PENUNTUN PRAKTIKUM

TEKNOLOGI ASAM NUKLEAT DAN

PROTEIN

UNTUK MAHASISWA S1 BIOKIMIA

Disusun Oleh:

Puspa Julistia Puspita Popi Asri Kurniatin

Suryani

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2020

2

IDENTITAS DIRI

NAMA :

NIM :

ALAMAT :

PHOTO

4x6

3

PRAKATA

Buku Penuntun Praktikum Keteknikan Asam Nukleat dan Protein ditujukan untuk

mahasiswa Program Sarjana Biokimia di lingkungan Institut Pertanian Bogor. Pada umumnya

percobaan-percobaan yang ada bersifat analitis dan mendalam, menyerupai dengan penelitian

mahasiswa di bidang teknologi DNA dan protein.

Jenis percobaan yang dikumpulkan dalam buku ini sengaja dipilihkan yang berkelanjutan,

dimulai dari isolasi DNA plasmid, isolasi DNA kromosom, restriksi DNA, elektroforesis, PCR,

pembuatan sel kompeten, dan transformasi. Percobaan-percobaan tersebut penting sebagai dasar

analisis molekuler dalam bidang Biokimia dan sebagai bekal dalam melakukan analisis lanjutan

seperti amplifikasi DNA, DNA blotting, serta sintesis DNA dan protein rekombinan.

Akhir kata, penyusun atas nama Staf Pengajar Biokimia mengucapkan banyak terima

kasih pada semua pihak yang telah membantu untuk terbitnya buku penuntun ini. Kritik-kritik dari

pemakai buku penuntun ini masih penyusun harapkan untuk perbaikan pada masa yang akan

datang sehingga dapat lebih bermanfaat bagi kita semua.

Bogor, Januari 2020

Penyusun

.

4

KETENTUAN DAN PENILAIAN PRAKTIKUM

Rencana Kerja Praktikum

Setiap mahasiswa diwajibkan untuk mempunyai Rencana Kerja Praktikum yang dibuat

dalam Buku Penuntun Praktikum. Rencana kerja ini berisi:

1. Prosedur kerja yang dibuat secara Diagram Alir 2. Hasil pengamatan, data, dan perhitungan- perhitungan yang

diperlukan. Rencana kerja praktikum ini (No. 1) diperiksa oleh asisten praktikum saat Anda mengerjakan kuis sedangkan nomor 2 diperiksa setelah praktikum selesai. Selain itu Anda juga harus telah mengetahui prinsip/teori dasar dari percobaan yang akananda laksanakan saat praktikum.

Kuis

Diberikan di awal praktikum dengan jumLah soal maksimum 3 buah dan dikerjakan dalam waktu

5-10 menit.

Penilaian Kerja

Penanggung jawab dan asisten praktikum akan membimbing, menjawab pertanyaan, dan melihat kerja anda dalam melaksanakan percobaan. Dalam penilaiannya diusahakan untuk seobyektif mungkin. Terdapat beberapa contoh yang dapat mengurangi nilai pada bagian ini yaitu:

1. Terlambat dalam menghadiri praktikum, nilai 0 jika anda terlambat lebih dari 30 menit. 2. Tempat anda bekerja kotor/berantakan 3. Menggunakan alat kaca yang kotor – contohnya ada titik noda reagen atau lainnya (debu)

di dalam alat kaca yang anda gunakan 4. Salah dalam mengoperasikan alat terutama yang instrumen seperti neraca

analitik/Spectronic 20 5. Adanya indikasi yang menunjukkan bahwa anda tidak mempersiapkan dengan baik dan

tidak memahami percobaan yang dilakukan secukupnya. Hal ini tidak berarti anda tidak boleh bertanya, bertanyalah jika anda mempunyai pertanyaan atau memerlukan konfirmasi dalam langkah-langkah percobaan. Maksud dari kalimat di atas adalah anda bekerja dengan terus melihat pada penuntun praktikum.

6. Tidak membersihkan daerah kerja anda pada meja laboratorium sebelum anda meninggalkan laboratorium.

7. Tidak mematikan alat seperti neraca atau alat instrumen lainnya pada akhir waktu praktikum.

Laporan Praktikum

Nilai untuk laporan praktikum bergantung pada bagaimana cara anda menuliskan (bahasa yang anda gunakan sesuai dengan EYD) serta kelengkapan dalam penulisan laporan tersebut. Laporan dibuat dalam lembar kertas ukuran A4. FORMAT LAPORAN PRAKTIKUM

Laporan praktikum dibuat per individu dengan bagian- bagian yang dituliskan harus sesuai seperti yang tertera di bawah ini.

1. Berisi Judul, Nama mahasiswa, Nama asisten, dan Nama dosen praktikum.

5

2. Hasil Pengamatan: Hasil praktikum sewajarnya disajikan dalam bentuk tabel, gambar, grafik, atau yang lain sesuai dengan percobaan dan yang disampaikan oleh asisten.

3. Pembahasan : Sebelum menentukan apa yang harus ditulis dalam pembahasan, penulis hendaknya membaca sekali lagi hipotesis atau tujuan praktikumnya. Cocokkan harapan itu dengan hasil utama. Anda harus membandingkan dengan hasil penelitianterdahulu, kemudian membuat pertimbangan teoritisnya. Pembahasan merupakan kumpulan argumen mengenai relevansi, manfaat, dan kemungkinan atau keterbatasan percobaan Anda, serta hasilnya.

4. Simpulan: simpulan pokok dari keseluruhan praktikum hendaknya disusun secara hati-hati. Simpulan memang memerlukan kecermatan luar biasa dan dibenarkan memunculkan tiga kali (sebaiknya dengan ungkapan yang berbeda-beda), yaitu dalam Pembahasan, Simpulan, dan Abstrak. Simpulan memuat hasil praktikum dan jawaban atas tujuan praktikum atau hipotesis

5. Daftar Pustaka: Bab ini berupa suatu daftar dari semua artikel jurnal dan pustaka lain yang diacu secara langsung dalam tubuh tulisan, kecuali bahan- bahan yang tidak diterbitkan dan tidak dapat diperoleh dari perpustakaan. Teknik penulisan dan pengajuan harus berpedoman pada Pedoman Penyajian Karya Ilmiah IPB terbaru.

6. Laporan praktikum ditulis on the spot atau dikumpulkan pada jadwal praktikum minggu berikutnya (tergantung pengamatan dan percobaan pada hari tersebut). Laporan praktikum yang tidak cukup lengkap seperti tidak adanya salah satu bagian seperti yang telah ditetapkan di atas akan dikembalikan kepada praktikan untuk dilengkapi terlebih dahulu sebelum dinilai dalam jangka waktu paling lama 2 hari setelah pengembalian dan nilai akan dikurangi sebanyak 5 untuk ketidaklengkapan tersebut. Laporan praktikum yang terlambat dikumpulkan (tidak pada waktu yang telah ditentukan) dikurangi nilainya sebanyak 5 setiap hari keterlambatan.

Distribusi nilai untuk tiap bagian dalam laporan tersebut yaitu:

Bagian Laporan Nilai Hasil 30

Pembahasan 40 Kesimpulan 10 Daftar Pustaka 10 Pertanyaan 10

Total: 100

Nilai Akhir Kinerja Laboratorium

Setiap percobaan akan bernilai maksimum 380 dengan distribusi maksimum masing-

masing adalah:

1. Buku catatan kerja laboratorium (maks 100) 2. Kuis (maks 100)

3. Penilaian Kerja (min 40, maks 80)

4. Laporan praktikum (maks 100)

6

Untuk nilai akhir tiap percobaan, dari keempat jenis penilaian tersebut menyumbangkan

persentase nilai akhir sebanyak: 20% untuk rencana kerja laboratorium, 10% kuis, 30%

penilaian kerja, dan 40% laporan praktikum. Sedangkan untuk nilai akhir laboratorium akan

dijumlahkan setiap nilai akhir percobaan lalu dibagi dengan jumLah percobaan yang telah

dilaksanakan. Nilai praktikum adalah rata-rata nilai akhir praktikum laboratorium dan ujian

praktikum.

i

PETUNJUK UMUM PRAKTIKUM

Isi dari penuntun terbagi dalam bab-bab yang disesuaikan dengan materi kuliah. Untuk

memperoleh hasil percobaan yang benar maka haruslah diketahui pokok-pokok yang sering

dijumpai dalam laboratorioum, meliputi peralatan yang digunakan, cara penggunaannya, bahan

kimia dan bahayanya. Dibawah ini dapat dilihat beberapa yang harus diperhatikan.

1. Setiap praktikan harus datang pada waktu-waktu praktikum sebab hanya ada satu kali saja

kesempatan untuk melakukannya.

2. Bawalah kain lap sendiri, jas praktek atau celemek plastik yang tahan asam untuk kebersihan

dan perlindungan pakaian dan badan.

3. Tiap praktikan yang mengerjakan percobaan secara kelompok harus mengetahui semua cara

kerja dan hasil percobaannya.

4. Jika ada kejadian-kejadian yang tidak diingini seperti terbakar, terkena asam-asam pekat,

terminum pereaksi-pereaksi tertentu atau terhirup gas-gas yang berbahaya segeralah hubungi

penanggung jawab praktikum atau lihat cara pencegahan/pengobatannya seperti yang tertera

pada laboratory emergency chart.

5. Untuk penghematan, pakailah bahan secukupnya saja. Rencana kerja harus dibuat sebelumnya,

sebab mengulangi kegagalan akan memerlukan bahan baru.

6. Berhati-hatilah memakai alat-alat, kalau rusak belum tentu dapat diganti dengan semestinya.

7. Botol-botol persediaan bahan harus ditutup kembali dengan tutup aslinya untuk mencegah

tercampurnya satu bahan pereaksi dengan yang lain.

8. Waktu mengambil bahan berupa tepung atau kristal, harus dijaga supaya tidak ada yang

berhamburan di atas meja. Biasanya bahan-bahan ini disediakan di meja yang terpisah.

9. Pakailah pipet yang sesuai dengan bahan yang diperlukan. Isilah pipet yang berskala dengan

bahan secukupnya, kalau ada lebihnya janganlah dikembalikan ke dalam botol persediaan.

10. Kertas saring bukan untuk menulis atau untuk mengeringkan alat-alat, tetapi hanya dapat

dipakai sebagai saringan. Sesuaikan pemilihan jenis saringan dengan percobaan.

11. Kalau pekerjaan telah selesai, alat-alat yang telah bersih dan kering disimpan kembali ke dalam

lemari sesuai dengan jumlah semula. Jangan lupa menutup saluran gas pembakar.

12. Kunci lemari harus diserahkan kembali untuk disimpan.

13. Laporan praktikum dibuat dalam buku tersendiri (Penjelasan di awal praktikum). Pokok-pokok

yang harus dilaporkan yaitu judul percobaan, prinsip, tujuan, cara kerja, hasil, diskusi, dan

kesimpulan. Disertakan juga jawaban dari pertanyaan-pertanyaan.

14. Peringatan akan diberikan sesuai dengan pelanggaran yang telah dilakukan.

ii

15. Ketentuan-ketentuan lain yang dianggap perlu untuk kelancaran praktikum belum tertera pada

petunjuk umum praktikum ini tetapi akan diberikan kemudian.

iii

DAFTAR ISI

Halaman

Prakata .......................................................................................................................................... i

Petunjuk Umum Praktikum ............................................................................................................ ii

Daftar Isi ....................................................................................................................................... v

Jadwal Praktikum ........................................................................................................................ vi

I. Isolasi dan Pemurnian DNA Plasmid ......................................................................................... 1

II. Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Restriksi ................................................................. 8

III. Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi ......................................................................... 12

III. Isolasi DNA Kromosom Tanaman Dengan Metode Doyle ...................................................... 17

IV. PCR ...................................................................................................................................... 22

V. Elektroforesis Gel Agarose ..................................................................................................... 28

Daftar Pustaka ...................................................................................................................... ..... 33

iv

JADWAL PRAKTIKUM

TEKNOLOGI ASAM NUKLEAT DAN PROTEIN

Semester Genap 2019/2020

RABU, 07.00-10.00

Pertemuan Tanggal Materi

1 22 Januari 2020 Penjelasan praktikum

2 29 Januari 2020 Isolasi dan pemurnian Plasmid DNA I:

(Pembuatan larutan 1-3, media LB)

3 5 Februari 2020 Isolasi dan pemurnian Plasmid DNA II

4 12 Februari 2020 Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Restriksi

5 19 Februari 2020 Penentuan Kualitas dan Kuantitas DNA Plasmid dan

DNA hasil restriksi (Elektroforesis Agarose)

6 26 Februari 2020 Isolasi DNA kromosom :

(Pembuatan buffer lisis, isoamil:kloroform)

7 04 Maret 2019 Isolasi DNA kromosom

9 Maret – 21 Maret

2020

UTS Semester Genap 19-20

8 1 April 2020 Penentuan kualitas dan kuantitas DNA kromosom

(Elektroforesis agarose) Lab 1

9 8 April 2020 Pembuatan sel kompeten dan transformasi:

(Pembuatan media LB, MgCl2 100 mM, CaCl2 75

mM) Lab 2

10 15 April 2020 Pembuatan sel kompeten

11 22 April 2020 Transformasi:

12 29 April 2020 PCR RAPD/SRAP DNA Genom Tanaman Herbal

13 29 April 2020 Elektroforesis gel agarosa : Penentuan kualitas hasil

PCR

14 6 Mei 2020 Ujian praktikum

Bogor, Januari 2020

Puspa Julistia Puspita PJP Teknologi Asam Nukleat dan Protein

1

ISOLASI DAN PEMURNIAN DNA PLASMID

I. Pendahuluan

Plasmid adalah DNA sirkular utas ganda berukuran relatif kecil, mampu bereplikasi secara

mandiri yaitu tidak bergantung pada replikasi DNA kromosom, dan proses replikasinya tidak terkait

dengan mekanisme pembelahan sel. Secara alami plasmid umum dijumpai pada sel bakteri dan

yeast, membawa satu atau sejumlah gen, yang dapat berupa gen pembawa sifat resisten terhadap

antibiotoka, penyandi enzim restriksi, atau penyandi enzim yang terlibat dalam pembentukan toksin

atau antibiotika.

Karakteristik yang penting dari plasmid adalah dapat melakukan replikasi sel, terdapat di luar

kromosom (ekstra kromosom) dan secara genetik dapat ditransfer dengan stabil. Plasmid terdapat

secara alami maupun sudah mengalami modifikasi sesuai dengan keperluan dalam manipulasi

genetik. Plasmid dapat berukuran 1 – 300 kb, sehingga dapat dibedakan dengan mudah dari

kromosom bakteri (3000 – 5000 kb)

Pada saat diisolasi plasmid dapat berada pada berbagai konformasi sirkular terbuka (open

circular), konformasi sirkulat tertutup secara kovalen (covalently closed circular) yang juga disebut

konformasi superkoil, serta konformasi linier. Konformasi sirkular terbuka terjadi jika salah satu utas

DNA plasmid sirkular terputus. Jika pemutusan ikatan fosfodiester terjadi pada kedua utas maka

akan terbentuk konformasi liner yang memiliki dua ujung.

Plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen (cloning vector). Agar dapat

digunakan sebagai vektor, plasmid antara lain harus memiliki origin of replication yang bersifat unik.

Origin of replication memungkinkan plasmid memperbanyak diri tanpa bergantung pada proses

replikasi DNA kromosom. Marka seleksi diperlukan dalam proses transformasi seleksi transforman.

Situs restriksi diperlukan sebagai tempat untuk menyisipkan fragmen DNA asing yang diklon.

Plasmid dapat diperbanyak dengan cara membiakkan sel bakteri yang membawa plasmid

tersebut. Sel kemudian dipanen dan plasmid yang berada didalam sel diisolasi. Sacara umum

proses isolasi dan pemurnian DNA plasmid melibatkan tiga tahap utama yaitu tahap pemecahan sel,

tahap penghilangan protein (deproteinasi), dan tahap pemekatan DNA. Ada beberapa metode yang

dapat digunakan untuk mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari sel bakteri.

Proses preparasi dapat dilakukan dalam skala kecil (mini-prep), skala menengah (midi-prep)

dan skala besar (large-prep). Pada praktikum berikut akan dilakukan preparasi (isolasi dan

pemurnian) DNA plasmid dala skala kecil dengan menggunakan teknik lisis alkali.

2

II. Tujuan

Tujuan Instruksional Khusus :

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa akan dapat menunjukkan sifat dan struktur DNA plasmid

melalui proses isolasi terhadap DNA plamid

Keterampilan

1. Mengisiolasi dan memurnikan DNA plasmid dari biakan sel bakteri E.coli

III. Prosedur

3.1. Pembuatan Larutan

Bahan-Bahan:

- Tris-HCl 1 M pH 7.5 (stok) dalam 50 mL - EDTA 0.1 M dalam 50 mL NaOH

- Sukrosa 15 % - NaOH 0.2 M

- SDS 10 % - Na asetat 3 M, pH 4.6

- Fenol - Kloroform

- Etanol absolute - Etanol 96%

- Etanol 70%

- ddH2O steril - Ekstrak khamir

- Tripton - NaCl

- Ampicilin 50.000 ppm

- Buffer TE (10 mM Tris HCl pH 7.5 -8 dan 1

mM EDTA) dibuat dalam 50 mL

- Isoamilalkohol

Alat-Alat:

- Neraca analitik - Alat-alat gelas

Isolasi DNA Plasmid dilakukan dengan metode modifikasi. Larutan yang dibutuhkan dalam

Isolasi DNA kromosom yaitu (1) Larutan 1 dibuat dalam 50 mL dan terdiri dari Tris-HCl 25 mM

(konsentrasi akhir) pH 7.5 sebagai bufer, EDTA 10 mM (konsentrasi akhir) sebagai pengkelat, dan

sukrosa 15% (konsentrasi akhir) untuk memecah dinding sel bakteri; (2) Larutan 2 dibuat dalam 50

mL dan terdiri dari NaOH 0.2 M untuk mengendapkan dinding sel dan SDS 10 % sebagai emulgator;

(3) Larutan 3 dibuat dari Na asetat 3 M, pH 4.6 sebagai buffer dan dibuat dalam 50 mL; (4) Larutan

3

fenol/kloroform/isoamilalkohol (PCI) (1:1:1), etanol absolut (96%), dan etanol 70% untuk

mengendapkan protein, ddH2O steril (Aquabides).

Media LB g/L dibuat dari 5 g/L ekstrak khamir, 10 g/L tripton, 5 g/L NaCl. Media LB dibuat

dalam volume 100 mL dan disesuaikan pHnya hingga ± 7.2. Kemudian media LB dimasukkaqn ke

dalam Erlenmeyer dan ditutup aluminium foil dan diotoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Media

LB 100 mL ditambahkan ampicilin Semua bahan dicampurkan dan dilarutkan dalam akuades sampai

volumenya tepat 100 ml dan ditambahkan 100 µL ampicilin dengan konsentrasi akhir 50 ppm dari

stok 50.000 ppm ampicilin.

Ampicilin dibuat dengan ditimbang 0,1 g ampicilin dan dimasukkan dalam tabung eppendorf

ukuran 2 mL. Kemudian dilarutkan dalam 40 µL NaOH 10 N dan ditambah akuades hingga volume 2

mL. Setelah itu disaring menggunakan filter milipore. Ampisilin kemudian dibagi dalam 2 tabung

eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin bersuhu 40C dan diberi Label.

3.2. Isolasi dan Pemurnian DNA Plasmid

Bahan-Bahan:

- Larutan 1 - Larutan 2

- Larutan 3 - Kultur bakteri E. coli yang berisi plasmid

rekombinan

- Medium LB - Fenol

- Isoamilalkohol

- Kloroform - Etanol absolut 96% dan 70%

- ddH2O - Etanol 70%

- Tip

- Pipet Mikro ukuran 100 – 1000 ul

- Buffer TE

Alat-Alat:

- Oven incubator - Sentrifus kecepatan tinggi berpendingin

- Vorteks - Alat-alat gelas

Pre cultured (H-7)

1. Bakteri E.coli rekombinan yang telah di thawing ditumbuhkan dalam media cawan LA/NA

dengan metode gores, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setalah bakteri

tumbuh boleh disimpan dalam 40C tidak lebih dari 2 minggu untuk digunakan dalam percobaan.

2. Kemudian E.coli ditumbuhkan kembali dalam media LA/NA kemudian digores dengan sistem 4

kuadran (enrichment culture) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian bakteri

4

yang tumbuh di media LA/NA dapat disimpan tidak lebih dari 1 minggu untuk digunakan dalam

percobaan.

3. 1 cm2 E.coli dalam media LA/NA ditumbuhkan di media LB (50 mL dalam 125 mL Erlenmeyer)

dan dibiakkan selama 18 jam dalam inkubator bergoyang pada suhu ruang atau suhu 37oC.

Kemudian diukur konsentrasi bakteri E.coli (OD) dengan menggunakan spektrofotometer. OD

bakteri berkisar 0.5-0.6 setelah dibiakkan kurang lebih 18 jam.

4. Sebanyak 10% E.coli ditumbuhkan kembali dalam media LB (50 mL dalam 125 mL Erlenmeyer)

dan diinkubasi kembali selama 18 jam dalam inkiubator bergoyang pada suhu ruang atau suhu

37oC. Kemudian diukur konsentrasi bakteri E.coli (OD) dengan menggunakan spektrofotometer.

Isolasi DNA Plasmid

1. Bakteri E.coli yang telah dibiakkan dalam media LB disentrifugasi selama 4-5 menit pada

13.200 rpm. Kemudian supernatan dibuang dan pellet dipindahkan dalam eppendorf 1.5 mL.

Pelet dicuci dengan 1 mL ddH2O sebanyak 2 kali. Setiap pencucian disentrifugasi 13.200 rpm

selama 3 menit, terakhir di cuci dengan 1 mL buffer TE dan disentrifugasi 13.200 rpm selama 3

menit.

2. Pellet diresuspensi dengan 100 µl larutan 1, lalu lakukan vorteks selama 1. Simpan tabung di

atas es selama 5 menit.

3. Tambahkan 200 µl larutan 2. Tutup tabung dan bolak balik tabung secara perlahan. Jangan

divorteks. Simpan tabung dalam es selama 5 menit.

4. Tambahkan 150 µl larutan 3. Tutup tabung dan bolak-balikkan secara perlahan untuk

mengaduk. Simpan tabung dalam es selama 5 menit.

5. Sentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4oC dengan kecepatan 13.200 rpm. Pindahkan

supernatan ke dalam tabung baru.

6. Tambahkan 0.7 – 0.8 mL larutan fenol/kloroform/isoamilalkohol. di vorteks lalu sentrifugasi

selama 10 menit pada 13.200 rpm. Pindahkan lapisan atas secara hati-hati ke dalam tabung

eppendorf baru.

7. Tambahkan 1 ml etanol absolut (96%)/isopropanol. Aduk dengan vorteks. Biarkan dalam suhu

ruang selama 15 menit.

8. Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.200 rpm selama 5 menit. Buang supernatan dan .

cuci dengan etanol 70% dan sentrifugasi kembali selama 5 menit.

9. Hilangkan supernatan dan keringkan pelet dalam pengering vakum atau tisue kimwipes.

10. Suspensikan kembali pelet dalam 50 - 100 µl ddH2O / Buffer TE (10 mM Tris HCl pH 7.5 -8 dan

1 mM EDTA

5

11. Simpan dalam – 20oC sebelum digunakan

Kuantifikasi DNA menggunakan Spektrofotometer (Sambrook and Russel (1989) dengan

modifikasi)

DNA genom yang telah diisolasi diukur absorbansinya menggunakan Thermo Scientific

Spektrofotometer Nanodrop 2000 pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm (A260/280

dan A260/230) untuk menentukan kemurnian dan konsentrasi DNA.

IV. Pertanyaan

1. Sebutkan tahapan isolasi DNA Plasmid?

2. Jelaskan bagaimana prinsip pemisahan DNA kromosom dan DNA Plasmid?

3. Larutan apa yang berperan sebagai (a). Lisis ; (b). Penghilang protein ; (c) presipitasi

DNA

4. Jelaskan perbedaan antara plasmid dan vektor?

5. Plasmid yang diisolasi pada percobaan kali ini akan digunakan sebagai apa?

6. Berapa kemurnian dari DNA Plasmid yang diisolasi

6

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

7

Hasil Pengamatan

8

PEMOTONGAN DNA PLASMID DENGAN ENZIM RESTRIKSI

I. Pendahuluan

Proses rekayasa genetika sering digunakan sebagai jalan untuk menghasilkan berbagai

produk-produk bioteknologi. Teknologi rekayasa genetika tidak dapat dilakukan tanpa bantuan

berbagai kerja enzim (memotong gen yang akan ditranslasikan, membuat ujung fragmen DNA yang

sesuai sehingga dapat digunakan dengan fragmen lain yang dikehendaki hingga proses

penyambungan fragmen-fragmen DNA sehingga membentuk DNA rekombinan).

Enzim yang diperlukan untuk pemotongan DNA sebagai syarat untuk pembuatan DNA

rekombinan disebut enzim restriksi (endonuklease restriksi). Enzim restriksi hanya memotong DNA

secara spesifik yaitu terbatas pada daerah atau situs yang dikenalinya.

Situs pengenalan enzim restriksi merupakan daerah yang simetri atau palindrom yaitu bahwa daerah

itu mempunyai urutan yang sama bila dibaca dari arah kiri dan kanan. Enzim restriksi dapat

mengenali 4 nukleotida (Sau3A, GATC), 6 nukleotida (EcoRI, GAATTC) dan 8 nukleotida (NotI).

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi menghasilkan 2 jenis ujung potongan yaitu potongan

berujung rata (blunt end) dan potongan berujung tidak rata/kohesif (sticky end atau cohesive).

II. Tujuan

Tujuan Instruksional Khusus :

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa akan dapat membandingkan bentuk DNA plasmid utuh

dan DNA plasmid yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi

Keterampilan

1. Melakukan restriksi pada DNA plasmid

2. Menentukan ukuran molekul DNA plasmid linear

III. Prosedur

3.1. Cara Kerja

Bahan-Bahan:

- DNA plasmid rekombinan hasil isolasi

pertemuan I

- Enzim restriksi (EcoRI)

- Buffer restriksi - ddH2O steril

9

Alat-Alat:

- Pipet mikro 200 – 1000 ul - Alat-alat gelas

- Inkubator

1. Masukkan 5 – 10 mg DNA plasmid atau sekitar 20 µl , 5 µl bufer enzim (10x), 1 µl enzim

restriksi dan ddH2O steril 24 µl hingga volume larutan mencapai 50 µl. Urutan membuat

campuran reaksi enzim adalah ddH2O steril, bufer enzim, DNA dan enzim restriksi. Untuk

mengurangi kerusakan enzim biasakan bekerja di atas es.

2. Inkubasikan pada suhu yang sesuai dengan kebutuhan enzim restriksi untuk bekerja selama

1 jam atau lebih. Kebanyakan enzim bekerja aktif pada suhu 37oC.

3. Hentikan aktivitas enzim dengan memanaskan pada suhu 65 – 70oC setelah penambahan

bromfenol biru sebagai penanda migrasi.

4. Masukkan ke dalam sumur pada gel elektroforesis (1%) dan migrasikan pada 75 – 100 volt

selama 44-60 menit. Gunakan penanda ukuran molekuler (marker DNA).

5. Bandingkan bentuk plasmid DNA utuh dengan DNA plasmid yang mengalami pemotongan

dengan enzim restriksi dan tentukan ukuran DNA plasmid linier.

Pertanyaan

1. Apa yang dimaksud dengan Enzim Restriksi

2. Bagaimana kerja dari enzim endonuklease restriksi dan eksonuklease restriksi

3. Sebutkan hasil pemotongan dari enzim restriksi

4. Apa yang dimaksud dengan Adapter dan Linker

10

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

11

Hasil Pengamatan

12

PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI

I. Pendahuluan

Dalam teknologi asam nukleat, proses manipulasi vektor dan DNA sisipan untuk

menghasilkan molekul DNA rekombinan dilakukan secara in vitro. Vektor yang telah membawa DNA

sisipan (DNA rekombinan) selanjutnya dimasukkan ke dalam sel inang. Keberhasilan memasukkan

DNA rekombinan ke dalam sel inang merupakan salah satu tahap kunci untuk keberhasilan

rekayasa asam nukleat.

Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap DNA asing. Oleh karena

itu, dilaboratorium, sel umumnya diberi perlakuan khusus agar mampu menyerap molekul DNA. Sel

yang mampu menyerap molekul DNA disebut sel kompeten. Sel dapat dibuat menjadi kompeten

antara lain melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl2) atau garam rubidium klorida

(RbCl). Pada percobaan berikut akan dilakukan pembuatan sel bakteri kompeten dengan

menggunakan garam kalsium klorida.

Proses pemasukan molekul DNA (plasmid) ke dalam sel inang disebut transformasi.

Selanjutnya sel inang yang membawa DNA plasmid disebut transforman. Dalam hal ini sel inang

dikatakan mengalami transformasi karena sel tersebut mengalami perubahan fenotip, misalnya yang

semula sensitif terhadap antibiotika tertentu lalu berubah menjadi resisten terhadap antibiotika

tersebut. Perubahan sifat ini diakibatkan oleh adanya gen (khususnya yang digunakan sebagai

marka seleksi) yang terkandung dalam plasmid. Pada percobaan berikut akan dilakukan

transformasi sel bakteri Escherichia coli menggunakan DNA plasmid.

II. Tujuan

Tujuan Instruksional Khusus :

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa akan dapat menjelaskan proses pembuatan sel

kompeten dan transforman

Keterampilan

1. membuat sel Escherichia coli kompeten.

2. mentransformasi sel bakteri dengan DNA plasmid.

3. melakukan seleksi transforman.

13

III. Prosedur

3. 1. Pembuatan Sel Kompeten

Bahan-Bahan:

- Kultur bakteri - Media LB cair dalam 200 mL

- MgCl2 100 mM dalam 80 mL

- Media LA + ampicilin dengan konsentrasi

akhir 50 ppm

- CaCl2 75 mM dalam 100 mL

Alat-Alat:

- Sentrifus - Alat-alat gelas

1. Koloni tunggal E. coli D-alfa dari LB agar dalam cawan petri yang telah diinkubasi selama 16-20

jam pada 37oC diambil dan ditumbuhkan dalam 30 mL LB pada suhu 37oC dengan kecepatan

agitasi 200 rpm.

2. Pindahkan 1 ml kultur bakteri (yang telah dibiakkan semalam dalam medium LB) ke dalam 14 ml

medium LB, sehingga total volume adalah 15 mL

3. Inkubasikan pada 37oC selama 1.5 – 2.5 jam (hingga akhir fase log). Pada fase ini OD kisaran

0.5 – 0.6.

4. Sebanyak 15 ml kultur disentrifugasi pada 8000 rpm, suhu 4oC selama 2 menit.

5. Buang supernatan dan suspensikan kembali pelet dalam 1 ml MgCl2 – CaCl2 dingin (80 mM

MgCl2 – 20 mM CaCl2) (tanpa divorteks).

6. Sentrifugasi kembali 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC, buang supernatan, dan

suspensikan kembali pelet dalam 600 uL CaCl2 0,1 M (tanpa divorteks).

7. Sel kompeten dapat langsung digunakan atau disimpan dalam suhu -80oC

8. Gunakan 200 µl sel kompeten untuk percobaan transformasi.

Method by Sambrook and Russell 2001

3.2. Transformasi

Bahan-Bahan:

- Sel kompeten - DNA plasmid

- Media LB cair - Media LB agar

Alat-Alat:

- Penangas air - Alat-alat gelas

1. Kedalam tabung eppendorf pindahkan 200 µl sel kompeten.

14

2. Tambahkan 0.26 ug atau kurang lebih 2 µl DNA plasmid.

3. Diamkan tabung dalam es pada suhu 4oC selama 30 menit.

4. Berikan kejut panas (heat shock) pada 42oC selama 90 detik.

5. Tambahkan 800 µl medium LB dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 45 menit.

6. Tuang dan taburkan 100 µl produk transformasi dalam medium pada LA/NA dan inkubasikan

pada 37oC semalam (selama 18 jam).

7. Medium yang digunakan ada (1) LA/NA dengan ampisilin dan (2) LA/NA tanpa ampisilin

8. Digunakan kontrol negatif yaitu E.coli kompeten ditambah dengan akuabides (ddH2O) sebagai

pengganti plasmid rekombinan.

Pertanyaan

1. Jelaskan pengertian dari (a) sel kompeten, (b) Transformasi, (c) transforman

2. Apa peran heatshock pada proses transformasi

3. Sebutkan faktor apa saja yang mempengaruhi keberhasilan transformasi

4. Bagaimana cara menentukan keberhasilan transformasi yang dilakukan

15

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

16

Hasil Pengamatan

17

ISOLASI DNA KROMOSOM TANAMAN DENGAN METODE DOYLE

Pendahuluan

Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia,

darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang

sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit

sekunder, seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak

mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi

dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang

kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak

asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA

tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian

pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode

khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel.

Pada praktikum ini kita akan mencoba melakukan isolasi DNA dari temulawak berbagai

sumber dengan menggunakan Metode Doyle. Tanaman yang digunakan menggunakan jaringan

tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas, misalnya menggunakan daun yang masih

muda. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan maupun bakteri dapat

menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu

digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB dan buffer lisis yang

mengandung potassium asetat dan SDS. Proteinase digunakan untuk membantu mendenaturasi

protein pada jaringan. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding

sel dan juga mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat

menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan

dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium

asetat-protein-debris sel. Selanjutnya pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol

(24:1) yang membantu mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan

untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 96%-100%. DNA dalam alkohol akan

terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut

dalam air.

Tujuan : Setelah melakukan pratikum isolasi DNA :

1. Dapat melakukan isolasi DNA dari jaringan daun pada tanaman

18

2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA

A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah mortar, Eppendorf, pipet mikro dan tip,

autoklaf. Bahan yang digunakan antara lain, daun temulawak dari berbagai aksesi, es batu, PVP

dan buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 50 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v)

2-merkaptoetanol), kloroform:isoamil alkohol (24:1), isopropanol, molecular water.

B. Prosedur

Isolasi DNA Kromosom dengan metode Doyle dan Doyle (1990) dan modifikasi menggunakan 5-

mM EDTA (Pharmawati 2009)

A. Isolasi DNA Kromosom

Daun/buah

1. Ambil daun / daging buah sebanyak 0.5 – 1 gram atau seluas 1-2 cm2

2. Hancurkan atau haluskan daging buah/ daun dengan menggunakan blender atau sendok

yang ditekan-tekan di atas saringan atau haluskan sampel dengan alu dan mortar dengan

menggunakan PVP seujuan dan 1 mL buffer ekstraksi.

3. Tambahkan 1x / 0.75 mL kloroform:isoamil alkohol (24:1) dan sentrifugasi dengan

kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ºC

4. Tambahkan enzim proteinase K sebanyak 10 µl

5. Homogenkan dengan alat vorteks selama 5 detik

6. Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 55ºC selama 45 menit

7. Pindahkan supernatan ke tabung baru dan tambahkan dengan 2/3 volume isopropanol

dingin dan lakukan inversi perlahan sebanyak 10 kali.

8. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ºC.

9. Buang supernatan, keringkan pelet dan tambahkan 100 µL molecular water dan simpan

pada suhu -20 ºC untuk analisis selanjutnya.

10. Ukur Konsentrasi DNA dengan spektrofotometer nano

B. Kuantifikasi DNA menggunakan Spektrofotometer (Sambrook and Russel (1989) dengan

modifikasi)

DNA genom yang telah diisolasi diukur absorbansinya menggunakan Thermo Scientific

Spektrofotometer Nanodrop 2000 pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm (A260/280

dan A260/230) untuk menentukan kemurnian dan konsentrasi DNA.

19

Pertanyaan

1. Sebutkan tahapan dalam isolasi DNA kromosom Tanaman

2. Sebutkan peran dari larutan di bawah ini :

(a) CTAB

(b) EDTA

(c) kloroform:isoamilalkohol

(d) merkaptoetanol

(e) isopropanol

3. Bagaimana cara mengetahui kemurnian DNA yang diisolasi?

4. Berapa konsentrasi dan kemurnian DNA kromosom yang anda peroleh?

20

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

21

Hasil Pengamatan

22

POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

I. Pendahuluan

Polimerase Chain Reaction atau PCR adalah suatu teknik untuk amplifikasi DNA target

secara in-vitro dengan cepat. Teknik ini ditemukan ole Karry Mulis tahum 1983, dan mendapatkan

Nobel pada tahun 1994 atas penemuannya tersebut. PCR dapat diaplikasikan pada bidang biologi

molekuler, bioteknologi, biokimia, dan juga kesehatan.

Proses PCR meliputi denaturasi, yaitu pembukaan untai ganda DNA; dilanjutkan dengan

annealing atau penempelan primer pada DNA cetakan: lalu extension atau proses pemanjangan pita

DNA (Gambar 1). Pada prosesnya reaksi PCR membutuhkan DNA cetakan, primer, enzim tag DNA

polimerase, dan dNTP.

Gambar 1 Proses PCR

Saat ini PCR telah dikembangkan menjadi berbagai variasi metode untuk tujuan tertentu,

salah satunya yang akan dilakukan pada praktikum ini adalah SRAP atau Single Random Amplified

Polimorfism DNA-PCR. Pada praktikum ini akan dilakukan PCR dengan primer acak untuk

mengenali polimorfisme pada tanaman daun wungu dan temulawak. Prosedur yang dilakukan

mengacu pada hasil penelitian Prahaditya (2012) dan Azmi (2019).

II. Tujuan

Tujuan Instruksional Khusus :

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa dapat menjelaskan prinsip reaksi PCR dan terampil

menggunakan metode ini untuk amplifikasi DNA

23

Keterampilan

1. Menyiapkan sampel dan pereaksi untuk PCR

2. Mengoperasikan alat PCR

III. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah tube PCR 200 µL, freezer -20°C, PCR Biorad T100™ Thermal

Cycler, perangkat elektroforesis (Biorad Mini-Sub® Cell GT Cell dan PowerPac™ HC High-Current

Power Supply), Biorad Gel Doc™ EZ Gel Documentation System, sentrifuse, vortex, penangas air,

Thermo Scientific Spektrofotometer Nanodrop 2000.

Bahan yang digunakan adalah daun wungu dan daun temulawak kering, agarose agar, safe DNA

loading dye, TBE 10x, Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix (2X), Generuler 100 bp

plus DNA Ladder, Generuler 1 kb plus DNA Ladder, peq dye, etanol 96%, Nuclease Free Water

(NFW), akuabides, Tris EDTA Buffer solution pH 8, 4 primer SRAP reverse dan 4 primer SRAP

forward (Tabel 1).

IV. Prosedur

Tabel 1 Urutan basa nukleotida primer yang digunakan

No. Jenis Nama Urutan basa nukleotida Jumlah basa

Tm theory (°C)

Tm-5 (°C)

1

Forward

Me1 5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’ 17 50 45

2 Me2 5’-TGAGTCCAAACCGGAGC-3’ 17 54 49

3 Me3 5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’ 17 50 45

4 Me4 5’-TGAGTCCAAACCGGACC-3’ 17 54 49

5

Reverse

Em1 5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’ 18 50 45

6 Em2 5’-GACTGCGTACGAATTTGC-3’ 18 54 49

7 Em3 5’-GACTGCGTACGAATTGAC-3’ 18 54 49

8 Em4 5’-GACTGCGTACGAATTTG-3’ 17 50 45 Keterangan: Tm = Suhu annealing Sumber: Li & Quiros (2001)

Primer SRAP telah dioptimasi dan diperoleh 8 terbaik yang menunjukkan tingkat polimerfisme.

Seperti yang tersaji pada Tabel 2.

Tabel 2 Kombinasi primer SRAP terpilih No. Kode Kombinasi primer Tm 1 (°C) Tm 2 (°C)

1 F7 Me2 + Em3 35.2 47.5

2 B6 Me2 + Em2 44 57

3 B9 Me3 + Em1 44 57

4 F8 Me2 + Em4 35.2 47.5

5 B12 Me3 + Em4 44 57

6 F10 Me3 + Em2 35.2 47.5

7 B11 Me3 + Em3 44 57

8 F4 Me1 + Em4 35.2 47.5

Keterangan: Tm = Suhu annealing

24

Amplifikasi DNA Sampel. Total volume cocktail PCR yang digunakan adalah 25 µL

dengan komposisi yaitu 1 µL DNA template (50 ng/µL), 0.7 µL forward primer (20 µM), 0.7 µL

reverse primer (20 µM), 13 µL PCR mix (Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix (2X))

dan 9.6 µL free nuclease water. Volume template DNA dan free nuclease water yang ditambahkan

disesuaikan dengan konsentrasi DNA genom yang telah dikuantifikasi dengan konsentrasi akhir

template DNA dalam 25 µL campuran cocktail PCR adalah 50 ng/µL.

Proses reaksi PCR yang dilakukan mengacu pada Li & Quiros (2001) dengan sedikit

modifikasi. Fase pre-denaturasi dilakukan pada suhu 94°C selama 5 menit. Berikutnya dilakukan 5

siklus denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing 1 pada suhu 44°C (untuk suhu B atau

35.2°C untuk suhu F) selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit. Setelah 5

siklus sebelumnya selesai, dilanjutkan 35 siklus berikutnya, yaitu denaturasi pada suhu 94°C

selama 1 menit, annealing 2 pada suhu 57°C (untuk suhu B atau 47.5°C untuk suhu F) selama 1

menit dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit. Fase berikutnya adalah fase final extention

yang dilakukan pada suhu 72°C selama 8 menit. Kemudian dilanjutkan dengan holding temperature

pada suhu 4°C.

Elektroforesis Produk PCR

Pembuatan Agarose 2.5%. Sebanyak 0.75 gram agarosea ditimbang lalu dilarutkan ke

dalam 30 mL TBE 1x. Campuran kemudian dipanaskan menggunakan penangas sampai homogen

(tidak berwarna). Setelah itu, 2.5 µL Peq Dye ditambahkan ke dalam agarose tersebut lalu

dihomogenkan. Agarose cair dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisiran/comb dengan

jumlah sumur yang akan terbentuk adalah 15. Sisiran kemudian diangkat setelah gel memadat.

Running Elektroforesis. Larutan TBE 1x dituang ke dalam tangki elektroforesisis yang

telah disiapkan. Sebanyak 6 µL produk PCR dimasukkan ke dalam sumur agarose dan 6 µL

Generuler 1 kb plus DNA Ladder dimasukkan ke dalam sumur agarose yang berada di ujung kanan.

Elektroforesis dilakukan selama 120 menit pada 70 volt. Hasil elektroforesis kemudian divisualisasi

menggunakan UV transiluminator. Hasil visualisasi kemudian didokumentasikan.

Pertanyaan

1. Jelaskan prinsip PCR dengan metode SRAP

2. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA

3. Gambarkan hasil elektroforegram PCR DNA kromosom yang diperoleh dengan

menggunakan UV transluminator

25

4. Apa yang dapat anda sarankan apabila hasil PCR tidak ada/ apa yang dapat dimodifikasi

untuk meningkatkan keberhasilan amplifikasi DNA?

5. Selain dengan metode SRAP, sebutkan metode PCR yang lainnya yang anda ketahui

serta jelaskan prinsipnya (minimal 2)

26

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

27

Hasil Pengamatan

28

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

I. Pendahuluan

Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan senyawa berdasarkan kecepatan migrasi dari

senyawa yang bermuatan listrik di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel merupakan

salah satu teknik utama dalam biologi molekular dan merupakan metode standar untuk pemisahan,

identifikasi dan pemurnian fragmen DNA.

Prinsip dasar teknik ini adalah Deoxyribonucleotid Acid (DNA), Ribonucleotid Acid (RNA), atau

protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan

berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan

tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan, konsentrasi gel agarosa, tegangan listrik

yang diberikan, dan konformasi DNA. DNA bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan

listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.

Pemisahan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel

yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda

antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan

jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang

lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak

rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam elektroforesis bervariasi antara 0,7 % - 1.5%.

Biasanya konsentrasi gel 0,8% - 1% sangat baik untuk memisahkan fragmen DNA berukuran 1-

20.000 pasang basa. Konsentrasi gel kurang dari 0,5% dapat meningkatkan daya pisah

elektroforesis namun sangat rapuh dan sulit ditangani. Etidium bromida dapat ditambahkan ke

suspensi DNA untuk tujuan visualisasi hasil elektroforesis (pita-pita DNA dapat dideteksi di bawah

sinar UV). Pada percobaan kali ini EtBr digantikan dengan Peq Dye.

II. Tujuan

Tujuan Instruksional Khusus :

Setelah praktikum ini, mahasiswa akan Mengetahui prinsip elektroforesis DNA dan melakukan teknik

elektroforesis DNA dengan gel agarose

III. Keterampilan

1. Melakukan elektroforesis gel agarosa

29

III. Prosedur

3.1. Pembuatan Larutan dan Gel

Bahan-Bahan:

- Agarosa - Tris HCl

- Asam borat - EDTA

- Loading dye - DNA marker

- Peq Dye - 1 kb DNA Ladder

Alat-Alat:

- Perangkat elektroforesis - Alat-alat gelas

- UV transiluminator -

3.2. Elektroforesis Gel hasil Isolasi DNA

Elektroforesis DNA Hasil Isolasi (Guenni et al. (2016) dengan modifikasi)

Pembuatan Agarose 1%. Larutan bufer TBE 5x dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat

0.83 M, dan EDTA 10 mM. Sebanyak 0.3 gram agarose ditimbang lalu dilarutkan ke dalam 30 mL

TBE 1x. Campuran kemudian dipanaskan menggunakan penangas sampai homogen (tidak

berwarna). Setelah itu, 2 µL Peq Dye ditambahkan ke dalam agarose lalu dihomogenkan. Agarose

cair dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisiran (15 sumur). Sisiran kemudian diangkat

setelah gel memadat.

Running Elektroforesis. Larutan TBE 1x dituang ke dalam tangki elektroforesisis yang telah

disiapkan. Sebanyak 5 µL DNA genom dihomogenkan dengan 1 µL DNA Loading Dye kemudian

dimasukkan ke dalam sumur agarose. Sebanyak 6 µL Generuler 1 kb plus DNA Ladder dimasukkan

ke dalam sumur agarose yang berada di ujung kanan. Elektroforesis dilakukan selama 45 menit

pada 85 volt. Hasil elektroforesis divisualisai menggunakan UV transiluminator.

Tabel 1. Pemisahan fragmen DNA melalui elektroforesis gel agarosa (Sambrook dan Russel, 1989).

(%) W/V Ukuran fragmen

0.5

0.8

1.0

1.2

1,5

700 bp – 25 kbp

500 bp – 15 kbp

250 bp – 12 kbp

150 bp – 6 kbp

80 bp – 4 kbp

30

Pertanyaan

1. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi DNA!

2. Apa fungsi Peq Dye pada percobaan kali ini?

3. Sampel apa saja yang digunakan pada percobaan kali ini?

4. Apa fungsi Loading Dye dan marker DNA pada percobaan kali ini?

5. Selain Elektroforesis Agarose, sebutkan dan jelaskan jenis elektroforesis lainnya

yang anda ketahui!

31

Hari : Dosen Praktikum :

Tanggal : Asisten :

Kelompok :

Praktikan : 1

2

3

Rencana Kerja (wajib dibuat dalam bentuk skema)

32

Hasil Pengamatan

33

DAFTAR PUSTAKA

Azmi, WA. 2019. Keragaman Genetik Daun Wungu Dari 11 Etnis Di Indonesia Bagian Timur

Berdasarkan Marka Molekuler Srap. Skripsi. Institut Pertanian Bogor.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena. Yogyakarta : Yayasan Essentia Medica.

Fatchiyah, Estri LA, Sri W, Sri R. 2011. Biologi Molekuler : Prinsip Dasar Analisis. Jakarta : Erlangga.

Guenni K, Aouadi M, Chatti K, Salhi-Hannachi A. 2016. Analysis of genetic diversity og Tunisian

pistachio (Pistacia vera L.) using sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers.

GMR. 15(4): 1-15.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda.

Prahaditya, Deffy. 2012. Analisis Keragaman Genetika Tanaman Kunyit dan Temulawak secara

Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) Menggunakan

Primer OPA-OPD 6-10. Skripsi. Institut Pertanian Bogor.

Sambrook J, Russel D.W. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition. New

York: Cold-Spring Harbor Laboratory Pr.