Nama : Ida Aprilia

Kelas : S1 A

NIM : 1413015011

Efek Pra-Analisis Pengambilan sampel darah dan Penanganan

dalam immunoassay kuantitatif untuk rematik Arthritis

Variabilitas dalam pengambilan sampel darah pra-analitis dan penanganan

secara signifikan dapat berdampak diperoleh hasil kuantitatif dalam

immunoassays. Khususnya, dalam desain dan pelaksanaan uji klinis yang besar,

bahkan perbedaan kecil dalam pengolahan sampel dan penanganan dapat memiliki

efek dramatis dalam analitis, hasil interpretasi, manajemen uji dan hasil.

Pada protein non-antibodi, konsentrasi biomarker, jenis sampel memiliki

dampak yang signifikan; sampel plasma umumnya menunjukkan penurunan

konsentrasi biomarker protein relatif terhadap serum. ketika biomarker

konsentrasi digabungkan algorithmically menjadikannya skor tes tunggal seperti

multibiomarker suatu Uji aktivitas penyakit rheumatoid arthritis (MBDA),

perubahan biomarker protein konsentrasi dapat mengakibatkan bias skor. Hasil ini

menggambarkan pentingnya karakteristik metodologi pra-analitis, jenis sampel,

pengolahan sampel dan prosedur penanganan untuk pengujian klinis untuk

memastikan keakuratan tes.

1 Pendahuluan

Pemahaman tentang persyaratan pra-analitis immunoassay multiplexing

sangat penting karena penelitian telah menunjukkan bahwa sebagian besar variasi

dan kesalahan dalam biomarker protein pengukuran terjadi pada fase pra-analitis

sebelum spesimen analisis (Rai dan Vitzthum, 2006). Memang, penelitian telah

menunjukkan bahwa perbedaan kecil dalam variabel pra-analitis, seperti

pengolahan atau penanganan spesimen, dapat secara dramatis mempengaruhi

keandalan analitis dan kemampuan untuk memproduksi immunoassays multipleks

Dalam penelitian ini, kami menguji pengaruh variabel pra-analitis yang

terkait dengan pengumpulan, pengolahan dan penanganan sampel darah pada

kinerja tes MBDA dan masing-masing biomarker protein immunoassays yang

terdiri dari tes MBDA. Di sini, kita melaporkan pengukuran biomarker protein

dan Rata MBDA dalam serum dibandingkan plasma serta dalam sampel serum

diolah dengan dua metode yang berbeda. Sebagai perbandingan, kita juga

mengevaluasi efek dari variabel pra-analitis ini pada pengukuran autoantibodi

biasanya ditemukan pada pasien RA menggunakan immunoassay kustom

dikembangkan pada Meso Skala Penemuan (MSD) platform. Data menunjukkan

bahwa koleksi darah, pengolahan, danpenanganan metode memiliki signifikan

dampak pada beberapa non-antibodi pengukuran biomarker protein, sedangkan

pengukuran autoantibody muncul relatif kuat untuk variabel pra-analitis ini.

Perubahan konsentrasi biomarker protein dari pra-analitis penanganan sampel

memperkenalkan bias dalam skor MBDA. hasil penelitian ini menggambarkan

pentingnya karakteristik pra-analitis variabilitas untuk memastikan keakuratan

biomarker protein tes, dan pastikan bahwa pengolahan serum standar dan

prosedur penanganan untuk tes biomarker protein sangat penting untuk menjamin

kehandalan dari hasil yang diperoleh dalam uji klinis.

2. Bahan dan metode

2.1. Bahan

2.1.1. Biomarker autoantibody

Peptida yang berasal dari potensi RA autoantigens dengan terminal biotin.

Antibodi sekunder Berlabel terhadap IgG manusia adalah dari Meso Skala

Penemuan (MSD, Gaithersburg, MD).

2.1.2. biomarker protein

Sumber untuk antibodi menangkap, antibodi deteksi, dan standar analit

digunakan untuk mengukur 12 protein biomarker yang terdiri dari tes MBDA.

2.1.3. Standar Multiplex untuk tes MBDA

Prediluted kalibrator set multiplexing disiapkan untuk setiap panel. Setiap

kurva standar terdiri dari 8 poin mencakup berbagai macam metode analisis,

termasuk uji kosong. prediluted standar disiapkan dengan protein rekombinan

berduri ke dalam pengencer sampel yang sesuai yang mengandung setara

konsentrasi serum yang hadir dalam sampel diencerkan. prediluted standar yang

aliquoted ke dalam sekali pakai botol dan disimpan pada -80 ° C.

2.1.4. Kontrol kualitas Assay untuk uji MBDA Prediluted

Jika konsentrasi biomarker diamati dari setiap QC menjalankan kontrol

jatuh di luar rentang yang diharapkan, semua sampel pada uji gagal piring

diulang. Proses kontrol serum digunakan untuk memantau seluruh yang Proses

uji, termasuk pengenceran sampel, baik biomarker level dan tingkat skor. Jika ada

proses kontrol gagal, MBDA spesifikasi Rata, semua sampel pada piring yang

berisi proses kontrol gagal diulang. Untuk sampel pasien, koefisien persen variasi

(% CV) dari sinyal antara sumur duplikat dihitung untuk setiap penanda. Jika%

CV berada di atas tertentu biomarker Batas penerimaan (biasanya 20%),

konsentrasi dilaporkan untuk sampel yang dianggap tidak dapat diandalkan dan

diuji ulang.

2.1.5. Instrumentasi

Microplates dibaca pada SEKTOR Imager 6000 pembaca (MSD,

Gaithersburg, MD), yang menggunakan suara ultra-rendah charge-coupled device

(CCD) kamera dengan dirancang khusus lensa telecentric untuk mendeteksi

cahaya yang dipancarkan pada ~ 620 nm pada stimulasi elektrokimia. Gambar

piring diperoleh dalam enam sektor dan data kemudian diakuisisi ke MSD

DiscoveryWorkbench Software.

2.2. Metode

2.2.1. Protokol pengambilan sampel

Serum vs plasma Serum dan plasma sampel berpasangan dikumpulkan dari RA

subyek yang memenuhi American College of Rheumatology (ACR) 1987 kriteria

(Arnett et al., 1988). Semua sampel dikumpulkan bawah Investigational Review

Board disetujui protokol dengan informed consent. Untuk mengumpulkan sampel,

32 orang dengan RA telah dicocokkan serum dan plasma sampel yang diambil

dengan SerumSeparator Transport (SST ™) Pembuluh dan EDTA Vacutainer

tabung dari Becton Dickinson (BD, Franklin Lakes, NJ), masing-masing, dari

sama jarum suntik.

2.2.2. Serum pengambilan sampel protokol

'protokol' vs 'tradisional' Untuk mengevaluasi koleksi serum dan variabel

penanganan, sampel serum dikumpulkan dari 10 individu yang didiagnosis

dengan RA berdasarkan ACR 1987 kriteria (Arnett et al., 1988). Semua sampel

dikumpulkan di bawah Investigational Review Board disetujui protokol dengan

informed consent. Karena terbatas jumlah sampel yang tersedia, hanya 7 set cocok

yang dianalisis untuk percobaan autoantibodi.

2.2.3. Pengukuran autoantibody biomarker

Biomarker autoantibody dievaluasi dengan kustom tes menggunakan

platform MSD. Sampel yang dikumpulkan dalam kondisi yang berbeda dijalankan

dalam rangkap dua di satu piring dan sinyal mentah yang digunakan untuk analisis

data.

2.2.4. Pengukuran biomarker Protein

Biomarker 12 protein yang merupakan tes MBDA diukur dengan

menggunakan-analit spesifik menangkap dan deteksi antibodi.Setelah inkubasi

dengan campuran antibodi deteksi selama 60 menit, piring dicuci lagi, dan setelah

menambahkan 150 uL buffer membaca, sinyal electrochemiluminescence

dikuantifikasi seperti dalam MSD Penemuan Workbench. Konsentrasi sampel

digunakan untuk perbandingan lebih lanjut hasil yang diperoleh dengan sampel

yang berbeda proses pengumpulan / penanganan.

2.3. perhitungan

MBDA algorithmscores adalah bilangan bulat from1 untuk 100, dengan

penyakit ambang batas aktivitas dirancang untuk menjadi setara dengan ambang

batas dari DAS28CRP:

• MBDA skor algoritma ≤29 dianggap penyakit yang rendah aktivitas.

• Algoritma MBDA skor 30 sampai ≤44 dianggap moderat aktivitas penyakit.

• MBDA skor algoritma> 44 dianggap penyakit yang tinggi kegiatan

3. hasil

3.1. Perbandingan plasma vs sampel serum

3.1.1. Pengukuran autoantibody biomarker dalam plasma dan sampel serum

Semua tes autoantibody dipamerkan kurang dari 10% perbedaan (median

perbedaan) antara kedua jenis sampel (Tabel 3), baik dalam Food and Drug

Administration disarankan Spesifikasi pada ± 15% untuk akurasi (FDA, 2001).

semua analisa untuk autoantibodi dihitung pada sinyal mentah di antibodi

pengukuran biomarker. Sebuah analisis lebih ketat tambahan dibandingkan

koefisien korelasi dan kemiringan linear regresi. Dalam perbandingan plasma dan

serum cocok sampel set, korelasi adalah 0,99 (0,98-1,00) dengan kemiringan

sekitar 1.00, menunjukkan sedikit atau tidak ada perbedaan dalam kuantisasi

sinyal autoantibodi dalam serum vs sampel plasma.

3.1.2. Perbandingan konsentrasi biomarker protein antara plasma dan serum

sampel

Konsentrasi protein memiliki pergeseran sistematis dengan kemiringan

yang paling penanda yang kurang dari 1,00, menunjukkan konsentrasi serum

diukur lebih tinggi untuk sebagian besar biomarker. Konsentrasi EGF plasma

tidak berkorelasi dengan konsentrasi serum EGF cocok (korelasi koefisien 0.33).

3.2. Dampak penanganan sampel serum: protokol vs tradisional

3.2.1. Sampel serum penanganan untuk tes autoantibody

Pengukuran autoantibodi antara tradisional dan sampel protokol

menunjukkan perbedaan rata-rata pada umumnya kurang dari 15%.

3.2.2. Sampel penanganan Serum untuk biomarker protein pengukuran

Penanda dengan signifikan perbedaan sampel tradisional, 7 biomarker

meningkat, sementara hanya leptin menurun. Konsentrasi serum dalam sampel

ditangani dengan tradisional Metode meningkat sebanyak 40 kali lipat, sementara

VEGF-A dan konsentrasi resistin juga meningkat 2 sampai 4 kali lipat.

3.3. MBDA dan variabel pra-analitis

Sampel dengan serum rendah skor MBDA telah artifisial meningkat skor ketika

plasma digunakan sebagai sampel.Sampel dengan "protokol" rendah MBDA Skor

yang artifisial meningkat dengan metode tradisional, tapi kali ini terutama sebagai

akibat dari konsentrasi tinggi IL-6. Dalam kedua perbandingan, sampel dengan

artifisial kempes skor yang diamati pada skor MBDA tinggi. sementara perubahan

beberapa biomarker yang diamati pada sampel dengan skor MBDA yang kempes,

konsentrasi EGF tinggi secara konsisten diamati.

4. Diskusi

Metode pengambilan sampel darah (serum vs plasma) dan koleksi serum /

metode penanganan (tradisional vs protocol). Meskipun serum dan plasma kedua

sampel dikumpulkan secara rutin dan komposisi dianggap setara, ini adalah studi

pertama untuk pengetahuan penulis mana pengukuran kuantitatif dari 12 protein

dalam platform multiplexing dan delapan autoantibodi dari sampel cocok

dibandingkan secara sistematis cara subyek rheumatoid arthritis. Kami mengamati

bahwa efek variabel pra-analitis yang sangat berbeda pada biomarker protein vs

biomarker antibodi. Hal ini penting untuk mengumpulkan sampel di bawah

protokol yang didefinisikan dengan baik untuk kedua biomarker penemuan dan

validasi studi, terutama karena bahkan dalam sebuah panel tes biomarker

multiplexing, berbeda biomarker dipengaruhi sangat berbeda oleh preanalytical ini

variabel.Penelitian sebelumnya membandingkan plasma dan serum memiliki

menunjukkan bahwa tingkat terukur dari analit dapat bervariasi antara 2 jenis

sampel.

Autoantibodi adalah imunoglobulin manusia terhadap protein individu

sendiri dan harus menyajikan karakteristik yang sama antibodi terhadap bakteri.

Bahkan, hasil kami menegaskan bahwa antibodi tampaknya biomarker stabil yang

tidak sebagian besar dipengaruhi oleh variabel pra-analitisPerbedaan pengukuran

autoantibodi dalam sampel berpasangan sebagian besar dalam +/- 15%.

5. Kesimpulan

Pengukuran autoantibody biomarker muncul kuat untuk koleksi darah dan

penanganan metode. Sebaliknya, koleksi darah, pengolahan dan penanganan

metode memiliki signifikan berdampak pada konsentrasi protein serum terukur.

Plasma sampel umumnya dipamerkan penurunan kadar protein yang biomarker

diuji. Hasil penelitian ini menggambarkan pentingnya dari karakteristik

variabilitas pra-analitis untuk memastikan akurasi tes untuk pengembangan,

validasi, dan uji klinis dengan tes biomarker. Hal ini sangat penting pada saat tes

yang terintegrasi dalam uji klinis yang besar, di mana menggunakan standar

pengolahan dan penanganan prosedur serum akan menjadi bagian penting dari

desain penelitian, langsung mempengaruhi hasil interpretasi dan tahap berikutnya

uji coba.