PEMBIAKAN VIRUSBanyak virus yang telah dapat dibiakkan dalam biakan jaringan atau dalam telur berembrio dengan keadaan lingkungan yang dapat dikendalikan secara ketat.walaupun demikian pertumbuhan virus pada hewan percobaan masih tetap digunakan untuk isolasi primer virus tertentu dan untuk penelitian patogenitas virus dan onkogenesis virus.

Jadi ada tiga jenis biakan untuk virus yaitu :

1. Hewan PercobaanJenis hewan percobaan,umur,jenis kelamin serta cara penyuntikannya berbeda-beda tergantung dari jenis virus.Contohnya : Untuk virus polio maka hewan percobaan yang digunakan adalah kera. Cara penyuntikan adalah sbb :

secara intra cerebral (ke dalam otak) secara intra spinal (ke dalam sus-sum tulang belakang) secara intra nasal (diteteskan ke dalam hidung) secara intra musculair (disuntikan ke dalam otat paha)

Dalam waktu 2 minggu setelah penyuntikan,maka kera akan lumpuh. Ini dibuktikan bahwa tinja penderita mengandung virus polio.

2. Telur Berembrio.Telur berembrio yang biasanya digunakan adalah telur ayam negeri,telur ayam kampung, atau telur bebek.Umur dari telur,cara penyuntikan,suhu pengaraman dan lamanya pengeraman tergantung dari jenis virus yang akan disuntikkan.

3. Biakan Jaringan (tissue Culture)3 tipe dasar biakan jaringan,yaitu:

a. biakan jaringan primer,dibuat dengan cara menyebarkan sel (dengan tripsin) dari jaringan tuan rumah.umumnya sel ini tidak sanggup tumbuh lebih dari beberapa kali pemindahbiakan,sebagai biakan skunderb. strain sel diploid,adalah biakan skunder yang telah mengalami perubahan yang memungkinkan sel-sel tersebut dibiak terbatas (sampai 50 kali pemind biakan)tetapi tetap memiliki pola kromosom normal.c. Garis sel berkesinambungan,adalah biakan sel yang sanggup untuk tumbuh lebih lama dan berasal dari strain sel atau jaringan ganas.biakan sel ini selalu memiliki jumlah kromosom yang sudah berubah dan tidak teratur (1 : 16-23)

1. CARA PENGAMBILAN DAN PENANGANAN SPECIMENTujuan : mengetahui cara pengambilan dan penanganan sampel virologi

Prinsip :• Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis dan dimasukan dalam larutan antibiotik dan anti jamur.• Penanganan sampelSampel dimasukkan dalam media transport dan dimasukkan dalam bok pendingin

Alat :• Cotton bud steril• Botol steril / tabung bertutup steril

Bahan :• Media transport (PBS antibiotik)• Larutan antibiotik• Larutan antijamur

Bahan pemeriksaan :• Organ tersangka• Susu• Sperma• Swab anus• Swab trakhea

Prosedur kerja :1. sampel Organ• organ yang dicurigai terinfeksi virus diambil secara aseptis dan dimasukan ke dalam kontainer• organ digerus• ditambah media PBS,larutan antibiotik dan antijamur untuk mencegah pertumbuhan kontaminan jamur dan bakteri.• Disentrifuge 1000 rpm selama 10 menit• Diambil supernatan dan ditambah antibiotik• Diinkubasi 30 menit 37oC• Diinokulasikan dalam telurr atau media sel.

2. Sampel Swab• Swab steril dimasukan ke dalam pharing/anus dan digosokkan ke sekeliling organ (untuk pharing)• Swab dikeluarkandan dimasukkan ke dalam tabung berisi media transport dan dimasukkan bok pendingin untuk dibawa ke laboratorium.• Sampel swab divortex dan disentrifuge 1000 rpm 10 menit• Diambil supernatannya dan diinokulasikan dalam telur berembrio atau media sel

2. ISOLASI VIRUS PADA TELUR BEREMBRIOIsolasi virus secara invivo paling banyak dilakukan pada telur ayam berembrio karena lebih praktis dan relatif murah. Keberhasilan atau kegagalan menggunakan telur berembrio ini tergantung dari : rute inokulasiumur embrio,suhu inkubasi,lama inkubasi,volume dan pengenceran inokulum,status imun dari flok

Penyuntikan pada telur berembrio dapat dilakukan melalui 6 cara :1. intra alantois2. selaput korio alantois (CAM)3. intra kuning telur (yolk sac)4. intra amnionik5. intra venous

Virus yang tumbuh pada telur berembrio biasanya ditandai dengan kematian embrio,embrio menjadi kerdil,perdarahan di bawah kulit,pertumbuhan abnormal otot dan bulu serta organ visceral seperti hati dan

limfanya membengkak,warnanya pucat dan kehijauna,ada nekrotik,fokal di hati dan jantung dan endapan asam urat di ginjal,selaput corio alantois (CAM)menebal karena edemaa dan terdapat bintik putih (pock)atau plak.

Berbagai metode dapat dipakai untuk identifikasi dan klkasifikasi virus yaitu berdasarkan :1. tipe asam inti (DNA atau RNA)2. diameter virion3. bentuk nukleokapsid (kubus atau helical)4. sifat kimiawi virus,kepekaan terhadap pelarut lemak yaitu lipoprotein5. sifat fisika (thermo stabilitas)yaitu kepekaan virus terhadap pemanasan pada suhu 56C,proses cair beku,ultra sonikasi6. sifat biologis yaitu kemampuan mengaaglutinasi darah ,merah unggas dan mamalia,elusi dan patogenitas (2 : 3-6)

Tujuan : Mengisolasi virus yang dicurigai dalam telur berembrio

Alat : Alat peneropong posisi embrio Pencil Bor telur Spuit steril 1 ml Selotip/kutek/lilin Inkubator Reagen : Desinfektan ( Alkohol 70% atau yodium)

Bahan : Telur berembrio

Prosedur kerja :

A. Penyuntikan telur berembrioMetode Penyuntikan Intra alantois

Prosedur kerja :1. intra Selaput alantois• Digunakan embrio umur 8-11 hari.• Dekat dengan rongga udara di desinfektan dan dilubangi dengan bor telur.• Menggunakan tuberculin syring dengan jarum berukuran 25 gauge (16 mm),inokulum sebanyak 0,1 – 0,2 ml pertelur.disuntik dengan hati-hati langsung ke dalam selaput alantois. Jarum tidak boleh digerak-gerakkan ke samping untuk menghindari sobeknya selaput korio alantois dan matinya alantois.• Lubang bekas suntikan ditutup dengan kutek atau lilin dan telur diinkubasi di dalam inkubator suhu 37C selama 3 – 7 hari• Telur diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam• Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong di atas batas rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril.• Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk• Perubahan diamati seperti perdarahan di bawah kulit,udema,dan kerdil

2. intra Korio-alantois• Digunakan embrio umur 10 - 11 hari.

• Kulit telur dekat rongga udara dan sebelah samping didesinfeksi• Kulit telur dibor,pengeboranharus hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois atau mengenai pembuluh darah• Telur ditempatkan dengan poisisi horisontal,kemudian dibuat rongga udara tiruan disamping dengan cara menyedot udara melaui lubang rongga udara• Setelah lubang udara berpindah ke samping,lubang udara semula pada rongga udara ditutup dengan kutek atau lilin• Inokulum sebanyak 0,1-0,2 ml,dimasukkan vertikal masuk di atas selaput korio alantois.lubang ditutup dengan kutek atau lilin• Telur diinkubasi 37C selama 5607 hari dan diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam• Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong dekat rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril.• Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk• Selaput korio alantois diambil dan diperiksa perubahan seperti udema,penebalan dan bintik atau bercak putih (pock atau plak)• Selaput korio alantois ini ditampung dengan cairan alanto amnionik tadi

3. intra kuning telur• Digunakan telur berembrio umur 6-8 hari• Telur diletakkan posisi tegak,kulit telur di atas rongga udara didesinfektan kemudian dibor• Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 25 mm, telur diinokulum dengan suntikan tegak lurus masuk ke selaput kuning telur.disedot sedikit untuk memastikan jarum telah masuk kuning telur• Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 3-10 hari atau sampai embrio menetas• Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas

4. intra amnionik• Digunakan embrio telur umur 10-11 hari.• Posisi telut ditentukan dan diberi tanda dengan pencil• Kulit telur di atas rongga udara didesinfeksi kemudian kulit telur dibor• Menggunakan spuit 1 ml dengan jarum 22 gauge sebanyak 0,1-0,2 ml inokulum disuntikan langsung menembus selaput amnionik. Jika jarum tepat masuk selaput tersebut maka akan ada gerakan embrio menyentuh ujung jarum• Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 2-4 hari• Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas 1 jam

5. intra venous• Digunakan telur berembrio umur 10-12 hari• tentukan posisi pembuluh darah di bawah batas rongga udara• kulit telur didesinfektan kemudian kulit telur dibor bentuk segitiga tepatdi lokasi pembuluh darah. Hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois• supaya pembuluh darah jelas terlihat,kulit telur diusap dengan aseton sedikit.• Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 16 mm (25 gauge) inokulum dimasukkan melalui pembuluh darah dengan arah ke rongga udara• kulit telur ditutup kembali dengan potongan kulit telur semula kemudian ditutup dengan selotip dan diinkubasi 37C selama 7 hari• Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka

segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkasB. Memanen specimen dari telur terinfeksi Kulit telur didesinfeksi Kulit telur dipotong tepat di atas batas rongga udara Cairan alantois,amnionik,selaput korio alantois,selaput kuning telur dan embrio di panen Perubahan pada selaput korio alantois diamati penebalan,bercak-bercak putih,perdarahan di bawah kulit embrio dan kekerdilan.

3. PEMBUATAN KULTURE JARINGANKulture sel adalah memelihara suatu jenis sel tertentu dalam suatu wadah dengan media yang sesuai. Untuk mendapatkan kulture sel harus diisolasi dari jaringan donor atau organ. Agar sel yang kita peroleh berupa satu sel maka sel tersebut berasal dari satu sel yang dipelihara atau dengan memurnikan sel sebelum dipelihara.Sel primer adalah biakan sel yang baru pertama kali diisolasi dari donor,untuk mendapatkannya bisa diperoleh dari

Sel Mesenchymal Sel adiphose,chondrocyt,endhotelial.fibroblast,myocyte,osteoblast,dental Sel epithelial Sel epithelial respiratory,mucosa oral,keratnocyt,hepatocyt,kidney Sell turunan sumsum tulang Sel bone marrow stromal,peripheral blood mononuclear (2: 7)

PEMBUATAN KULTURE JARINGAN CHICKEN EMBRIO FIBROBLAST (CEF)

Tujuan : Mengetahui cara pembuatan kulture jaringan CEF

Alat :• Pinset steril• Gunting steril• Petri disk• Safety kabinet• Sentrifuge• Mikroskop • Beaker glass• Kasa• Spuit 5 ml,10 ml• Tabung Sentrifuge• Flash

Bahan :• Telur ayam berembrio 9-11 hari• Media MEM 5-10 %• Serum Sapi • PBS AB• Alkohol 70 %• Trypsin 0,25 %

Prosedur kerja :1. Cara Tanpa Pemanasan :a. Tangan, sarung tangan, gunting, pinset, telur disterilkan dengan alkohol 70 %.b. Telur dibuka tepat di atas rongga udara dengan menggunakan gunting, kemudian diambil di bagian

leher dengan menggunakan pinset, ambil embrio (dikerjakan di ruang steril/safety kabinet)c. Masukkan embrio ayam ke dalam cawan petri, kemudian dipisahkan dengan memotong bagian kepala, sayap, kaki, dan viscera /isi perut embrio (bagian yang dipotong ini dibuang).d. Bagian tubuh embrio dicuci dengan larutan PBS AB beberapa kali (2-3 kali) untuk menghilangkan sel darah merah, dipindahkan ke cawan petri yang lain.e. Bagian tubuh digunting kecil-kecil, kemudian dituangi dengan larutan tripsin 0,25 %. Digoyang dan dimasukkan larutan ini ke dalam tabung sentrifuge dengan memipetnya dengan pipet steril.f. Diputar dalam sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm.g. dibuang bagian yang jernih, bagian yang keruh di tambahkan lagi dengan larutan tripsin, lalu di sentrifuge kembali selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm, ulangi pengerjaan ini sampai ± 3 kali.h. Hasil sentrifuge yang terakhir diambil bagian yang jernihnya, kemudian dipindahkan kedalam flask.i. Ditambah larutan MEM 1-2 ml, kocok, disaring dengan kasa steril, filtrat ditambah dengan larutan MEM 5ml, kocok, ditambah serum sapi 2ml, goyang.j. Diamati dibawah mikroskop, tampak sel-sel yang terpisah merata dan transparan.k. Disimpan di dalam inkubator 37ºC 5% C¬¬¬O2, dilihat pertumbuhan selnya tiap hari dengan mikroskop.

2. Dengan pemanasan :- Pengerjaan seperti cara di atas (a, b, c, d, e) cairan tadi dimasukkan ke dalam flask dengan pipet steril kemudian di putar dengan magnetik stirer diatas hot plate. (jangan terlalu panas).

PEMBUATAN KULTUR JARINGAN (TISSUE CULTURE) DARI SEL HATI DAN GINJAL ANAK AYAM

Tujuan : Mengetahui cara kulture jaringan sel hati dan ginjal anak ayam

Alat :• Petridisk• Sentriufuge• Tabung sentrifuge• Beaker glass• Pipet tetes • Mikroskop• Pinset steril• Spuit• Botol/flask

Bahan :• Anak ayam umur 2-3 hari• PBS AB• MEM • Serum sapi• Alkohol 70%• Larutan Tripsin

Prosedur kerja- Anak ayam yang sudah disembelih disemprot/disterilkan dengan alkohol 70%. Kemudian di bedah, bagian ginjal diambil dan dipindahkan ke petridisk.- Dicuci dengan larutan PBS AB sebanyak 2-3 kali.- Ginjal digunting kecil-kecil dalam media PBS AB tadi, kemudian ditambah larutan tripsin.- Dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge, dan di putar dalam sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

- Cairan atas dibuang dan endapan diambil. Ditambah larutan tripsin, lalu diputar lagi (ulangi pengerjaan ini sebanyak 2-3 kali).- Cairan atas dibuang dan endapan dicuci dengan PBS AB.- Dipindahkan ke dalam flask, ditambahkan larutan MEM sebanyak 1-2 ml, kocok, disaring dengan kasa steril, lalu ditambah larutan MEM lagi sebanyak 5 ml dan serum sapi 2ml, goyang.- Diamati di bawah mikroskop, akan tampak sel-sel transparan dan terpisah merata.- Disimpan dalam inkubator 37OC dan setiap hari dilihat perkembangan selnya di bawah mikroskop.

Cara Inokulasi sel :a. Setelah terbentuk satu lapis sel(monolayer) maka sel dicuci dengan PBSb.Sampel dimasukkan dalam media dan biarkan 30 menit untuk terjadinya absorbsi.c.Sel ditambah dengan media dan diinkubasikan 2 atau 3 hari dengan diamati sitopatologi efek (CPE)d.Pada sampel yang positif akan ditemukane.Matinya sel,giant,sel,atau negri bodies

Hasil :Positif akan ditemukan negri bodies intra sitoplasma yang berwarna merah muda