surat keputusan ketua lipi - e-journal.biologi.lipi.go.id

Berita Biologi merupakan Jurnal Ilmiah ilmu-ilmu hayati yang dikelola oleh Pusat PenelitianBiologi - Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), untuk menerbitkan hasil karya-penelitian (original research) dan karya-pengembangan, tinjauan kembali (review) dan ulasan

topik khusus dalam bidang biologi. Disediakan pula ruang untuk menguraikan seluk-beluk peralatanlaboratorium yang spesifik dan dipakai secara umum, standard dan secara internasional. Juga uraiantentang metode-metode berstandar baku dalam bidang biologi, baik laboratorium, lapangan maupunpengolahan koleksi biodiversitas. Kesempatan menulis terbuka untuk umum meliputi para penelitilembaga riset, pengajar perguruan tinggi maupun pekarya-tesis sarjana semua strata. Makalah harusdipersiapkan dengan beipedoman pada ketentuan-ketentuan penulisan yang tercantum dalam setiapnomor.

Diterbitkan 3 kali dalam setahun yakni bulan April, Agustus dan Desember. Setiap volumeterdiri dari 6 nomor.

Surat Keputusan Ketua LIPINomor: 1326/E/2000, Tanggal 9 Juni 2000

Dewan Pengurus

Pemimpin Redaksi

B Paul Naiola

Anggota Redaksi

Andria Agusta, Dwi Astuti, Hari Sutrisno, Iwan Saskiawan

Kusumadewi Sri Yulita, Tukirin Partomihardjo

Redaksi Pelaksana

Marlina Ardiyani

Desain dan Komputerisasi

Muhamad Ruslan, Yosman

Sekretaris Redaksi/Korespondensi Umum

(berlangganan, surat-menyurat dan kearsipan)

Enok, Ruswenti, Budiarjo

Pusat Penelitian Biologi-LIPIKompleks Cibinong Science Center (CSC-LIPI)

Jin Raya Jakarta-Bogor Km 46,Cibinong 16911, Bogor - IndonesiaTelepon (021) 8765066 - 8765067

Faksimili (021) 8765059e-mail: [email protected]

[email protected]@indo.net.id

Keterangan foto cover depart: Keragaman genetik plasma nutfahpadi beras putih dan beras warna,sesuai makalah di halaman 143 Foto: Dwinita W Utami - Koleksi BB Biogen-Badan Pengembangandan Penelitian Pertanian-Departemen Pertanian.

Referee/Mitra Bestari

Anggota Referee / Mitra Bestari

MikrobiologiDr Bambang Sunarko (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Prof Dr Feliatra (Universitas Riau)Dr Heddy Julistiono (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr I Nengah Sujaya (Universitas Uday and)Dr Joko Sulistyo (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Joko Widodo (Universitas Gajah Mada)Dr Lisdar I Sudirman (Institut Pertanian Bogor)Dr Ocky Kama Radjasa (Universitas Diponegoro)

MikologiDr Dono Wahyuno (BB Litbang Tanaman Rempah

dan Obat-Deptan)Dr Kartini Kramadibrata (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)

GenetikaProf Dr Alex Hartana (Institut Pertanian Bogor)Dr Warid Ali Qosim (Universitas Padjadjaran)Dr Yuyu Suryasari Poerba (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)

TaksonomiDr Ary P Keim (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Daisy Wowor (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Prof (Ris) Dr Johanis P Mogea (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Rosichon Ubaidillah (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)

Bioiogi MolekulerDr Eni Sudarmonowati (Pusat Penelitian Bioteknologi-

LIPI)Dr Endang Gati Lestari (BB Litbang Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian-Deptan)Dr Hendig Winarno (Badan Tenaga Atom Nasional)Dr I Made Sudiana (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Nurlina Bermawie (BB Litbang Tanaman Rempah

dan Obat-Deptan)Dr Yusnita Said (Universitas Lampung)

BioteknologiDr Nyoman Mantik Astawa (Universitas Udayana)Dr Endang T Margawati (Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI)Dr Satya Nugroho (Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI)

VeterinerProf Dr Fadjar Satrija (FKH-IPB)

Bioiogi PeternakanProf (Ris) Dr Subandryo (Pusat Penelitian Ternak-Deptan)

EkologiDr Didik Widyatmoko (Pusat Konservasi Tumbuhan-LIPI)Dr Dewi Malia Prawiradilaga (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Frans Wospakrik (Universitas Papua)Dr Herman Daryono (Pusat Penelitian Hutan-Dephut)Dr Istomo (Institut Pertanian Bogor)Dr Michael L Riwu Kaho (Universitas Nusa Cendana)Dr Sih Kahono (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)

BiokimiaProf Dr Adek Zamrud Adrian (Universitas Andalas)Dr Deasy Natalia (Institut Teknologi Bandung)Dr Elfahmi (Institut Teknologi Bandung)Dr Herto Dwi Ariesyadi (Institut Teknologi Bandung)Dr Tri Murningsih (Pusat Penelitian Bioiogi -LIPI)

FisiologiProf Dr Bambang Sapto Purwoko (Institut Pertanian Bogor)Dr Gono Semiadi (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Irawati (Pusat Konservasi Tumbuhan-LIPI)Dr Nuril Hidayati (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)Dr Wartika Rosa Farida (Pusat Penelitian Biologi-LIPI)

BiostatistikIr Fahren Bukhari, MSc (Institut Pertanian Bogor)

Bioiogi Perairan Darat/LimnologiDr Cynthia Henny (Pusat Penelitian Limnologi-LIPI)Dr Fauzan Ali (Pusat Penelitian Limnologi-LIPI)Dr Rudhy Gustiano (Balai Riset Perikanan Budidaya

Air Tawar-DKP)Bioiogi TanahDr Rasti Saraswati (BB Sumberdaya Lahan Pertanian-

Deptan)

Biodiversitas dan IkiimDr Rizaldi Boer (Institut Pertanian Bogor)Dr Tania June (Institut Pertanian Bogor)

Bioiogi KelautanProf Dr Chair Rani (Universitas (Hasanuddin)Dr Magdalena Litaay (Universitas Hasanuddin)Prof (Ris) Dr Ngurah Nyoman Wiadnyana (Pusat Riset

Perikanan Tangkap-DKP)Dr Nyoto Santoso (Lembaga Pengkajian dan

Pengembangan Mangrove)

ii

Berita Biologi 10(2) - Agustus 2010

Berita Biologi menyampaikan terima kasihkepada para Mitra Bestari/ Penilai (Referee) nomor ini

10(2)-Agustus 2010

Dr. Andria Agusta - Pusat Penelitian Biologi LIP IDr. Ary P. Keim - Pusat Penelitian Biologi LIPI

Dr. B Paul Naiola - Pusat Penelitian Biologi LIPIDr. Endang Gati Lestari - BB Litbang Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian-DeptanDr. Endang Tri Margawati - Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI

Dr. Iwan Saskiawan - Pusat Penelitian Biologi LIPIDr. Kusumadewi Sri Yulita - Pusat Penelitian Biologi LIPI

Dr. Marlina Ardiyani - Pusat Penelitian Biologi LIPIDr. Satya Nugroho - Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI

Referee/ Mitra Bestari Undangan

Drs. Edi Mirmanto, M.Sc. - Pusat Penelitian Biologi LIPIDr. Herwasono Soedjito - Pusat Penelitian Biologi LIPIDr. Joeni Setijo Rahajoe - Pusat Penelitian Biologi LIPI

Dr. Rianta - Pusat Penelitian Limnologi LIPIDr. Syahroma H. Nasution - Pusat Penelitian Limnologi

Prof. (Ris.) Dr. Woro A. Noerdjito - Pusat Penelitian Biologi LIPIDra. Yuliasri Jamal, M.Sc. - Pusat Penelitian Biologi LIPI

iii


DAFTAR ISI

MAKALAH HASIL RISET (ORIGINAL PAPERS)

PENINGKATAN KUALITAS NUTRISI TEPUNG DAUN LAMTORO SEBAGAI PAKAN IKANDENGAN PENAMBAHAN EKSTRAK ENZIM CAIRAN RUMEN DOMBA(Improvement Nutrition Value of Leucaena Leaf Meal as Fish Feed with Addition of Sheep RumenFluid Enzyme]Indira Fitriliyani, Enang Harris, Ing Mokoginta, Nahrowi 135

SIDIKJARI DNA PLASMA NUTFAH PADI LOKAL MENGGUNAKAN MARKA MOLEKULERSPESIFIK UNTUK SIFAT PADI BERAS MERAH| DNA Fingerprinting of Local Rice Germplasm using The Specific Markers for Red Rice]Dwinita W. Utami, Aderahma Ilhami, Ida Hanarida 143

PENGGUNAAN VAKSIN Aeromonas hydrophila: PENGARUHNYA TERHADAP SINTASANDAN IMUNITAS LARVA IKAN PATIN (Pangasionodon hypophthalmus)(The Application of Aeromonas hydrophila Vaccine: The Effects on The Survival Rate andImmunity of Patin Seed (Pangasionodon hypophthalmus)]Angela M Lusiastuti dan Wartono Hadie 151

KEANEKARAGAMAN LUMUT DI TAMAN NASIONAL BUKIT BARISAN SELATAN,PROVINSI LAMPUNG, SUMATERA[Mosses Diversity In Bukit Barisan Selatan National Park, Lampung Province, Sumatera]Florentina Indah Windadri 159

PRIMER-PRIMER BARU UNTUK MENGAMPLIFIKASI GEN PENGKODE PROTEINAMPLOP VIRUS DENGUE STRAIN CH53489[Novel Primers to Amplify The Gene Coding for Envelope Protein of Dengue Virus StrainCH53489]Ira Djajanegara 167

ANALISIS VEGETASI POHON DI HUTAN HUJAN TROPIK HARAPAN, JAMBI[Vegetation Analysis of Trees in Harapan Rainforest, Jambi]Muhammad Mansur, Teguh Triono, Ismail, Setyawan Warsono Adi,Enu Wahyu, Gofar Ismail 173

KEANEKARAGAMAN KUMBANG LUCANID (Coleoptera: Lucanidae) DI TAMANNASIONAL BOGANI NANI WARTA BONE, SULAWESI UTARA[Lucanids Beetle Diversity (Coleoptera: Lucanidae) in the Bogani Nani Wartabone National Park,North Sulawesi]Roni Koneri 179

ANALISIS PREDIKSI SEBARAN ALAMI GAHARU MARGA Aquilaria DAN Gyrinops DIINDONESIA[Natural Distribution Prediction Analyses of Agarwood Genera of Aquilaria and Gyrinops) inIndonesia)Roemantyo dan Tukirin Partomihardjo 189

VIRULENCE OF Xanthomonas oryzae pv. oryzae AND REACTION OF RICE GENOTYPES TOTHE RACES OF THE PATHOGEN[Virulensi Xanthomonas oryzae pv. oryzae dan Reaksi Genotipe Padi Terhadap Ras Patogen]Y Suryadi and Triny S Kadir 199

Dafttar Isi

KEANEKARAGAMAN TUMBUHAN PULAU SEPANJANG JAWA TIMUR[Plant Diversity of Sepanjang Island, East Java]Rugayah, Suhardjono, S Susiarti 205

PENGARUH LAMA PENYIMPANAN, SUHU DAN LAMA PENGERINGAN KENTANGTERHADAP KUALITAS KERIPIK KENTANG PUTIH[Effect of Storage, Temperature and Drying Duration of Potato on Potato chip Quality]AH Asgar, Asih Kartasih, Asep Supriadi dan Henna Trisdyani 217

SELEKSIJAMUR TANAH PENGURAI LIGNIN DAN PAH DARI BEBERAPA LINGKUNGANDI BALI[The Selection of Lignin and PAHs Degrading Fungi from Some Environment in Bali]YB Subowo dan Corazon 227

PENGARUH EKSTRAK AIR DAN ETANOL Kaempferia spp. TERHADAP AKTIVITAS DANKAPASITAS FAGOSITOSIS SEL MAKROFAG YANG DIINDUKSI BAKTERI Staphylococcusepidermldis[Influenced of Water and Ethanol Extracts of Kaempferia spp. to Phagocytosis Activity andCapacity Macrophage Cells Induce by Staphylococcus epidermldis]Tri Murningsih 235

KERAGAMAN BAKTERI ENDOFITIK PADA EMPAT JENIS VARIETAS PADI DENGANMETODA ARDRA (Amplified Rlbosomal DNA Restriction Analysis)[The Diversity of Endophytic Bacteria Within Four Different Rice Varieties by Using ARDRA(Amplified Rlbosomal DNA Restriction Analysis) Method]Dwi N Susilowati, Nurul Hidayatun, Tasliah, danKMulya 241

RESPON TANAMAN PADI GOGO (Oryza satlva L.) TERHADAP STRESS AIR DANINOKULASI MIKORISA[Response of Upland Rice (Oryza satlva L.) Under Water Stress and Mycorrhyzae Inoculation]Harmastini Sukiman, Syoflatin Syamsiyah dan Adiwirman, 249

KOMPOSISI JENIS KEPITING (Decapoda: Brachyura) DALAM EKOSISTEM MANGROVEDAN ESTUARI, TAMAN NASIONAL BALI BARAT[Crabs (Decapoda: Brachyura) Species Composition in Mangrove and Estuarine Ecosystem,West Bali National Park]Dewi Citra Murniati 259

KOMUNIKASI PENDEK

CATATAN JENIS-JEMS TUMBUHAN ASING DAN INVASIF DI TAMAN NASIONALGUNUNG CEDE PANGRANGO, JAWA BARAT[Recorded of Alien Invasive Species in Gunung Gede Pangrango National Park, West Java]Sunaryo dan Eka F Tihurua 265

vi


PRIMER-PRIMER BARU UNTUK MENGAMPLIFIKASI GEN PENGKODEPROTEIN AMPLOP VIRUS DENGUE STRAIN CH534891

[Novel Primers to Amplify The Gene Coding for EnvelopeProtein of Dengue Virus Strain CH53489]

Ira DjajanegaraPusat Teknologi Bioindustri - BPPT

Gedung BPPT 2 Lantai 15, Jl. M.H. Thamrin 8, Jakarta-10340

ABSTRACTRestriction site of BamHI and Sail must be added in order to express the gene encoding envelope protein of dengue virus strainCH53489 (gene E) into expression vector pMAL-p2x. This approach required the PCR technique for amplification as well asrestriction sites addition. However, PCR amplification is prone to error due to the process of misincorporation eventhough usingPlatinum taq polymerase. Therefore, it is important to be concern that there will be no alteration of the gene especially forbiopharmaceutical purposes such as recombinant vaccine. This experiment was aimed to design several primers of DenV-M F, D3-1715s, D3-2117s, D3-1911c and DenV-M R for full length sequencing of the amplified products. Primers were designed in silicousing Oligo Explorer and tried in vitro to check the ability of the primers to produce fragments. The sequencing results showed thatthe amplified product suffered from misincorporation during amplification (98.9% homology). However, the 3-D protein structureprediction did not show any major changes in the protein structure. Further analysis of the expressed protein is required to be usedfor biopharmaceutical purposes.

Kata kunci: Protein amplop, virus dengue strain CH53489, PCR, misinkorporasi, sekuens penuh

PENDAHULUAN

Penyakit demam berdarah Dengue adalah salahsatu penyakit tropis yang berbahaya di dunia terutamadi negara tropis seperti Indonesia. Menurut Guirakhooet al. (2004), paling tidak 40% dari populasi duniaterkena resiko terserang virus dengue. Terdapat 4serotipe virus dengue yang umumnya dijumpai diIndonesia yaitu serotipe 1, 2, 3 dan 4 dimana yangpaling sering dijumpai adalah serotipe 2 dan 3. Adapunsalah satu jenis strain virus dengue serotipe 3 adalahCH53489 dimana strain ini telah dibuktikan positif untukdigunakan dalam bidang kesehatan baik untukkeperluan diagnostik maupun therapeutik.

Virus dengue serotipe 3 strain CH53489 dapatdigunakan sebagai model untuk mendesain vaksin ataukit deteksi dalam rangka menanggulangi wabahpenyakit demam berdarah dengue di Indonesia, karenastrain ini adalah jenis yang paling banyak ditemui untukserotipe 3. Alasan lain adalah meskipun serotipe 2 dan3 umum dijumpai di Indonesia, namun serotipe 3menimbulkan gejala lebih parah. Gejala yang timbulakibat infeksi virus dengue sangat bervariasi mulai darigejala virus nonspesifik sampai kematian. MenurutChaturvedi dan Shrivastava (2004), beberapa faktoryang mempengaruhi derajat keganasan dari demamberdarah dengue adalah jenis serotipe dan strain dari

virus tersebut, usia, status imun dan faktor genetis sipasien. Oleh karena itu, penting bagi penduduk yangtinggal di daerah endemik demam berdarah sepertiIndonesia untuk divaksinasi dengan serotipe yangpaling ganas seperti misalnya serotipe 3.

Di antara semua komponen dari tubuh virus,protein amplop memegang peranan penting dalaminteraksi antara virus dan inangnya. Protein amplopterlibat dalam pengenalan dan penempelan di reseptorpada inangnya selain respons imun (Chang et al., 1995).Dapat disimpulkan bahwa protein amplop merupakanaspek penting dalam vaksinasi. Studi secara lebihmendalam terhadap protein amplop dari virus denguestrain CH53489 di mana gen pengkode protein amplopini dikenal dengan nama gen E. Ini akan sangatmembantu pembuatan vaksin maupun kit diagnostikuntuk menanggulangi wabah penyakit berbahaya ini.Gen E relatif terkonservasi dan terbukti tidak mengalamimutasi sehingga layak dipakai dalam pembuatan vaksindan kit diagnostik.

Salah satu cara untuk memproduksi proteinamplop suatu virus yang akan dipakai sebagai vaksinmaupun alat diagnostik dalam jumlah yang tidakterbatas adalah dengan cara mengekspresikan genpengkode protein tersebut pada organisme lainsehingga proses produksi dapat ditingkatkan jumlah

'Diterima: 03 September 2009 - Disetujui: 08 Januari 2010

167

Djajanegara - Primer-primer Baru untuk Mengamplifikasi Gen Pengkode Protein Amplop Virus Dengue

dan kecepatannya. Beberapa sistem ekspresi heterologyang telah banyak dipakai antara lain adalah ekspresidi bakteri (Escherichia coli), khamir (Pichiapastoris)

dan tembakau (Nicotiana tabaccum) (Julian et al.,

2005). Dalam penelitian ini, gen pengkode proteinamplop dari virus dengue strain CH53489 dicobadiekspresikan di E. coli dengan menggunakan vektorekspresi pMAL-p2x. Akan tetapi, dalam upayamemasukkan gen tersebut ke dalam vektor ekspresi,dua situs restriksi perlu ditambahkan. Salah satu carapenambahan situs restriksi adalah dengan prosesPolymerase Chain Reaction (PCR). Situs restriksiBamHI ditambahkan pada posisi 5' dari primer DenVM-F sedangkan situs restriksi Sail ditambahkan padaposisi 3' dari primer DenVM-R. Namun demikian,penambahan ini membutuhkan proses PCR yang dikenalkurang akurat dalam menginkorporasikan nukleotidasehingga dapat menimbulkan terjadinya mutasi.

Replikasi DNA bukanlah suatu proses yangsempurna dimana DNA polymerase sering melakukanbeberapa kesalahan atau mutasi seperti penambahan,pengurangan atau salah menginkorporasikannukleotida-nukleotida. Laju kesalahan selama prosesreplikasi adalah 1 per 109 nukleotida. Kesalahan inidapat dihindari jika proses replikasi dilakukan secarain vivo karena DNA polymerase yang ada di dalam selmempunyai kemampuan untuk memeriksa danmegganti nukleotida-nukleotida yang menyimpang.Masalahnya Taq Polymerase yang dipakai untukmereplikasi DNA secara in vitro dalam proses PCR tidakmemiliki kemampuan tersebut. Walaupun menggunakanbeberapa Taq Polymerase khusus yang mempunyaikeakuratan tinggi seperti Platinum Taq Polymerase,masih terjadi kemungkinan kesalahan inkorporasi yaitusebesar ll%-57% (Invitrogen, 2005). Mengingatadanya resiko terjadinya mutasi dalam prosesperbanyakan DNA, terutama yang akan dipakai sebagaibahan pengobatan baik secara therapeutik maupundiagnostik, maka sekuensing secara menyeluruh darifragmen DNA hasil perbanyakan melalui proses PCRperlu dilakukan.

Berdasarkan permasalahan di atas, makapenelitian ini dimaksudkan untuk memverifikasikemungkinan terjadinya misinkorporasi pada genpengkode protein amplop dari virus dengue strain

CH53489 (gene E ) yang telah diperbanyak melaluiproses PCR. Hal ini sebagai upaya memasukkan 2 situsrestriksi khusus sehingga dapat dimasukkan ke dalamvektor ekspresi pMAL-p2x. Dampak dari terjadinyamisinkoroporasi selama proses PCR, akan dikaji untukmenentukan seberapa jauh mutasi tersebutmempegaruhi pemakaian gen hasil amplifikasi PCRtersebut yang nantinya digunakan sebagai bahanvaksin atau bahan diagnostik. Proses verifikasidilakukan dengan mendesain beberapa primer spesifikyang dapat dipakai untuk mensekuens secara penuhgen E. Proses desain primer akan dioptimalkan denganmenggunakan beberapa program komputer sepertiOligo Explorer dan Genetyx. Sedangkan analisasekuens untuk melihat persamaan dan perbedaannyadengan sekuen gene E yang ada di GenBank denganmenggunakan program BlastN (www.ncbi.nih.gov)(Robinson, 2005). Hasil dari penelitian ini diharapkandapat menjadi penunjang program pengekspresian genpengkode protein amplop dari virus dengue strainCH53489 (gene E)di E. coli. Protein amplop dari virusdengue strain CH53489 yang diproduksi secara massaltersebut dapat dipakai sebagai bahan vaksin ataupunbahan diagnostik untuk menanggulangi penyakitdemam berdarah dengue.

BAHAN DAN METODESepuluh 10 uL cDNA hasil proses transkripsi

terbalik dari RNA (RT-PCR) virus dengue strainCH53489 didapat dari Departemen Mikrobiologi,Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. cDNAtersebut disimpan di dalam vektor plasmid pBS-SKII(InVitrogen).

Reagen-reagen molekuler yang dipakai dalampenelitian ini antara lain adalah reagen PCR (InVitrogen),Platinum tag polymerase (InVitrogen) dan Qiagen GelPurification Kit (Qiagen). Metode dasar molekulerseperti PCR, electrophoresis DNA dan Big Dye

sequencing dilakukan sesuai metode yang dipakai olehSambrook dan Russel (2001).

Beberapa program komputer yang dipakai dalampenelitian ini antara lain OligoExplorer (MedProbe),Genetyx (Software Development), FastPCR (Universityof Helsinki), ABI 3130 Genetic Analyzer and BLAST

(NCBI).

168


Primer-primer didesain menggunakan programkomputer OligoExplorer dan Genetyx. Primer-primeryang terpilih melalui kedua program tersebutdisimulasikan untuk proses PCR in silico menggunakanprogram komputer FastPCR dalam rangka memeriksaapakah primer-primer tersebut telah menempel di situsyang spesifik pada cetakan DNA dan dapatmenghasilkan fragmen dengan ukuran sesuai prediksi.Primer-primer terpilih kemudian dipakai dalam prosesPCR menggunakan thermal cycler pada kondisi: [94°C- 4 menit, (94°C - 4 menit, 57°C - 30 detik, 72°C -1 menit)X 25 siklus dan 72°C - 20 menit]. Produk PCR yangdidapat kemudian dianalisa dengan menggunakanAgarose gel 1% (w/v), tegangan listrik sebesar 110volt dan pewarnaan Etbr 20 ug/ul. Untuk mengetahuiukuran fragmen, dipakai 1 Kb plus Ladder (InVitrogen)sebagai marker.

cDNA diamplifikasi dengan pasangan primeryang telah ditambahkan situs restriksi khusus padaujung-ujungnya. Hasil amplifikasi pada gel dipotongdan dimurnikan menggunakan Qiagen Gel PurificationKit (Qiagen). Amplikon kemudian disekuens denganprimer-primer yang telah didesain sebelumnya. Hasilsekuens yang didapat dibandingkan dengan sekuengen pengkode protein amplop dari virus Dengue strainCH53489 sequences (gene E) yang ada di GenBankmenggunakan program BlastN (www.ncbi.nih.gov)(Robinson, 2005). Sekuens dari amplikon yang didapatdari proses PCR dan sekuens gene E dari GenBakkemudian ditranslasikan menjadi asam amino danstruktur 3 dimensi. Protein yang didapat disimulasikandan dibandingkan untuk melihat apakah perubahanpada sekuen akibat proses PCR terjadi pada daerah

penting protein amplop virus tersebut. Keadaan ininantinya akan berpengaruh pada aplikasinya baiksebagai vaksin maupun alat diagnostik.

HASIL

Berdasarkan hasil simulasi program-programkomputer yang digunakan, maka didapat 6 primer yangpaling memenuhi syarat untuk mendapatkan sekuensdari gen pengkode protein selubung dari virus denguestrain CH53489 sequences (gene E) secara penuh.Keenam primer tersebut dianalisa dengan program PCRFastPCR (University of Helsinki) terbukti mampumenempel secara spesifik pada cetakan yang akandigunakan sehingga mampu memproduksi satuamplikon spesifik dengan ukuran sesuai prediksi. Tigapasang primer didesain dengan program OligoExplorer

(MedProbe) (DenVM F, d3-1288c & d3-1911c)sedangkan sisanya(d3-1715s, d3-2117s & DenVM R)dengan program Genetyx (Software Development).Daerah target dari sekuensing gen E ini meliputi 1500pasang basa. Keenam primer tersebut disajikan padaTabell.

Proses PCR secara In vitro yang dilakukan,hasilnya dapat dilihat seperti pada Gambar 1. PadaGambar 1, terlihat bahwa pemakaian kombinasi keenamprimer tersebut dapat menghasilkan satu amplikon yangmengindikasikan bahwa keenam primer tersebut dapatmenempel secara spesifik pada cetakan. Lebih lanjut,ukuran dari amplikon yang dihasilkan telah sesuaidengan prediksi hasil analisa dengan programkomputer FastPCR. Berdasarkan hasil tersebut, makakeenam primer tersebut digunakan untuk mensekuensgen target pengkode protein amplop dari virus dengue

Tabel 1. Enam macam primer DNA yang didesain dan berhasil mengamplifikasi fragmen gen pengkode proteinselubung dari virus dengue strain CH53489

No

1

2

3

4

Nama primer

DenVMF (Forward) & d3-1288c(Reverse)DenVMF (Forward) & d3-1911c(Reverse)d3-1715s (Forward) & DenVM R(Reverse)

DenVM R (Reverse) &d3-2117s(Forward)

Susunan basa

5 'TAGAGGATCCGCAATGAGATGCGTGGGAGTAGG-3'(mengandung situs BamHT) & 5'-TTCGCGATGTCACCAAG-3'5'TAGAGGATCCGCAATGAGATGCGTGGGAGTAGG-3'(mengandung situs BamHI)& 5'CTTTGTACTCAACCTTAATGA-3'5'-GCACTGACAGGAGCTACAGA 3' &5' AAGCTTGTCGACGTCAGCTTGTACCACGGCTCC-3'(mengandung situs Sail)5'AAGCTTGTCGACGTCAGCTTGTACCACGGCTCC-3'(mengandung situs Sail) & 5'-CGATTGGGAAGATGTTCGA-3'

Panjang fragmenyang dihasilkan

370 bp

993 bp

715 bp

312 bp

169


300 bp

Gambarl. Amplifikasi dengan proses PCR mengunakan pasangan primer terpilih (M: 1 Kb plus ladder marker; 1:Kontrolnegatif; 2: DenVM F andd3-1288c, 3: DenVMF andd3-191 lc, 4: DenVM R andd3-2117s, 5:DenVMRandd3-1715s)

LZ1

Gambar 2. Struktur 3-D protein hasil translasi DNA melalui proses PCR (a) dan DNA yang ada di GenBank (b)

strain CH53489 sequences (gene E).

Primer-primer terpilih tersebut mampudigunakan untuk proses sekuensing dan menghasilkansekuens berkualitas yang dapat dibaca sampai 400pasang basa.. Hasil sekuensing dengan proses Big

Dye sequencing yang dapat dibaca biasanya sekitar300 pasang basa dimana maksimum pembacaan sekitar400 pasang basa. Situs-situs restriksi BamHI dan Sail

yang diintroduksikan melalui proses PCR dalam rangkamengakomodasi pengklonan ke dalam vektor ekspresipMAL-p2X telah tergabung ke dalam DNA hasilamplifikasi melalui proses PCR (data tidak ditampilkan).Secara keseluruhan terlihat adanya persamaan(homology) sebesar 98.9% karena terdapat sedikitpasangan basa yang berubah atau hilang. Hasilpencocokan di tingkat asam amino mencapai 94% jikadibandingkan dengan sekuens asam amino dari gen

tersebut yang tercatat di GenBank. Terdapat sekitar 6asam amino yang tidak sesuai.

Adapun prediksi struktur 3 dimensi dari DNAhasil PCR dan DNA yang ada di GenBank yangditranslasikan secara simulasi dapat dilihat padaGambar 2.

Data pada Gambar 2 menunjukkan bahwa secaramenyeluruh tidak ada perubahan konformasi daristruktur 3 dimensi dari protein selubung virus Denguestrain CH53489. Namun terlihat adanya perubahanminor pada daerah-daerah yang ditandai denganlingkaran berwarna (Gambar 2).

PEMBAHASAN

Primer-primer dirancang dengan memperhatikanbeberapa faktor antara lain jumlah nukleotida (18-30pasang basa), suhu annealing yang idealnya berkisar

170


antara 45°C - 70°C, kandungan GC pada primer yangidealnya berkisar antara 40% - 65% dan nukleotidaterakhir yaitu G atau C (Sambrook and Russel, 2001).Program komputer OligoExplorer dan Genetyx(Software Development) memberikan output yangcukup lengkap yaitu desain primer beserta semuaspesifikasinya antara lain, suhu leleh (Tm), persen GC,stabilitas ujung 3 ' . Hal ini untuk menghindarikemungkinan primer untuk menempel pada dirinyasendiri (self annealing) dan terjadinya penempelaninternal yang mengakibatkan terbentuknya strukturjepit rambut (hairpin loops). Berdasarkan analisadengan program komputer OligoExplorer (MedProbe)dan Genetyx (Software Development), keenam primertersebut memenuhi persyaratan.

Penambahan situs restriksi adalah satu-satunyacara untuk memungkinkan gen target dapat dimasukkanke dalam verktor ekspresi di Escherichia coli yaitupMAL-p2x (New England Biolabs). Hal ini dikarenakantidak ada vektor lain yang dapat dipakai untukmengambil kedua situs tersebut dengan posisi BamHI

pada ujung 5' and Sail pada ujung 3 ' . Kedua situs inidipilih karena keduanya berada pada situs multi kloningdari vektor ekspresi pMAL-p2x. Dengan demikian,menempatkan BamHI di ujung 5' dan Sail di ujung 3'maka gen target dapat diekspresikan dengan orientasiyang benar. Alasan lainya adalah kedua situs tersebuttidak dijumpai pada gen target sehingga pemotongandenga kedua situs tersebut tidak akan menganggukeutuhan dari gen target. Adapun alasan terakhir adalahpenambahan ekstra nukleotida tidak akanmempengaruhi proses annealing sebuah primer (Saiki,1992).

Primer-primer yang telah didesain tersebutdipasang-pasangkan. Kombinasi pasangan primertersebut dianalisa secara simulasi menggunakanprogram komputer FastPCR untuk memprediksi besarfragmen yang dihasilkan jika proses PCR dilakukan.Berdasarkan analisa program komputer FastPCR,

pasangan primer DenVM F dengan d3-1288c akanmenghasilkan sebuah fragmen sebesar 370 bp,pasangan primer DenVM F dengan d3-1911c akanmenghasilkan sebuah fragmen sebesar 993 bp,pasangan primer DenVM R dengan d3-1715s akanmenghasilkan sebuah fragmen sebesar 715 bp dan

pasangan primer DenVM R dengan d3-2117s akanmenghasilkan sebuah fragmen sebesar 312 bp.Kesemua kombinasi tersebut dapat mengakomodasisekuensing secara penuh dari gen target (Robinson,2005).

Gambar 1 menunjukkan bahwa kesemua primerdapat menempel secara spesifik pada cetakan DNAsehingga tidak dijumpai adanya pita-pta tambahansebagai indikasi ketidak-spesifikan primer tersebut.Data pada Gambar 1 menunjukkan amplikon denganpanjang sesuai prediksi yang mengkonfirmasikan hasilsimulasi dengan program komputer FastPCR. Secarateoritis, maka primer-primer ini dapat dipakai untukmendapatkan sekuens secara penuh dan dapat puladigunakan untuk menghasilkan sekuen dengan kualitasbaik yang dapat terbaca hingga 400 bp. Kombinasipasangan primer-primer internal ini nantinya juga akanberguna untuk mengambil daerah di dalam gen targetyang bersifat immunogenik. Hal ini akan sangatmembantu penelitian lanjutan berupa pemetaan epitopedari protein amplop virus Dengue serotipe 3 strainCH53489.

Analisa kecocokan pada tingkat nukleotidamenunjukkan terjadinya peristiwa misinkoroporasinukleotida-nukleotida selama proses PCR berlangsung.Hal ini agak mengejutkan karena walaupunmenggunakan Platinum Taq Polymerase yangmempunyai akurasi tinggi masih saja terjadi mutasi.Sebagai akibatnya kecocokan di tingkat nukleotidahanya mencapai 98.9% dan di tingkat asam amino 94%.Terdapat dua kemungkinan yang dapat menyebabkanterjadinya fenomena ini. Pertama adalah telah terjadimutasi pada RNA virus Dengue yang dikoleksi dilapang sebelum RNA tersebut diubah menjadi cDNAmelalui proses transkripsi terbalik. Laju mutasi padavirus sangat tinggi terutama virus yang mempunyaiRNA sebagai materi genetik seperti virus Dengue(Chang et. al, 1995). Kedua adalah kemungkinanterjadi misinkorporasi walaupun menggunakan enzimTaq Polymerase yang mempunyai keakuratan tinggiseperti Platinum Taq Polymerase. Penggunakan enzimPlatinum Taq Polymerase meningkatkan akurasisebanyak 6 kali lipat jika dipakai untuk mengamplifikasiDNA dengan ukuran 1.0-1.5 kb. Namun demikian,polymerase ini masih mempunyai kemungkinan

171


misinkorporasi sebesar 11-57% (Stratagene, 2004).Gambar 2 menunjukkan bahwa secara

keseluruhan struktur 3 dimensi dari protein hasiltranslasi dari gen yang diperbanyak melalui PCR hanyamengalami perubahan minor. Sebagai tambahan,Gambar 2 juga menunjukkan bahwa konformasi proteintidak berubah. Menurut Klug and Cummings (1994),perubahan asam amino akibat substitusi nukleotidadapat ditolerir pada kondisi sebagai berikut 1)Substitusi nukleotida tidak mengubah asam amino yangdikodekan, 2) Apabila asam amino berubah, makaperubahan yang terjadi tidak pada situs aktif proteintersebut, dan 3) Apabila asam amino berubah, makaperubahan yang terjadi tidak mempegaruhi fungsiprotein tersebut.

Berdasarkan hasil penelitian ini, protein hasiltranslasi gen pengkode protein amplop dari virusdengue strain CH53489 yang diperbanyak melaluiproses PCR hanya mengalami perubahan minor tanpamengubah konformasinya. Produk amplifikasi tersebutdapat diekspresikan ke dalam vektor ekspresi pMAL-p2x. Meskipun demikian masih dibutuhkan studilanjutan mengenai daerah-daerah immunogenik darigen tersebut secara lebih mendalam jika akan dipakaidalam produksi vaksin.

KESEMPULANEnam primer hasil desain menggunakan program

komputer OligoExplorer (MedProbe) dan Genetyx

(Software Development) terbukti mampumengamplifikasi dan mensekuen gen pengkode Proteinamplop dari virus dengue strain CH53489 (gene E) yangtelah diperbanyak melalui proses PCR.

DAFTARPUSTAKAChang GJ, BC Cropp, RM Kinney, DW Trent and DJ

Gubler. 1995. Nucleotide sequence variation of theenvelope protein gene identifies two distinct genotypesof yellow fever virus. Journal of Virology 69(9), 5773-5780.

Chaturvedi UC and R Shrivastava. 2004. uenguthaemorrhagic fever: A global challenge. Indian Journalof Medical Microbiology 22(1), 5-6.

Guirakhoo F, Z Zhang, G Myers, BW Johnson, KPugachev, R Nichols, N Brown, I Levenbook, KDraper, S Cyrek, J Lang, C Fournier, B Barrere.S Delagrave and TP Monath. 2004. A single aminoacid substitution in the envelope protein of chimericyellow fever-dengue 1 vaccine virus reducesneurovirulence for suckling mice and viremia/viscerotropism for monkeys. Journal of Virology78(18), 9998-10008.

Gyllensten U. 1992. Direct sequencing of in vitro amplifiedDNA. In: HA Erlich (Ed.) PCR technology: Principlesand Aplications for DNA Amplification, 45-60. WHFreeman and company, New York.

Invitrogen. 2005. Platinum* Taq DNA Polymerase HighFidelity. Product Manual. USA.

Julian K-CMa, E Barros, R Bock, P Christou P, PJ Dale,PJ Dix, R Fischer, J Irwin, R Mahoney, MPezzotti, S Schillberg, P Sparrow, E Stoger andRM Twyman. 2005. Molecular farming for new drugsand vaccines: Current perspectives on the productionof Pharmaceuticals in transgenic plants. EMBO Reports6(7), 593-599.

Klug WS and MR Cummings. 1994 Concept of Genetics,15-35. 4lh ed. Prentice Hall, New York.

Robinson AJ, CG Love, J Batley, G Barker and DEdwards,D. 2005. Simple sequence repeat markerloci discovery using SSR primer. Bioinformatics, 20,1475-1476.

Russell PJ. 1994. Fundamentals of Genetics, 79-87. HarperCollins College Publishers, New York.

Saiki RK. 1992. The design and optimation of the PCR. In:HA Erlich (Ed.) PCR technology: Principles andAplications for DNA Amplification, 7-16. WH Freemanand company, New York.

Sambrook J and DW Russell. 2001. Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed, 256-287. Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York.

Stratagene. 2004. Easy-A™ high-fidelity PCR cloningenzyme and master mix. Technical Profile, 35-59. LaJolla, USA.

172

surat keputusan ketua lipi - e-journal.biologi.lipi.go.id

Documents