uji aktivitas antidiabetes ekstrak dan fraksi dari...

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIDIABETES EKSTRAK DAN

FRAKSI DARI EKSTRAK n-HEKSANA BUAH KETAPANG

(Terminalia catappa L.) SEBAGAI INHIBITOR α-GLUKOSIDASE

DAN PENAPISAN FITOKIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

MAMIK YUNIARSIH

0806453655

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI FARMASI

DEPOK

JULI 2012

Uji aktivitas..., Mamik Yuniarsih, FMIPA UI, 2012

ii

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIDIABETES EKSTRAK DAN

FRAKSI DARI EKSTRAK n-HEKSANA BUAH KETAPANG

(Terminalia catappa L.) SEBAGAI INHIBITOR α-GLUKOSIDASE

DAN PENAPISAN FITOKIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi

MAMIK YUNIARSIH

0806453655

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI FARMASI

DEPOK

JULI 2012


iii

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME

Saya yang bertanda tangan di bawah ini dengan sebenarnya menyatakan bahwa

skripsi ini saya susun tanpa tindakan plagiarisme sesuai dengan peraturan yang

berlaku di Universitas Indonesia.

Jika di kemudian hari ternyata saya melakukan plagiarisme, saya akan

bertanggung jawab sepenuhnya dan menerima sanksi yang dijatuhkan oleh

Universitas Indonesia kepada saya.

Depok, 2 Juli 2012

Mamik Yuniarsih


iv

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua

sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya

nyatakan dengan benar.

Nama : Mamik Yuniarsih

NPM : 0806453655

Tanda Tangan :

Tanggal : 2 Juli 2012


v

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :


NPM : 0806453655

Program Studi : Sarjana Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari

Ekstrak n-Heksana Buah Ketapang (Terminalia

catappa L.) sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan

Penapisan Fitokimia dari Fraksi Teraktif

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

pada Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Indonesia.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Dr. Katrin, M.S., Apt

Pembimbing II : Dra. Azizahwati, M.S., Apt

Penguji I : Dr. Amarila Malik, M.Si., Apt

Penguji II : Dra. Maryati Kurniadi, M.Si., Apt

Ditetapkan di : Depok

Tanggal : 2 Juli 2012


vi

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur hanya kepada Allah SWT atas segala limpahan

rahmat dan kasih sayang-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan penelitian

dan penyusunan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka

memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi di Departemen

Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.

Penulis menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai

pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit

untuk menyelelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Ibu Prof. Dr. Yahdiana Harahap, M.S., selaku Ketua Departemen Farmasi

FMIPA UI;

2. Ibu Dr. Katrin, M.S., Apt selaku dosen pembimbing skripsi yang telah

menyediakan waktu, bantuan, tenaga, dan pikiran untuk mengarahkan

penulis dalam penelitian dan penyusunan skripsi;

3. Ibu Dra. Azizahwati, M.S., Apt selaku dosen pembimbing skripsi yang

telah menyediakan waktu, bantuan, tenaga, dan pikiran untuk

mengarahkan penulis dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini;

4. Bapak Dr. Abdul Mun’im, M.Si., Apt selaku kepala proyek dan dosen

yang telah menyediakan waktu, bantuan, tenaga, dan pikiran untuk

mengarahkan penulis dalam penelitian skripsi ini;

5. Bapak Dr. Herman Suryadi, M.S., Apt selaku pembimbing akademik yang

telah memberikan bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh

pendidikan di Departemen Farmasi FMIPA UI;

6. Bapak dan Ibu staf pengajar Departemen Farmasi FMIPA UI atas ilmu

pengetahuan dan bantuan yang telah diberikan selama menempuh

pendidikan di Departemen;

7. Kedua orang tua (Bapak Tumino dan Ibu Narni) dan adikku Sidiq

Nuradiansyah yang senantiasa memberikan kasih sayang, semangat, dan

doa demi kelancaran studi penulis;


vii

8. Rekan penelitian Devin, Lia, Elsa, Nita, Indah, dan rekan-rekan penelitian

fitokimia lain yang selalu membantu selama proses penelitian;

9. Sahabat Dewi, Suci, Rahmi, Irie, Ima, Septi, dan Kak Ika yang telah setia

menemani dan berbagi suka, duka, canda, tawa, dan air mata selama

penulis menempuh pendidikan di Farmasi;

10. Madah Bahana UI yang telah memberikan pengalaman yang luar biasa dan

kesempatan berprestasi;

11. Para laboran serta karyawan Departemen Farmasi FMIPA UI yang telah

membantu terlaksananya penelitian ini;

12. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah

membantu proses penelitian dan penyusunan skripsi ini.

Penulis berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua

pihak yang telah membantu. Semoga skripsi yang masih membutuhkan banyak

bantuan dan saran ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan

khususnya ilmu kefarmasian dan manfaatnya dapat dinikmati oleh seluruh

masyarakat.

Penulis

2012


viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di

bawah ini:


NPM : 0806453655

Program Studi : Sarjana

Departemen : Farmasi

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Jenis karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada

Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive Royalty

Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul :

Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari Ekstrak n-Heksana Buah

Ketapang (Terminalia catappa L.) sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Penapisan

Fitokimia dari Fraksi Teraktif

beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti

Noneksklusif ini, Universitas Indonesia berhak menyimpan,

mengalihmedia/format-kan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database),

merawat, dan memublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama

saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Depok

Pada tanggal : 2 Juli 2012

Yang menyatakan

( Mamik Yuniarsih )


ix Universitas Indonesia

ABSTRAK

Nama : Mamik YuniarsihProgram Studi : S1 FarmasiJudul : Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari Ekstrak

n-Heksana Buah Ketapang (Terminalia catappa L.)sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Penapisan Fitokimiadari Fraksi Teraktif

Diabetes melitus merupakan gangguan metabolisme yang ditandai denganhiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak dan protein yangdisebabkan oleh penurunan sekresi insulin, penurunan sensitivitas insulin, ataukeduanya. Salah satu terapi yang digunakan untuk mengobati diabetes melitusadalah obat penghambat aktivitas α-glukosidase. Obat penghambat aktivitas α-glukosidase bekerja menghambat α-glukosidase yang terdapat pada dinding usushalus. Penghambatan kerja enzim tersebut secara efektif dapat mengurangipencernaan karbohidrat kompleks dan absorbsinya, sehingga dapat mengurangipeningkatan kadar gula postprandial pada penderita diabetes. Tujuan daripenelitian ini adalah untuk memperoleh fraksi yang memiliki penghambatanaktivitas α-glukosidase tertinggi dari ekstrak n-heksana buah ketapang danmengetahui golongan senyawa kimia dari fraksi teraktif. Metode ekstraksi yangdigunakan adalah ekstraksi bertingkat secara refluks dengan menggunakan pelarutn-heksana, etil asetat, dan metanol. Alat microplate reader digunakan untukmenguji penghambatan aktivitas α-glukosidase. Hasil menunjukkan bahwaekstrak n-heksana aktif menghambat aktivitas α-glukosidase dengan IC50 sebesar67,914 µg/mL. Fraksi D merupakan fraksi teraktif dari ekstrak n-heksana dengannilai IC50 sebesar 49,715 µg/mL. Jenis mekanisme penghambatan kerja enzimnyaadalah inhibitor kompetitif. Berdasarkan hasil penapisan fitokimia menunjukkanbahwa fraksi teraktif mengandung senyawa terpenoid dan glikon.

Kata Kunci : diabetes melitus, α-glukosidase, Terminalia catappa L.,buah ketapang, terpenoid.

xvi + 90 halaman ; 13 gambar; 20 tabel; 21 lampiranDaftar Acuan : 51 (1966-2012)


x Universitas Indonesia

ABSTRACT

Name : Mamik YuniarsihProgram study : S1 PharmacyTitle : Antidiabetic Activity Test of Extract and Fractions from

Ketapang Fruits (Terminalia catappa L.) as α-GlucosidaseInhibitor and Phytochemical Screening from the MostActive Fraction.

Diabetes mellitus is a group of metabolic disorders characterized byhyperglycemia and abnormalities in carbohydrate, fat, and protein metabolism asresults from defects in insulin secretion, insulin sensitivity, or both. One therapythat is used in treating diabetes mellitus is α-glucosidase inhibitor. It inhibitsactivity of α-glucosidase in the intestinal wall. Inhibition of this enzyme canreduce digestion and absorption of complex carbohydrates effectively so that, canreduce postprandial glucose levels in diabetic patients. The aim of this study wasto get the fraction which had the highest α-glucosidase inhibitory activity from n-hexane extract of ketapang fruits and to know the phytochemical compounds fromthe most active fraction. The method of extraction is graduated-reflux with n-hexane, ethyl acetate, and methanol. The inhibitory activity of α-glucosidase wasassayed by microplate reader. The result showed that n-hexane extract of ketapangfruits actively inhibits α-glucosidase activity with IC50 values 67,914 µg/mL. Dfraction was the most active fractions from n-hexane extract with IC50 values49,715 µg/mL. Its type of enzyme inhibition mechanism is competitive inhibitory.The result of phytochemical screening showed that the most active fractioncontains terpenoids and glycons.

Key Words : diabetes mellitus, α-glucosidase, Terminalia catappa L.,Ketapang fruits, terpenoids.

xvi + 90 pages ; 13 pictures; 20 tables; 21 appendicesBibliography : 51 (1966-2012)


xi Universitas Indonesia

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...........................................................................................iiSURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME..........................................iiiHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS................................................ivHALAMAN PENGESAHAN.............................................................................vKATA PENGANTAR ........................................................................................viHALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .......................viiiABSTRAK ..........................................................................................................ixABSTRACT........................................................................................................xDAFTAR ISI.......................................................................................................xiDAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xivDAFTAR TABEL...............................................................................................xvDAFTAR LAMPIRAN.......................................................................................xvi

1. PENDAHULUAN..........................................................................................11.1 Latar Belakang ........................................................................................11.2 Tujuan Penelitian.....................................................................................2

2. TINJAUAN PUSTAKA................................................................................32.1 Tanaman Ketapang (Terminalia catappa L.) ..........................................3

2.1.1 Klasifikasi.......................................................................................32.1.2 Morfologi .......................................................................................52.1.3 Ekologi dan Penyebaran ................................................................52.1.4 Kandungan Kimia ..........................................................................52.1.5 Manfaat ..........................................................................................6

2.1.5.1 Tradisional .........................................................................62.1.5.2 Penelitian ...........................................................................6

2.2 Diabetes Melitus......................................................................................72.2.1 Definisi...........................................................................................72.2.2 Klasifikasi.......................................................................................72.2.3 Penatalaksanaan .............................................................................8

2.2.3.1 Terapi Tanpa Obat .............................................................92.2.3.2 Terapi Farmakologi............................................................10

2.3 Enzim ......................................................................................................122.3.1 Karakter Enzim ..............................................................................122.3.2 Mekanisme Penghambatan Enzim.................................................142.3.3 Penentuan Kinetika Penghambatan Enzim ....................................172.3.4 Penghambat α-Glukosidase ...........................................................172.3.5 Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase ..................................18

2.4 Metode Pemisahan ..................................................................................192.4.1 Ekstraksi.........................................................................................19

2.4.1.1 Cara Dingin........................................................................192.4.1.2 Cara Panas..........................................................................20

2.4.2 Kromatografi Lapis Tipis ...............................................................212.4.2.1 Fase Diam ..........................................................................212.4.2.2 Fase Gerak .........................................................................21


xii Universitas Indonesia

2.4.3 Kromatografi Kolom ......................................................................222.5 Microplate Reader ...............................................................................232.6 Penapisan Fitokimia ...............................................................................24

2.6.1 Alkaloid..........................................................................................242.6.2 Flavonoid .......................................................................................242.6.3 Terpenoid .......................................................................................242.6.4 Tanin ..............................................................................................252.6.5 Saponin ..........................................................................................252.6.6 Kuinon ...........................................................................................252.6.7 Glikosida........................................................................................26

3. METODE PENELITIAN .............................................................................273.1 Lokasi dan Waktu Penelitian...................................................................273.2 Bahan dan Alat ........................................................................................27

3.2.1 Bahan Uji .......................................................................................273.2.2 Bahan Kimia ..................................................................................273.2.3 Alat .................................................................................................28

3.3 Cara Kerja ...............................................................................................283.3.1 Penyiapan Simplisia .......................................................................283.3.2 Ekstraksi .........................................................................................293.3.3 Fraksinasi .......................................................................................293.3.4 Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase .....................................29

3.3.4.1 Penyiapan Larutan Pereaksi ...............................................303.3.4.2 Prosedur .............................................................................31

3.3.5 Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase ..................................323.3.5.1 Penyiapan Larutan Akarbose .............................................333.3.5.2 Penyiapan Larutan Sampel ................................................333.3.5.3 Pengujian Blanko...............................................................333.3.5.4 Pengujian Kontrol Blanko .................................................333.3.5.5 Pengujian Sampel ..............................................................333.3.5.6 Pengujian Kontrol Sampel .................................................343.3.5.7 Pengujian Standar ..............................................................343.3.5.8 Pengujian Kontrol Standar/Pembanding............................34

3.3.6 Uji Kinetika Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase ...................363.3.7 Penapisan Fitokimia.......................................................................37

3.3.7.1 Identifikasi Alkaloid ..........................................................373.3.7.2 Identifikasi Flavonoid ........................................................373.3.7.3 Identifikasi Terpenoid........................................................383.3.7.4 Identifikasi Tanin...............................................................383.3.7.5 Identifikasi Saponin ...........................................................383.3.7.6 Identifikasi Antrakuinon ....................................................383.3.7.7 Identifikasi Glikosida.........................................................38

4. HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................................404.1 Penyiapan Bahan Uji...............................................................................404.2 Ekstaksi Simplisia ...................................................................................414.3 Fraksinasi ................................................................................................414.4 Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase ..............................................42


xiii Universitas Indonesia

4.5 Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase ...........................................444.6 Penentuan Kinetika Penghambatan α-Glukosidase.................................464.7 Penapisan Fitokimia ................................................................................47

4.7.1 Alkaloid..........................................................................................484.7.2 Flavonoid .......................................................................................484.7.3 Terpenoid .......................................................................................484.7.4 Tanin ..............................................................................................484.7.5 Saponin...........................................................................................484.7.6 Antrakuinon ...................................................................................494.7.7 Glikon.............................................................................................49

5. KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................505.1 Kesimpulan...............................................................................................505.2 Saran .......................................................................................................50

DAFTAR ACUAN.............................................................................................51


xiv Universitas Indonesia

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Terminalia catappa L ............................................................................4Gambar 2.2 Penguraian substrat oleh enzim.......................................................13Gambar 2.3 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi ...............14Gambar 2.4 Plot timbal-balik ganda atau plot Lineweaver-Burk 1/vi versus

1/[S] yang digunakan untuk mengevaluasi nilai Km dan Vmax .........15Gambar 2.5 Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif .............................16Gambar 2.6 Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif .........................17Gambar 2.7 Struktur kimia akarbose ...................................................................18Gambar 2.8 Reaksi enzimatik α-glukosidase dan p-nitrofenil-α-D-

glukopiranosida ...............................................................................19Gambar 2.9 Microplate Reader...........................................................................23Gambar 3.1 Microplate 96 sumur .......................................................................28Gambar 4.1 Grafik optimasi konsentrasi substrat ...............................................44Gambar 4.2 Plot Lineweaver-Burk fraksi D dari ekstrak n-heksana dengan

Konsentrasi 50 µg/mL.....................................................................47Gambar 4.3 Pola kromatogram terpenoid ...........................................................55


xv Universitas Indonesia

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Prosedur optimasi konsentrasi substrat..................................................32Tabel 3.2 Prosedur uji penghambatan aktivitas α-glukosidase .........................35Tabel 3.3 Prosedur penentuan kinetika penghambatan enzim..........................37Tabel 4.1 Persentase perbandingan berat buah ketapang kering terhadap

berat buah ketapang segar .................................................................56Tabel 4.2. Rendemen ekstrak buah ketapang.....................................................56Tabel 4.3. Rendemen hasil fraksinasi kolom .....................................................56Tabel 4.4. Optimasi aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi substrat...........57Tabel 4.5 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada akarbose.......57Tabel 4.6 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak

n-heksana...........................................................................................58Tabel 4.7 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak

etil asetat............................................................................................58Tabel 4.8 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak

metanol..............................................................................................59Tabel 4.9 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi A .........59Tabel 4.10 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi B .........60Tabel 4.11 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi C .........60Tabel 4.12 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi D .........61Tabel 4.13 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi E..........61Tabel 4.14 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi F..........62Tabel 4.15 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi G .........62Tabel 4.16 Data uji kinetika penghambatan α-glukosidase fraksi D (teraktif) ...63Tabel 4.17 Hasil perhitungan tetapan michaelis-menten fraksi D

(konsentrasii 50 µg/mL)....................................................................63


xvi Universitas Indonesia

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema kerja ekstraksi bertingkat ........................................................64Lampiran 2. Skema kerja fraksinasi ekstrak n-heksana buah ketapang dan

penapisan fitokimia dari fraksi yang memiliki penghambatanaktivitas α-glukosidase terbesar .....................................................65

Lampiran 3. Skema uji penghambatan aktivitas α-glukosidase ........................66Lampiran 4. Sertifikat analisis α-glukosidase ....................................................67Lampiran 5. Sertifikat analisis p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida .....................68Lampiran 6. Hasil determinasi tumbuhan ..........................................................69Lampiran 7. Perhitungan bobot α-glukosidase yang ditimbang ........................70Lampiran 8 Perhitungan aktivitas enzim pada optimasi konsentrasi substrat...71Lampiran 9. Perhitungan IC50 dari akarbose ......................................................73Lampiran 10.Perhitungan IC50 dari ekstrak n-heksana........................................74Lampiran 11.Perhitungan IC50 dari ekstrak etil asetat.........................................75Lampiran 12.Perhitungan IC50 dari ekstrak metanol...........................................76Lampiran 13.Perhitungan IC50 dari fraksi A..... ..................................................77Lampiran 14.Perhitungan IC50 dari fraksi B........................................................78Lampiran 15.Perhitungan IC50 dari fraksi C........................................................79Lampiran 16.Perhitungan IC50 dari fraksi D .......................................................80Lampiran 17.Perhitungan IC50 dari fraksi E........................................................81Lampiran 18.Perhitungan IC50 dari fraksi F ........................................................82Lampiran 19.Perhitungan IC50 dari fraksi G .......................................................83Lampiran 20.Perhitungan kinetika penghambatan aktivitas α-glukosidase

pada fraksi teraktif (fraksi D)......................................................... 84Lampiran 21.Plot hubungan konsentrasi dan % inhibisi pada akarbose,

ekstrak dan fraksi ........................................................................... 85


1 Universitas Indonesia

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes Melitus (DM) adalah gangguan metabolisme yang ditandai

dengan hiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak dan

protein yang disebabkan oleh penurunan sekresi insulin, penurunan sensitivitas

insulin, atau keduanya dan menyebabkan komplikasi kronis mikrovaskular,

makrovaskular dan neuropati (Wells, Dipiro, Schwinghammer dan Dipiro, 2009).

World Health Organization (WHO) pada tahun 2000 menyatakan jumlah

penderita DM di seluruh dunia adalah 171 juta orang dan akan meningkat sampai

dua kali lipat pada tahun 2030. Indonesia termasuk dalam 10 besar daftar negara

dengan penderita diabetes terbanyak selain India, Cina, Amerika, Jepang,

Pakistan, Rusia, Brazil, Italia, dan Bangladesh (Aziza B., 2007). Dalam Diabetes

Atlas 2000 (International Diabetes Federation) tercantum perkiraan penduduk

Indonesia di atas 20 tahun sebesar 125 juta dan dengan asumsi prevalensi DM

sebesar 4,6%, diperkirakan pada tahun 2000 berjumlah 5,6 juta. Berdasarkan pola

pertambahan penduduk seperti saat ini, diperkirakan pada tahun 2020 nanti akan

ada sejumlah 178 juta penduduk berusia di atas 20 tahun dan dengan asumsi

prevalensi DM sebesar 4,6 % akan didapatkan 8,2 juta pasien diabetes (Suyono et

al., 2007).

Walaupun diabetes melitus merupakan penyakit kronik yang tidak

menyebabkan kematian secara langsung, tetapi dapat berakibat fatal bila

pengelolaannya tidak tepat. Pengelolaan DM memerlukan penanganan secara

multidisiplin yang mencakup terapi non-obat dan terapi obat. Penatalaksanaan

diabetes mempunyai tujuan akhir untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas

DM, yang secara spesifik ditujukan untuk mencapai dua target utama, yaitu

menjaga agar kadar glukosa plasma berada dalam kisaran normal dan mencegah

atau meminimalkan kemungkinan terjadinya komplikasi diabetes. Dalam

penatalaksanaan DM, langkah pertama yang harus dilakukan adalah

penatalaksanaan tanpa obat berupa pengaturan diet dan olah raga. Apabila dengan


2

Universitas Indonesia

langkah pertama ini tujuan penatalaksanaan belum tercapai, dapat dikombinasikan

dengan langkah farmakologis berupa terapi insulin atau terapi obat hipoglikemik

oral, atau kombinasi keduanya (Dirjen Binfar Depkes RI, 2005).

Obat golongan penghambat α-glikosidase dapat memperlambat absorpsi

polisakarida, dekstrin, dan disakarida di usus halus. Dengan menghambat kerja α-

glukosidase di usus halus, dapat mencegah peningkatan glukosa plasma pada

orang normal dan pasien DM. Karena kerjanya tidak mempengaruhi sekresi

insulin, maka tidak akan menyebabkan efek samping hipoglikemia (Departemen

Farmakologi dan Terapeutik FKUI, 2007).

Selain pengobatan dengan obat hipoglikemik, beberapa tanaman

tradisional juga sudah diteliti aktivitasnya sebagai antidiabetes. Keunggulan

penggunaan herba terletak pada bahan dasarnya yang bersifat alami sehingga efek

sampingnya dapat ditekan seminimal mungkin. Tanaman yang dilaporkan umum

digunakan sebagai obat tradisional diantaranya adalah alpukat, kayu manis,

jamblang, bawang putih, dan meniran (Soumyanath, 2006).

Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa ekstrak petroleum

eter, metanol dan air buah ketapang menunjukkan aktivitas antidiabetes pada tikus

diabetes yang diinduksi oleh aloksan (Nagappa, Thakurdesai, Rao dan Singh,

2003). Pada penelitian yang dilakukan terhadap berbagai fraksi buah ketapang

(Terminalia catappa L.) diketahui dari fraksi petroleum eter, etil asetat, butanol

dan metanol-air memiliki aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase (Sofawati,

2011). Hal ini menunjukkan bahwa buah ketapang memiliki potensi sebagai obat

antidiabetes. Oleh karena itu pada penelitian ini, peneliti ingin mengetahui fraksi

dari ekstrak n-heksana yang memiliki aktivitas antidiabetes terbesar dan

melakukan penapisan fitokimia dari fraksi yang paling aktif.

1.2 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek penghambatan

aktivitas α-glukosidase dari ekstrak dan fraksi dari ekstrak n-heksana buah

ketapang serta melakukan penapisan fitokimia dari fraksi teraktif buah ketapang

(Terminalia catappa L.).



BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Ketapang (Terminalia catappa L.)

2.1.1 Klasifikasi (Jones & Luchsinger, 1987; Little, E. L., Jr., 1979)

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Bangsa : Myrtales

Suku : Combretaceae

Marga : Terminalia

Jenis : Terminalia catappa L.

Sinonim : Terminalia moluccana Lamk.

Terminalia procera Roxb.

Terminalia latifolia Blanco, non Swartz.

Nama Daerah: Beowa, Ki, Geutapang, Ketapang, Lahapang, Kayafa,

Katapleng, Sairise (Sumatera). Katapang (Jawa).

Katapang, Klihi, Lisa, Ketapas (Nusa Tenggara).

Ketapang, Katapang, Sadina, Salisa, Saliha, Klis, Ngusu

(Maluku). Tarisei, Dumpayang of lumpayong, Talisei,

Kanangan, Katapang, Atapang (Sulawesi). Kalis, Kris

(Irian Jaya) (PT. Eisai Indonesia, 1986).


4


1

2[Sumber: Dokumentasi pribadi]

Keterangan: (1) Tanaman Ketapang; (2) Buah Ketapang

Gambar 2.1 Terminalia catappa L.

4


1




4


1





5


2.1.2 Morfologi

Pohonnya besar, tingginya bisa mencapai 40 m dan diameter batangnya 2

m. Batangnya berwarna abu-abu sampai abu-abu kecoklatan. Bunganya kecil

berkisar antara 4-6 mm, berwarna putih atau krem, memiliki lima lobed, dan

memiliki bau yang tidak sedap. Daun memiliki ujung yang berbentuk bulat dan

tumpul, mengkilap, kasar dan berwarna hijau tua yang kemudian akan berubah

menjadi kuning dan merah ketika akan gugur. Buah berbentuk telur gepeng, keras,

berwarna hijau kemudian kuning, merah dan ungu kemerahan jika buah sudah

masak. Daging buahnya berserabut. Di dalam buah ketapang terdapat biji yang

berbentuk jorong, bagian ujung agak meruncing dan pipih, sedangkan bagian

pangkal membulat (Heyne, 1987; Thomson dan Evans, 2006).

2.1.3 Ekologi dan Penyebaran

Tanaman ini tumbuh liar di dataran rendah Nusantara, di pasir atau pada

karang di pantai. Ditanam pada ketinggian sampai 800 M dari permukaan laut

(Heyne, 1987). Tanaman ini hanya dapat bertahan hidup pada daerah tropis dan

subtropis serta dapat tumbuh subur pada tanah yang memiliki drainase yang baik.

Tanaman ketapang berasal dari Asia Tenggara dan umum ditemukan di seluruh

area, tetapi jarang ditemukan di Sumatera dan Kalimantan. Tanaman ini juga

tumbuh di Australia bagian Selatan, Pakistan, India, Afrika Timur dan Barat,

Madagaskar, dan dataran rendah di Amerika Tengah dan Selatan (Lemmens &

Wulijarni-Soetjipto, 1992).

2.1.4 Kandungan Kimia

Secara umum tanaman ketapang mengandung tanin (puni-calagin,

punicalin, terflavin A dan B, tergallagin, ter-catain, asam chebulagic, geranin,

granatin B, corilagin), flavonoid (isovitexin, vitexin, isoorientin, rutin), dan

triterpenoid (Ahmed, BM, Dhanapal dan Chandrashekara, 2005).


6


2.1.5 Manfaat

2.1.5.1 Tradisional

Secara tradisional tanaman ketapang telah dimanfaatkan untuk

pengobatan. Diantaranya, dapat diminum sebagi infus untuk mengobati sakit

kepala akibat migrain dan demam tinggi. Kulit kayu digunakan sebagai

antidisentri dan diuretik ringan. Daunnya digunakan sebagai antiinflamasi dan

antiseptik (Khare, C.P., 2007; WHO, 1998). Buah ketapang juga digunakan oleh

bangsa Afrika untuk pengobatan diabetes melitus (Soumyanath, 2006).

2.1.5.2 Penelitian

a. Antijamur

Ekstrak n-heksana dan etanol 95% dari daun ketapang diuji terhadap

empat jenis biakan jamur Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes,

Epidermophyton flocosum dan Microsporum gypseum dengan metode difusi agar

menggunakan cakram kertas. Dari hasil uji tersebut diketahui bahwa ekstrak daun

ketapang memiliki aktivitas terhadap jamur Microsporum gypseum (Malik,

Soediro, Padmawinata dan Yulinah, 1993).

b. Antidiabetes

Ekstrak petroleum eter, metanol dan air dari buah ketapang diuji secara in

vivo terhadap tikus hiperglikemik yang diinduksi aloksan. Hasil uji menyatakan

bahwa ekstrak metanol dan air dari buah ketapang secara signifikan memiliki

aktivitas antidiabetes pada tikus hiperglikemik yang diinduksi aloksan tanpa

adanya perubahan pada berat badan (Nagappa, Thakurdesai, Rao dan Singh,

2003). Ekstrak air dari daun ketapang juga dilaporkan memiliki aktivitas

antidiabetes yang diuj secara in vivo pada tikus diabetes yang diinduksi aloksan

(Ahmed, BM, Dhanapal dan Chandrashekara, 2005).

c. Antiinflamasi

Ekstrak kasar etanol yang kemudian dipartisi oleh petroleum eter,

kloroform, etil asetat dan n-butanol dari daun ketapang memiliki aktivitas


7


antiinflamasi yang diuji secara in vivo pada edema kuping di tikus yang diinduksi

TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) (Fan et al., 2004).

2.2 Diabetes Melitus

2.2.1 Definisi

Diabetes melitus (DM) adalah suatu kelainan metabolik kronis yang

melibatkan metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein dengan ciri glukosuria

dan hiperglikemia (Basuki, Dewiyanti, Artanti, dan Kardono, 2002).

2.2.2 Klasifikasi

Klasifikasi Diabetes Melitus berdasarkan etiologinya yang diperkenalkan

oleh American Diabetes Association (ADA) dan telah disahkan oleh World Health

Organization (WHO), yaitu:

a. Diabetes Melitus Tipe 1

Diabetes melitus tipe 1 adalah penyakit hiperglikemia akibat ketiadaan

absolut insulin. Hal ini diperkirakan terjadi akibat destruksi autoimun sel-sel beta

pulau Langerhans. Sebelumnya, tipe diabetes ini disebut sebagai Insulin

Dependent Diabetes Mellitus (IDDM), karena individu pengidap penyakit ini

harus mendapat insulin pengganti. Diabetes tipe 1 biasanya dijumpai pada

individu yang tidak gemuk berusia kurang dari 30 tahun, dengan perbandingan

laki-laki sedikit lebih banyak daripada wanita. Insiden diabetes tipe 1 memuncak

pada usia remaja dini, sehingga pada masa dahulu bentuk ini disebut sebagai

diabetes juvenilis. Akan tetapi, diabetes tipe 1 dapat timbul pada semua kelompok

usia (Corwin, 2009).

b. Diabetes Melitus Tipe 2

Diabetes melitus tipe 2 merupakan DM yang tidak tergantung insulin dan

dinamakan Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM). Pada NIDDM,

terdapat resistensi insulin yang disertai defisiensi insulin relatif atau defek sekresi

insulin disertai resistensi insulin (Aziza, 2007). NIDDM sangat sering terjadi pada

orang dewasa yang kelebihan berat badan yang telah berumur lebih dari 40 tahun

(Johnson, 1998).


8


Untuk kebanyakan individu, diabetes melitus tipe 2 tampaknya berkaitan

dengan kegemukan. Selain itu, kecenderungan pengaruh genetik, yang

menentukan kemungkinan individu mengidap penyakit ini cukup kuat (Corwin,

2009).

c. Diabetes Melitus Gestational

Dikenali pertama kali selama kehamilan dan mempengaruhi 4% dari

semua kehamilan. Karena terjadi peningkatan sekresi berbagai hormon yang

mempunyai efek metabolik terhadap toleransi glukosa, maka kehamilan adalah

suatu keadaan diabetogenik (Price dan Wilson, 2005).

d. Diabetes Melitus Tipe Lain

Ada beberapa tipe diabetes yang lain seperti defek genetik fungi sel beta,

defek genetik kerja insulin, penyakit eksokrin pankreas, endokrinopati, karena

obat atau zat kimia, infeksi, sebab imunologi yang jarang dan sindroma genetik

lain yang berkaitan dengan DM (Suyono et al., 2007).

2.2.3 Penatalaksanaan

Tujuan pengobatan diabetes melitus adalah mengurangi komplikasi

mikrovaskuler dan makrovaskuler jangka panjang, mencegah komplikasi akut dari

kadar glukosa darah yang tinggi, dan memelihara secara keseluruhan kualitas

hidup pasien (Chisholm-Burns, 2008).

Pada dasarnya ada dua pendekatan dalam penatalaksanaan diabetes, yang

pertama pendekatan tanpa obat dan yang kedua adalah pendekatan dengan obat.

Dalam penatalaksanaan DM, langkah pertama yang harus dilakukan adalah

penatalaksanaan tanpa obat berupa pengaturan diet dan olah raga. Apabila dengan

langkah pertama ini tujuan penatalaksanaan belum tercapai, dapat dikombinasikan

dengan langkah farmakologis berupa terapi insulin atau terapi obat hipoglikemik

oral, atau kombinasi keduanya (Dirjen Binfar Depkes RI, 2005).


9


2.2.3.1 Terapi Tanpa Obat

a. Pengaturan Diet

Diet yang baik merupakan kunci keberhasilan penatalaksanaan diabetes.

Diet yang dianjurkan adalah makanan dengan komposisi yang seimbang dalam

hal karbohidrat, protein dan lemak, sesuai dengan kecukupan gizi baik sebagai

berikut: karbohidrat : 60-70 %, protein : 10-15 %, dan lemak : 20-25 %.

Jumlah kalori disesuaikan dengan pertumbuhan, status gizi, umur, stres

akut dan kegiatan fisik, yang pada dasarnya ditujukan untuk mencapai dan

mempertahankan berat badan ideal. Penurunan berat badan telah dibuktikan dapat

mengurangi resistensi insulin dan memperbaiki respons sel-sel β terhadap

stimulus glukosa. Dalam salah satu penelitian dilaporkan bahwa penurunan 5 %

berat badan dapat mengurangi kadar HbA1c sebanyak 0,6 % (HbA1c adalah salah

satu parameter status DM), dan setiap kilogram penurunan berat badan

dihubungkan dengan 3-4 bulan tambahan waktu harapan hidup.

Selain jumlah kalori, pilihan jenis bahan makanan juga sebaiknya

diperhatikan. Masukan kolesterol tetap diperlukan, namun jangan melebihi 300

mg per hari. Sumber lemak diupayakan yang berasal dari bahan nabati, yang

mengandung lebih banyak asam lemak tak jenuh dibandingkan asam lemak jenuh.

Sebagai sumber protein sebaiknya diperoleh dari ikan, ayam (terutama daging

dada), tahu dan tempe, karena tidak banyak mengandung lemak.

Masukan serat sangat penting bagi penderita diabetes, diusahakan paling

tidak 25 g per hari. Disamping akan menolong menghambat penyerapan lemak,

makanan berserat yang tidak dapat dicerna oleh tubuh juga dapat membantu

mengatasi rasa lapar yang kerap dirasakan penderita DM tanpa risiko masukan

kalori yang berlebih. Disamping itu makanan sumber serat seperti sayur dan buah-

buahan segar umumnya kaya akan vitamin dan mineral (Dirjen Binfar Depkes RI,

2005).

b. Latihan Jasmani

Prinsipnya, tidak perlu olah raga berat, olah raga ringan asal dilakukan

secara teratur akan sangat bagus pengaruhnya bagi kesehatan (Dirjen Binfar

Depkes RI, 2005). Dianjurkan latihan jasmani secara teratur (3-4 kali seminggu)


10


selama kurang lebih 30 menit, yang sifatnya sesuai CRIPE (continuous,

rhythmical, interval, progressive, endurance training). Sedapat mungkin

mencapai zona sasaran 75-85 % denyut nadi maksimal (220-umur), disesuaikan

dengan kemampuan dan kondisi penyakit penyerta. Sebagai contoh olahraga

ringan adalah berjalan kaki biasa selama 30 menit, olahraga sedang adalah

berjalan cepat selama 20 menit dan olahraga berat misalnya jogging (Suyono, et

al., 2007).

2.2.3.2 Terapi Farmakologi

a. Insulin

Insulin masih merupakan obat utama untuk DM tipe 1 dan beberapa jenis

DM tipe 2. Berbagai jenis insulin dengan kejernihan yang berbeda-beda tersedia.

Saat ini, insulin manusia yang paling banyak digunakan karena efek samping dan

komplikasi yang lebih sedikit (Corwin, 2009). Sediaan yang tersedia memiliki

farmakokinetika yang berbeda berdasarkan mula kerja dan masa kerjanya, antara

lain insulin kerja singkat, insulin kerja sedang, insulin kerja sedang mulai kerja

singkat, insulin kerja lama, dan sediaan insulin campuran. Mekanisme kerja dari

insulin adalah menurunkan kadar gula darah dengan menstimulasi pengambilan

glukosa perifer dan menghambat produksi glukosa hepatik.

b. Sulfonilurea

Obat-obat kelompok ini bekerja merangsang sekresi insulin di kelenjar

pankreas, oleh sebab itu hanya efektif apabila sel-sel β Langerhans pankreas

masih dapat berproduksi (Dirjen Binfar Depkes RI, 2005). Golongan sulfonilurea

dibagi menjadi 2, yaitu generasi I dan generasi II. Contoh obat generasi I antara

lain klorpropamid, tolbutamid, dan tolazamid. Untuk obat generasi II antara lain

glipizid dan gliburid. Obat sulfonilurea generasi II ini, umumnya potensi

hipoglikemiknya hampir 100x lebih besar dari generasi I (Departemen



11


c. Biguanida

Sebenarnya dikenal 3 jenis obat antidiabetes dari golongan biguanid, yaitu

fenformin, buformin, dan metformin, tetapi yang pertama telah ditarik dari

peredaran karena sering menyebabkan asidosis laktat. Sekarang yang banyak

digunakan adalah metformin (Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI,

2007). Biguanida bekerja menghambat glukoneogenesis dan meningkatkan

penggunaan glukosa di jaringan.

d. Tiazolidindion

Tiazolidindion adalah golongan obat baru yang mempunyai efek

farmakologis meningkatkan sensitivitas insulin. Dapat diberikan secara oral.

Golongan obat ini bekerja meningkatkan glukosa disposal pada sel dan

mengurangi produksi glukosa di hati (Suyono et al., 2007).

e. Penghambat α-Glukosidase

Contoh dari penghambat α-glukosidase adalah akarbose dan miglitol.

Akarbose dapat digunakan sebagai monoterapi pada DM usia lanjut atau DM

yang glukosa postprandialnya sangat tinggi. Di klinik sering digunakan bersama

antidiabetik oral lain dan/atau insulin (Departemen Farmakologi dan Terapeutik

FKUI, 2007).

Efek samping sistemik jarang terjadi tetapi pemberian dosis tinggi

berhubungan dengan peningkatan idiosinkratik kadar serum hepatik transaminase.

Efek samping yang sering terjadi, terutama gangguan lambung, lebih banyak gas,

lebih sering flatus dan kadang-kadang diare. Efek samping ini meningkat dengan

keberlanjutan terapi tetapi akan berkurang dengan pemberian dosis awal yang

rendah dan titrasi dosis (Walker dan Edwards, 2003).

f. Incretin Mimetics (Glucagon-Like Peptide Receptor Agonists)

Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) adalah hormon yang merangsang sekresi

insulin, menekan sekresi glukagon, menghambat pengosongan lambung, dan

mengurangi nafsu makan (Linn, Wofford, O’Keefe & Posey, 2009). Analog

sintetik dari GLP-1 adalah exenatid (Katzung, 2006). Obat ini merupakan terapi


12


tambahan yang diinjeksikan secara subkutan dua kali sehari pada penderita

diabetes melitus tipe 2 yang diobati dengan metformin atau sulfonilurea dan

masih memiliki kontrol glikemik yang optimal (Katzung, 2006; Linn, Wofford,

O’Keefe & Posey, 2009).

g. Incretin Enhancers (Dipeptidyl Peptidase-4 Activity Inhibitors)

Penghambat Dipeptidil Peptidase-4 (DPP-4) bekerja menghambat enzim

DPP-4 dalam menguraikan inkretin (Linn, Wofford, O’Keefe & Posey, 2009).

Obat golongan ini tidak mengakibatkan penurunan atau kenaikan berat badan dan

tidak menyebabkan efek samping pada gastrointestinal (Wells, Dipiro,

Schwinghammer dan Dipiro, 2009). Contoh dari obat golongan penghambat DPP-

4 adalah sitagliptin. Sitagliptin merupakan terapi farmakologi pada penderita

diabetes melitus tipe 2 dan dapat digunakan sebagai terapi tunggal atau

dikombinasikan dengan metformin atau pioglitazon (Katzung, 2006; Linn,

Wofford, O’Keefe & Posey, 2009).

2.3 Enzim

2.3.1 Karakter Enzim

Enzim adalah katalis yang dapat mempercepat reaksi tanpa mengalami

perubahan secara permanen sebagai konsekuensi dari keikutsertaannya dalam

reaksi yang bersangkutan (Murray, Granner, & Rodwell, 2009). Suatu enzim

dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat daripada apabila reaksi

tersebut dilakukan tanpa katalis. Substrat adalah senyawa yang bereaksi dengan

bantuan enzim. Suatu enzim bekerja secara khas terhadap substrat tertentu.

Kekhasan inilah ciri suatu enzim. Ini sangat berbeda dengan katalis lain (bukan

enzim) yang dapat bekerja terhadap berbagai macam reaksi.

Untuk dapat bekerja terhadap suatu zat atau substrat harus ada hubungan

atau kontak antara enzim dengan substrat. Hubungan antara substrat dengan

enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja. Tempat atau bagian

enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat dinamakan

bagian aktif (active site). Hubungan hanya mungkin terjadi apabila bagian aktif

mempunyai ruang yang tepat dapat menampung substrat. Apabila substrat


13


mempunyai bentuk atau konformasi lain, maka tidak dapat ditampung pada

bagian aktif suatu enzim. Hubungan atau kontak antara enzim dengan substrat

menyebabkan terjadinya kompleks enzim-substrat. Kompleks ini merupakan

kompleks yang aktif, yang bersifat sementara dan akan terurai lagi apabila yang

diinginkan telah terjadi. Secara sederhana sekali penguraian suatu senyawa atau

substrat oleh suatu enzim dapat digambarkan sebagai berikut:

[Sumber: Poedjiadi, 2006 ]

Gambar 2.2 Penguraian substrat oleh enzim

Persamaan Michaelis-Menten memperlihatkan secara matematis hubungan

antara kecepatan awal reaksi vi dan konsentrasi substrat

v [ ][ ] (2.1)

Keterangan : vi = kecepatan awal reaksi, Vmax = kecepatan reaksi maksimal, [S] = konsentrasisubstrat, Km = konstanta Michaelis/ konsentrasi substrat dengan kecepatan awal reaksi (vi) adalahseparuh dari kecepatan maksimal (Vmax/2).

Michaelis dan Menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi bergantung pada

konsentrasi kompleks enzim-substrat (ES), sebab apabila bergantung pada

konsentrasi substrat (S), maka penambahan konsentrasi substrat akan

menghasilkan pertambahan kecepatan reaksi (Poedjiadi, 2006). Di sini dapat

dilihat bahwa pada penambahan pertama kecepatan reaksi naik dengan cepat.

Tetapi, jika penambahan substrat dilanjutkan maka penambahan kecepatan mulai

menurun sampai pada suatu ketika tidak ada penambahan kecepatan reaksi lagi.


14


[Sumber: Girindra, 1990]

Gambar 2.3 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi

Michaelis dan kawan-kawannya menyatakan bahwa reaksi yang dikatalisis oleh

enzim pada berbagai konsentrasi substrat mengalami 2 fase, yaitu (1) jika

konsentrasi substrat masih rendah, daerah yang aktif pada enzim tidak terikat

semuanya dengan substrat dan (2) jika jumlah molekul substrat meningkat pada

daerah yang aktif terikat seluruhnya oleh substrat, dan pada saat ini enzim telah

bekerja dengan kapasitas penuh (Girindra, 1990).

2.3.2 Mekanisme Penghambatan Enzim

Mekanisme penghambatan enzim dapat diperkirakan melalui penentuan

kinetika penghambatan enzim. Jenis inhibisi ditentukan dengan analisis data

menggunakan metode Lineweaver-Burk untuk memperoleh tetapan kinetika

Michaelis- Menten (Dewi et al., 2007). Persamaan Michaelis-Menten

memperlihatkan secara matematis hubungan antara kecepatan awal reaksi vi dan

konsentrasi substrat [S] (Murray, Granner, dan Rodwell, 2009). Sedangkan plot

Lineweaver-Burke adalah plot kurva substrat-penghambat dan substrat-tanpa

penghambat dengan 1/[S] sebagai sumbu x dan 1/vo sebagai sumbu y. S adalah

variasi konsentrasi substrat, sedangkan vo adalah kecepatan inisial (initial

velocity) atau kecepatan awal.


15


[Sumber : Murray, Granner, dan Rodwell, 2009]

Gambar 2.4 Plot timbal-balik ganda atau plot Lineweaver-Burk 1/vi

versus 1/[S] yang digunakan untuk mengevaluasi nilai Km dan Vmax

a. Inhibisi kompetitif (Murray, Granner, dan Rodwell, 2009)

Umumnya, pada inhibisi kompetitif ini, inhibitor (I) berikatan dengan

bagian dari tempat aktif yang mengikat substrat dan menghambat akses ke

substrat. Oleh karena itu, struktur kebanyakan inhibitor kompetitif klasik

cenderung mirip dengan struktur substrat, dan karenanya dinamai analog substrat.

. Untuk inhibisi kompetitif klasik, garis yang menghubungkan titik data

eksperimen bertemu di sumbu y (Gambar 2.5). Karena perpotongan garis di

sumbu y = 1/Vmax, pola ini menunjukkan bahwa ketika 1/[S] = 0, vi tidak

bergantung pada keadaan inhibitor.


16



Gambar 2.5 Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif

b. Inhibisi nonkompetitif (Murray, Granner, dan Rodwell, 2009)

Pada inhibisi nonkompetitif, pengikatan inhibitor tidak mempengaruhi

pengikatan substrat. Oleh karena itu, kompleks EI dan EIS dapat terbentuk.

Namun, sementara kompleks enzim-inhibitor tetap dapat mengikat substrat,

namun efesiensinya mengubah substrat menjadi produk yang tercermin oleh Vmax,

berkurang. Inhibitor nonkompetitif mengikat enzim di bagian-bagian yang

berbeda dari bagian pengikat substrat dan umumnya tidak atau sedikit memiliki

kesamaan struktural dengan substrat.

Untuk inhibisi nonkompetitif sederhana, E dan EI memiliki afinitas yang

sama dengan substrat, dan kompleks EIS menghasilkan produk pada kecepatan

yang hampir dapat diabaikan (Gambar 2.6). Inhibisi nonkompetitif yang lebih

kompleks terjadi jika pengikatan inhibitor memang mempengaruhi afinitas.


17



Gambar 2.6 Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif

2.3.3 Penentuan Kinetika Penghambatan Enzim (Girindra, 1990)

Untuk menentukan macam inhibitor dilihat dari gambar 2.4. Grafik yang

didapat dari persamaan

= [ ] + (2.2)

merupakan garis lurus linier yang memotong absis pada titik -1/Km dan memotong

ordinat pada titik 1/Vmaks. Sekarang jika inhibitor ditambahkan ke dalam suatu

sistem enzim maka akan terjadi hambatan reaksi. Tetapi dengan penambahan

substrat tidak terhingga, dimana 1/[S] sama dengan 0, maka akan didapatkan garis

lurus yang berpotongan dengan ordinat 1/V pada titik 1/Vmaks. Apabila dalam

penelitian didapatkan data yang memberi bentuk grafik demikian, maka inhibitor

enzim itu termasuk inhibitor kompetitif. Sebaliknya, jika didapatkan garis dimana

titik pada sumbu naik sedangkan Km tidak berubah, jenis inhibitor termasuk

nonkompetitif.

2.3.4 Penghambat α-Glikosidase

Senyawa-senyawa penghambat α-glukosidase bekerja menghambat enzim

α-glukosidase yang terdapat pada dinding usus halus. Enzim-enzim (maltase,

isomaltase, glukomaltase dan sukrase) berfungsi untuk menghidrolisis


18


oligosakarida, pada dinding usus halus. Inhibisi kerja enzim ini secara efektif

dapat mengurangi pencernaan karbohidrat kompleks dan absorbsinya, sehingga

dapat mengurangi peningkatan kadar glukosa postprandial pada penderita

diabetes (Dirjen Binfar Depkes RI, 2005). Karena kerjanya yang tidak

mempengaruhi sekresi insulin, maka tidak akan menyebabkan efek samping

hipoglikemia.

Contoh sediaan dari golongan penghambat α-glikosidase ini adalah

akarbose dan miglitol. Namun, yang paling sering digunakan adalah akarbose.

Akarbose merupakan oligosakarida yang berasal dari mikroba (Departemen


[Sumber: British Pharmacopoeia Commission, 2009]

Gambar 2.7 Struktur kimia akarbose

Akarbose bekerja menghambat α-glukosidase sehingga mencegah penguraian

sukrosa dan karbohidrat kompleks dalam usus halus, dengan demikian

memperlambat dan menghambat penyerapan karbohidrat.

2.3.5 Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase secara in vitro dilakukan dengan

reaksi enzimatis menggunakan p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa sebagai substrat

dan pengukuran secara spektrofotometri. Enzim α-glukosidase akan

menghidrolisis p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida menjadi p-nitrofenol (berwarna

kuning) dan glukosa dengan reaksi sebagai berikut:


19


[Sumber : Basuki, Minarti, Artanti, Kardono, & Simandjuntak]

Gambar 2.8. Reaksi Enzimatis α-glukosidase dan p-nitrofenil-α-D-

glukopiranosida

Aktivitas enzim diukur berdasarkan absorbansi yang berwarna kuning.

Apabila tumbuhan memiliki kemampuan menghambat aktivitas α-glukosidase

maka p-nitrofenol yang dihasilkan akan berkurang (Basuki, Dewiyanti, Artanti,

dan Kardono, 2002).

2.4 Metode Pemisahan

2.4.1 Ekstraksi (Departemen Kesehatan RI, 2000)

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut. Beberapa

metode yang sering digunakan dalam ekstraksi bahan alam dengan menggunakan

pelarut antara lain.

2.4.1.1 Cara Dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokon atau pengadukan pada temperatur

ruangan (suhu kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode

pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan

pengadukan yang kontinu (terus menerus). Remaserasi berarti dilakukan

p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida+

α-glukosidaseα-D-glukosap-nitrofenol


20


pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama

dan seterusnya.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada suhu kamar.

Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap

perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak), terus menerus

sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

2.4.1.2 Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu

pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan

jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum

dilakukan pada temperatur 40-50oC.

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98oC)

selama waktu tertentu (15-20 menit).


21


e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan

temperatur sampai titik didih air.

Proses ekstraksi akan menghasilkan ekstrak. Ekstrak adalah sediaan kental

yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau

simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir

semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan

sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.

2.4.2 Kromatografi Lapis Tipis (Gandjar dan Rohman, 2007)

Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar, selain

kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase diam pada KLT berupa lapisan yang

seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat

alumunium, atau pelat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut

pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada

pengembangan secara menaik atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan

secara menurun.

2.4.2.1 Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran

kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata

partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin

baik kinerja KLT dalam hal efisiensinya dan resolusinya. Penjerap yang paling

sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi

yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi.

2.4.2.2 Fase Gerak

Sistem yang paling sederhana pada fase gerak adalah campuran dua

pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur

sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara maksimal. Berikut

adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:


22


a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sensitif

b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf

terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan

c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti

juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar

seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan

meningkatkan harga Rf secara signifikan.

d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran

pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan

perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia

masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan

asam.

2.4.3 Kromatografi Kolom (Gritter, Bobbitt, dan Schwarting, 1991)

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah dengan

menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom terdiri dari fase diam dan

fase gerak. Fase diam ditempatkan di dalam tabung kaca berbentuk silinder, pada

bagian bawah tertutup dengan katup atau keran, dan fase gerak dibiarkan mengalir

ke bawah melaluinya karena gaya berat.

Kolom kromatografi dibuat dengan menuangkan suspensi fase diam dalam

pelarut yang sesuai ke dalam kolom dan dibiarkan memampat. Selanjutnya

permukaan pelarut diturunkan sampai tepat pada bagian atas fase diam, dan

cuplikan yang dilarutkan dalam pelarut yang sesuai diletakkan pada bagian atas

kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam lapisan atas penyangga. Kemudian fase

gerak dimasukkan dan dibiarkan mengalir mengembangkan kromatogram. Pada

kondisi yang dipilih dengan baik, linarut yang berupa komponen campuran, turun

berupa pita dengan laju yang berlainan dan dengan demikian dipisahkan. Linarut

biasanya dipisahkan dengan cara membiarkannya mengalir keluar dari kolom dan

mengumpulkannya sebagai fraksi.


23


2.5 Microplate Reader

Microplate reader merupakan suatu instrumen khusus yang dirancang

untuk mengukur serapan sampel kimia hingga 96 sampel dalam suatu prosedur

tunggal. Sampel tersebut ditempatkan dalam suatu wadah khusus yang disebut

sumuran. Sumuran tersebut dapat menampung sejumlah kecil sampel kimia dan

dapat menampung hingga 96 sampel kimia. Sumuran tersebut ideal untuk

melakukan berbagai reaksi kimia sekaligus dengan jumlah sampel yang besar.

Microplate reader bekerja dengan memancarkan suatu jenis cahaya tertentu pada

masing-masing sampel dalam sumuran. Kerja alat ini dapat disesuaikan dengan

berbagai cara, yaitu dapat membaca sebagian atau semua sampel dalam urutan

waktu tertentu atau dapat membaca sampel pada satu waktu (Shmaefsky, 2006).

[Sumber: Zakhartsev, Portner, & Blusta, 2003]

Keterangan: (A) Tampilan tiga dimensi dari sumuran; (B) Tampilan tiga dimensi sumuransaatpengoperasian; (C) Prinsip kerja sumuran.1. sumuran; 2. insulated flexible tubes; 3. pengatur suhueksternal; 4. arah pergerakan sumuranpada saat pembacaan; 5. sumber cahaya; 6. light beams; 7.detektor; 8. aliran udara panas; 9. sumuran yang terisi oleh sampel cair.

Gambar 2.9Microplate reader

Microplate reader secara otomatis melakukan pengukuran endpoint dan

analisis kinetika. Pembaca dapat mengukur densitas optik suatu larutan dalam

sumuran pada panjang gelombang antara 340 nm hingga 900 nm. Microplate


24


reader juga dilengkapi dengan inkubator yang suhunya dapat diatur hingga 50oC

dan shaker yang lama waktu pengocokannya dapat diatur (Bio-tek Instruments,

2005).

2.6 Penapisan Fitokimia (Harborne, 1987).

Penapisan fitokimia adalah pemeriksaan kandungan kimia secara kualitatif

untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan.

Pemeriksaan diarahkan pada senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat

bagi kesehatan seperti, alkaloid, senyawa flavonoid, terpenoid, tanin, saponin,

glikosida, dan kuinon.

2.6.1 Alkaloid

Alkaloid adalah golongan senyawa yang bersifat basa, mengandung satu

atau lebih atom nitrogen biasanya dalam gabungan berbentuk siklik. Alkaloid

sebagian besar berbentuk kristal padat dan sebagian kecil berupa cairan pada suhu

kamar, memutar bidang polarisasi dan terasa pahit.

2.6.2 Flavonoid

Flavonoid umumya terdapat dalam semua tumbuhan berpembuluh, terikat

pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid yang mungkin saja terdapat

dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Karena alasan

itu, maka dalam menganalisis flavonoid biasanya lebih baik bila memeriksa

aglikon yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis sebelum

memperhatikan kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal.

Proses ekstraksi flavonoid dilakukan dengan etanol mendidih untuk menghindari

oksidasi enzim.

2.6.3 Terpenoid

Terpenoid merupakan senyawa yang berasal dari molekul isoprena

CH2=C(CH3)-CH=CH2 dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan

dua atau lebih satuan C5 ini. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa,

mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpen dan seskuiterpen yang


25


mudah menguap (C10 dan C15), diterpen yang lebih sukar menguap (C20) dan

senyawa yang tidak menguap, yaitu triterpenoid, dan sterol (C30), serta pigmen

karotenoid. Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat

dalam sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan

tumbuhan dengan menggunakan eter dan kloroform. Saponin dan glikosida

jantung merupakan golongan senyawa triterpen atau steroid yang terdapat dalam

bentuk glikosida.

2.6.4 Tanin

Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae

terdapat khusus dalam jaringan kayu. Tanin merupakan senyawa yang memiliki

gugus fenol, rasa sepat dan mampu menyamak kulit karena kemampuannya

menyambung silang protein. Menurut batasannya, tanin dapat bereaksi dengan

proteina membentuk kopolimer mantap yang tak larut dalam air. Secara kimia,

terdapat dua jenis utama tanin yaitu tanin terkondensasi dan tanin terhidrolisis.

Tanin terkondensasi atau flavolan secara biosintesis dapat dianggap terbentuk

dengan cara kondensasi katekin tunggal (atau galokatekin) yang membentuk

senyawa dimer dan kemudian oligomer yang lebih tinggi. Tanin terhidrolisis

mengandung ikatan ester yang terhidrolisis jika dididihkan dalam asam klorida

encer.

2.6.5 Saponin

Saponin adalah glikosida triterpen yang merupakan senyawa aktif

permukaan dan dapat menimbulkan busa jika dikocok dengan air. Pada

konsentrasi yang rendah dapat menyebabkan hemolisis sel darah merah pada

tikus.

2.6.6 Kuinon

Kuinon merupakan senyawa berwarna dan memiliki kromofor dasar.

Untuk tujuan identifikasi, kuinon dibagi menjadi empat kelompok, diantaranya

adalah benzokuinon, naftokuinon dan antrakuinon diperlukan hidrolisis asam

untuk melepas kuinon bebasnya. Sedangkan kuinon isoprenoid yang terlibat


26


dalam respirasi sel dan fotosintesis diperlukan cara khusus untuk memisahkannya

dari bahan lipid lain.

2.6.7 Glikosida

Glikosida merupakan suatu senyawa yang bila dihidrolisis akan terurai

menjadi gula (glikon) dan senyawa lain (aglikon atau genin). Pada umumnya

glikon berupa glukosa, fruktosa, laktosa, galaktosa dan manosa. Dapat pula

berupa gula khusus seperti sarmentosa, oleandrosa, simarosa dan rutinosa.

Sedangkan aglikon (genin) biasanya mempunyai gugus –OH dalam bentuk

alkoholis atau fenolis. Glikosida dapat dibedakan menjadi α-glikosida dan β-

glikosida. Pada tanaman, glikosida biasanya terdapat dalam bentuk β-glikosida.

Kegunaan glikosida bagi tanaman adalah untuk cadangan gula sementara,

sedangkan bagi manusia umumnya digunakan untuk obat jantung, diuretika, dan

prekursor hormon steroid.



BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorim Fitokimia dan Kimia Farmasi Analisis

Kuantitatif Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen

Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, selama kurang lebih empat bulan, dari

bulan Februari hingga Juni 2012.

3.2 Bahan dan Alat

3.2.1 Bahan Uji

Buah ketapang (Terminalia catappa L.) yang diperoleh dari sekitar

lingkungan FMIPA, Universitas Indonesia pada bulan Februari 2012 dan telah

dideterminasi di Herbarium Bogoriense (LIPI) Cibinong.

3.2.2 Bahan Kimia

Enzim α-glukosidase yang berasal dari rekombinan Saccharomyces

cerevisiae (Sigma Aldrich, USA), substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida

(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Jepang), dapar fosfat (pH 6,8), dimetil

sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), bovine serum albumin (BSA) (Merck,

Jerman), akarbose (PT. Dexa Medica), natrium karbonat (Merck, Jerman), kalium

dihidrogenfosfat (Analar), kalium hidroksida (Merck, Jerman), n-heksana, etil

asetat, methanol, diklormetan, etanol 96%, aseton, asam asetat glasial (Merck,

Jerman), asam asetat anhidrat (Univar, USA), aqua demineralisata, kloroform,

kuersetin (Merck, Jerman), silika gel 60 H, aquades, air bebas CO2, aluminium

(III) klorida, anisaldehid, bismut (III) nitrat (Merck, Jerman), besi (III) klorida,

vanilin, asam sulfat (Merck, Jerman), eter, natrium hidroksida (Univar, USA),

kuersetin (Merck, Jerman), lempeng kromatografi lapis tipis silika gel 60 F254

(Merck, Jerman), dan silika gel 60 H.


28


3.2.3 Alat

Lemari pengering, alat penggiling, ayakan, refluks, oven (Hotpack

Vacuum Oven), timbangan analitik (ACIS AW-X Series), timbangan digital,

rotary vacum evaporator (Buchi® R11, Switzerland), kertas saring, lemari

pendingin (Panasonic), pH meter (Eutech Instruments), vortex mixer (VM 2000),

microplate reader (BioTek Elx808, USA), microplate 96 sumur, pipet mikro

(Thermo Scientific), multichannel pipet (Thermo Scientific), inkubator, kolom

kromatografi, alat fluorosensi, hot plate dan alat-alat gelas.

Gambar 3.1 Microplate 96 sumur

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Penyiapan Simplisia

Bagian tanaman ketapang yang digunakan adalah buahnya. Buah yang

digunakan adalah yang tua tetapi belum matang, masih hijau dan belum gugur

pada bulan Februari 2012. Buah ketapang yang telah dikumpulkan kemudian

disortasi, dibersihkan dari pengotor, lalu ditimbang. Kemudian, dirajang dengan

cara ditumbuk dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada udara terbuka

dan terlindung dari sinar matahari selama kurang lebih 5 hari. Setelah simplisia

kering, ditimbang kembali agar dapat diketahui bobot penyusutannya. Selanjutnya

simplisia tersebut diserbuk dengan menggunakan mesin penggiling dan diayak

dengan ayakan 40 mesh. Serbuk simplisia kemudian disimpan di tempat yang

terlindung dari cahaya untuk mencegah kerusakan dan kemunduran mutu.


29


3.3.2 Ekstraksi

Sejumlah 1 kg serbuk simplisia kering direfluks menggunakan pelarut

dengan kepolaran yang meningkat, yaitu n-heksana, etil asetat dan metanol.

Simplisia direfluks dengan menggunakan pelarut n-heksana sebanyak 6 kali

hingga warna filtratnya memudar, kemudian disaring dari ampasnya. Setelah itu

ampas yang dihasilkan direfluks dengan menggunakan pelarut etil asetat sebanyak

6 kali hingga warna filtratnya memudar kemudian disaring dari ampasnya.

Terakhir ampas direfluks dengan metanol sebanyak 5 kali. Setiap proses refluks

menggunakan pelarut sebanyak 3 liter dengan suhu yang diajaga 70-80oC dimana

satu siklus refluks dilakukan selama 1 jam. Filtrat yang dihasilkan dari masing-

masing pelarut kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40-50oC

dengan kecepatan 40 rpm hingga didapatkan ekstrak kental. Selanjutnya, ekstrak

kental yang diperoleh ditimbang untuk mengetahui rendemennya dan disimpan di

empat yang terlindung dari cahaya.

3.3.3 Fraksinasi

Ekstrak kental n-heksana ditimbang, kemudian difraksinasi dengan

menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 H. Namun

sebelum melakukan KK, terlebih dahulu dilakukan KLT untuk menentukan

pengembangan yang optimum. Fase gerak yang digunakan adalah n-heksana dan

etil asetat dengan berbagai perbandingan. Fraksi yang diperoleh ditampung dalam

botol setiap 100 mL. Selanjutnya, masing-masing fraksi tersebut di KLT untuk

memperoleh pola kromatogramnya. Fraksi dengan pola kromatogram yang sama

disatukan. Setelah itu dilakukan kembali uji penghambatan aktivitas α-

glukosidase.

3.3.4 Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase

Sebelum dilakukan uji penghambatan α-glukosidase, perlu dilakukan

terlebih dahulu optimasi enzim sehingga dapat diketahui kondisi optimal dari

enzim agar dapat bekerja secara optimal. Optimasi yang dilakukan adalah

optimasi konsentrasi substrat. Sebelum pengujian, terlebih dahulu dilakukan


30


penyiapan larutan pereaksi, seperti larutan dapar fosfat (pH 6,8), larutan natrium

karbonat ,larutan enzim, dan larutan substrat.

3.3.4.1 Penyiapan Larutan Pereaksi

a. Larutan Dapar Fosfat

1) Kalium dihidrogenfosfat 0,2 M

Kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dibuat dengan cara 6,805 g kalium

dihidrogenfosfat dilarutkan dalam aqua demineralisata bebas CO2 dan

diencerkan hingga 250,0 mL.

2) Natrium Hidroksida 0,2 M

Natrium hidroksida 0,2 M dibuat dengan cara 1,6 g NaOH dilarutkan

dalam aqua demineralisata bebas CO2 hingga 200,0 mL.

3) Larutan Dapar Fosfat pH 6,8

Larutan dapar fosfat pH 6,8 dibuat dengan cara 125,0 mL Kalium

dihidrogenfosfat 0,2 M dicampurkan dengan 56,0 mL natrium hidroksida 0,2

M dan diencerkan dengan aqua demineralisata CO2 hingga 500,0 mL.

b. Larutan α-Glukosidase

Larutan enzim dibuat dengan cara 5,056 mg enzim α-glukosidase

ditimbang kemudian dilarutkan dalam 100 mL larutan BSA dalam kondisi dingin.

Larutan induk enzim diencerkan dengan dapar fosfat pH 6,8 hingga diperoleh

larutan enzim 0,05 U/mL. Larutan induk enzim kemudian disimpan. Idealnya

larutan enzim tidak disimpan, namun apabila disimpan usahakan selesai dalam

waktu beberapa bulan (jika disimpan pada suhu -20oC) dan dalam waktu beberapa

minggu (jika disimpan pada suhu 2-8oC). Larutan enzim dibuat pada kondisi suhu

yang rendah (2-8oC), baik wadah maupun ruangan yang digunakan (Sigma, 1996).

c. Larutan Substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG)

Larutan substrat 20 mM dibuat dengan cara 60,25 mg p-nitrofenil-α-D-

glukopiranosida dilarutkan dalam 10,0 mL aqua demineralisata bebas CO2.


31


Kemudian dari larutan induk tersebut diencerkan kembali dengan aqua

demineralisata bebas CO2 hingga mendapatkan konsentrasi substrat 10 mM; 5

mM; 2,5 mM; 1,25 mM dan 0,625 mM.

d. Larutan Natrium Karbonat 200 mM

Larutan natrium karbonat 200 mM dibuat dengan cara 10,6 g serbuk

natrium karbonat ditimbang kemudian dilarutkan dengan 500 mL aqua

demineralisata bebas CO2.

3.3.4.1 Prosedur (Basuki, Dewiyanti, Artanti, dan Kardono, 2002)

a. Penentuan Optimasi Konsentrasi Substrat

Masing-masing campuran reaksi terdiri dari 2 µL dimetil sulfoksida

(DMSO), 63 µLdapar fosfat (pH 6,8) dan 10 µL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida

dengan konsentrasi masing-masing 20 mM, 10 mM, 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM,

dan 0,625 mM, lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37o C. Untuk larutan uji,

tambahkan 25 µL larutan enzim 0,05 U/mL dan diinkubasi selama 30 menit.

Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 100 µL 200 mM natrium karbonat.

P-nitrofenol yang dihasilkan dibaca absorbansinya pada λ 405 nm. Pada uji

larutan kontrol, penambahan natrium karbonat dilakukan terlebih dahulu sebelum

penambahan enzim (Tabel 3.1).


32


Tabel 3.1 Prosedur optimasi konsentrasi substrat

ReagenVolume (µL)

Uji Kontrol

DMSO 2 2

Dapar fosfat (pH 6,8) 63 63

Substrat (konsentrasi 20mM, 10 mM, 5

mM, 2,5 mM, 1,25 mM, 0,625 mM)10 10

Inkubasi 37oC, 5 menit

Enzim 25 -

Natrium karbonat 200 Mm - 100


Enzim - 25

Natrium karbonat 200 mM 100 -

Ukur absorbansi pada λ = 405 nm

b. Perhitungan Aktivitas Enzim (Kikkoman, 2001)

Satu unit enzim akan melepaskan 1,0 µmol D-glukosa dari p-nitrofenil-α-

D-glukosida per menit pada pH 6,8 dan suhu 37oC (Sigma, 2011).

Unit mL enzim⁄ = ( ), (3.1)Unit mg enzim = Unit mL enzim x (3.2)

Keterangan :V= Volume total (mL); df = faktor pengenceran; 18.3= Ekstinsi milimolar p-nitrophenol pada 400 nm; Ve= Volume enzim (mL); t= Waktu inkubasi (menit); C= Banyaknya α-glukosidase dalam larutan (mg/mL)

3.3.5 Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dilakukan terhadap larutan

blanko (larutan tanpa sampel/standar), larutan akarbose sebagai standar

pembanding dan larutan sampel (ekstrak dan fraksi). Setiap larutan uji dibuat

larutan kontrol masing-masing.


33


3.3.5.1 Penyiapan Larutan Akarbose

Sebanyak 10,2 mg akarbose ditimbang kemudian dilarutkan dalam 10,0

mL dapar fosfat pH 6,8 hingga diperoleh konsentrasi larutan 1020 ppm.

3.3.5.2 Penyiapan Larutan Sampel

Sebanyak ±10,0 mg sampel (ekstrak dan fraksi) dilarutkan dalam 3 mL

dimetil sulfoksida kemudian dicukupkan volumenya dengan dapar fosfat pH 6,8

pada labu ukur 10,0 mL sehingga didapatkan larutan sampel dengan konsentrasi

1000 ppm. Selanjutnya pengenceran sampel dilakukan dengan teknik pipetting.

3.3.5.3 Pengujian Blanko

Sebanyak 2 µL larutan dimetil sulfoksida ditambah dengan 63 µL dapar

fosfat pH 6,8 dan 10 µL larutan 10 mM p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida,

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan 25 µL larutan

enzim 0,05 U/mL, sampel diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 37oC.

Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 100 µL 200 mM natrium karbonat.

Sampel diukur absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang

405 nm.

3.3.5.4 Pengujian Kontrol Blanko

Sebanyak 2 µL larutan dimetil sulfoksida ditambah dengan 63 µL dapar

fosfat pH 6,8 dan10 µL larutan 10 mM p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida,

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan 100 µL 200

mM natrium karbonat dan diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 37oC.

Setelah masa inkubasi selesai, tambahkan 25 µL larutan enzim 0,05 U/mL.

Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang

405 nm.

3.3.5.5 Pengujian Sampel

Sebanyak 2 µL, 5 µL, 10 µL, 15 µL, dan 20 µL larutan sampel berturut-

turut ditambah dengan 63 µL, 60 µL, 55 µL, 50 µL, dan 45 µL dapar fosfat pH


34


6,8 dan 10 µL 10 mL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida, diinkubasi selama 5 menit

pada suhu 37oC. Kedalam sampel ditambahkan 25 µL larutan enzim 0,05 U/ml,

sampel diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 37oC. Setelah masa

inkubasi selesai, tambahkan 100 µL 200 mM natrium karbonat. Sampel diukur

absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm.

3.3.5.6 Pengujian Kontrol Sampel

Sebanyak 2µL, 5 µL, 10 µL, 15 µL, dan 20 µL larutan ekstrak berturut-

turut ditambah dengan 63 µL, 60 µL, 55 µL, 50 µL, dan 45 µL dapar fosfat pH

6,8 dan 10 µL larutan 10 mL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida, diinkubasi selama

5 menit pada suhu 37oC. Kedalam sampel ditambahkan 100 µL 200 mM natrium

karbonat, sampel diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 37oC. Setelah

masa inkubasi selesai, tambahkan 25 µL larutan enzim 0,05 U/mL. Sampel diukur

absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm.

3.3.5.7 Pengujian Standar

Sebanyak 10 µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL, dan 60 µL larutan standar

(akarbose) berturut-turut ditambah dengan 55 µL, 45 µL, 35 µL, 25 µL, dan 5 µL

dapar fosfat pH 6,8 dan 10 µL larutan 10 mM p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida,

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan 25 µL larutan

enzim 0,05 U/mL dan diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 37oC.

Setelah masa inkubasi selesai, tambahkan 100 µL 200 mM natrium karbonat.


405 nm.

3.3.5.8 Pengujian Kontrol Standar/Pembanding

Sebanyak 10 µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL, dan 60 µL larutan standar

(akarbose) berturut-turut ditambah dengan 55 µL, 45 µL, 35 µL, 25 µL, dan 5 µL

dapar fosfat pH 6,8 dan 10 µL 10 mM p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG),

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan 100 µL 200

mM natrium karbonat, kemudian diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu

37oC. Setelah masa inkubasi selesai, tambahkan 25 µL larutan enzim 0,05 U/mL.


35



405 nm.

Tabel 3.2 Prosedur uji penghambatan aktivitas α-glukosidase

ReagenVolume (µL)

B1 B0 S1 S0

Sampel / inhibitor - - 2-20 2-20

DMSO 2 2 - -

Dapar fosfat 63 63 45-63 45-63

Substrat 10 10 10 10


Enzim 25 - 25 -

Natrium karbonat - 100 - 100


Enzim - 25 - 25

Natrium karbonat 100 - 100 -


Keterangan : B1= Blanko, B0= Kontrol Blanko, S1= Sampel dan Standar (akarbose), S0= KontrolSampel dan Kontrol Standar (akarbose)

Aktivitas inhibitor α-glukosidase dapat dihitung dengan rumus:

% inhibisi = × 100 % (3.3)

Keterangan:S= absorbansi sampel (S1-S0); C = absorbansi kontrol (B1-B0)

IC50 dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear, konsentrasi

sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Dari persamaan: y = a +

bx dapat dihitung nilai IC50 dengan menggunakan rumus :

IC = (3.4)


36


3.3.6 Uji Kinetika Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Uji kinetika penghambatan aktivitas enzim diukur dengan meningkatkan

konsentrasi p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (substrat). Sampel yang akan

digunakan sebagai penghambat aktivitas enzim merupakan fraksi teraktif n-

heksana (Fraksi D). Sebanyak 5 µL dan 10 µL fraksi uji berturut-turut ditambah

dengan 60 µL dan 55 µL dapar fosfat pH 6,8 dan 10 mM p-nitrofenil-α-D-

glukopiranosida dengan 4 konsentrasi berbeda, yaitu 1,25 mM; 2,5 mM; 5 mM

dan 10 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan

25 µL larutan enzim 0,05 U/mL dan diinkubasi kembali selama 30 menit pada

suhu 37oC. Setelah masa inkubasi selesai, tambahkan 100 µL 200 mM natrium

karbonat. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada panjang

gelombang 405 nm. Setiap pengujian dilakukan koreksi, yaitu dengan pembuatan

larutan kontrol.

Jenis inhibisi ditentukan dengan analisis data menggunakan metode

Lineweaver-Burk untuk memperoleh tetapan kinetika Michaelis-Menten (Dewi, et

al.,2007). Tetapan kinetika Michaelis-Menten dihitung berdasarkan persamaan

regresi y = a + bx, dimana x adalah 1/[S] dan y adalah 1/A. Jenis inhibisi dapat

juga dilihat dari bentuk plot Lineweaver-Burk (Murray, Granner, & Rodwell,

2009).


37


Tabel 3.3 Prosedur penentuan kinetika penghambatan enzim

Reagen

Volume (µL)

Tanpa

Inhibitor

Tanpa

Inhibitor

Kontrol

Dengan

Inhibitor

Dengan

Inhibitor

Kontrol

Ekstrak - - 5-10 5-10

DMSO 2 2 - -

Dapar 63 63 55-60 55-60

Substrat 10 10 10 10

Inkubasi 37oC selama 5 menit

Enzim 25 - 25 -

Na2CO3 - 100 - 100

Inkubasi 37oC selama 30 menit

Enzim - 25 - 25

Na2CO3 100 - 100 -


3.3.7 Penapisan Fitokimia (Wagner, Bladt dan Zgainski, 1984)

Fraksi teraktif dari ekstrak n-heksana buah ketapang dilakukan penapisan

fitokimia untuk mengetahui kandungan golongan senyawa kimianya. Penapisan

fitokimia dilakukan dengan cara kromatografi lapis tipis, kecuali identifikasi

glikosida, yaitu menggunakan pereaksi kimia.

3.3.7.1 Identifikasi Alkaloid

Lempeng KLT dielusi dengan eluen kloroform-metanol (85:15). Setelah

dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot Dragendorf LP. Hasil positif akan

menunjukkan warna jingga-coklat Hasil positif akan menunjukkan warna kuning

pada sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm.

3.3.7.2 Identifikasi Flavonoid

Lempeng KLT dielusi dengan eluen butanol-asam asetat glasial-aquades

(40:10:50). Setelah dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot AlCl3. Hasil


38


positif akan menunjukkan warna kuning pada sinar UV dengan panjang

gelombang 366 nm.

3.3.7.3 Identifikasi Terpenoid

Lempeng KLT dielusi dengan eluen benzen-etil asetat (90:10). Setelah

dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot vanilin-asam sulfat. Hasil positif

akan menunjukkan warna biru kuat, hijau, merah, ungu atau coklat pada cahaya

tampak setelah dipanaskan pada suhu 110˚C selama 5-10 menit.

3.3.7.4 Identifikasi Tanin


(40:10:50). Setelah dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot larutan FeCl3

10%. Hasil positif akan menunjukkan warna hijau-kehitaman.

3.3.7.5 Identifikasi Saponin


(50:10:40). Setelah dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot anisaldehid-

asam sulfat. Hasil positif akan menunjukkan warna biru, biru-ungu, atau

kekuningan pada cahaya tampak setelah dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10

menit.

3.3.7.6 Identifikasi Antrakuinon

Lempeng KLT dielusi dengan eluen etil asetat-metanol-aquades


asam sulfat. Hasil positif akan menunjukkan warna merah pada cahaya tampak

atau flourosensi kuning di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm.

3.3.7.7 Identifikasi glikosida (Depkes RI, 1995)

Ekstrak ditambahkan dengan etanol 70% 20 ml, tambahkan 25 ml air dan

25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, kocok, diamkan selama 5 menit dan saring. Sari

filtrat tiga kali, tiap kali dengan 20 ml campuran (3:1) kloroform P dan


39


isopropanol. Kumpulan sari tambahkan natrium sulfat anhidrat, saring dan uapkan

pada suhu tidak lebih dari 50oC. Larutkan sisa dengan 2 ml metanol.

a. Larutan percobaan sebanyak 1 mL diuapkan hingga kering, sisanya

ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat P dan 1 tetes asam sulfat P. Hasil

positif terbentuknya warna biru atau hijau.

b. Larutan percobaan sebanyak 1 mL diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan

dengan 2 mL air dan 5 tetes Molisch LP. Kemudian ditambahkan dengan

hati-hati 2 mL asam sulfat P. Hasil positif terbentuknya cincin berwarna ungu

pada batas cairan (Reaksi Molisch).



BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Bahan Uji

Pada penelitian ini, bahan uji yang digunakan adalah bagian buah tanaman

ketapang (Terminalia catappa L.) yang diperoleh dari lingkungan sekitar FMIPA

Universitas Indonesia. Bagian buah pada tanaman ketapang dipilih karena pada

penelitian terdahulu diketahui bahwa buah ketapang memiliki aktivitas

antidiabetes (Mahmudah, 2011; Sofawati, 2011). Tanaman yang diperoleh

selanjutnya dideterminasi di Herbarium Bogoriense (LIPI), Cibinong. Hasil

determinasi menunjukkan bahwa bahan uji merupakan tanaman ketapang

(Terminalia catappa L.) dari famili Combretaceae (Lampiran 6). Buah ketapang

yang digunakan adalah buah yang telah tua tetapi belum matang, masih hijau dan

belum gugur pada bulan Februari 2012.

Buah ketapang yang telah dikumpulkan kemudian disortasi, dibersihkan

dari pengotor, lalu ditimbang. Setelah selesai dibersihkan, buah ketapang dirajang

dengan cara ditumbuk dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada udara

terbuka dan terlindung dari sinar matahari selama kurang 5 hari. Tujuan dari

perajangan adalah untuk mempercepat pengeringan karena kadar air yang sangat

banyak pada buah ketapang. Pengeringan dilakukan untuk mendapatkan simplisia

yang tidak mudah rusak, karena dengan mengurangi kadar air dapat mencegah

penurunan mutu atau perusakan simplisia dari pembusukkan (Depkes RI, 1985).

Simplisia yang telah cukup kering selanjutnya dimasukkan ke dalam

lemari pengering. Setelah kering, simplisia kering ditimbang kembali agar dapat

diketahui bobot penyusutannya (susut pengeringan). Hasil susut pengeringan

dapat dilihat pada Tabel 4.1. Selanjutnya simplia tersebut diserbuk dengan

menggunakan alat penggiling dan diayak dengan ayakan 40 mesh. Kemudian

simplisia disimpan di tempat yang tertutup untuk mencegah perusakan dan

penurunan mutu.


41


4.2 Ekstraksi Simplisia

Sejumlah 1 kg serbuk simplisia kering diekstraksi dengan cara panas, yaitu

refluks menggunakan pelarut yang kepolarannya meningkat n-heksana, etil asetat,

dan metanol. Simplisia direfluks dengan menggunakan pelarut tersebut sebanyak

5-6 kali hingga warna filtratnya memudar agar jumlah senyawa yang tersari lebih

banyak dan senyawa berkhasiat tersari seluruhnya. Dipilih metode ekstraksi

dengan cara refluks karena metode ini membutuhkan waktu lebih singkat dan

metode ini sudah banyak digunakan untuk uji penghambatan aktivitas α-

glukosidase selain maserasi, sokhlet dan perkolasi (Chan, Sun, Reddy, & Wu,

2010).

Untuk sekali siklus refluks dibutuhkan waktu selama 1 jam. Kemudian,

filtrat dipisahkan dari ampasnya dengan cara disaring. Filtrat yang dipeoleh

kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40-50oC dan kecepatan

40 rpm hingga menjadi ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh ditimbang

untuk dihitung rendemennya (lihat Tabel 4.2) dan disimpan dalam wadah tertutup

rapat. Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh dengan

simplisia awal (Depkes RI, 2000). Skema ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 1.

4.3 Fraksinasi

Ekstrak kental yang telah diperoleh selanjutnya difraksinasi dengan

kromatografi kolom. Sebelum melakukan kromatografi kolom, terlebih dahulu

dilakukan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk melihat eluen yang memiliki

pemisahan terbaik. Dari hasil kromatografi lapis tipis diperoleh bahwa eluen

terbaik yang dapat digunakan untuk kromatografi kolom adalah heksana/etil asetat

dengan berbagai perbandingan

Setelah mengetahui eluen yang tepat untuk fraksinasi kolom, selanjutnya

dilakukan kromatografi kolom. Cara pembuatan kolom yang digunakan adalah

cara basah dan fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 H. Silika gel yang

ditimbang sebanyak 190 gr. Silika gel dibuat larutan suspensi dengan

menggunakan pelarut n-heksana. Selanjutnya suspensi silika gel dimasukkan ke

dalam kolom yang bagian bawahnya sudah diberi kapas sambil diketuk-ketukkan


42


hingga padat. Setelah kolom terbentuk, pada bagian atas kolom diberi kertas

saring.

Penyiapan sampel dilakukan dengan cara kering. Ekstrak ditimbang

sebanyak 19 gr, kemudian dilarutkan dengan aseton. Setelah ekstrak agak kental,

ditambahkan sejumlah silika gel dan diaduk-aduk hingga menjadi serbuk.

Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam kolom. Pemasukkan sampel harus hati-

hati agar didapat sampel yang merata di seluruh permukaan kolom.

Fase gerak yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat dengan berbagai

perbandingan. Penggantian konsentrasi fase gerak dilakukan berdasarkan

penurunan pita warna kolom. Dari hasil kromatografi kolom didapatkan 84 fraksi

yang ditampung pada wadah botol 100 mL. Selanjutnya fraksi-fraksi tersebut

digabung berdasarkan kemiripan pola kromatografi pada KLT. Setelah

digabungkan didapatkan 8 fraksi gabungan. Kedelapan fraksi tersebut kemudian

ditimbang untuk mengetahui rendemen fraksi (lihat Tabel 4.3). Bobot fraksi yang

lebih dari 0,100 g dipilih unuk dilakukan uji penghambatan aktivitas α-

glukosidase. Skema fraksinasi dapat dilihat pada lampiran 2.

4.4 Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase

Sebelum melakukan uji penghambatan α-glukosidase perlu dilakukan

terlebih dahulu uji pendahuluan untuk mengetahui kondisi optimal dari enzim

agar dapat bekerja secara optimal. Dilakukan optimasi enzim untuk memastikan

bahwa penurunan aktivitas penghambatan α-glukosidase merupakan hasil kerja

ekstrak yang memiliki aktivitas penghambatan pada enzim tersebut. Optimasi

yang dilakukan adalah konsentrasi substrat. Kerja enzim sebenarnya juga

dipengaruhi oleh suhu dan pH. Namun, optimasi suhu dan pH tidak dilakukan

karena dalam sertifikat analisis enzim (Lampiran 4) dinyatakan bahwa satu unit

dari enzim dapat melepaskan 1,0 mikromol D-glukosa dari p-nitrofenil-α-D-

glukosida per menit pada pH 6,8 dan suhu 37oC. Dari keterangan dapat diketahui

bahwa enzim bekerja optimal pada pH 6,8 dan suhu 37oC. Pengukuran aktivitas

enzim juga tidak dilakukan karena enzim yang digunakan masih baru sehingga

diharapkan aktivitas enzim yang digunakan masih baik.


43


Reaksi enzimatis berlangsung pada suhu 37oC. Enzim stabil pada pH 6,8,

oleh karena itu pada pengujian digunakan dapar fosfat pH 6,8. Natrium karbonat

digunakan untuk menghentikan reaksi enzimatis. Inkubasi dilakukan dua kali,

yaitu 5 menit pada tahap pertama yang bertujuan untuk memberikan waktu bagi

larutan uji untuk mencapai suhu 37oC dan 30 menit pada tahap kedua yang

bertujuan untuk enzim bereaksi dengan substrat (reaksi enzimatis). Unit enzim

yang dapat digunakan pada uji pendahuluan ini adalah 0,05 U/ml (Lampiran 7).

Enzim yang digunakan sebesar 1 mg dengan spesifikasi 15,2 mg enzim

mengandung 23% protein dan terdapat 215 unit enzim tiap mg protein.

Variasi konsentrasi substrat yang digunakan untuk optimasi adalah 0,625

mM; 1,25 mM; 2,5 mM; 5 mM; 10 mM dan 20 mM. Pengujian dilakukan dengan

mencampurkan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida dan dapar fosfat (pH

6,8) diinkubasi pada 37oC selama 5 menit kemudian ditambahkan larutan enzim

dan diinkubasi kembali selama 30 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan

penambahan natrium karbonat. Produk yang dihasilkan dari reaksi antara enzim α-

glukosidase dan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida diukur serapannya pada

panjang gelombang 405 nm. Untuk mengoreksi hasil serapan blanko, dilakukan

juga pengamatan aktivitas enzim pada kontrol. Pada kontrol, natrium karbonat

ditambahkan setelah inkubasi substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida dan dapar

fosfat (pH 6,8) pada 37oC selama 5 menit dan kemudian diinkubasi selama 30

menit. Setelah itu, ditambahkan α-glukosidase pada campuran reaksi tersebut.

Hasil yang diperoleh dari kontrol dapat digunakan untuk melihat apakah masih

ada produk yang terbentuk antara p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida dan α-

glukosidase saat kondisi campuran telah dibasakan dengan natrium karbonat. Data

serapan dan nilai aktivitas enzim dapat dilihat pada Tabel 4.4.


44


Gambar 4.1 Grafik optimasi konsentrasi substrat

Aktivitas enzim akan meningkat seiring dengan pertambahan substrat hingga

mencapai suatu enzim dengan keadaan jenuh oleh substrat. Hasil yang diperoleh

dari optimasi subtrat diketahui bahwa aktivitas enzim meningkat pada konsentrasi

substrat 0,625 mM sampai 10 mM dan tidak mengalami kenaikan (keadaan

konstan) pada konsentrasi substrat 20 mM (Gambar 4.1). Keadaan konstan terjadi

diperkirakan karena sisi aktif enzim sudah terisi penuh oleh substrat. Berdasarkan

hasil yang diperoleh maka konsentrasi substrat yang digunakan untuk uji

penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase adalah 10 mM.

4.5 Uji penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Untuk pengujian penghambatan aktivitas α-glukosidase digunakan metode

yang diperoleh dari Prof. K. Kawanishi (Kobe Pharmaceutical University,

komunikasi personal) yang dimodifikasi dengan melakukan penetapan tersebut

pada 96 well microtiter plate. Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase

dilakukan dengan menggunakan larutan enzim 0,05 U/ml dan konsentrasi larutan

substrat 10 mM. Pengujian dilakukan dengan menggunakan berbagai konsentrasi

ekstrak dengan tujuan mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap daya

inhibisi. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka semakin tinggi daya

inhibisinya. Konsentrasi ekstrak dan daya inhibisi yang diperoleh dibuat

persamaan regresi untuk mendapatkan nilai IC50. Nilai IC50 adalah konsentrasi

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25

Akt

ivita

s Enz

im (U

/mg)

Konsentrasi Substrat (mM)

Optimasi Konsentrasi Substrat


45


ekstrak dari penghambatan α-glukosidase yang dapat menghambat 50% dari

aktivitas α-glukosidase. Semakin kecil nilai IC50, semakin baik daya inhibisinya.

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dilakukan dengan mengukur

serapan produk, yaitu p-nitrofenol pada panjang gelombang 405 nm menggunakan

alat microplate reader ELx808. Perhitungan aktivitas enzim dilakukan dengan

membandingkan larutan sampel (S) dengan blanko (B). Larutan blanko

merupakan larutan uji tanpa sampel/ekstrak, namun perlakuannya sama dengan

larutan uji sampel. Larutan kontrol untuk sampel (S0) dan blanko (B0) juga dibuat

sebagai faktor koreksi. Koreksi yang dilakukan untuk memastikan bahwa natrium

karbonat sudah menghambat kerja enzim dan mengetahui apakah ada absorbansi

yang terbaca dari senyawa selain p-nitrofenol misalnya dikarenakan warna ekstrak

yang berwarna yang dapat mempengaruhi nilai serapan.

Sebelum dilakukan uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase pada

ekstrak, terlebih dahulu dilakukan uji penghambatan aktivitas pada pembanding,

yaitu akarbose. Hasil pengujian menunjukkan bahwa akarbose memiliki efek

penghambatan aktivitas α-glukosidase dengan nilai IC50 260,453 ppm (Tabel 4.5).

Akarbose yang digunakan sebagai pembanding dinilai kurang efektif dalam

menghambat aktivitas α-glukosidase yang berasal dari mikroorganisme

Saccharomyces cerevisiae. Akarbose lebih efektif menghambat aktivitas α-

glukosidase yang berasal dari mamalia seperti sukrase dan maltase (Kim, Nam,

Kurihara, & Kim, 2008; Shinde, et al., 2008).

Hasil pengujian pada semua ekstrak menunjukkan adanya penghambatan

aktivitas α-glukosidase (Tabel 4.6, Tabel 4.7 dan Tabel 4.8). Berdasarkan nilai

IC50 yang diperoleh diketahui bahwa semua ekstrak memiliki penghambatan

aktivitas enzim α-glukosidase yang lebih baik dari akarbose. Nilai IC50 berturut-

turut pada ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol adalah 67,914 µg/mL;

57,174 µg/mL dan 97,881 µg/mL.

Setelah dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada akarbose

dan ekstrak, selanjutnya dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada

fraksi n-heksana buah ketapang. Fraksi yang didapat dari kromatografi kolom

berjumlah 8 fraksi. Namun pada fraksi H jumlah sampelnya sangat sedikit yaitu

kurang dari 100 mg, sehingga peneliti hanya menguji 7 fraksi n-heksana buah


46


ketapang. Nilai IC50 terbesar didapat pada fraksi D yaitu 49,715 µg/mL (Tabel

4.12). Dari hasil uji penghambatan α-glukosidase pada akarbose, ekstrak dan

fraksi didapatkan nilai r (dari persamaan linier) yang beragam. Nilai r yang kurang

bagus (<0,99) mungkin diakibatkan karena penimbangan yang kurang teliti pada

akarbose, ekstrak, atau fraksi sehingga konsentrasi yang diharapkan berbeda

dengan konsentrasi yang sebenarnya. Jadi, perlu ketelitian yang tepat dalam

menimbang dan jika memungkinkan akarbose bisa dibeli dalam kemasan kecil

sehingga bisa langsung dilarutkan di wadahnya.

4.6 Penentuan Kinetika Penghambatan α-Glukosidase

Penentuan kinetika penghambatan enzim dilakukan dengan menggunakan

plot Lineweaver-Burk yang dapat menunjukkan jenis penghambatan dari sampel.

Sampel yang digunakan adalah fraksi n-heksana buah ketapang yang memiliki

nilai penghambatan tertinggi yaitu fraksi D. Analisis kinetika penghambatan

enzim dilakukan dengan menggunakan empat konsentrasi berbeda dari substrat p-

nitrofenil-α-D-glukopiranosida dan dua konsentrasi berbeda dari larutan sampel.

Konsentrasi substrat yang digunakan adalah 10 mM; 5 mM; 2,5 mM; dan 1,25

mM. Sedangkan, konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 25 µg/mL dan 50

µg/mL.

Plot Lineweaver-Burk, akan menunjukkan mekanisme penghambatan dari

fraksi D buah ketapang terhadap enzim α-glukosidase. Mekanisme

penghambatannya dapat berupa inhibisi nonkompetitif dan inhibisi kompetitif.

Inhibisi nonkompetitif akan memberikan perpotongan antara garis noninhibitor

dan garis inhibitor (sampel) pada sumbu x, sedangkan inhibisi kompetitif akan

berpotongan di sumbu y

Berdasarkan hasil yang diperoleh (Tabel 4.16) diketahui bahwa

mekanisme penghambatan fraksi D dari ekstrak n-heksana buah ketapang adalah

inhibisi kompetitif karena terdapat perpotongan garis antara inhibitor dan

noninhibitor di sumbu y serta memilki nilai Vm yang hampir sama.


47


Gambar 4.2 Plot Lineweaver-Burk fraksi D dari ekstrak n-heksana dengan

konsentrasi 50 µg/mL

Berdasarkan hasil di atas, diketahui persamaan regresi sistem inhibitor, yaitu y =

47,276x + 1,3191. Dari persamaan regresi dapat dihitung nilai vmax dan Km. Nilai

vmax yang diperoleh sebesar 0,758 µmol/mL dan nilai Km yang diperoleh sebesar

35,839 µmol/mL. Sedangkan pada sistem noninhibitor diperoleh persamaan y =

4,28x + 1,261, nilai vmax sebesar 0,793 µmol/mL dan Km sebesar 3,394 µmol/mL.

4.7 Penapisan Fitokimia

Fraksi teraktif dari ekstrak n-heksana selanjutnya dilakukan penapisan

fitokimia. Tujuan dari penapisan fitokimia adalah untuk mengetahui golongan

senyawa dari fraksi teraktif yang memiliki penghambatan aktivitas α-glukosidase.

Penapisan fitokimia dilakukan dengan cara KLT karena jumlah sampel yang akan

diidentifikasi tidak cukup banyak. Kontrol positif digunakan untuk

membandingkan senyawa uji. Kontrol positif yang digunakan berupa simplisia

atau senyawa tertentu yang telah diketahui memiliki suatu kandungan kimia yang

diuji. Untuk alkaloid digunakan Chinae Cortex, terpenoid digunakan Caryophylli

Flos, tanin digunakan Camellia Folium, antrakuinon digunakan Rhei Radix,

glikosida digunakan Nerii Folium dan saponin digunakan Liquiritae Radix. Fase

diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254. Lempeng KLT yang digunakan

berukuran 7,5 × 2,5 cm dengan jarak elusi 6,3 cm.

y = 47,276x + 1,3191R² = 0,994

y = 4,28x + 1,261R² = 0,9949

-45

-35

-25

-15

-5

5

15

25

35

45

-1 -0,5 0 0,5 1

1/v

1/[S]

Plot Lineweaver-Burk

Inhibitor

Noninhibitor


48


4.7.1 Alkaloid

Lempeng KLT dielusi dengan eluen kloroform-metanol (85:15). Setelah

dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot Dragendorf LP. Hasil uji tidak

berwarna sehingga diketahui bahwa fraksi yang diuji tidak mengandung senyawa

alkaloid.

4.7.2 Flavonoid


(40:10:50). Setelah dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot AlCl3. Hasil uji

menunjukkan tidak terdapat bercak berwarna kuning pada sinar UV-Vis dengan

panjang gelombang 366 nm. Dapat dibuat kesimpulan bahwa fraksi uji tidak

mengandung flavonoid.

4.7.3 Terpenoid

Lempeng KLT dielusi dengan eluen benzen-etil asetat (90:10). Setelah

dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot vanilin-asam sulfat. Didapatkan

dari kontrol positif dan fraksi uji bercak berwarna ungu setelah dipanaskan. Dapat

disimpulkan bahwa fraksi uji mengandung terpenoid.

4.7.4 Tanin


(40:10:50). Setelah dielusi lempeng disemprot dengan penyemprot larutan FeCl3

10%. Dari hasil uji, tidak ditemukan adanya warna hijau kehitaman, sehingga

dapat disimpulkan bahwa fraksi uji tidak mengandung tanin.

4.7.5 Saponin



asam sulfat. Hasil menunjukkan pada kontrol positif terdapat bercak berwarna

kuning sedangkan pada fraksi uji tidak terdapat bercak kuning, melainkan bercak

berwarna coklat setelah dipanaskan.


49


4.7.6 Antrakuinon

Lempeng KLT dielusi dengan eluen etil asetat-metanol-aquades


asam sulfat. Dari hasil KLT, menunjukkan bahwa fraksi uji tidak mengandung

antrakuinon karena pada standar terbentuk bercak merah sedangkan pada fraksi

uji tidak terbentuk bercak merah, melainkan bercak kuning kehijauan pada cahaya

tampak.

4.7.7 Glikon

Glikosida merupakan bagian karbohidrat terbesar yang terdapat dalam

tumbuhan dan bila terhidrolisis akan terurai menjadi glikon dan aglikon. Gula

(glikon) hasil terhidrolisis dapat diidentifikasi menggunakan pereaksi Mollisch.

Hasilnya positif jika setelah ditambahkan pereaksi Mollisch dan asam sulfat pekat

melalui dinding tabung akan terbentuk cincin warna. Berdasarkan hasil

identifikasi, fraksi uji mengandung glikon (gula) karena terbentuk cincin warna.

Berdasarkan hasil penapisan fitokimia, diketahui bahwa fraksi D dari

ekstrak n-heksana mengandung terpenoid dan glikon.

Tabel 4.18 Hasil penapisan fitokimia

No. Golongan Senyawa Sampel

1 Alkaloid -

2 Flavonoid -

3 Terpen +

4 Tanin -

5 Saponin -

6 Antrakuinon -

7 Glikon +Keterangan: (+) = terdeteksi; (-) = tidak terdeteksi



BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil uji penghambatan aktivitas α-glukosidase diketahui

bahwa ektrak n-heksana, etil asetat dan metanol memiliki IC50 berturut-turut

sebesar 67,914 µg/mL; 57,174 µg/mL dan 97,881 µg/mL. Dari ketujuh fraksi

n-heksana yang diuji, fraksi D memiliki penghambatan aktivitas α-glukosidase

tertinggi (IC50 = 49,715 µg/mL) dengan mekanisme penghambatan kompetitif.

Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa fraksi D dari ekstrak n-heksana

buah ketapang mengandung terpenoid dan glikon.

5.2. Saran

Untuk mendukung data penelitian ini, hendaknya dilakukan penelitian

lebih lanjut dengan melakukan isolasi dan karakterisasi senyawa aktif sehingga

tanaman tersebut dimungkinkan untuk dikembangkan dalam pengobatan penyakit

diabetes melitus tipe 2.



DAFTAR ACUAN

Ahmed, S.M., Vrushabendra, S.B., P Gopkumar R.D., & Chandrashekara, V.M.(2005). Anti-diabetic activity of Terminalia catappa Linn. leaf extracts inalloxan-induced diabetic rats. Iranian Journal of Pharmacology &Therapeutics, 4, 36-39.

Aziza B., Lucky. (2007). Ledakan cuci darah akibat diabetes melitus. Jakarta:Ikatan Dokter Indonesia, 1.

Basuki, T., Dewiyanti, Indah D., Artanti, N., dan Kardono, L.B.S. (2002).Evaluasi aktivitas daya hambat terhadap enzim α-glukosidase dari ekstrakkulit batang, daun, bunga dan buah kemuning (Murraya paniculata[l.]Jack.). Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXI, 314-318.

Basuki, T., Minarti, Artanti, N., Kardono, L.B.S., dan Simandjuntak, Portumuan.(2002). Evaluasi aktivitas berbagai ekstrak rimpang temu mangga (Curcumamangga Val. & Zyp.) terhadap daya hambat enzim α-glukosidase. ProsidingSeminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXI, 59-63.

Bio-tek Instrument. (2005). ELx808™ Absorbance Microplate Reader Operator’sManual. April 26, 2012. http://www.biotek.com/

British Pharmacopoeia Commission. (2009). British pharmacopoeia 2009.London: Stationery Office, 66.

Chan, H.H, Sun, H.D., Reddy, M.V.B, & Wu, T.S. (2010). Potent α-Glucosidaseinhibitors from the Roots of Panax japonicus C. A. Meyer var.major.Phytochemistry, 71 (11), 1360-1364.

Chisholm-Burns, Marie A., et al. (2008). Pharmacotherapy Principles andPractice. New York: McGraw-Hill, 649.

Corwin, Elizabeth J. (2009). Buku saku patofisiologi. Jakarta: EGC, 625-639.

Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran UniversitasIndonesia. (2007). Farmakologi dan terapi edisi V. Jakarta : Gaya Baru,490-493.

Departemen Kesehatan RI. (1979). Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta:Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 780.

Departemen Kesehatan RI. (2000). Parameter standar umum ekstrak tumbuhanobat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 10-11.


52


Departemen Kesehatan RI. (1995). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta:Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 334.

Dewi, et al. (2007). Inhibitory effect of Koji Aspergillus terreus on α-glucosidaseactivity and postprandial hyperglycemia. Pakistan Journal of BiologicalSciences, 10(18), 3131-3135.

Direktorat Jenderal Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan Departemen KesehatanRepublik Indonesia. (2005). Pharmaceutical care untuk penyakit diabetesmelitus. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 24-45.

Fan, Y.M., et al. (2004). Phytochemical and antiinflammatory studieson Terminalia catappa. Fitoterapia, 75, 253–260.

Farnsworth, N.R. (1966). Biological and phytochemical screening of plants.Journal of Pharmaceutical Science 55(3), 226-276.

Gandjar, Ibnu G., dan Rohman, Abdul. (2007). Kimia farmasi analisis.Yogyakarta: Pustaka Pelajar, 353-359.

Girindra, Aisjah. (1990). Biokimia I. Jakarta: Gramedia, 94-103.

Gritter, Roy J., Bobbit, James M., dan Schwarting, Arthur E. (1991). Pengantarkromatografi edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB, 9-10.

Harbone, J.B. (1987). Metode fitokimia. Edisi II (Kosasi Patmawinata dan IwangSudiro, Penerjemah). Bandung : Penerbit ITB, 47-52; 103-104; 113-115;122-127; 234-264.

Heyne, K. (1987). Tumbuhan berguna Indonesia III. Jakarta: Badan LitbangKehutanan, 1502-1503.

Johnson, M.(1998). Diabetes terapi dan pencegahannya. Jawa Barat: IndonesiaPublishing House, 24.

Jones, S.B., & Luchsinger, A.E. (1987). Plant systematics (2nd ed.).New York:McGraw-Hill Companies, Inc, 361.

Katzung, Betram G. (2007). Basic and clinical pharmacology 10th edition. NewYork: McGraw-Hill, 702-703.

Khare, C.P. (2007). Indian medicinal plants. New York: Springer, 653.

Kikkoman. (2001). α-Glucosidase (αGLS-SE) from recombinant E. coli, 95-98.

Kim, K.Y., Nam, K.A., Kurihara, H., & Kim, S.M. (2008). Potent α-glucosidaseinhibitors purified from the Red Alga Grateloupia elliptica. Phytochemistry,69, 2820-2825.


53


Lemmens, R.H.M.J & Wulijarni-Soetjipto, N. (1992). Plant resources of South-EastAsia 3: Dye and tannin-producing plants. Bogor: PROSEA, 120-122.

Linn, W.D., Wofford, M.R., O’Keefe, M.E., & Pose, L.M. (2009).Pharmacotherapy in primary care. New York: McGraw-Hill, 279-298.

Little, E. L., Jr. (1979). Integrated Taxonomic Information System ReportTerminalia catappa L. Februari 11, 2012. http://www.itis.gov.

Mahmudah, K.F. (2011). Uji aktivitas antidiabetes dengan metode penghambatanenzim α-glukosidase dan skrining fitokimia pada beberapa tanamanindonesia. Depok : Universitas Indonesia.

Malik, A., Soediro, I., Padmawinata, K., dan Yulinah, Elin. (1993). Pemeriksaankandungan kimia dan aktivitas daun Terminalia catappa linn. dan daunPluchea indica Less. Juni 14, 2012. http://bahan-alam.fa.itb.ac.id.

Murray, Robert K., Granner, Daryl K., danRodwell, Victor W. (2009). BiokimiaHarper edisi 27 (Brahm U. Pendit, Penerjemah). Jakarta: EGC, 53-74.

Nagappa, A.N., Thakurdesai, P.A., Venkat, N.R., & Jiwan, S. (2003). Antidiabeticactivity of Terminalia catappa Linn fruits. Journal of Ethnopharmacology88, 45-50.

Poedjiadi, Anna. (2006). Dasar-dasar biokimia. Jakarta: UI-Press, 146-147.

Price, Sylvia A., dan Wilson, Lorraine M. (2005). Patofisiologi: Konsep klinisproses-proses penyakit (Brahm U. Pendit, et al., Penerjemah). Jakarta: EGC,1262.

PT. Eisai Indonesia. (1986). Indek tumbuh-tumbuhan obat di Indonesia. Jepang:PT. Eisai Indonesia, 85.

Shinde, J., et al. (2008). α-Glucosidase inhibitory activity of Syzygium cumini(Linn.) Skeels seed kernel in vitro and in Goto-Kakizaki (GK) rats.Carbohydrate Research, 343, 1278-1281.

Shmaefsky, Brian. (2006). Biotechnology 101. United States of America:Greenwood, 94.

Sigma (1996, September 8). Product Information. April 15, 2012.http://www.sigmaaldrich.com/

Sofawati, Devi. (2011). Uji aktivitas antidiabetes fraksi-fraksi buah ketapangdengan metode penghambatan aktivitas α-glukosidase dan identifikasigolongan senyawa kimia dari fraksi yang aktif. Depok: UniversitasIndonesia.

Soumyanath, A. (2006). Traditional medicines for modern time antidiabetic plant.New York: Taylor & Francis Group, 22-33.


54


Sugiwati, S., Setiasih, S., dan Afifah, E. (2009). Antihyperglicemic activity of themahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] leaf extracts as analpha glucosidase inhibitor. Makara Kesehatan 13(2), 74-78.

Suyono, Slamet, et al. (2007). Penatalaksanaan diabetes melitus terpadu. Jakarta:Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, 8-40.

Thomson, Lex A. J. dan Evans, Barry. (2006). Species profiles for Pacific Islandagroforestry. Februari 10, 2012. http://www.traditionaltree.org

Wagner, H., Bladt, S., & Zgainski, E. (1984). Plant drug analysis: A thin layerchromatography atlas. New York: Springer-Verlag, 7; 288; 299-304.

Walker, Roger dan Edwards, Clive. (2003). Clinical pharmacy and therapeutics3rd edition. London : Churchill Livingstone, 657.

Wells, Barbara G., Dipiro, Joseph T., Schwinghammer, Terry L., dan Dipiro,Cecily V. (2009). Pharmacotherapy handbook seventh edition. New York:McGraw-Hill Medical, 210.

World Health Organization. (1998). Medicinal plants in the South Pacific.Manila: World Heaith Organization, 193.

Zakhartsev, M. V., Portner, H. O., & Blusta, R. (2003). Environmentally low-temperature kinetic and thermodynamicstudy of lactate dehydrogenasefrom Atlantic cod (G. morhua) using a 96-well microplate technique.Analytical Biochemistry, 10-20.


GAMBAR


55

Keterangan: Rf: (1) 0,16; (2) 0,11; (3) 0,32; (4) 0,48; (5) 0,87

Gambar 4.3 Pola kromatogram terpenoid a. Standar (Caryophylli Flos), b. fraksi

uji disemprot dengan larutan penampak noda vanilin-asam sulfat [secara visual]

dengan eluen benzen : etil asetat (90 : 10)

1 2

3

4

5


TABEL


56

Tabel 4.1. Persentase perbandingan berat buah ketapang kering terhadap berat

buah ketapang segar

Nama tanaman

uji

Sebelum

dikeringkan (g)

Setelah

dikeringkan (g)

Persentase

(%)

Buah ketapang 9476,8 3248,6 65,72

Tabel 4.2. Rendemen ekstrak buah ketapang

Nama ekstrakBerat simplisia

(g)

Berat ekstrak kental

(g)

Rendemen ekstrak

(%)

n- Heksana

3248,6

89,9 2,767

Etil asetat 29,5 0,908

Metanol 71,7 2,207

Tabel 4.3 Rendemen hasil fraksinasi kolom

Nama fraksiBerat sampel

(g)

Berat fraksi

(g)

Rendemen fraksi

(%)

A

19

1,9837 10,4405

B 3,1181 16,4111

C 0,7176 3,7768

D 0,6229 3,2784

E 0,4416 2,3242

F 0,2454 1,2916

G 0,3457 1,8195

H 0,088 0,4632


57

Tabel 4.4 Optimasi aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi substrat

Konsentrasi

substrat

Absorbansi

(A)U-K

Aktivitas Enzim

U/mL U/mg

0,625 mMUji (U) 0,046

0,042 0,0031 0,0612Kontrol (K) 0,004

1,25 mMUji (U) 0,071

0,071 0,0052 0,1035Kontrol (K) 0,000

2,5 mMUji (U) 0,118

0,107 0,0078 0,1567Kontrol (K) 0,009

5 mMUji (U) 0,182

0,182 0,0133 0,2652Kontrol (K) 0,000

10 mMUji (U) 0,226

0,216 0,0157 0,3148Kontrol (K) 0,010

20 mMUji (U) 0,239

0,223 0,0162 0,3249Kontrol (K) 0,016

Tabel 4.5 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada akarbose

Konsentrasi

(ppm)Absorbansi S1-S0 % Inhibisi

IC50

(ppm)

51S1 0,439

0,415 14,433

260,453

S0 0,024

76,5S1 0,410

0,410 15,464S0 0

102S1 0,392

0,384 20,825S0 0,008

153S1 0,347

0,343 29,278S0 0,004

204S1 0,289

0,285 41,237S0 0,004

Blanko (B) 0,485

Persamaan regresi y = 0,1799x + 3,1445


58

Tabel 4.6 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak n-heksana

Konsentrasi

(µg/mL)Absorbansi S1-S0 % Inhibisi

IC50

(µg/mL)

16,4S1 0,484

0,476 14,079

67,914

S0 0,008

32,8S1 0,447

0,429 22,563S0 0,018

41S1 0,376

0,341 38,447S0 0,035

82S1 0,280

0,247 55,415S0 0,033

123S1 0,610

0,060 89,169S0 0,550

Blanko (B) 0,554

Persamaan regresi y= 0,6832x + 3,6013

Tabel 4.7 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak etil asetat

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10,1S1 0,867

0,756 11,268

57,174

S0 0,111

25,25S1 0,807

0,649 23,826S0 0,158

50,5S1 0,656

0,473 44,484S0 0,183

75,75S1 0,539

0,296 65,258S0 0,243

101S1 1,088

0,119 86,033S0 0,969Blanko (B) 0,852



59

Tabel 4.8 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada ekstrak metanol

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

28,7S1 0,416 0,398 29,181

97,881

S0 0,018

57,4S1 0,367 0,330 41,281S0 0,037

86,1S1 0,371 0,309 45,018S0 0,062

114,8S1 0,528 0,270 51,957S0 0,258

172,2S1 0,519 0,148 73,665S0 0,371

Blanko (B) 0,562


Tabel 4.9 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi A

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10,1S1 0,446

0,438 12,224

58,39

S0 0,008

25,25S1 0,400

0,386 22,645S0 0,014

50,5S1 0,330

0,297 40,481S0 0,033

75,75S1 0,230

0,171 65,731S0 0,059

101S1 0,151

0,075 84,969S0 0,076

Blanko (B) 0,499



60

Tabel 4.10 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi B

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10,2S1 0,495

0,445 5,720

58,641

S0 0,050

25,5S1 0,469

0,385 18,432S0 0,084

51S1 0,398

0,293 37,924S0 0,105

76,5S1 0,214

0,104 77,966S0 0,11

102S1 0,189

0,075 84,110S0 0,114

Blanko (B) 0,472

Persamaan regresi y = 0,9228x - 4,1135

Tabel 4.11 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi C

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10S1 0,632

0,629 16,689

51,527

S0 0,003

25S1 0,520

0,504 33,245S0 0,016

50S1 0,432

0,397 47,417S0 0,035

75S1 0,260

0,235 68,874S0 0,025

100S1 0,162

0,109 85,563S0 0,053

Blanko (B) 0,755



61

Tabel 4.12 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi D

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10S1 0,463

0,429 14,028

49,715

S0 0,034

25S1 0,392

0,347 30,461S0 0,045

50S1 0,319

0,269 46,092S0 0,050

75S1 0,160

0,100 79,959S0 0,060

100S1 0,169

0,053 89,379S0 0,116

Blanko (B) 0,499


Tabel 4.13 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi E

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10,4S1 0,366

0,358 12,683

56,087

S0 0,008

26S1 0,336

0,312 23,902S0 0,024

52S1 0,276

0,212 48,293S0 0,064

78S1 0,212

0,135 67,073S0 0,077

104S1 0,170

0,042 89,756S0 0,128

Blanko (B) 0,410



62

Tabel 4.14 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi F

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10S1 0,489

0,472 2,881

57,019

S0 0,017

25S1 0,393

0,375 22,839S0 0,018

50S1 0,311

0,297 38,889S0 0,014

75S1 0,168

0,133 72,634S0 0,035

100S1 0,096

0,055 88,683S0 0,041

Blanko (B) 0,486

Persamaan regresi y = 0,9591x - 4,6873

Tabel 4.15 Data uji penghambatan aktivitas α-glukosidase pada fraksi G

Konsentrasi


IC50

(µg/mL)

10,1S1 0,647

0,639 15,364

54,030

S0 0,008

25,25S1 0,554

0,549 27,285S0 0,005

50,5S1 0,472

0,432 42,781S0 0,04

75,75S1 0,274

0,226 70,066S0 0,048

101S1 0,146

0,088 88,344S0 0,058

Blanko (B) 0,755



63

Tabel 4.16 Data uji kinetika penghambatan aktivitas α-glukosidase fraksi D (teraktif)

Konsentrasi

Substrat (mM)Absorbansi Sampel (V)

1/[S] 1/[V1] 1/[V2] 1/[V3]

[S] V1 V2 V3

10 0,353 0,2 0,611 0,1 2,833 5 1,637

5 0,22 0,091 0,48 0,2 4,545 10,989 2,083

2,5 0,152 0,046 0,321 0,4 6,579 21,739 3,115

1,25 0,054 0,026 0,216 0,8 18,519 38,462 4,629Keterangan: V1 = konsentrasi inhibitor 25 µg/mL; V2 = konsentrasi inhibitor 50 µg/mL;V3 = noninhibitor; [S] = konsentrasi substrat

Tabel 4.17 Hasil perhitungan tetapan Michaelis-Menten fraksi D (konsentrasi 50

µg/mL)

a b vmax Km

Noninhibitor 4,28 1,261 0,793 3,394

Inhibitor 50 µg/mL 47,276 1,3191 0,758 35,839


LAMPIRAN


64

Lampiran 1. Skema kerja ekstraksi bertingkat

Direfluks dengan n-heksanasebanyak 6 kali hingga warnafiltrat memudar, disaring.

Serbuk buah ketapang± 3 kg

Ampas/ ResiduEkstrak n-heksana

Direfluks dengan etil asetatsebanyak 6 kali hinggawarna filtrat memudar,disaring.

diuapkan denganrotavapor 40-50oC,kecepatan 40 rpm

Ampas/ ResiduEkstrak Etil asetat

Direfluks dengan metanolsebanyak 5 kali hinggawarna filtrat memudar,disaring.

diuapkan dengan rotavapor40-50oC, kecepatan 40 rpm

Ekstrak etil asetatkental

Ekstrak metanol

Ekstrak metanolkental

Ampas/ Residu

Ekstrak n- heksanakental

diuapkan dengan rotavapor40-50oC, kecepatan 40 rpm

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase


65

Lampiran 2. Skema kerja fraksinasi ekstrak n-heksana buah ketapang dan penapisan

fitokimia dari fraksi yang memiliki penghambatan aktivitas α-glukosidase terbesar

Ekstrak n-heksana kental

Kromatografi kolom (KK)Fase diam silika gel 60Fase gerak n-heksana : etil asetat denganberbagai perbandingan kepolaran

84 fraksi hasil KK

Dilakukan penggabungan fraksi yang memilikipola kromatogram yang sama dengan KLT

A

Dilakukan uji penghambatanaktivitas α-glukosidase

Penapisan fitokimia

B EC D F G H

D(Fraksi teraktif)

Terpenoid dan glikon

Bobot > 100 mg


66

Lampiran 3. Skema uji penghambatan aktivitas α-glukosidase

2 μL larutan dimetil sulfoksida / sampel(ekstrak) / standar (akarbose)+ 63 μL buffer fosfat (pH 6,8)

+ 10 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida 10mM,

diinkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit.

+ 25μL larutanenzim pada uji dan

100 μLNa2CO3200 mM

pada kontrolsampel

Reaksi enzimatis dimulaidiinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 30 menit.

Penghentian reaksi dengan 100 μL natrium karbonat 200 mMpada uji dan penambahan 25 μL larutan enzim pada kontrol

sampel

Diukur menggunakan microplate reader pada λ = 405 nm


67

Lampiran 4. Sertifikat analisis α-glukosidase

67


67



68

Lampiran 5. Sertifikat analisis p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida

68


68



69

Lampiran 6. Hasil determinasi tumbuhan

69


69



70

Lampiran 7. Perhitungan bobot α-glukosidase yang ditimbang

Pada label kemasan α-glukosidase tertera 15,2 mg solid; 23 % protein; 215

Unit/mg protein.

Jumlah protein = x 15,2 mg solid = 3,496 mg protein.

Dalam 15,2 mg solid terdapat:3,496 mg protein × 215 Umg protein = 751,64 UAkan dibuat larutan induk 2,5 U/mL:Larutan induk = 2,5 UmL = 250 U100 mLYang ditimbang: 250 U751,64 U x 15,2 mg solid = 5,056 mg solidPengenceran larutan α-glukosidase:dipipet 2,0 ml larutan enzim, dilarutkan dengan dapar fosfat pH (6,8) hingga volume

100,0 mL 2 mL100,0 mL x 2,5 UmL = 0,05 UmLSehingga didapatkan larutan α-glukosidase dengan konsentrasi 0,05 U mL⁄sebanyak 100,0 mL.


71

Lampiran 8. Perhitungan aktivitas enzim pada optimasikonsentrasi substrat

Diketahui: V = 0,2 mL ; df = 5; Ve = 0,025 mL; t = 30; C= 0,05

Rumus: Unit mL enzim⁄ = (A Uji − A Blanko)xVxdf18,3xV xtKonsentrasi 0,625 mMUnit mL enzim⁄ = 0,042 x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0031 U/mLUnit mg enzim = 0,0031 U mL enzim x 10,05 = 0,0612 U/mgKonsentrasi 1,25 mMUnit mL enzim⁄ = 0,071 x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0052 U/mLUnit mg enzim = 0,0031 U mL enzim x 10,05 = 0,1035 U/mgKonsentrasi 2,5 mMUnit mL enzim⁄ = 0,107 x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0078 U/mLUnit mg enzim = 0,0078 U mL enzim x 10,05 = 0,1567 U/mgKonsentrasi 5 mMUnit mL enzim⁄ = 0,182 x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0133 U/mLUnit mg enzim = 0,0133 U mL enzim x 10,05 = 0,2652 U/mgKonsentrasi 10 mMUnit mL enzim⁄ = 0,216x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0157 U/mL


72

Unit mg enzim = 0,0157 U mL enzim x 10,05 = 0,3148 U/mgKonsentrasi 20 mMUnit mL enzim⁄ = 0,223 x 0,2 x 518,3 x 0,025 x 30 = 0,0162 U/mLUnit mg enzim = 0,0162 U mL enzim x 10,05 = 0,3249 U/mg


73

Lampiran 9. Perhitungan IC50 dari akarbose

Absorbansi blanko : 0,485

Konsentrasi 51 ppm% inhibisi = 0,485 − 0,4150,485 × 100% = 14,433 %Konsentrasi 76,5 ppm% inhibisi = 0,485 − 0,4100,485 × 100% = 15,464 %Konsentrasi 102 ppm% inhibisi = 0,485 − 0,3840,485 × 100% = 20,825 %Konsentrasi 153 ppm% inhibisi = 0,485 − 0,3430,485 × 100% = 29,278 %Konsentrasi 204 ppm% inhibisi = 0,485 − 0,2850,485 × 100% = 41,237 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier: y = 0,1799x + 3,1445

Rumus menghitung IC50 =IC = 50 − 3,14450,1799 = 260,453


74

Lampiran 10. Perhitungan IC50 dari ekstrak n-heksana


Konsentrasi 16,4 µg/mL% inhibisi = 0,554 − 0,4760,554 × 100% = 14,079 %Konsentrasi 32,8 µg/mL% inhibisi = 0,554 − 0,4290,554 × 100% = 22,563 %Konsentrasi 41 µg/mL% inhibisi = 0,554 − 0,3410,554 × 100% = 38,447 %Konsentrasi 82 µg/mL% inhibisi = 0,554 − 0,2470,554 × 100% = 55,415 %Konsentrasi 123 µg/mL% inhibisi = 0,554 − 0,0600,554 × 100% = 89,169 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier: y= 0,6832x + 3,6013

Rumus menghitung IC50 =IC = 50 − 3,60130,6832 = 67,914 μg/mL


75

Lampiran 11. Perhitungan IC50 dari ekstrak etil asetat


Konsentrasi 10,1 µg/mL% inhibisi = 0,852 − 0,7560,852 × 100% = 11,268 %Konsentrasi 25,25 µg/mL% inhibisi = 0,852 − 0,6490,852 × 100% = 23,826 %Konsentrasi 50,5 µg/mL% inhibisi = 0,852 − 0,4730,852 × 100% = 44,484 %Konsentrasi 75,75 µg/mL% inhibisi = 0,852 − 0,2960,852 × 100% = 65,258 %Konsentrasi 101 µg/mL% inhibisi = 0,852 − 0,1190,852 × 100% = 86,033 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu




76

Lampiran 12. Perhitungan IC50 dari ekstrak metanol


Konsentrasi 28,7 µg/mL% inhibisi = 0,562 − 0,3980,562 × 100% = 29,181 %Konsentrasi 57,4 µg/mL% inhibisi = 0,562 − 0,3300,562 × 100% = 41,281 %Konsentrasi 86,1 µg/mL% inhibisi = 0,562 − 0,3090,562 × 100% = 45,018 %Konsentrasi 114,8 µg/mL% inhibisi = 0,562 − 0,2700,562 × 100% = 51,957 %Konsentrasi 172,2 µg/mL% inhibisi = 0,562 − 0,1480,562 × 100% = 73,665 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu




77

Lampiran 13. Perhitungan IC50 dari fraksi A


Konsentrasi 10,1 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,4380,499 × 100% = 12,224 %Konsentrasi 25,25 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,3860,499 × 100% = 22,645 %Konsentrasi 50,5 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,2970,499 × 100% = 40,481 %Konsentrasi 75,75 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,1710,499 × 100% = 65, 731 %Konsentrasi 101 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,0750,499 × 100% = 84,969 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu




78

Lampiran 14. Perhitungan IC50 dari fraksi B


Konsentrasi 10,2 µg/mL% inhibisi = 0,472 − 0,4450,472 × 100% = 5,720 %Konsentrasi 25,5 µg/mL% inhibisi = 0,472 − 0,3850,472 × 100% = 18,432 %Konsentrasi 51 µg/mL% inhibisi = 0,472 − 0,2930,477 × 100% = 37,924 %Konsentrasi 76,5 µg/mL% inhibisi = 0,472 − 0,1040,472 × 100% = 77,966 %Konsentrasi 102 µg/mL% inhibisi = 0,472 − 0,0750,472 × 100% = 84,110 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier: y = 0,9228x - 4,1135

Rumus menghitung IC50 =IC = 50 − (−4,1135)0,9228 = 58,641 μg/mL


79

Lampiran 15. Perhitungan IC50 dari fraksi C


Konsentrasi 10 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,6290,755 × 100% = 16,689 %Konsentrasi 25 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,5040,755 × 100% = 33,245 %Konsentrasi 50 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,3970,755 × 100% = 47,417 %Konsentrasi 75 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,2350,755 × 100% = 68,874 %Konsentrasi 100 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,1090,755 × 100% = 85,563 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier:y = 0,75x + 11,355



80

Lampiran 16. Perhitungan IC50 dari fraksi D


Konsentrasi 10 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,4290,499 × 100% = 14,028 %Konsentrasi 25 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,3470,499 × 100% = 30,461 %Konsentrasi 50 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,2690,499 × 100% = 46,092 %Konsentrasi 75 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,1000,499 × 100% = 79,959 %Konsentrasi 100 µg/mL% inhibisi = 0,499 − 0,0530,499 × 100% = 89,379 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier:y = 0,8678x + 6,8575



81

Lampiran 17. Perhitungan IC50 dari fraksi E


Konsentrasi 10,4 µg/mL% inhibisi = 0,410 − 0,3580,410 × 100% = 12,683 %Konsentrasi 26 µg/mL% inhibisi = 0,410 − 0,3120,410 × 100% = 23,902 %Konsentrasi 52 µg/mL% inhibisi = 0,410 − 0,2120,410 × 100% = 48,293 %Konsentrasi 78 µg/mL% inhibisi = 0,410 − 0,1350,410 × 100% = 67,073 %Konsentrasi 104 µg/mL% inhibisi = 0,410 − 0,0420,410 × 100% = 89,756 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu




82

Lampiran 18. Perhitungan IC50 dari fraksi F


Konsentrasi 10 µg/mL% inhibisi = 0,486 − 0,4720,486 × 100% = 2,881%Konsentrasi 25 µg/mL% inhibisi = 0,486 − 0,3750,486 × 100% = 22,839 %Konsentrasi 50 µg/mL% inhibisi = 0,486 − 0,2970,486 × 100% = 38,889 %Konsentrasi 75 µg/mL% inhibisi = 0,486 − 0,1330,486 × 100% = 72,634 %Konsentrasi 100 µg/mL% inhibisi = 0,486 − 0,0550,486 × 100% = 88,683 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu

y, diperoleh persamaan regresi linier: y = 0,9591x - 4,6873

Rumus menghitung IC50 =IC = 50 − (−4,6873)0,9591 = 57,019 μg/mL


83

Lampiran 19. Perhitungan IC50 dari fraksi G


Konsentrasi 10,1 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,6390,755 × 100% = 15,364 %Konsentrasi 25,25 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,5490,755 × 100% = 27,285 %Konsentrasi 50,5 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,4320,755 × 100% = 42,781 %Konsentrasi 75,75 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,2260,755 × 100% = 70,066 %Konsentrasi 101 µg/mL% inhibisi = 0,755 − 0,0880,755 × 100% = 88,344 %Dengan memplotkan konsentrasi sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu




84

Lampiran 20. Perhitungan kinetika penghambatan aktivitas α-glukosidase pada

fraksi teraktif (fraksi D)

Dari tabel 4.16 diperoleh persamaan regresi:

Tanpa inhibitor y = 4,28x + 1,261

Inhibitor y = 47,276x + 1,3191

Sehingga didapatkan

1. vmaks =

Tanpa inhibitor vmaks= , = 0,793 μmol/mL menitInhibitor vmaks = , = 0,758 µmol/mL menit

2. Km =

Tanpa inhibitor Km = ,, = 3,394 μmol/mLInhibitor Km = ,, = 35,839 µmol/mL


85

Lampiran 21. Plot hubungan konsentrasi dan % inhibisi pada akarbose, ekstrak

dan fraksi.

14,433

15,46420,825

29,278

41,237y = 0,1799x + 3,1445R² = 0,9782

05

1015202530354045

0 50 100 150 200 250

% in

hibi

si

Konsentrasi (µg/mL)

Akarbose

14,07922,563

38,44755,415

89,169y = 0,6832x + 3,6013R² = 0,9777

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% in

hibi

si


Ekstrak n-heksana


86

(lanjutan)

11,26823,826

44,484

65,258

86,033y = 0,822x + 3,0031R² = 0,999

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Ekstrak etil asetat

29,18141,281

45,01851,957

73,665y = 0,2945x + 21,174R² = 0,9768

01020304050607080

0 50 100 150 200

% in

hibi

si


Ekstrak metanol


87

(lanjutan)

12,22422,645

40,481

65,731

84,969y = 0,8145x + 2,434R² = 0,9959

0102030405060708090

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi A

5,72

18,432

37,924

77,966

84,11y = 0,9228x - 4,1135

R² = 0,9607

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi B


88

(lanjutan)

16,68933,245

47,417

68,874

85,563y = 0,75x + 11,355

R² = 0,9938

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi C

14,028

30,461

46,092

79,959

89,379y = 0,8678x + 6,8575

R² = 0,9744

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi D


89

(lanjutan)

12,68323,902

48,293

67,073

89,756y = 0,8256x + 3,6942R² = 0,9986

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi E

2,881

22,839

38,889

72,634

88,683y = 0,9591x - 4,6873R² = 0,9857

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi F


90

(lanjutan)

15,36427,285

42,781

70,066

88,344y = 0,8145x + 5,9925

R² = 0,9927

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% in

hibi

si


Fraksi G


uji aktivitas antidiabetes ekstrak dan fraksi dari...

Documents