). Hal ini menunjukkan bahwa

fraksi air ekstrak etanolik daun selasih mengandung senyawa fenolik.

57  

 

Gambar 5. Hasil uji fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = kontrol positif [asam galat], dan C = larutan uji [fraksi air ekstrak etanolik daun selasih])

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji ini menggunakan reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa

antioksidan. Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas

antioksidan dalam fraksi air ekstrak etanolik daun selasih. Keberadaan senyawa

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Pengujian menunjukkan

hasil positif dengan larutan uji berwarna kuning (gambar 6). Hal ini menunjukkan

bahwa fraksi air ekstrak etanolik daun selasih memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 6. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif, B = kontrol positif [rutin], dan C = larutan uji [fraksi air ekstrak etanolik

daun selasih])

58  

 

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk

pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, et

al., 2002; Prakash, et al., 2010). Metode ini dipilih daripada metode deoksiribosa

(radikal hidroksil) karena metode ini lebih praktis. Metode radikal hidroksil

memerlukan proses metode yang panjang dengan pembentukan radikal hidroksil

yang membutuhkan reaksi Fenton (Fe3+/ascorbate/EDTA/H2O2). DPPH

merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat

mendonorkan atom hidrogen. Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan dapat

mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH mempunyai

λ maksimum pada 517 nm (Dehpour, et al., 2009). Oleh karena itu, peneliti

melakukan scanning λ maksimum pada pelarut, fraksi air, dan rutin pada daerah

400-600 nm. Hal ini dilakukan dengan tujuan memastikan bahwa tidak ada

gangguan pengukuran pada daerah λ maksimum DPPH yang dapat menyebabkan

hasil pengukuran absorbansi dari DPPH menjadi tidak akurat. Hasil scanning

λ maksimum pada daerah 400-600 nm tersebut dapat dilihat di lampiran 6. Hasil

tersebut tidak menunjukkan adanya gangguan pada daerah λ maksimum DPPH.

Setelah dipastikan tidak terdapat gangguan maka metode DPPH dapat

dilaksanakan untuk menguji aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik

selasih. Untuk menguji aktivitas antioksidan perlu dilakukan terlebih dahulu

proses optimasi metode DPPH. Proses optimasi tersebut berupa penentuan OT dan

scanning λ maksimum DPPH.

59  

 

(1) Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan

Tujuan penentuan OT adalah untuk menetapkan rentang waktu dimana

larutan pembanding dan uji sudah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna

sehingga diperoleh nilai absorbansi yang stabil. Jika nilai absorbansi stabil maka

pengukuran bisa reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. Penentuan

OT dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH pada λ maksimum teoritis

DPPH, yaitu 517 nm (Dehpour, et al., 2009) setiap 5 menit selama 60 menit pada

larutan pembanding dan uji.

Gambar 7. Grafik penentuan OT rutin

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorba

nsi

Waktu (menit)

Penentuan OT rutin

2,5 µg/mL

7,5 µg/mL

12,5 µg/mL

60  

 

Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi air

Hasil penentuan OT terlihat pada gambar 7 dan 8, yaitu pada menit ke-5

sampai ke-60 baik pada larutan pembanding maupun uji, absorbansi DPPH

memberikan nilai yang semakin stabil, hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara

DPPH dengan senyawa antioksidan dalam larutan pembanding dan uji semakin

sempurna dan akhirnya berhenti. Dari gambar 7 dan 8, dapat dinyatakan bahwa

OT pada larutan pembanding (rutin) selama 30 menit, sedangkan pada larutan uji

(fraksi air) selama 25 menit.

(2) Penentuan λ maksimum metode uji aktivitas antioksidan

Tujuan penentuan λ maksimum adalah untuk menetapkan panjang

gelombang DPPH yang digunakan dalam penelitian ini. Pengukuran absorbansi

perlu dilakukan pada λ maksimum karena pada λ maksimum, dengan hanya

sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar

sehingga didapatkan sensitivitas analisis yang maksimum.

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Absorba

nsi

Waktu (menit)

Penentuan OT fraksi air

20,1 µg/mL

40,2 µg/mL

60,2 µg/mL

61  

 

Selain itu, kurva pada λ maksimum relatif datar sehingga adanya sedikit

pergeseran panjang gelombang karena variasi instrumental, absorbansi tetap

stabil.

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH

Penentuan λ maksimum dilakukan dengan scanning terhadap DPPH

dengan konsentrasi 0,016; 0,080; dan 0,048 mM pada panjang gelombang visibel

dari 400 nm sampai 600 nm. DPPH bisa terukur pada daerah visibel karena

memiliki gugus kromofor dan auksokrom (gambar 9), sedangkan dengan adanya

elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm

yang menyebabkan larutan DPPH berwarna ungu. Ketika elektronnya menjadi

berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya

menurun dan larutan menjadi berwarna kuning. Pemilihan rentang panjang

gelombang 400-600 nm didasarkan pada warna DPPH berupa ungu dan

λ maksimum-nya pada 517 nm.

62  

 

Panjang gelombang maksimum DPPH pada 517 nm tersebut, didapatkan

dari hasil penelitian dari jurnal metode DPPH yang memakai daun selasih sebagai

bahan ujinya (Aqil, et al., 2006; Wangcharoen dan Morasuk, 2007 a&b). Dari

ketiga seri larutan DPPH di atas, diperoleh λ maksimum, yaitu pada 515,5 nm

(gambar 10).

Gambar 10. Spektra λ maksimum DPPH pada tiga seri konsentrasi (keterangan: konsentrasi A = 0,080 mM; B = 0,048 mM; C = 0,016 mM)

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter

tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan (Harmita, 2004).

Untuk mengetahui validitas metode uji aktivitas antioksidan dilakukan

analisis akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas terhadap replikasi aktivitas

antioksidan rutin dan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

63  

 

Tiga persamaan regresi linear antara konsentrasi rutin dan fraksi air

dengan %IC telah dibuat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan yang

paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear yang

paling baik untuk rutin diperoleh dari replikasi II (y = 5,5246 x + 4,61; dengan

0,9999 sebagai nilai r), sedangkan untuk fraksi air diperoleh dari replikasi III

(y = 1,0961 x – 6,619; dengan r = 0,9958 sebagai nilai r). Persamaan tersebut

digunakan untuk menghitung konsentrasi terukur baik untuk rutin maupun larutan

uji. Hasil %recovery dan %CV dapat dihitung jika konsentrasi tersebut telah

didapatkan. Gambar 11 dan 12 menunjukkan kurva persamaan regresi linear

aktivitas antioksidan rutin dan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

Gambar 11. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin

y = 5,5246 x + 4,61r = 0,9999

0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%90.00%

2.6 5.2 7.8 10.4 13.0

%IC

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin

Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin

Linear (Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin)

64  

 

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih

Dari gambar 11 dan 12, tampak bahwa ada korelasi antara konsentrasi

rutin dan fraksi air dengan %IC yang ditunjukkan dari koefisien korelasi grafik

(nilai r) yang mendekati nilai satu. Koefisien korelasi tersebut bernilai positif yang

menunjukkan bahwa hubungan antara konsentrasi baik rutin maupun fraksi air

dengan %IC yang dihasilkan sebanding. Semakin besar konsentrasi dari rutin

maupun fraksi air maka semakin besar %IC yang dihasilkan, begitu juga

sebaliknya.

(1) Akurasi metode uji aktivitas antioksidan

Penilaian akurasi berdasarkan pada nilai perolehan kembali (%recovery)

dari data hubungan antara seri konsentrasi rutin dan fraksi air dengan aktivitas

antioksidan yang dihasilkan.

y = 1,0961 x – 6,619r = 0,9958

0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%

20.1 30.1 40.2 50.2 60.2

%IC

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi air

Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi air

Linear (Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi air)

65  

 

Tabel VI. Hasil %Recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin

Rutin Konsentrasi

teoritis (µg/mL)

% IC Konsentrasi

terukur (µg/mL)

%Recovery (%)

SD (%)

%CV (%)

Seri 1 2,6 19,14% 2,6 101,2

0,6 0,6 2,6 19,02% 2,6 100,3 2,5 18,43% 2,5 100,1

Seri 2 5,2 34,13% 5,3 102,8

1,1 1,1 5,2 33,53% 5,2 100,7 5,0 32,82% 5,1 102,1

Seri 3 7,8 48,28% 7,9 101,3

1,0 1,0 7,8 47,44% 7,8 99,4 7,5 46,02% 7,5 99,9

Seri 4 10,4 62,66% 10,5 101,0

1,6 1,5 10,4 61,83% 10,4 99,6 10,0 61,36% 10,3 102,7

Seri 5 13,0 76,22% 13,0 99,7

2,0 2,0 13,0 76,69% 13,0 100,4 12,5 76,10% 12,9 103,5

Tabel VII. Hasil %Recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air

Fraksi Air

Konsentrasi teoritis

(µg/mL) % IC

Konsentrasi terukur (µg/mL)

%Recovery (%)

SD (%)

%CV (%)

Seri 1 20,1 17,68% 22,2 110,3

2,7 2,5 20,0 16,86% 21,4 107,1 20,1 16,51% 21,1 105,0

Seri 2 30,1 27,87% 31,5 104,5

2,0 1,9 30,0 26,93% 30,6 102,0 30,1 26,58% 30,3 100,6

Seri 3 40,2 35,71% 38,6 96,1

1,2 1,3 40,0 34,89% 37,9 94,7 40,2 34,66% 37,7 93,7

Seri 4 50,2 49,06% 50,8 101,2

0,8 0,8 50,0 48,01% 49,8 99,7 50,2 48,95% 50,7 101,0

Seri 5 60,2 63,58% 64,0 106,4

2,5 2,4 60,0 61,83% 62,4 104,1 60,2 60,30% 61,1 101,4

66  

 

Dari data pada tabel VI dan VII, %recovery rutin berada dalam rentang

99,4%-103,5%, sedangkan fraksi air berada dalam rentang 93,7%-110,3%.

Persyaratan %recovery untuk rutin sebagai bahan p.a. terpenuhi. Rentang

%recovery yang baik untuk rutin kadar sekitar 10 ppm berkisar antara 90%-107%.

Persyaratan %recovery untuk fraksi air sebagai bahan alam juga terpenuhi.

Rentang %recovery yang baik untuk bahan alam berkisar antara 80%-120%.

Metode ini memiliki akurasi yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah

ditetapkan.

(2) Presisi metode uji aktivitas antioksidan

Penilaian presisi berdasarkan pada nilai %CV dari data hubungan antara

seri konsentrasi rutin dan fraksi air dengan aktivitas antioksidan yang dihasilkan.

Dari data pada tabel VI dan VII, %CV rutin berada dalam rentang 0,6%-2,0 %,

sedangkan fraksi air berada dalam rentang 0,8%-2,5%. Persyaratan %CV untuk

rutin sebagai bahan p.a. terpenuhi. Rentang %CV yang baik untuk kadar sekitar

10 ppm harus ≤ 5%. Persyaratan %CV untuk fraksi air sebagai bahan alam juga

terpenuhi. Rentang %CV yang baik untuk bahan alam ≤ 15%. Metode ini

memiliki presisi yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

(3) Linearitas metode uji aktivitas antioksidan

Hasil nilai koefisien korelasi (r) persamaan regresi linear untuk rutin yang

paling bagus adalah pada replikasi II, yaitu 0,9999; sedangkan untuk fraksi air

yang paling bagus, yaitu 0,9958 pada replikasi III. Persyaratan linearitas yang

baik untuk rutin adalah jika memiliki nilai r > 0,999, sedangkan untuk fraksi air

67  

 

sebesar r hitung > r tabel (0,8783). Nilai r tabel tersebut diperoleh dari degree of

freedom (d.f.) sebanyak 3 dengan tingkat kepercayaan 95%. Penggunaan

perbandingan r tabel dengan nilai r hitung pada fraksi air didasarkan karena fraksi

air mengandung tidak hanya zat murni tetapi berupa campuran zat yang dapat

saling mempengaruhi. Nilai r rutin dan fraksi air memenuhi persyaratan maka

metode ini memiliki linearitas yang baik.

(4) Spesifisitas metode uji aktivitas antioksidan

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan

akurat absorbansi DPPH diantara seluruh komponen sampel potensial yang

mungkin ada dalam sampel (larutan rutin dan fraksi air ekstrak etanolik daun

selasih). Dari hasil spektra (lampiran 6 dan 7), untuk larutan rutin tidak

menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi DPPH yang terukur,

sedangkan untuk larutan fraksi air terdapat sedikit gangguan absorbansi.

Hal tersebut dikarenakan hasil fraksinasi pasti memiliki suatu warna. Fraksi air

yang didapatkan cenderung berwarna kuning kecoklatan. Oleh karena itu, metode

ini memiliki spesifisitas yang baik untuk menguji rutin tetapi kurang baik untuk

menguji fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

Aktivitas antioksidan dari suatu bahan uji dinyatakan dengan IC50. Nilai

tersebut diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan

antara konsentrasi bahan uji dengan %IC. Semakin kecil nilai IC50, maka semakin

68  

 

besar aktivitas antioksidan suatu bahan uji. Tujuan dari uji ini adalah memperoleh

nilai IC50 dari fraksi air ekstrak etanolik daun selasih. Nilai tersebut kemudian

dibandingkan dengan nilai IC50 yang didapatkan dari rutin (gambar 13). Rutin

merupakan senyawa fenolik yang tergolong dalam flavonoid. Menurut Lopez, et

al., (2003) gugus O-dihidroksi pada cincin B diasosiasikan dengan gugus fungsi

dalam rutin yang menyebabkan adanya aktivitas antioksidan.

Gambar 13. Struktur rutin (dos Santos, et al., 2008)

69  

 

Tabel VIII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH

Replikasi Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi larutan

pembanding% IC Persamaan regresi

linear

I

2,6 0,680 19,14%y = Bx + A

y = 5,4880 x + 5,279 r = 0,9998

5,2 0,554 34,13%7,8 0,435 48,28%10,4 0,314 62,66%13,0 0,200 76,22%

II

2,6 0,681 19,02% y = Bx + A

y = 5,5246 x + 4,61 r = 0,9999

5,2 0,559 33,53% 7,8 0,442 47,44% 10,4 0,321 61,83% 13,0 0,196 76,69%

III

2,5 0,686 18,43% y = Bx + A

y = 5,7552 x + 3,782 r = 0,9997

5,0 0,565 32,82% 7,5 0,454 46,02% 10,0 0,325 61,36% 12,5 0,201 76,10%

Keterangan: absorbansi kontrol = 0,841

Tabel IX. Hasil %IC fraksi air ekstrak etanolik daun selasih menggunakan radikal DPPH

Replikasi Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi larutan uji % IC Persamaan regresi

linear

I

20,1 0,703 17,68% y = Bx + A

y = 1,1263 x - 6,453 r = 0,9930

30,1 0,616 27,87% 40,2 0,549 35,71% 50,2 0,435 49,06% 60,2 0,311 63,58%

II

20,0 0,710 16,86% y = Bx + A

y = 1,1102 x - 6,704 r = 0,9943

30,0 0,624 26,93% 40,0 0,556 34,89% 50,0 0,444 48,01% 60,0 0,326 61,83%

III

20,1 0,713 16,51% y = Bx + A

y = 1,0961 x – 6,619 r = 0,9958

30,1 0,627 26,58% 40,2 0,558 34,66% 50,2 0,436 48,95% 60,2 0,339 60,30%

Keterangan: absorbansi kontrol = 0,854

70  

 

Pada tabel VIII dan IX, larutan kontrol memiliki absorbansi yang lebih

tinggi dibandingkan rutin dan fraksi air. Hal ini disebabkan karena pada larutan

kontrol tidak terdapat senyawa yang berperan antioksidan. Pada berbagai seri

konsentrasi baik rutin maupun fraksi air tampak bahwa semakin besar konsentrasi

larutan maka aktivitas antioksidannya semakin besar pula. Hal ini disebabkan

adanya penurunan absorbansi DPPH akibat adanya donor proton dari senyawa

beraktivitas antioksidan sehingga terbentuk senyawa DPPH-H. Senyawa ini tidak

memberikan serapan pada λ maksimum penelitian (515,5 nm).

N

N

O2N NO2

NO2

N

NH

O2N NO2

NO2

+ RH R+

DPPHBerwarna ungu

DPPH-HBerwarna kuning

Gambar 14. Donasi proton senyawa antioksidan ke radikal DPPH

(Prakash, et al., 2010)

Tabel X. Hasil nilai IC50 fraksi air ekstrak etanolik daun selasih dan rutin

Bahan Uji

IC50 Rata-rata (µg/mL)

SD (µg/mL)

CV (%) Rep. 1

(µg/mL) Rep. 2

(µg/mL) Rep. 3

(µg/mL) Rutin 8,1 8,2 8,1 8,13 0,06 0,71 Fraksi air 50,1 51,1 51,6 50,93 0,76 1,50

Keterangan: Rep. = Replikasi; SD = Simpangan Deviasi; dan CV = Coefficient of Variant

71  

 

Dari tabel X, rata-rata nilai IC50 rutin sebesar 8,13±0,06 µg/mL, sedangkan

fraksi air sebesar 50,93±0,76 µg/mL. Untuk memastikan bahwa terdapat

perbedaan bermakan antara nilai IC50 rutin dengan fraksi air maka data nilai

aktivitas antioksidan diuji secara statistik. Pengujian memakai software PASW

Statistics 18, langkah pertama yang dilakukan adalah mengetahui data %IC yang

dihasilkan mengikuti distribusi normal atau tidak normal sebagai parameter

statistik deskriptif. Pengujian distribusi normal tersebut digunakan untuk

menentukan jenis uji selanjutnya yang digunakan (parametrik dan non-

parametrik). Jika data berdistribusi normal maka jenis uji selanjutnya adalah uji

parametrik, tetapi jika data berdistribusi tidak normal maka jenis uji selanjutnya

adalah uji non-parametrik. Dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui

distribusi normal suatu data. Hipotesis alternatif yang digunakan adalah data %IC

berdistribusi tidak normal. Hipotesis null (Hnull) adalah data %IC berdistribusi

normal. Hasil statistik menunjukkan nilai p sebesar masing-masing 0,200 untuk

rutin dan fraksi air. Bila dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan,

yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%) maka Hnull diterima karena nilai signifikansi

yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Maka

dapat disimpulkan bahwa %IC rutin maupun fraksi air mengikuti distribusi

normal.

Setelah mengetahui data tersebut mengikuti distribusi normal maka

dilakukan uji parametrik berupa uji T tidak berpasangan sebagai parameter

statistik induktif guna melihat signifikansi nilai IC50 antara rutin dengan fraksi air.

Digunakan uji T tidak berpasangan karena nilai IC50 antara rutin dan fraksi air

72  

 

berdiri sendiri atau tidak saling berhubungan. Hipotesis alternatif yang digunakan

adalah nilai IC50 rutin lebih kecil daripada fraksi air. Hipotesis null (Hnull) adalah

nilai IC50 rutin tidak lebih kecil daripada fraksi air. Hasil pengujian memperoleh

nilai signifikansi 0,000 antara rutin dengan fraksi air. Bila dibandingkan dengan

nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 maka Hnull ditolak karena nilai

signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang

ditentukan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin lebih kecil

daripada fraksi air.

Tabel XI. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan rutin dan fraksi air

ekstrak etanolik daun selasih

Intensitas Nilai IC50 Rutin Fraksi air ekstrak etanolik daun

selasih

Sangat kuat < 50 µg/mL √ -

Kuat 50-100 µg/mL - √

Sedang 101-150 µg/mL - -

Lemah > 150 µg/mL - -

Dari hasil penggolongan tingkat kekuatan antioksidan, rutin lebih

memiliki intensitas aktivitas antioksidan daripada fraksi air. Di luar hal tersebut,

fraksi air tetap memiliki intensitas yang kuat sebagai antioksidan.

73  

 

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total (1) Penentuan OT penetapan kandungan fenolik total

Tujuan penentuan OT adalah untuk menetapkan rentang waktu dimana

reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu telah berlangsung secara

sempurna.

Gambar 15. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolik total

Hasil (gambar 15) menunjukkan bahwa dari menit ke-5 sampai 30,

absorbansi senyawa molybdenum blue yang terbentuk telah stabil. Hal ini

menunjukkan bahwa reaksi dalam metode Folin-Ciocalteu telah sempurna sejak

menit ke-5. Untuk waktu OT, peneliti memilih waktu 10 menit agar penelitian

berlangsung efektif dan efisien.

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.000

0 5 10 15 20 25 30 35

Absorba

nsi

Waktu (menit)

Penentuan OT kandungan fenolik

50 µg/mL

100 µg/mL

150 µg/mL

74  

 

(2) Penentuan λ maksimum penetapan kandungan fenolik total

Dari hasil spektra, senyawa berwarna biru tersebut memiliki λ maksimum

pada 750 nm (gambar 16). Hal ini sesuai dengan penelitian-penelitian yang

menyatakan bahwa λ maksimum senyawa berwarna biru hasil metode Folin-

Ciocalteu berada pada rentang λ 750-765 nm (Gansch, Weber, dan Lee, 2009;

Veeru, et al., 2009).

Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum senyawa berwarna biru pada tiga seri konsentrasi asam galat (keterangan:

konsentrasi asam galat A = 50 µg/mL; B = 100 µg/mL; C = 150 µg/mL)

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

Untuk mengetahui validitas metode uji aktivitas antioksidan dilakukan

analisis akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas terhadap replikasi kandungan

fenolik total. Tiga persamaan regresi linear antara konsentrasi asam galat dengan

absorbansi telah dibuat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan yang

75  

 

paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear yang

paling baik didapatkan dari replikasi II dengan y = 0,0061 x – 0,0338 dan 0,9995

sebagai nilai r. Persamaan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi

terukur asam galat. Hasil %recovery dan %CV dapat dihitung jika konsentrasi

tersebut telah didapatkan. Di bawah ini merupakan kurva persamaan regresi

linearnya.

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linear antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi

(1) Akurasi penetapan kandungan fenolik total

Penilaian akurasi berdasarkan pada nilai perolehan kembali (%recovery)

dari data hubungan antara seri konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang

dihasilkan.

y = 0,0061 x – 0,0338r = 0,9995

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900

50 75 100 125 150

Absorba

nsi

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat

Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat

Linear (Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat)

76  

 

Tabel XII. Hasil %Recovery dan %CV penetapan kandungan fenolik total

Replikasi Konsentrasi

teoritis (µg/mL)

AbsorbansiKonsentrasi

terukur (µg/mL)

%Recovery (%)

SD (%)

%CV (%)

Seri 1 50,0 0,277 51,0 101,9

1,2 1,2 50,0 0,279 51,3 102,6 50,0 0,272 50,1 100,3

Seri 2 75,0 0,409 72,6 96,8

0,8 0,8 75,0 0,412 73,1 97,4 75,0 0,405 71,9 95,9

Seri 3 100,0 0,561 97,5 97,5

0,7 0,7 100,0 0,566 98,3 98,3 100,0 0,558 97,0 97,0

Seri 4 125,0 0,718 123,2 98,6

0,7 0,7 125,0 0,723 124,1 99,2 125,0 0,712 122,3 97,8

Seri 5 150,0 0,878 149,5 99,6

0,3 0,3 150,0 0,881 150,0 100,0 150,0 0,876 149,1 99,4

Dari data pada tabel XII, %recovery konsentrasi asam galat berada dalam

rentang 95,9%-102,6%. Persyaratan %recovery untuk asam galat sebagai bahan

p.a. terpenuhi. Rentang %recovery yang baik untuk asam galat pada kadar

sekitar 150 ppm berkisar antara 90%-107%. Metode ini memiliki akurasi yang

baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

(2) Presisi penetapan kandungan fenolik total

Penilaian presisi berdasarkan pada nilai %CV dari data hubungan antara

seri konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang dihasilkan. Dari data pada

tabel XII, %CV yang dihasilkan berada dalam rentang 0,3%-1,2%. Persyaratan

%CV tersebut untuk asam galat sebagai bahan p.a. terpenuhi. Rentang %CV yang

baik untuk kadar sekitar 150 ppm harus ≤ 2,5%. Metode ini memiliki presisi yang

baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

77  

 

(3) Linearitas penetapan kandungan fenolik total

Hasil nilai koefisien korelasi (r) persamaan regresi linear penetapan

kandungan fenolik total yang paling bagus adalah pada replikasi II, yaitu 0,9995.

Persyaratan linearitas yang baik jika nilai r > 0,999 terpenuhi. Metode ini

memiliki linearitas yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

(4) Spesifisitas penetapan kandungan fenolik total

Dari hasil spektra (lampiran 6 dan 12), untuk larutan asam galat tidak

menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi senyawa berwarna

biru yang terukur, sedangkan untuk larutan fraksi air terdapat sedikit gangguan

absorbansi. Hal tersebut dikarenakan hasil fraksinasi pasti memiliki suatu warna.

Fraksi air yang didapatkan cenderung berwarna kuning kecoklatan. Oleh karena

itu, metode ini memiliki spesifisitas yang baik untuk menguji asam galat tetapi

kurang baik untuk menguji fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total

Sesuai dengan penelitian Veeru, et al. (2009), bahwa senyawa fenolik

tumbuhan merupakan golongan mayoritas senyawa yang mempunyai aktivitas

antioksidan. Maka tidaklah mengherankan apabila dalam penelitian ini dilakukan

pula penetapan jumlah kandungan fenolik total pada fraksi air ekstrak etanolik

daun selasih.

78  

 

Untuk membuat kurva baku penentuan kandungan fenolik total diperlukan

senyawa fenolik standar, yaitu asam 3,4,5-trihidroksibenzoat (asam galat)

(gambar 18). Hal ini dikarenakan asam galat merupakan senyawa fenolik tetapi

bukan tergolong dalam flavonoid dan keberadaannya sangat melimpah di alam

(Bruneton, 1999).

COOH

HO

OH

OH

1

3 54

62

Gambar 18. Struktur asam galat (Eslami, Pasanphan, Wagner,

dan Buettner, 2010)

Metode yang digunakan untuk penentuan kandungan fenolik total adalah

metode Folin-Ciocalteu. Metode ini memakai reagen fenol asam fosfomolibdat-

fosfotungstat yang biasa disebut reagen fenol Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini

adalah reaksi ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asam fosfomolibdat-

fosfotungstat. Fenol akan menjadi ion fenolat dalam suasana basa yang lebih

reaktif. Oleh karena itu, dalam metode ini ditambahkan natrium karbonat agar

senyawa fenolik dapat dengan mudah bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu.

Ion fenolat dioksidasi oleh asam dalam pereaksi Folin-Ciocalteu dan

kompleks molybdenum-tungstat akan direduksi oleh senyawa fenolik dalam

sampel hingga menghasilkan warna biru (molybdenum-blue).

79  

 

H3PO4(MoO3)12 +

OH

H2O

H5(PMo12O40)

H7(PMo12O40)

atau

Kompleks molybdenum-bluePereaksi Folin-Ciocalteu Senyawa Fenol

Kuinon

O

O

+ +

 

Gambar 19. Reaksi senyawa fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

Pereaksi Folin-Ciocalteu akan mendapatkan proton (H+) dari gugus fenol

sampel dan air (tereduksi), sedangkan gugus fenol akan mendapatkan tambahan

atom oksigen dari air dan pereaksi (teroksidasi), sehingga terbentuk kompleks

molybdenum-blue (Dharmesti, 2008).

Tabel XIII. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi Persamaan regresi

linear

I

50,0 0,277 y = Bx + A

y = 0,0060 x – 0,0358 r = 0,9993

75,0 0,409 100,0 0,561 125,0 0,718 150,0 0,878

II

50,0 0,279 y = Bx + A

y = 0,0061 x – 0,0338 r = 0,9995

75,0 0,412 100,0 0,566 125,0 0,723 150,0 0,881

III

50,0 0,272 y = Bx + A

y = 0,0061 x – 0,0414 r = 0,9993

75,0 0,405 100,0 0,558 125,0 0,712 150,0 0,876

80  

 

Tabel XIV. Hasil absorbansi fraksi air

Konsentrasi fraksi air (µg/mL) Absorbansi

750,0 0,427 760,0 0,431 750,0 0,430

Tabel XV. Hasil kandungan fenolik total fraksi air

Kandungan fenolik

(µg/mL)

Kandungan fenolik total (mg ekivalen

asam galat per g fraksi air)

Rata-rata (mg ekivalen asam

galat per g fraksi air)

SD (mg ekivalen asam

galat per g fraksi air)

75,5 5,03 5,04 0,03 76,2 5,01

76,0 5,07

Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat pada tabel XIII

menghasilkan 3 persamaan regresi linear. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih

persamaan yang paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi

linear yang paling baik diperoleh dari replikasi II dengan y = 0,0061 x – 0,0338

dan 0,9995 sebagai nilai r. Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi

linear y = 0,0061 x – 0,0338; maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi air

ekstrak etanolik daun selasih sebesar 5,04±0,03 mg ekivalen asam galat per g

fraksi air.

 

81  

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik daun selasih dengan

menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50

sebesar 50,93±0,76 µg/mL.

2. Kandungan fenolik total fraksi air ekstrak etanolik daun selasih yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar 5,04±0,03 mg ekivalen

asam galat per g fraksi air.

B. Saran

1. Perlu dilakukan suatu modifikasi dan optimasi preparasi sampel agar fraksi

yang didapatkan tidak memberikan serapan pada daerah panjang gelombang yang

diteliti dan agar kandungan fenolik dalam selasih dapat sepenuhnya terekstraksi.

2. Jika fraksi masih memberikan serapan pada daerah panjang gelombang yang

diteliti padahal sudah dilakukan modifikasi dan optimasi preparasi sampel, maka

dapat dipilih metode lain tentang pengujian aktivitas antioksidan dan penetapan

kandungan fenolik yang lebih spesifik.

3. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa yang memiliki

aktivitas antioksidan dalam fraksi air ekstrak etanolik daun selasih.

 

82  

Daftar Pustaka

Abul-Fadl, M.A.M., 1949, Colorimetric Determination of Potassium by Folin-

Ciocalteu Phenol Reagent, Postgraduate Medical School, London, 44, 282.

Aggarwal, B.B., Danda, D., dan Bokyung, S., 2008, Targeting Inflammatory Pathways for Prevention and Treatment of Chronic Diseases by Phytochemicals Derived From Traditional Remedies, Proceeding International Conference on Newer Developments in Drug Discovery From Natural Products and Traditional Medicines, India.

Ames, B.N., 1983, Dietary Carcinogens and Anticarcinogens, Science, 221(4617), 1256-1264.

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 11-12.

Anton, R., Carere, A., Delmulle, L., Galli, C.L., Rietjens, I., Silano, V., et al., 2009, Advice on the EFSA Guidance Document for the Safety Assessment of Botanicals and Botanical Preparations Intended for Use as Food Supplements, Based on Real Case Studies, EFSA Journal, 7(9), 65.

Aqil, F., Ahmad, I., dan Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants, Turk J Biol, 30, 177-183.

Arini, Y.D., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Spektrofotometri Visibel Menggunakan Deoksiribosa dan Penentuan Kadar Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang (Terminalia catappa L.), Skripsi, 56, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Armala, M. M., 2009, Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Bassett, J., Denney, R.C., Jeffery, G.H., dan Mendham, J., 1991, Vogel’s Textbook of Quantitative Inorganic Analysis Including Elementary Instrumental Analysis, Longman Group UK Limited, London, pp. 165-166.

83  

  

Bruneton, J., 1999, Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Medicinales, diterjemahkan oleh Hatton, C.K., Lavoisier Publishing, Paris, pp. 229.

Dave, A., 2010, Rotary Evaporation in the Kitchen, http://www.cooking issues.com/primers/rotovap, diakses tanggal 4 Januari 2011.

Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Ahallications of Thin Layer Chromatography, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York, pp. 569, 608-611.

Decker, E., 1998, Strategies for Manipulating the Prooxidative Antioxidative Balance of Foods to Maximize Oxidative Stability, Trends Food Sci. Technol., 9, 241-248.

Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412.

Dharmesti, M.D.D., 2008, Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat (Padina vickersiae Hoyt.) dengan Metode Folin-Ciocalteu, Skripsi, 35-36, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, Archives of Biochemistry and Biophysics, 315, 161–169.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7 dan 1061.

dos Santos, S.X., Mazo, L.H., dan Cavalheiro, E.T.G., 2008, The Use of a Graphite-Silicone Rubber Composite Electrode in the Determination of Rutin in Pharmaceutical Formulation, J. Braz. Chem. Soc., 19(8), 1603.

Ebrahimzadeh, M.A., Pourmorad, F., Hafezi, S., 2007, Antioxidant Activities of Iranian Corn Silk, Turk J Biol, 32(2007), 43-49.

Eslami, A.C., Pasanphan, W., Wagner, B.A., dan Buettner, G.R., 2010, Free Radicals Produced by the Oxidation of Gallic Acid: an Electron Paramagnetic Resonance Study, Chemistry Central Journal, 4(15), 2.

84  

  

Evans, C.S., dan Hedger, J.N., 2001, Degradation of Plant Cell Wall Polymers, in Gadd, G.M., (Ed.), Fungi in Bioremediation, Cambridge University Press, United Kingdom, pp. 18.

Galati, A., McKay, A., dan Tan, S.C., 2005, Minimising Post-Harvest Losses of Carrots, Farmnote, 75(95), 2.

Gansch, H., Weber, C.A., dan Lee, C.Y., 2009, Antioxidant Capacity and Phenolic Phytochemicals in Black Raspberries, New York Fruit Quarterly, 17(1), 20.

Gharavi, N., Haggarty, S., dan El-Kadi, A.O.S., 2007, Chemoprotective and Carcinogenic Effects of tert-Butylhydroquinone and Its Metabolites, Current Drug Metabolism, 8, 1-7.

Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., dan Kufrevioglu, O.I., 2004, Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, hal. 47-109, diterjemahkan oleh Padmawinata K. dan Sudiro I., Penerbit ITB, Bandung.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan, Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.

Henson, S., 2008, Health Benefits of Holy Basil, American Botanical Council, 359, 1.

Huang, D., Ou, B., dan Prior, R.L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays, J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856.

Inglett, G.E., Rose, D.J., Chen, D., Stevenson, D.G., dan Biswas, A., 2009, Phenolic Content and Antioxidant Activity of Extracts from Whole Buckwheat (Fagopyrum esculentum Möench) with or without Microwave Irradiation, Food Chemistry, 119, 1216–1219.

International Conference On Harmonisation Expert Working Group, 2005, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH Harmonised Tripartite Guideline, Q2(R1), 4-5.

85  

  

Javanmardi, J., Stushnoff, C., Locke, E., dan Vivanco, J.M., 2003, Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Iranian Ocimum Accessions, Food Chemistry, 83, 547-550.

Kahl, R., 1984, Synthetic Antioxidants: Biochemical Actions and Interference With Radiation, Toxic Compounds, Chemical Mutagens and Chemical Carcinogens, Toxicology, 33(3-4), 185-228.

Kahl, R., dan Kappus, H., 1993, Toxicology of the Synthetic Antioxidants BHA and BHT in Comparison with the Natural Antioxidant Vitamin E, Z Lebensm Unters Forsch, 196(4), 329-38.

Kartesz, J.T., 2010, Plants Profile: Ocimum tenuiflorum L. holy basil, http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=OCTE72, diakses tanggal 6 September 2010.

Kenjale, R.D., Shah, R.K., dan Sathaye, S.S., 2007, Anti-stress and anti-oxidant effects of root of Chlorophytum borivilianum (Santa Pau & Fernandes), Indian Journal of Experimental Biology, 45, 974-979.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis, 13, 8-17.

Lopez, M., Martinez, F., Del-Valle, C., Ferrit, M., dan Luque, R., 2003, Study of Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method, Talanta, 60, 609-616.

Malkinson, A.M., 1999, Lung Tumor Promotion by BHT, Crisp Data Base National Institutes Of Health, http://www.feingold.org/malkinson.html, diakses tanggal 13 September 2010.

Mann, J., Davidson, R.S., Hobbs, J.B., Banthorpe, D.V., dan Harborne, J.B., 1994, Natural Products: Their Chemistry and Biological Significance, Longman Group UK Limited, London England, pp. 361-367.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.

86  

  

Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., dan Hansen, U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements, Sensors, 7(2007), 2080-2095, Jerman.

Maurya, R., Akanksha, Gupta, P., Singh, A.B., Srivastava, A.K., dan Palit, G., 2007, Antistress and Antidiabetic agents from some Indian traditional plants, Proceeding International Conference on Newer Developments in Drug Discovery From Natural Products and Traditional Medicines, India.

Mbata, T.I., 2010, Antioxidant Nutrients: Beneficial or Harmful, Internet Journal of Food Safety V, 7, 29-33.

Miller, R. dan Miller, S., 2003, Tulsi Queen of Herbs, The Green Isle Enterprise, 1-2.

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-219.

Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Vol III (2), pp. 71-76.

Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 26-33.

Niki, E., dan Noguchi, N., 2000, Evaluation of Antioxidant Capacity: What Capacity is Being Measured by Which Method?, IUBMB Life, 50, 323-329.

O'Neil, M.J., Smith, A., Heckelman, P., Obenchain Jr., J.R., Gallipeau, J.A.R., D'Arecca, M.A., et al., 2001, The Merck Index, an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, Thirteenth ed., Merck & Co., Inc., New Jersey, pp. 3792.

Palmer, D.M., dan Kitchin, JS., 2010, Oxidative Damage, Skin Aging, Antioxidants and a Novel Antioxidant Rating System, http://findarticles.com/p/ articles/mi_m0PDG/, diakses tanggal 14 September 2010.

87  

  

Parke, D.V., dan Lewis, D.F., 1992, Safety Aspects of Food Preservatives, Food Addit Contam., 9(5), 561-77.

Percival, M., 1998, Antioxidants, Advanced Nutrition Publication, Inc, http://acudoc.com/Antioxidants.PDF, diakses tanggal 13 September 2010.

Pereira, D.M., Valentão, P., Pereira, J.A., dan Andrade, P.B., 2009, Phenolics: From Chemistry to Biology, Molecules, 14, 2202-2211.

Peters, M.M., Rivera, M.I., Jones, T.W., Monks, T.J., dan Lau, S.S., 1996, Glutathione Conjugates of tert-Butyl-Hydroquinone, a Metabolite of the Urinary Tract Tumor Promoter 3-tert-Butyl-Hydroxyanisole, are Toxic to Kidney and Bladder, Cancer Research, 56, 1006-1011.

Prakash, A., Rigelhof, F., dan Miller, E., 2010, Antioxidant Activity, http://www.medallionlabs.com, diakses tanggal 14 September 2010.

Ramesh, B., dan Satakopan, V.N., 2010, In Vitro Antioxidant Activities of Ocimum Species: Ocimum basilicum and Ocimum sanctum, Journal of Cell and Tissue Research.

Robin Laboratoire, 2009, Washbenzin, No. 253-11241, Safety Data Sheet According to Regulation, Useldange, pp. 3.

Salganik, R.I., 2001, Review the Benefits and Hazards of Antioxidants: Controlling Apoptosis and Other Protective Mechanisms in Cancer Patients and the Human Population, Journal of the American College of Nutrition, 20, 5, 464S–472S.

Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R., dan Lakshman, K., 2005, In-Vitro Models for Antioxidant Activity Evaluation: a Review, http://www.pharmainfo.net/reviews/vitro-models-antioxidant-activity-evaluation-review, diakses tanggal 14 September 2010.

Solikhah, A, 2007, Sejuta Khasiat Selasih, Harian Online Kabar Indonesia, Okt 18; Kesehatan.

Sunardi, I.,K., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi, L.) terhadap 1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl (DPPH), Seminar Nasional Teknologi 2007, Teknologi Farmasi Fakultas Teknik Universitas Setia Budi, Yogyakarta.

88  

  

van Steenis, C.G.G.J., 1981, Flora untuk Sekolah di Indonesia, diterjemahkan oleh Surjowinoto, M., PT. Pradnya Paramita, Jakarta, pp. 35-360.

Veeru, P., Kishor, M.P., dan Meenakshi, M., 2009, Screening of Medicinal Plant Extracts for Antioxidant Activity, Journal of Medicinal Plants Research, 3(8), 608-612.

Voigt, R., 1995, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan oleh Soewandhi, S.N., hal. 570-571, Penerbit UGM, Yogyakarta.

Wangcharoen, W., dan Morasuk, W., 2007 a, Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Holy Basil, Songklanakarin J. Sci. Technol., 29(5), 1407-1415.

Wangcharoen, W. dan Morasuk, W., 2007 b, Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Some Thai Culinary Plants, Mj. Int. J. Sci. Tech., 01(02), 100-106.

Widodo, Y.R., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Selasih (Ocimum sanctum L.), Skripsi, xi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Wijayakusuma, H., 2005, Sehat dengan Selasih, Suara Karya Online, Nov 13; Kesehatan.

Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, pp. 13-15, 77-81.

Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of Scavenger Properties, http://www.baltic-analytics.de/index. php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 September 2010.

World Health Organization, 2003, WHO Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices (GACP) for Medicinal Plants, Government of the Grand Duchy of Luxembourg, pp. 11-15.

  

89  

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman selasih

90  

  

Lampiran 2. Gambar tanaman selasih dari daerah goa Selarong (Yogyakarta)

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Bobot daun selasih = 1000 g

Fraksi air 

Penimbangan Cawan I Cawan II

Cawan porselen 58,6066 g 57,4913 g

Cawan porselen + fraksi air 67,5333 g 72,6638 g

Bobot fraksi air 8,9267 g 15,1725 g

Total bobot fraksi air 24,0992 g

Rendemen fraksi air =

100%

= ,

100%

= 2,41 %

91  

  

Lampiran 4. Data penimbangan bahan

1. DPPH

Penimbangan Replikasi 1

Bobot kertas 0,2121 g

Bobot kertas + DPPH 0,2281 g

Bobot sisa 0,2123 g

Bobot DPPH 0,0158 g

2. Rutin

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Bobot kertas 0,2450 g 0,2343 g 0,2185 g

Bobot kertas + rutin 0,2477 g 0,2371 g 0,2212 g

Bobot sisa 0,2451 g 0,2345 g 0,2187 g

Bobot rutin 0,0026 g 0,0026 g 0,0025 g

3. Fraksi air

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Bobot cawan 22,1314 g 22,2230 g 22,3241 g

Bobot cawan + fraksi air 22,1569 g 22,2481 g 22,3493 g

Bobot sisa 22,1318 g 22,2231 g 22,3242 g

Bobot fraksi air 0,0251 g 0,0250 g 0,0251 g

92  

  

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji

1. DPPH

BM= 394,33

Mol = , ,

0,0401

M = , ,

0,401

2. Rutin (larutan pembanding)

Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Lar

utan

pe

mba

ndin

g

Seri 1 2,6 µg/mL 2,6 µg/mL 2,5 µg/mL

Seri 2 5,2 µg/mL 5,2 µg/mL 5,0 µg/mL

Seri 3 7,8 µg/mL 7,8 µg/mL 7,5 µg/mL

Seri 4 10,4 µg/mL 10,4 µg/mL 10,0 µg/mL

Seri 5 13,0 µg/mL 13,0 µg/mL 12,5 µg/mL

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding:

Replikasi 1

Konsentrasi larutan stok rutin= ,

260 μg/mL

Konsentrasi larutan intermediet pembanding (seri 1) =

V1 x C1 = V2 x C2

0,5 mL x 260 µg/mL = 10 x C2

C2 = 13 µg/mL

93  

  

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) =

V1 x C1 = V2 x C2

1 mL x 13 µg/mL = 5 x C2

C2 = 2,6 µg/mL

3. Fraksi air (larutan uji)

Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Lar

utan

uji

Seri 1 100,4 µg/mL 100,0 µg/mL 100,4 µg/mL

Seri 2 150,6 µg/mL 150,0 µg/mL 150,6 µg/mL

Seri 3 200,8 µg/mL 200,0 µg/mL 200,8 µg/mL

Seri 4 251,0 µg/mL 250,0 µg/mL 251,0 µg/mL

Seri 5 301,2 µg/mL 300,0 µg/mL 301,2 µg/mL

Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji:

Replikasi 1

Ditimbang 25,1 mg ditambahkan metanol p.a. sampai 25 mL, sehingga

konsentrasinya 1004,0 µg/mL.

Intermediet (seri 1)

V1 x C1 = V2 x C2

1 mL x 1004,0 µg/mL = 10 x C2

C2 = 100,4 µg/mL

Konsentrasi larutan uji (seri 1)

V1 x C1 = V2 x C2

1 mL x 100,4µg/mL = 5 x C2

C2 = 20,1 µg/mL

94  

  

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi

1. Scanning metanol

95  

  

2. Scanning metanol : air (1:1 v/v)

96  

  

3. Scanning rutin

97  

  

4. Scanning asam galat

98  

  

5. Scanning fraksi air (400-600 nm)

6. Scanning fraksi air (500-800 nm)

99  

  

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

1. Penentuan OT

2. Penentuan λ maksimum

a. Spektra DPPH 0,016 mM

Waktu (menit)

Konsentrasi rutin ( µg/mL ) Konsentrasi fraksi air ( µg/mL ) 13,0 39,0 65,0 100,4 200,8 301,2

5 0,819 0,497 0,220 0,730 0,590 0,401 10 0,800 0,485 0,210 0,721 0,575 0,360 15 0,790 0,479 0,204 0,715 0,559 0,338 20 0,777 0,476 0,203 0,704 0,550 0,315 25 0,774 0,474 0,201 0,704 0,549 0,311 30 0,774 0,473 0,199 0,703 0,549 0,311 35 0,774 0,473 0,199 0,703 0,549 0,311 40 0,774 0,473 0,199 0,703 0,549 0,311 45 0,774 0,473 0,199 0,703 0,549 0,311 50 0,774 0,473 0,199 0,702 0,549 0,310 55 0,774 0,473 0,199 0,702 0,548 0,310 60 0,774 0,473 0,199 0,702 0,548 0,310

100  

  

b. Spektra DPPH 0,048 mM

c. Spektra DPPH 0,080 mM

101  

  

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

% IC = /

100%

Rutin

Replikasi Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi kontrol

Absorbansi larutan

pembanding% IC Persamaan regresi

linear

I

2,6

0,841

0,680 19,14% y = Bx + A

y = 5,4880 x + 5,279 r = 0,9998

5,2 0,554 34,13% 7,8 0,435 48,28% 10,4 0,314 62,66% 13,0 0,200 76,22%

Fraksi air

Replikasi Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi kontrol

Absorbansi larutan

uji % IC Persamaan regresi

linear

I

20,1

0,854

0,703 17,68% y = Bx + A

y = 1,1263 x - 6,453 r = 0,9930

30,1 0,616 27,87% 40,2 0,549 35,71% 50,2 0,435 49,06% 60,2 0,311 63,58%

Contoh perhitungan nilai %IC:

Rutin (replikasi 1, konsentrasi 2,6 µg/mL)

%IC = , ,,

100% 19,14 %

Fraksi air (replikasi 1, konsentrasi 20,1 µg/mL)

%IC = , ,,

100% 17,68 %

102  

  

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak etanolik daun selasih dan rutin

Bahan

Uji

IC50 Rata-

rata SD CV Rep. 1

(µg/mL)

Rep. 2

(µg/mL)

Rep. 3

(µg/mL)

Rutin 8,1 8,2 8,1 8,13 0,06 0,71%

Fraksi air 50,1 51,1 51,6 50,93 0,76 1,50%

Keterangan: Rep. = Replikasi; SD = Simpangan Deviasi; dan CV =

Coefficient of Variant

Persamaan regresi linear dari konsentrasi dengan % IC adalah y = Bx + A

y = aktivitas antioksidan (%IC)

x = konsentrasi (µg/mL)

IC50 adalah nilai x pada saat y sebesar 50 %

Contoh perhitungan nilai IC50 (Rutin replikasi 1)

y = 5,4880 x + 5,279

50 = 5,4880 x + 5,279

x = 8,1 µg/mL

103  

  

Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan PASW Statistics 18

1. Uji normalitas Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

% IC rutin .144 15 .200* .912 15 .146

% IC fraksi air .152 15 .200* .920 15 .192

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

2. Uji T tidak berpasangan

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed)

Mean

Difference

Std.

Error

Differen

ce

95% Confidence

Interval of the

Difference

Lower Upper

IC50 Equal

variances

assumed

6.491 .063 -96.785 4 .000 -42.80000 .44222 -44.02779 -41.57221

Equal

variances

not

assumed

-96.785 2.023 .000 -42.80000 .44222 -44.68225 -40.91775

104  

  

Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total

Penimbangan asam galat

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Bobot kertas 0,2460 g 0,2243 g 0,2141 g

Bobot kertas + asam galat 0,2585 g 0,2368 g 0,2266 g

Bobot sisa 0,2460 g 0,2243 g 0,2141 g

Bobot asam galat 0,0125 g 0,0125 g 0,0125 g

Penimbangan fraksi air

Bobot Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Cawan 22,4930 g 22,1314 g 22,2230 g Cawan + fraksi air 22,5005 g 22,1390 g 22,2305 g Isi 0,0075 g 0,0076 g 0,0075 g

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total

1. Penentuan OT

Waktu

(menit)

Konsentrasi asam galat ( µg/mL )

50,0 100,0 150,0

5 0,277 0,561 0,878

10 0,277 0,561 0,878

15 0,277 0,561 0,878

20 0,277 0,561 0,878

25 0,277 0,561 0,878

30 0,277 0,561 0,878

105  

  

2. Penentuan λ maksimum

a. Spektra penentuan kandungan fenolik total asam galat 50 µg/mL

b. Spektra penentuan kandungan fenolik total asam galat 100 µg/mL.

106  

  

c. Spektra penentuan kandungan fenolik total asam galat 150 µg/mL.

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total

Contoh perhitungan kandungan fenolik total

y = 0,0061 x – 0,0338 0,427 = 0,0061 x – 0,0338 x = 75,5 µg/mL

Replikasi 1:

Kandungan fenolik total = . 0,0755 . , ,

5,03 mg ekivalen asam galat per g fraksi air

Replikasi II:

Kandungan fenolik total = . 0,0762 . , ,

5,01

107  

  

Replikasi III:

Kandungan fenolik total = . 0,0760 . , ,

5,07 mg ekivalen asam galat per g fraksi air

Keterangan: x = kandungan fenolik (mg/mL)

V = volume larutan uji yang diambil (mL)

m = massa fraksi air yang ditimbang (g)

  

108  

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas

Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik

Total Fraksi Air Ekstrak Etanolik Daun Selasih (Ocimum

sanctum L.)” memiliki nama lengkap Damianus Listyanta

Edhi Sambada. Penulis lahir di Klaten, Jawa Tengah pada

tanggal 28 September 1989, merupakan anak tunggal dari

pasangan Budi Rahayu dan Sri Astuti. Pendidikan formal yang telah ditempuh

oleh penulis: TK Kanisius Kalasan (1994-1995), SD Kanisius Kalasan (1995-

2001), SMP N 1 Kalasan (2001-2004), SMA Kolese de Britto (2004-2007). Pada

tahun 2007, penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma (USD) Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam tim tenis

Prambanan, Paroki Kalasan, dan Pemuda Karangnongko. Selama kuliah, penulis

pernah juara 4 tenis se-Paroki Kalasan (2009), juara 3 tenis se-Paroki Kalasan

(2010), dan wakil USD dalam bidang tenis PORSIMAPTAR X Akademi Polisi di

Semarang (2010). Selain itu, penulis juga aktif dalam beberapa kegiatan, antara

lain Koordinator Tim Kultur Jaringan Tanaman (2008-2009), Divisi Penelitian

dan Pengembangan Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (DPMF)

(2007-2008), Penyuluh Pengabdian Masyarakat (PM) “Biopori-Sumur Serapan

sebagai Solusi Banjir” di Pingit dan Badran Yogyakarta (2008), Koordinator Tim

PKM Dibiayai DIKTI “Pemanfatan Limbah Serbuk Jamu PT. Capung Indah

Abadi Menjadi Biopestisida dengan Bioaktivator EM-4” (2009), Peserta dari

perwakilan Apoteker kegiatan Bakti Sosial Rotary Taman Sari di Sendang

Sriningsih, Klaten (2009), serta asisten dosen untuk mata kuliah praktikum

Spektroskopi (2009), Farmakognosi-Fitokimia I (2010), Farmakognosi-Fitokimia

II (2010), dan Analisis Sediaan Obat Tradisional (2010), juga menjadi peserta

beberapa seminar.