studi in vitro dan in silico citrulline sebagai agen …repository.ump.ac.id/2722/1/siti komerawati,...

1

STUDI IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE

SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN

PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D

SKRIPSI

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

Mencapai Derajat Sarjana S-1

Diajukan oleh:

Siti Komerawati

1008010048

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

PURWOKERTO

2014

STUDI IN VITRO DAN…, Siti Komerawati, Fakultas Farmasi UMP, 2014

2

ii


3

iii


4

iv


5

INTISARI

SITI KOMERAWATI. Studi in vitro dan in silico Citrulline Sebagai Agen

Kokemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Payudara T47D

Di Bawah Bimbingan Nunuk Aries Nurulita Dan Asmiyenti Djaliasrin Djalil.

Latar Belakang: Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang

mempunyai prevalensi cukup tinggi. Terapi kanker payudara menggunakan agen

kemoterapi seperti doxorubicin masih banyak digunakan. Tetapi doxorubicin

memiliki efek samping yang serius seperti kardiotoksik. Pemilihan kemoterapi

kombinasi mempunyai pengaruh yang penting pada luaran terapi pada pasien

kanker payudara. Citrulline berpotensi sebagai agen kemopreventif kanker. NO

(Nitric Oxide) dapat mengaktivasi soluble Guanylyl Cyclase yang kemudian

menyebabkan vasodilatasi.

Tujuan penelitian: Penelitian ini bertujuan untuk menentukan efek sitotoksik

dari citrulline tunggal maupun yang di kombinasikan dengan doxorubicin,

mengetahui potensi antikanker citrulline dalam menginduksi kematian sel secara

apoptosis, serta memberikan gambaran interaksi antara citrulline dengan protein

soluble Guanylyl Cyclase secara in silico.

Metode Penelitian: Uji sitotoksik tunggal menggunakan metode MTT.

Konsentrasi larutan citrulline yang sebesar 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25 µM, 20

µM, 10 µM, 5 µM, dan 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 25

nM. Sedangkan konsentrasi uji sitotoksik kombinasi sebesar 100 nM, 50 nM, 25

nM, 12,5 nM untuk doxorubicin, dan 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM untuk

citrulline. Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode double staining.

Sedangkan uji docking dilakukan dengan metode PLANTS.

Hasil: Citrulline tidak memiliki efek sitotoksik pada masa inkubasi 24 jam. Nilai

IC50 tidak dapat dihitung. Uji apoptosis menunjukkan adanya mekanisme

kematian sel secara apoptosis. Uji docking dilakukan dengan metode PLANTS dan

diperoleh hasil berupa best score. Best score menyatakan energi interaksi. Energi

interaksi protein soluble Guanylyl Cyclase dengan ligannya adalah -171,808.

Sedangkan energi interaksi protein soluble Guanylyl Cyclase dengan citrulline

adalah -71,1463.

Kesimpulan: Citrulline tidak mempunyai potensi sitotoksik terhadap sel kanker

payudara T47D. Ikatan citrulline dengan protein soluble Guanylyl Cyclase tidak

lebih kuat dibandingkan dengan ligannya.

Kata kunci : citrulline, doxorubicin, soluble Guanylyl Cyclase, kanker payudara,

kokemoterapi, sel T47D, docking, PLANTS

v


6

ABSTRACT

Background: Breast cancer is one type of cancer that has a high enough

prevalence. Breast cancer therapy using chemotherapeutic agents such as

doxorubicin are still widely used. However doxorubicin has serious side effects

such as cardiotoxic. Selection of combination chemotherapy has an important

influence on the outcome of therapy in patients with breast cancer. Citrulline has

a potential cancer chemopreventive agent. NO (Nitric Oxide) can activates

soluble Guanylyl Cyclase which can cause vasodilatation.

Objective: To determine the cytotoxic effects of a single citrulline and

combination with doxorubicin, to determine the potential anticancer citrulline in

inducing apoptotic cell death, to determine of the interaction between the protein

soluble Guanylyl Cyclase by in silico.

Methods: Cytotoxic effect by using MTT method. Solution concentration of

citrulline by 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, and 1000 nM,

750 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM. While the solution

concentration to combination by 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM for

doxorubicin, and 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM for citrulline. Apoptosis effect

by using double staining method. While docking test was conducted using

PLANTS.

Results: Citrulline has nothing cytotoxic effect in the incubation period of 24

hours. IC50 value could not be calculated. Apoptosis experiment showed

induction of apoptotic cell death. Docking experiment was conducted using

PLANTS and resulted in the best score obtained. Best score is interaction energy.

Interaction energy of soluble Guanylyl Cyclase protein with the ligand is -

171,808. While the energy of of soluble Guanylyl Cyclase protein with citrulline

is -71,146.

Conclusion: Citrulline has nothing the potential cytotoxic effect to T47D breast

cancer cells. Citrulline binding with soluble Guanylyl Cyclase protein is not

stronger than the ligand.

Key word : citrulline, doxorubicin, soluble Guanylyl Cyclase, breast cancer,

T47D cells, co-chemotherapy, docking, PLANTS

vi


7

MOTTO

Hidup adalah perjuangan.

Menjalani hidup berarti mensyukuri nikmat yang telah Allah SWT

berikan kepada kita.

Pilihannya adalah berjuanglah sekarang atau tidak sama sekali.

Berani mencoba itu lebih baik daripada tidak pernah berbuat.

Dan jika takut akan membuat kesalahan, maka jangan pernah

melakukan apa-apa.

vii


8

PERSEMBAHAN

Bismillahirrahmanirahim............

Dengan mengucapkan syukur Alhamdulillah, Maha suci Allah yang telah

melimpahkan rahmat dan ridha-Nya kepada setiap hamba-hambanya yang slalu bersyukur.

Kupersembahkan karya ku ini untuk kalian semua, orang-orang yang aku sayang:

Bapak dan mamahku tercinta, kalian adalah motivator terbesar dalam hidupku yang tak

pernah jemu mendo’akan dan menyayangiku, atas semua pengorbanan, nasehat dan

kesabarannya mengantarkanku sampai di ujung perjuanganku ini. Tak pernah cukup

aku membalas sayang dan cinta kalian,

Adikku tersayang, Sri Rahayu Astuti yang slalu mendo’akan kakakmu ini untuk menjadi

orang yang sukses dengan terus memberikanku semangat, dan slalu mengingatkanku

untuk segera menyelesaikan skripsiku ini,

Teruntuk sahabat-sahabatku : Agustina Olivia, Vinie Triana, Rulfita Oka, Ari

Ardiansyah, Adi Wibowo, dan Helmy yang selalu menghibur dan memberikan

dukungan untuk terus berjuang sampai saat ini. Terimakasih karena kalian telah

memberiku banyak arti tentang kehidupan,

Teruntuk mba lusi dan mba rista, terimakasih telah memberiku arahan dan nasehat,

Teruntuk Alembana Latera L, terimakasih karena telah mendukungku dalam meraih apa

yang aku impikan,

Teman-teman kosku, Linda, maya dan okta yang telah mendukungku untuk terus

berjuang. Tetap semangat untuk kalian,

Almamaterku Universitas Muhammadiyah Purwokerto.


9

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat,

hidayah serta inayahNya, sehingga dapat menyelesaikan penelitian skripsi yang

berjudul “STUDI IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE SEBAGAI AGEN

KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA

T47D”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh gelar S1 di

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak

dapat menyelesaikan tugas ini dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini

penulis mengucapkan terima kasih kepada :

• Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah

Purwokerto

• Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen

pembimbing I yang telah memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam

penyusunan skripsi.

• Dr. Asmiyenti Djaliasrin Djalil, M.Si. selaku dosen pembimbing II yang telah

memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi.

• Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga

dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi.

• Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan

perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis sehingga penulis dapat

memahami tentang penelitian ini.

• Ibu Rumbiwati yang telah membimbing dan membantu jalannya penelitian.

• Kedua orang tua dan adikku yang telah memberikan dukungan moral, material

dan spiritual.

• Agustina Olivia Nezar dan Latifah yang telah berjuang bersama, terimakasih atas

kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian berlangsung.

• Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu.

viii

ix STUDI IN VITRO DAN…, Siti Komerawati, Fakultas Farmasi UMP, 2014

10

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari kata

sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang

membangun demi perbaikan penelitian di masa mendatang.

Semoga Allah SWT senantiasa membalas amal baik yang telah

Bapak/Ibu/Saudara berikan, dan harapan penulis semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi penulis sendiri pada khususnya dan bagi semua pihak yang

membutuhkan..

Purwokerto, 21 Maret 2013

Penulis

SITI KOMERAWATI

x


11

RIWAYAT HIDUP

Nama : Siti Komerawati

Tempat, Tanggal Lahir : Indramayu, 01 Mei 1991

Nama Orang Tua:

a. Ayah : Talim

b. Ibu : Rasminah

Riwayat Pendidikan :

a. TK : TK Jangkar Emas tahun 1996 - 1997

b. Sekolah Dasar : SD Negeri Bulak 1 tahun 1997 - 2003

c. Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 1 Kandanghaur tahun 2003 – 2006

d. Sekolah Menengah Atas : SMK Farmasi Yasinda Indramayu tahun 2006 –

2009

e. Perguruan Tinggi : Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah

Purwokerto

xi


12

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN ........................................................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii

SURAT PERNYATAAN ................................................................................ iv

INTISARI ........................................................................................................ v

ABSTRAK ...................................................................................................... vi

MOTTO .......................................................................................................... vii

PERSEMBAHAN ........................................................................................... viii

PRAKATA ...................................................................................................... ix

RIWAYAT HIDUP ......................................................................................... x

DAFTAR ISI ................................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xvi

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................ xvii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Permasalahan ........................................................ 1

B. Rumusan Masalah .......................................................................... 2

C. Tujuan Penelitian ........................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian ......................................................................... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Kanker Payudara ............................................................................ 4

B. Sel T47D ........................................................................................ 5

C. Kokemoterapi ................................................................................. 6

D. Doxorubicin ................................................................................... 8

E. Citrulline ......................................................................................... 10

F. soluble Guanylyl Cyclase ................................................................ 12

G. Metode Docking ............................................................................. 14

xii


13

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ..................................................... 15

B. Variabel Penelitian ......................................................................... 15

C. Definisi Variabel Operasional ........................................................ 15

D. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 16

E. Bahan dan Alat ............................................................................... 16

1. Bahan ........................................................................................ 16

a. Bahan Utama ....................................................................... 16

b. Agen Kemoterapi ................................................................ 16

c. Sel T47D cell line ............................................................... 16

d. Bahan Uji Sitotoksisitas ...................................................... 16

e. Bahan Uji Apoptosis ........................................................... 17

f. Bahan Docking Molekuler .................................................. 17

2. Alat ........................................................................................... 18

F. Cara Penelitian ................................................................................ 18

1. Pembuatan Larutan Uji ............................................................. 18

2. Uji Sitotoksisitas Tunggal ........................................................ 18

3. Uji Sitotoksisitas Kombinasi .................................................... 19

4. Uji Apoptosis ............................................................................ 19

5. Uji Docking .............................................................................. 20

G. Analisis Hasil .................................................................................. 20

a. Uji Sitotoksisitas Tunggal ........................................................ 20

b. Uji Sitotoksisitas Kombinasi .................................................... 20

c. Analisis Apoptosis .................................................................... 21

d. Analisis Docking ...................................................................... 21

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Uji Sitotoksik Tunggal Citrulline dan Doxorubicin

terhadap Sel Kanker Payudara T47D ........................................... 22

B. Hasil Uji Sitotoksik Kombinasi Citrulline dan Doxorubicin

terhadap Sel Kanker Payudara T47D ........................................... 29

xiii


14

C. Hasil Uji Apoptosis Citrulline dan Doxorubicin terhadap Sel

Kanker Payudara T47D ................................................................ 32

D. Hasil Uji Docking Molekular Citrulline dengan Protein Soluble

Guanylyl Cyclase ......................................................................... 34

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan .................................................................................... 37

B. Saran ............................................................................................... 37

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 38

LAMPIRAN .................................................................................................... 43

xiv


15

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Struktur protein untuk docking ....................................................... 17

Tabel 2. Persen viabilitas sel pada perlakuan citrulline tunggal .................. 27

Tabel 3. Persen viabilitas sel pada perlakuan doxorubicin tunggal .............. 27

Tabel 4. Persen viabilitas sel pada perlakuan Kombinasi citrulline dan

doxorubicin ..................................................................................... 30

Tabel 5 Score docking terhadap soluble guanylyl cyclase .......................... 36

xv


16

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Siklus Sel .......................................................................................... 4

Gambar 2. Morfologi sel T47D yang di peroleh dari situs ATCC .................... 6

Gambar 3. Struktur Doxorubicin ....................................................................... 8

Gambar 4. Struktur Citruline ........................................................................... 10

Gambar 5. Jalur NO dalam menstimulasi soluble Guanylyl Cyclase ............. 11

Gambar 6. Mekanisme NO dalam soluble Guanylyl Cyclase

smooth muscle relaxation ............................................................... 13

Gambar 7. Usulan mekanisme peran siklus L-Citrulline/L-Arginine

dalam regulasi fungsi saluran pernafasan ...................................... 13

Gambar 8. Morfologi sel T47D yang digunakan

pada laboratorium parasitologi FK UGM ...................................... 23

Gambar 9. Morfologi sel pada perlakuan citrulline dan doxorubicin pada

konsentrasi rendah dan tinggi ……………………………............ 25

Gambar 10. Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase

di dalam mitokondria menghasilkan kristal formazan ................... 26

Gambar 11. Hubungan persen viabilitas doxorubicin dengan

citrulline tunggal ........................................................................... 28

Gambar 12. Morfologi sel pada perlakuan kombinasi

doxorubicin dan citrulline ……..…………………………............ 30

Gambar 13. Hubungan persen viabilitas doxorubicin dengan

citrulline kombinasi ....................................................................... 31

Gambar 14. Seri Konsentrasi Doxorubicin dan Kombinasi

Doxorubicin dan Citrulline untuk uji t............................................. 33

Gambar 15. Foto Apoptosis ………………………............................................ 35

Gambar 16. Protein soluble Guanylyl Cyclase ……........................................... 36

xvi


17

DAFTAR SINGKATAN

FBS (Fetal Bovine Serum)

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

DMSO (Dimethyl Sulfoxide)

MTT {(3-(4,5-dimethylthyazoyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide)

PBS (Phosphate Buffered Saline)

DMEM (Dulbecco’s Modified Ecgle Medium)

SDS (Sodium Duodecyl Sulphate)

xvii


18

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Cara kerja skematis ................................................................... 44

Lampiran 2. Perhitungan seri konsentrasi pertama untuk uji sitotoksik

tunggal ....................................................................................... 45

Lampiran 3. Perhitungan seri konsentrasi kedua untuk uji sitotoksik

tunggal ....................................................................................... 48

Lampiran 4. Perhitungan seri konsentrasi untuk uji sitotoksik kombinasi ..... 51

Lampiran 5. Perhitungan persen viabilitas uji sitotoksik tunggal

konsentrasi pertama .................................................................... 53

Lampiran 6. Pemetaan dan hasil absorbansi uji sitotoksik tunggal seri

konsentrasi pertama .................................................................... 55

Lampiran 7. Pemetaan dan hasil absorbansi uji sitotoksik tunggal seri

konsentrasi kedua ....................................................................... 56

Lampiran 8. Pemetaan dan hasil absorbansi uji sitotoksik kombinasi ........... 57

Lampiran 9. Hasil perhitungan IC50 pada uji sitotoksik tunggal seri

konsentrasi kedua ....................................................................... 59

Lampiran 10. Hasil Uji T tak berpasangan ....................................................... 63

Lampiran 11. Hasil uji sitotoksik tunggal seri konsentrasi pertama

doxorubicin dan citrulline .......................................................... 65

xviii


studi in vitro dan in silico citrulline sebagai agen …repository.ump.ac.id/2722/1/siti komerawati,...

Documents