Deteksi Streptococcus pyogenes dengan PCR 1Jurnal Natur Indonesia 6 (1): 1-4 (2003)ISSN 1410-9379

PENDAHULUANTeknik sintesis dan amplifikasi fragmen DNA

secara in vitro yang dikenal dengan Polymerase chainreaction (PCR) merupakan salah satu metode untukmengidentifikasi penyakit infeksi yang baru-baru inibanyak dikembangkan. Metode ini digunakan untukmengatasi kelemahan metode diagnosis konvensionalseperti imunologi dan mikrobiologi. Patogen memilikiwaktu generasi lama dan tidak dapat dibiakkan secarain vitro atau patogen yang mirip dengan flora normalsulit untuk dideteksi dengan cara mikrobiologi biasa.Sedangkan titer antibodi tinggi tidak selamanyaberbanding lurus dengan adanya infeksi aktif(Retnoningrum 1997; Madigan et al, 1997).

Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmenDNA spesifik dimana terjadi penggandaan jumlahmolekul DNA pada setiap siklusnya secaraeksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknikini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengancepat dan akurat. Secara umum proses ini dapatdikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitudenaturasi templat, annealing (penempelan) pasanganprimer pada untai tunggal DNA target dan extension(pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperolehamplifikasi DNA antara 106-109 kali (Watson et al, 1992;Retnoningrum 1997).

Pada penelitian ini telah dipilih bakteri patogenStreptococcus pyogenes untuk dideteksi menggunakanPCR karena kelompok protein M yang terdapat pada

permukaan bakteri ini mempunyai sifat antigen danukuran bervariasi sehingga memberikan sistem modelyang menarik dalam mempelajari evaluasi genetik(Holligshead et al, 1986). Penelitian ini bertujuan untukmengisolasi kromosom bakteri patogen Streptococcuspyogenes galur UAB200 (serotipe M6), CS24 (serotipeM12) dan M24 (serotipe M24), amplifikasi gen targetdengan teknik PCR menggunakan kromosom sebagaitemplat, dan produk PCR dideteksi dengan metodeelektroforesis agarosa.

BAHAN DAN METODEBakteri. Kultur beku Streptococcus pyogenes

galur UAB200, CS24 dan M24, E coli DH 5α danPseudomonas aeruginosa galur PAO sebagai kontroldiperoleh dari PPAU-Bioteknologi ITB Bandung.Sebagai kontrol positif digunakan plasmid pD3 yangmerupakan plasmid rekombinan dengan gen emm 12sebagai sisipannya dan Streptococcus spp. galur B7.

Media dan Bahan Kimia. Blood agar plate dariBiofarma; media cair TSB (Tryptic Soy Broth); buferTris-HC1 10 mM pH 7,6 EDTA 1 mM, SDS 10%; larutanfenol: kloroform (1:1); natrium asetat 3 M; agarosa(Promega Corporation, Madison, USA); TAE 50x (242gr Tris base, 57,1 ml asam asetat glacial, 100 ml 0,5M EDTA pH 8 dalam 1 liter aquades); etidium bromida(10mg/ml); loading buffer (0,25% bromofenol biru 0,25%xylene cyanol F.F, 15% ficol); larutan standar DNA yangdirestriksi dengan l µM (urutan nukleotida 5' GCC GCC

Deteksi Bakteri Patogen Streptococcus pyogenesdengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Chainulfiffah Abdullah1, Debbie S Retnoningrum2

1Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Riau, Pekanbaru 282932Departemen Kimia, Institut Teknologi Bandung, Bandung, 40132

Diterima 17-06-2003 Disetujui 05-08-5003

ABSTRACTDetection of the pathogenic bacteria Streptococcus pyogenes was carried out by Polymerase Chain Reaction(PCR) technique using chromosomes species of UAB200, CS24, and M24 as templates. These three chromosomeswere successfully isolated by use of the second Bollet lysis method. Prior to lysis with microwave, additionaltreatments such as washing with sterile distilled water and freeze-thaw were performed. The amplification productof species UAB200, CS24, and M24 as templates with PCR using 30 cycles was detected by electrophoresisagarose gel using marker ladder 100pb and marker λλλλλHindIII as standard. The results obtained were as followsGenes emm6 and emm12 had 1495pb and 1700pb in length, respectively. The length of these two genes wereapproximately the same as those in the published data (1452pb for gene emm6 and 1693pb for gen emm12). Datafrom literature indicated that the length of gene emm24 is 1617pb. Unfortunately, an attempt to amplify geneemm24 failed.

Keywords: Polymerase Chain Reaction, Streptococcus pyogenes

2 Jurnal Natur Indonesia 6 (1): 1-4 (2003) Abdullah & Retnoningrum.

GGA TCC AAT AAG GAC CAT AAA AAT GGC T 3'(urutan nukleotida yang digaris bawahi adalah sisipengenalan enzim restriksi BamHI); reverse primer 25µM (urutan nukleotida 5' GAT GGA ATT C GTC GACTTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG AGC TTT GTT TTCTTC TTT GCG 3' (urutan nukleotida yang digaris bawahipertama kali adalah sisi pengenalan enzim restriksiEcoRI, yang kedua adalah sisi pengenalan enzimrestriksi Sa/I dan yang ketiga adalah mengkodepolihistidin); Taq DNA polimerase (Pharmacia, Biotech,USA) 5 U/µl; bufer PCR 1x yang diencerkan dari buferPCR 10 x (KCI 500 mM, Tris HCI 100 mM pH 8,3 padatemperatur kamar, MgC12 15 mM, gelatin 0,1% (b/v));dNTP 200µM; aquabides steril dan minyak mineral.

Isolasi kromosom Streptococcus pyogenes.Bakteri dari kultur beku digoreskan pada permukaanplat agar darah steril, dan diinkubasi pada suhu 370Cselama satu malam. Koloni tunggal Streptococuspyogenes diinokulasi dalam 1,5 ml media cair TSB dandiinkubasi selama 6 jam pada suhu 370C tanpapengocokan. Kultur kemudian dipindahkan ke dalam15 ml media cair TSB dan diinkubasi semalam padasuhu 370C. Kultur disentrifugasi pada 8.000 rpm selama15 menit. Supernatan dibuang dan endapandiresuspensi dalam 400 µl bufer TE, kemudiandisentrifugasi pada 6.000 rpm selama 10 menit.Endapan diresuspensi dalam 200 µl bufer TE dan 125µl larutan SDS 10%, kemudian diinkubasi pada suhu650C selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi pada6.000 rpm selama 10 menit. Endapan diresuspensidalam sisa supernatan yang hanya tinggal beberapamikro liter (lisis cara pertama). Suspensi sel inidipanaskan pada oven microwave 600 W selama 5 x 1menit atau lebih sampai lisis. Pada lisis cara keduaterdapat penambahan perlakuan, yaitu campuransuspensi dicuci dengan aquades steril 3x untukmencegah terkontaminasi DNA oleh SDS. Suspensisel yang telah dicuci tersebut dibekukan padatemperatur –70oC kemudian dicairkan (freeze-thaw).Perlakuan ini diulang dua kali, baru dipanaskan denganoven microwave 600 W selama 5 x 1 menit atau lebihsampai lisis. Tahap pemanasan diselingi dengan tahapinkubasi di dalam es selama 1 sampai 2 menit. 400 µlbufer TE ditambahkan dan disuspensikan denganmerata, kemudian disentrifugasi pada 6.000 rpmselama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalamtabung baru, diekstraksi dengan 400 µl fenol: chloroform(1:1), kemudian disentrifugasi. Supernatan diambil,ditambahkan natrium asetat 3M sebanyak 1/10 volume

supernatan, dan etanol absolut, lalu diinkubasi padasuhu –200C selama satu malam. Campurandisentrifugasi 6.000 rpm selama 10 menit. Endapandicuci dengan 1 ml etanol 70%, disentrifugasi 6.000rpm selama 10 menit, endapan dikeringkan padatemperatur ruang, kemudian tambahkan 25 µlaquabides. Larutan DNA 5 µl dielektroforesis padaagarosa 1% yang mengandung larutan etidium bromidadan marker standar λ Hind III.

Penyiapan gel agarosa. Agarosa 1% dan 1,5% dibuat dalam bufer 1x TAE, didinginkan sampai suhu600C, kemudian ditambahkan 1 µl larutan etidiumbromida (10 mg/ml), lalu diaduk. Larutan agardituangkan kedalam plat. Kemudian ditambahkan 10µl sample DNA dicampur dengan 2 µl loading bufferdimasukkan kedalam sumur. Marker DNA yangukurannya diketahui (λ n film kecepatan tinggi.

Amplifikasi gen emm6, emm12, dan emm24Streptococcus pyogenes. Amplifikasi dilakukandengan kondisi larutan PCR sebagai berikut.Konsentrasi akhir dNTP 0,2 mM, bufer PCR 1x (KCl 50mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3) Taq Polimerase 2,5 U/100 µl, primer 0,5 µM, MgCl2 25 mM, volume PCR 100µl.

Amplifikasi dilakukan dengan denaturasi awal 950C1 menit, 30x siklus, denaturasi 940C 1 menit, tahappenempelan 550C 1 menit, tahap polimerisasi 720C 1menit dan pemantapan 720C 4 menit denganmenggunakan PCR (Perkin Elmer DNA thermal cycler).

Produk PCR yang didapat dideteksi denganelektroforesis agarosa. Pita-pita yang terbentuk padagel agarosa dideteksi menggunakan transiluminatorultra violet dan selanjutnya difoto dengan film 3300ASA.

HASIL DAN PEMBAHASANIsolasi Kromosom Bakteri Patogen

Streptococcus pyogenes galur UAB200, CS24 danM24. Streptococcus pyogenes adalah bakteri grampositif yang mempunyai dinding sel tebal sehinggasukar untuk dilisis. Untuk itu lisis dilakukan dengandua cara yaitu dengan metode Bollet (Kaufhold et al,1994) dan dengan tambahan perlakuan 3 kali prosescair-beku kemudian baru dilisis dengan microwave.Ternyata dengan penambahan tahap pencucian denganaquades steril dan tahap freeze-thaw, didapatkanjumlah kromosom yang lebih banyak. DNA hasil isolasikromosom dengan metode Bollet, dipresipitasi denganetanol dengan tujuan untuk pemekatan sekaligus

Deteksi Streptococcus pyogenes dengan PCR 3

pemurnian kromosom. Endapan pelet putih dilarutkandalam 25 µl aquabides steril. Larutan diuji keberadaanDNA-nya dengan elektroforesis agarosa.

Pada lisis kromosom cara pertama (metodeBollet) data elektroforesis menunjukan bahwa padasupernatan terdapat kromosom galur UAB200, CS24dan M24 (Gambar 1a). Sedangkan pada endapannyatidak dijumpai kromosomnya (data tidak ditunjukkan).Ini mungkin disebabkan karena konsentrasikromosomnya relatif rendah sehingga tidak dapat

meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jikakonsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCRakan rendah.

PCR dapat dilakukan walaupun hanyamenggunakan sampel tanpa isolasi DNA, tetapi DNAtemplat yang dipersiapkan pada percobaanmengandung SDS dan deterjen yang menghambat

(a) (b)

mengendap. Untuk mendapatkan jumlah kromosomyang banyak digunakan lisis cara kedua. Cara ini lebihbaik, hasilnya dapat dilihat pada Gambar 1b.

Amplifikasi Gen emm6, emm12 dan emm24dengan Teknik PCR menggunakan Kromosomsebagai Templat. Setelah diperoleh kromosom darigalur UAB200, CS24 dan M24, maka kromosom inidigunakan sebagai templat untuk mengamplifikasi genemm6, emm12 dan emm24 dengan teknik PCR.Sebagai kontrol negatif digunakan kromosom P.aeruginosa PAO, E.coli DH5α, Streptococcus spp.B7dan aquabides steril. Sebagai kontrol positif digunakanplasmid pD3 yang telah direstriksi dengan EcoRI.

Enzim Taq polimerase ditambahkanmenggunakan teknik hot-start. Hal ini untuk mencegahterjadinya penempelan primer pada temperatur rendah.Penempelan primer yang terjadi pada temperaturrendah tidak spesifik sehingga akan menghasilkanamplifikasi dengan spesifisitas rendah. Spesifisitasrendah juga menurunkan sensitifitas karena adanyakompetisi antara produk spesifik dan nonspesifik(Retnoningrum 1997). Primer yang digunakan adalah0,5 µM, karena jika konsentrasi primer terlalu tinggidapat terjadi mispriming yang mengakibatkan

enzim Taq DNA polimerase sehingga dapat menurunkanefisiensi PCR. Untuk itu perlu dilakukan presipitasidengan etanol sekaligus untuk pemekatan kromosom.

Deteksi Produk PCR dengan MetodeElektroforesis Agarosa. Hasil elektroforesis produkamplifikasi PCR sebanyak 30 siklus melalui tiga tahapyaitu denaturasi, penempelan dan polimerisasi dapatdilihat pada Gambar 2, 3 dan 4.

Gambar 3. Hasil elektroforesis produk amplifikasi gen emm6, gen emm12, dan kontrol negatif: 1. Marker Ladder 100 pb,

2. Produk PCR gen emm6, 3. Produk PCR gen emm12, 4. Kontrol negatif tanpa templat, 5. Kontrol negatif Streptococcus spp. B7, 6. Kontrol negative E. Coli DH5 α, 7. Kontrol negatif P. aeruginosa PAO.

Gambar 1. Hasil elektroforesis kromosom Streptococcus pyogenes (a) Lisis cara 1, (b) Lisis cara 2: 1. HindIII, 2. Kromo-

som galur UAB200 (M6), 3. Kromosom galur CS24 (M12), 4. Kromosom galur M24.

Gambar 2. Hasil elektroforesis produk amplifikasi gen emm6,emm12, kontrol negatif dan kromosom: 1. MarkerLadder 100 pb, 2. Hasil amplifikasi gen emm6, 3.Hasil amplifikasi gen emm6, 4. Hasil amplifikasi genemm6, 5. Hasil amplifikasi gen emm12, 6. Hasilamplifikasi gen emm12, 7. Kontrol negatif non TaqPolimerase, 8. Kontrol negatif non Taq Polimerase,9. Kromosom Streptococcus spp. B7, 10. KromosomStreptococcus spp. B7, 11. Kromosom E. coli DH5 .

4 Jurnal Natur Indonesia 6 (1): 1-4 (2003) Abdullah & Retnoningrum.

Gambar 2,3 dan 4 menunjukkan produk PCR genemm6 mempunyai ukuran panjang antara 1400 pb dan1500 pb bila dibandingkan dengan marker ladder 100pb. Menurut hasil yang dipublikasi bahwa ukuranpanjang gen emm6 adalah 1452 pb. Dari hasilelektroforesis ukuran panjang gen emm6 adalah 1495pb. Hasil ini mendekati ukuran panjang gen emm6 yangtelah dipublikasi (Hollingshead et al, 1986).

Produk PCR gen emm12 mempunyai ukuranpanjang antara 1600 pb dan 1800 pb. Ukuran panjanggen emm12 yang telah dipublikasi yaitu 1693 pb. Hasilelektroforesis produk PCR gen emm12 adalah 1700pb. Hasil ini mendekati ukuran panjang gen emm12yang telah dipublikasi (Robbins et al, 1987).

Pada percobaan ini juga digunakan kromosomgalur M24 sebagai templat. Setelah diamplifikasidengan teknik PCR dan produknya dielektroforesisternyata tidak berhasil diperoleh produk PCR. Inimungkin disebabkan karena adanya inhibitor amplifikasiatau primer yang digunakan tidak dapat menempeldengan efisien pada templat. Menurut hasil yangdipublikasi (Mouw et al, 1988) bahwa ukuran panjanggen emm24 adalah 1617 pb.

Gambar 4. Reproduksibilitas amplifikasi gen emm12: 1. Marker λ HindIII, 2. Hasil amlifikasi produk PCR gen mm12, 3. Hasil amplifikasi produk PCR gen emm12, 4. Hasil amplifikasi produk PCR gen emm12, 5. Hasil amplifikasi produk PCR gen emm12, 6. Hasil amplifikasi produk PCR gen emm12, 7. Hasil amplifikasi produk PCR gen emm12.

KESIMPULANDari penelitian yang telah dilakukan dapat

disimpulkan bahwa isolasi kromosom galur UAB200,CS24 dan M24 sebagai templat telah berhasil denganbaik menggunakan lisis cara kedua denganpenambahan pencucian dengan aquades dan tahapfreeze-thaw sebelum dialisis. Setelah amplifikasidiperoleh produk PCR gen emm6 dengan ukuranpanjang 1495 pb, sedangkan gen emm12 adalah 1700pb, berdasarkan teknik elektroforesis gel agarosa.Ukuran panjangnya mendekati dengan data daripublikasi. Namun untuk gen emm24 tidak berhasil.

UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada BapakProf Oei Ban Liang, dan Dra Roga F Kembaren Msi,PPAU Bioteknologi ITB Bandung atas kesempatan danbimbingan yang diberikan serta LPIU DUE-Project UNRIyang telah mendanai penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKAHollingshead, S.K., Fischetti, V.A. & Scott, J.R. 1986. Complete

nucleotide sequence of type M protein of the group aStreptococcus. J. Biol. Chem. 261: 1677-1688.

Kaufhold, A., Podbielski, A., Baumgarten, G., Blokpoel, M.,Top, J. & Schouls, L. 1994. Rapid typing of group astreptococci by the use of DNA amplification and non-radioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMSMicrobiology Letters 119: 9-26.

Madigan, M.T., Martinho, J.M. & Parker, J. 1997. Biology ofMicroorganism. USA: Prentice Hall International Inc

Mouw, A.R., Beachey, E.H. & Vickers, B. 1988. Molecularevolution of Streptococcus M protein cloning and nucleotidesequence of type 24 M protein gene and relation to othergene of Streptococcus pyogenes. J. Bacteriol. 170: 676-684.

Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase ChainReaction (PCR) untuk diagnosis penyakit infeksi. JurusanFarmasi FMIPA. Bandung: ITB.

Robbins, J.C., Spanier, J.G., Jones, S.J., Simpson, W.J. &Cleary, P.P. 1987. Streptococcus pyogenes type 12Mprotein gene regulation by upstream sequences. J.Bacteriol. 169: 5633-5640.

Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J. & Zaller, M. 1992.Recombinant DNA. New York: WH Freeman.

Kontrol negatif pada amplifikasi digunakankromosom P. aeroginosa galur PAO. Streptococcusspp. galur B7, dan E coli DH5α. Pada amplifikasi initidak dihasilkan produk PCR. Ini mendukung bahwa

primer yang digunakan hanya mengenali templat yangberasal dari kromosom galur UAB200 dan CS24. Padaamplifikasi ini sebaiknya digunakan juga kontrol internalsebagai kontrol negatif.