skripsi - sitedi.uho.ac.idsitedi.uho.ac.id/uploads_sitedi/f1d112001_sitedi_skripsi muhamad... ·...

KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN FRAGMEN rDNA Trichoderma sp.ASAL PERKEBUNAN KAKAO (Theobromacacao L.) KONAWE

SkripsiDiajukan Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Sarjana (S-1)

OLEH:

MUHAMAD AZWAR SYAHF1D1 12 001

JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALUOLEOKENDARI

2016



OLEH:




2016



OLEH:




2016

iii

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Nama : Muhamad Azwar Syah

Tempat/Tanggal Lahir: Bone Kancitala/ 26 Desember 1995

Alamat : Jln. Prof.Abdur rauf Tarimana No. 43 Kel. Kambu

Alamat Instansi : -

No. Telp/HP : 081341801499

E-mail : [email protected]

Nama Ayah : Asyini

Nama Ibu : Wa Misali

Alamat : Desa Bone Kancitala Kec. Bone Kab. Muna

RiwayatPendidikan :

1. SD (SD Negeri 1 Bone), lulus tahun 2006

2. SMP (SMP Negeri 1 Baubau), lulus tahun 2009

3. SMA (SMA Negeri 1 Baubau), lulus tahun 2012

4. Perguruan Tinggi (Universitas Halu Oleo, Kendari), lulus tahun 2016

RiwayatPekerjaan :

1. Pernah menjadi Asisten Praktikum Biologi Dasar, Struktur dan PerkembanganTumbuhan, Biokimia, Mikrobiologi, Genetika, Mikologi, dan BiologiMolekuler Medik.

2. Pernah menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Jurusan periode 2013-2014.

3. Pernah menjadi anggota Dewan Perwakilan Mahasiswa periode 2014-2015.

4. Pernah menjadi sekretaris umum Badan Eksekutif Mahasiswa periode 2014-2015.

5. Pernah menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Islam (HMI) cabang Kendariangkatan XIX.

iii





Alamat Instansi : -

No. Telp/HP : 081341801499


Nama Ayah : Asyini



RiwayatPendidikan :





RiwayatPekerjaan :






iii





Alamat Instansi : -

No. Telp/HP : 081341801499


Nama Ayah : Asyini



RiwayatPendidikan :





RiwayatPekerjaan :






v

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT Tuhan semesta alam atas berkat rahmat dan

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan

skripsi dengan judul: Karakterisasi Morfologi dan Fragmen rDNA Trichoderma

sp. Asal Perkebunan Kakao Konawe. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari

berbagai pihak baik bimbingan, nasehat, arahan, serta doa maka penulisan hasil

penelitian ini tidak dapat terselesaikan dengan baik.

Penghargaan yang setinggi-tingginya dan ucapan terima kasih yang

setulus-tulusnya penulis haturkan kepada Dr. Muzuni, S.Si., M.Si selaku

pembimbing I dan Dr. Nur Arfa Yanti, S.Si., M.Si selaku pembimbing II atas

bimbingan arahan dan petunjuk yang sangat berharga dalam penulisan hasil

penelitian ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementerian Riset,

Teknologi dan Pendidikan Tinggi atas dibiayainya penelitian ini dalam Program

Kreativitas Mahasiswa (PKM), dan terpilih sebagai salah satu peserta dalam

PIMNAS pada tahun 2015.

Ucapan terima kasih tidak lupa pula penulis sampaikan kepada ayahanda

tersayang Asyini dan Ibunda tercinta Wa Misali, S.Pdi yang senantiasa

mendukung dan memberikan do’a yang tulus ikhlas serta kasih sayangnya yang

tak terhingga. Kepada kakak tercinta Muhamad Azlan Syah dan adik-adikku

tersayang Fina Rais dan Ade Farma yang menjadi sumber inspirasi dan motivasi

bagi penulis dalam menyelesaikan penelian dan penyusunan skripsi ini.

Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terima kasih dan

penghargaan kepada :

vi

1. Rektor Universitas Halu Oleo (UHO) Kendari.

2. Dekan Fakultas MIPA Universitas Halu Oleo (UHO).

3. Ketua Jurusan Biologi dan Sekretaris Jurusan Biologi Fakultas MIPA

Universitas Halu Oleo (UHO).

4. Kepala Laboratorium Biologi Fakultas MIPA Universitas Halu Oleo (UHO).

5. Dr. Amirullah, M.Si selaku penasehat akademik yang telah memberikan

pengarahan dan bimbingan dalam memprogramkan mata kuliah.

6. Dr. Nurhayani H.M., S.Si., M.Si, Dr. Suriana, M.Si, dan Dr. Hj. Sitti

Wirdhana Ahmad, S.Si., M.Si, selaku dewan penguji.

7. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Biologi serta seluruh staf Fakultas MIPA

UHO.

8. Laboran Laboratorium Jurusan Biologi Fakultas MIPA UHO.

9. Kakak senior Darson, S.Si dan Mawardi Janitra, S.Si yang telah banyak

membantu dan membimbing penulis selama melaksanakan penelitian.

10. Kakak Baitul Abidin, S.Pi., M. Biotech. yang telah banyak membantu penulis

dalam menyusun tugas akhir, dan sahabat tercinta Sadam yang telah

memberikan motivasi dan hiburan selama melaksanakan penelitian.

11. Kakak senior di Laboratorium Mikrobiologi: Taufik Walhidayah, S.Si.,

Irawati, S.Si, Nur Asni, S.Si, Zaenab Mola, Ridwan, S.Si, Artarini Oktavianti,

S.Si, Rahmatan Juhaepa, S.Si, dan Hasanah, S.Si, yang telah banyak

membantu penulis selama penelitian.

12. Teman-teman Biologi angkatan 2012: Saharudin, I Wayan Rustanto, Muh.

Rajab Sutra Wijaya,Muh. Zulvichar, LM. Yusuf, LM. Iman Sulaiman, Dafid

vii

Pratama, Muh. Gusmiranda, Hardianto, Febrianto Meyer Pakina, Desty

Triyaswati, Nur Isnaini Ulfa, Nuning, Andi Nurhana, Emi Nurfiani, Efis

Amalia, Kholifath, Siti Feni Musdalifah, Ulfa Muliani, Desi Afdaliana, Andi

Hildayani, Irmayanti Arief, Siti Surahmi, Kasmawati Dehe, Wa Ode

Sadawati,dan semuanya yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah

memberikan dorongan moril serta kebersamaan yang tidak terlupakan.

13. Kakak-kakak senior Biologi angkatan 2010, 2011 dan adik-adikku angkatan

2013, 2014, dan 2015 atas perhatian dan dukungannya.

14. Kakak-kakak Asisten di Biologi: Adi Karya, S.Si., M.Sc.,WD. Nanang Trisna

Dewi, S.Si., M.Si, Wd. Kartini, S.Si, Izal, S.Si, Al Firman, S.Si, Fitri Andrita,

S.Si, Wa Ode Desi, LD. Adi Parman, S.Si., La Riadi, S.Si,Fatma Cahya Putri,

S.Si., Wa Ode Rafiuddarajat, S.Si., dan semuanya yang tidak dapat

disebutkan satu persatu.

Selanjutnya penulis menyadari bahwa penulisan hasil penelitian ini masih

jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis

menerima segala saran yang sifatnya membangun demi penyempurnaannya.

Penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak

yang membutuhkan. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih atas segala

dukungan serta bimbingannya semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu menyertai

dan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Amin.

Kendari, April 2016

Penulis

viii

DAFTAR ISI

HalamanHALAMAN JUDUL ............................................................................... iHALAMAN PENGESAHAN ................................................................. iiDAFTAR RIWAYAT HIDUP ............................................................... iiiSURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ....................................... ivKATA PENGANTAR ............................................................................. vDAFTAR ISI............................................................................................ viiiDAFTAR TABEL ................................................................................... xDAFTAR GAMBAR ............................................................................... xiDAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xivDAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN .............................. xvABSTRAK ............................................................................................... xviABSTRACT ............................................................................................. xviiI. PENDAHULUAN ................................................................................ 1

A. Latar Belakang............................................................................ 1B. Perumusan Masalah .................................................................... 4C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4D. Manfaat Penelitian ...................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 5

A. Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) .................................... 51.Deskripsi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) ................ 52.Ekologi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)................... 63.Penyakit pada Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) ........ 64.Kondisi Perkebunan Kakao (Theobroma cacao L.)

Negara Indonesia.................................................................... 95.Kondisi Perkebunan Kakao (Theobroma cacao L.)

Sulawesi Tenggara.................................................................. 10B. Agen Hayati Trichodermasp....................................................... 11

1. Deskripsi Trichoderma sp. .................................................... 112. Ekologi Trichoderma sp. ....................................................... 123. Peranan Trichoderma sp. ....................................................... 13

C. Karakteristik Molekuler ............................................................ 141. Teori DNA (Deoxyribo nucleic acid) .................................... 142. Gen rRNA (RNA ribosomal) ................................................ 153. Metode Karakterisasi Molekuler ............................................ 16

III. METODE PENELITIAN ................................................................ 21

A. Waktu dan Tempat Penelitian .................................................... 21B. Jenis Penelitian ........................................................................... 21C. Bahan Penelitian ........................................................................ 21D. Alat Penelitian. ........................................................................... 22

ix

E. Variabel, Definisi Operasional dan Indikator Penelitian ............ 231. Variabel Penelitian ................................................................. 232. Definisi Operasional .............................................................. 243. Indikator Penelitian ............................................................... 24

F. Prosedur Penelitian ..................................................................... 25G. Analisis Data .............................................................................. 30H. Bagan Alur Sistematika Penelitian ............................................ 32

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 33

A. Karakteristik Morfologi Koloni Trichoderma sp. ...................... 33B. Karakteristik Morfologi Sel Trichoderma sp. ............................ 38C. Karakteristik Molekuler gen rRNA Trichoderma sp. ................. 44

1.Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Genom................................. 442. Amplifikasi Fragmen ITS dengan Teknik PCR...................... 483. Urutan Sekuen Fragmen ITS Isolat Trichoderma sp. ............. 484. Hasil Penyejajaran Gen rRNA................................................ 505. Situs Pemotongan Enzim Restriksi......................................... 516. Analisis Pohon Filogenetik ..................................................... 527. Analisis Kesejajaran Sekuen................................................... 59

V. PENUTUP ........................................................................................... 60

A. Simpulan .................................................................................... 60B. Saran ........................................................................................... 60

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 61

LAMPIRAN............................................................................................. 66

x

DAFTAR TABEL

No. Teks Halaman

1 Produksi kakao perkebunan kakao tahun 2009-2014........................... 10

2 Bahan Pendukung penelitian dan fungsinya ........................................ 21

3 Alat dan fungsi yang digunakan pada penelitian ................................. 22

4 Karakteristik morfologi koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp.pada media PDA ................................................................................. 33

5 Diameter koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp.pada media PDA ................................................................................ 37

6 Karakteristik morfologi sel dari ketiga isolat Trichoderma sp.pada media PDA................................................................................... 38

7 Hasil penghitungan spektrofotometri DNA genom.............................. 46

8 Nilai similaritas (%) dan jumlah nukleotida berbeda dalamsequence gen rRNA (ITS 1, 5.8S, ITS 2) antara ketiga isolatTrichoderma sp. dan isolat pembanding............................................... 58

9 Analisis Kesejajaran Lokal sekuen DNA sampel dengan sekuen DNApada GeneBank menggunakan program BLAST ................................. 59

xi

DAFTAR GAMBAR

No. Teks Halaman

1 Proses sekuensing mengunakan metode Sanger .......................................... 19

2 Struktur Gen rRNA ...................................................................................... 28

3 SkemaTahapan Penelitian ............................................................................ 32

4 Pengamatan karakteristik morfologi koloni isolat Trichoderma sp. padamedia PDA................................................................................................... 35

5 Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat A1 menggunakan perbesaran400x.............................................................................................................. 39

6 Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat B2 menggunakanperbesaran 400x .......................................................................................... 40

7 Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat C3 menggunakanperbesaran 400x .......................................................................................... 41

8 Hasil elektroforesis DNA genom isolat Trichoderma sp. padagel agarose 1% ........................................................................................... 45

9 Hasil elektroforesis amplifikasi fragmen ITS ketiga isolat menggunakanprimer Tricho-F dan Tricho-R pada gel agarose 1%................................... 47

10 Hasil penyejajaran sekuen fragmen ITS1 isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit................................... 48

11 Hasil penyejajaran sekuen gen 5.8S rRNA isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit................................... 49

12 Hasil penyejajaran sekuan fragmen ITS2 isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit................................... 49

13 Hasil penyejajaran sekuan fragmen ITS2 isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit................................... 50

14 Hasil Penyejajaran gen rRNA isolat dengan berbagai sekuengen rRNA spesies Trichoderma menggunakan programClustalW Alignment Bioedit......................................................................... 50

xii

15 Enzim restriksi gen rRNA pada daerah ITS 1, 5S, ITS 2 isolatTrichoderma menggunakan program NEBcutter2.0 .................................... 52

16 Pohon filogenetik yang menunjukkan hubungan kekerabatan antaraisolat A1, B2, dan C3 dengan beberapa spesies pembandingberdasarkan urutan gen ITS 1, 5.8S rRNA, dan ITS 2. Angka padapercabangan menunjukkan nilai bootstrap (%) berdasarkan algoritmaNeighbour-joining dengan 1000x replikasi.................................................. 54

17 Hasil pengamatan morfologi koloni isolat A1 pada media PDA ................ 65

18 Hasil pengamatan morfologi koloni isolat B2 pada media PDA ................ 65

19 Hasil pengamatan morfologi koloni isolat C3 pada media PDA ................ 65

20 Hasil penyejajaran fragmen ITS dari berbagai spesies Trichodermasp. dengan menggunakan program ClustalWAlignmentBioedit,a: Tricho-F, b: Tricho-R............................................................................... 66

21 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat A1dengan primer forward ................................................................................ 68

22 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat A1dengan primer reverse ................................................................................ 68

23 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat B2dengan primer forward ................................................................................ 69

24 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat B2dengan primer reverse........................................................................ ......... 69

25 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat C3dengan primer forward ...................................................................... ......... 70

26 Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen ITS isolat C3dengan primer reverse ....................................................................... ......... 71

27 Skor hasil alignment sekuen A1 dengan sekuen yangterdapat pada GeneBank ............................................................................. 73

28 Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat A1 ...... 73

29 Hasil alignment sekuen A1 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank ............................................................................. 74

30 Skor hasil alignment sekuen B2 dengan sekuen yang

xiii

terdapat pada GeneBank ............................................................................. 7531 Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat B2 ....... 75

32 Hasil alignment sekuen B2 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank ............................................................................. 76

33 Skor hasil alignment sekuen C3 dengan sekuen yangterdapat pada GeneBank ............................................................................. 77

34 Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat C3 ....... 77

35 Hasil alignment sekuen C3 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank ............................................................................. 78

36 Preparasi bahan dan alat ............................................................................. 79

37 Prosesperemajaan isolat ............................................................................ 79

38 Pengamatan morfologi koloni isolat .......................................................... 79

39 Pengamatan morfologi sel isolat ................................................................ 79

40 Tahap penggerusan sel ............................................................................... 79

41 Pemberian larutan CTAB ........................................................................... 79

42 Proses sentrifugasi larutan .......................................................................... 79

43 Tahap pemberian PC ................................................................................... 79

44 Proses spindown .......................................................................................... 80

45 Tahap penghilangan etanol 70% ................................................................. 80

46 Tahap pembuatan gel agaros ....................................................................... 80

47 Tahap pencetakan gel agaros ....................................................................... 80

48 Pemasukan sampel DNA pada agaros ......................................................... 80

49 Proses elektroforesis DNA .......................................................................... 80

50 Proses visualisasi DNA ............................................................................... 80

51 Pemograman mesin PCR ............................................................................. 80

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

No. Teks Halaman

1 Hasil pengamatan morfologi koloni ketiga isolat ....................................... 65

2 Desain primer Tricho-F dan Tricho-R ......................................................... 66

3 Penghitungan nilai absorbansi DNA menggunakanspektrofotometer ........ 67

4 Elektroferogram hasil sequencingfragmen ITS isolat A1............................ 68

5 Elektroferogram hasil sequencingfragmen ITS isolat B2 ............................ 69

6 Elektroferogram hasil sequencing fragmen ITSisolat C3 ............................ 70

7 Hasil multiple alignment sequences gen rRNA isolat A1, B2 dan C3menggunakan program MAFFT ................................................................. 71

8 Hasil penyejajaran fragmen ITS isolat A1 menggunakan programBLASTn pada situs Genebank NCBI .......................................................... 73

9 Hasil penyejajaran fragmen ITS isolat B2 menggunakan programBLASTn pada situs Genebank NCBI .......................................................... 75

10 Hasil penyejajaran fragmen ITS isolat C3 menggunakan programBLASTn pada situs Genebank NCBI .......................................................... 77

11 Dokumentasi penelitian ............................................................................... 79

xv

DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN

Lambang/singkatan Arti dan keterangan%µgµLoCrRNAAA1bpbufferB2CC3MgCl2

CO2

ddNTPdNTPDNADNA templateEDTAgGH2OITSmLmmmMnmO2

OPTPCRpHPHYDITRNArpmTAETaq DNATETTmVSDΛ

PersenMikrogramMikroliterDerajat CelciusRibosomal ribonucleic acidAdeninIsolat Trichoderma sp.BasepairLarutan penyanggaIsolat Trichoderma sp.SitosinIsolat Trichoderma sp.Magnesium kloridaKarbon dioksidaDideoksiribonukleotidaDeoksiribonukleotidaDeoxyribonucleicAcidCetakan DNAEthylene Diamine Tetra AcidGramGuaninAkuadesInternal Transcribed SpacerMililiterMilimeterMili MolarNanometerOksigenOrganisme Pengganggu tanamanPolymerase Chain ReactionNegative logarithma dari konsentrasi ion hidrogenThe Phylogenetic EditorRibonucleicacidRotation per minuteTris Acetat EDTAThermosaquaticus DNATris EDTATiminTemperatur meltingVascularStreakDiebackPanjang gelombang

xvi

KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN FRAGMEN ITSTrichoderma sp.ASAL PERKEBUNAN KAKAO (Theobromacacao L.) KONAWE

Oleh :Muhamad Azwar Syah

F1D112001

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik morfologi danmolekuler fragmen rDNATrichoderma sp. yang terdapat di perkebunan kakaoKonawe Sulawesi Tenggara. Karakterisasi morfologi isolat Trichoderma sp.meliputi karakterisasi morfologi sel dan morfologi koloni, sedangkan karakterisasimolekuler fragmen rDNAisolat Trichoderma sp. meliputi amplifikasi fragmenITS1, 5.8S, dan ITS2. Morfologi isolat Trichoderma sp. dikarakterisasi denganmenggunakan metode slide culture dan metode titik, sedangkan fragmen rDNAisolat Trichoderma sp. diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR(Polymerase Chain Reaction). Hasil karakterisasi morfologi isolat Trichodermasp. menunjukkan bahwa isolat A1, B2, dan C3 memiliki warna koloni hijaukeputihan, terbentuk garis radial dan area zonasi, percabangan konidioforcenderung teratur, fialid menyerupai bentuk termos, dan konidia berwarna hijau.Urutan nukleotida fragmen rDNAyang berhasil diamplifikasi denganmenggunakan primer Tricho-F dan Tricho-R, yaitu isolat A1 sebanyak 528 bp,dan urutan nukleotida fragmen rDNA isolat B2 dan C3 masing-masing 529 bp.Berdasarkan hasil karakterisasi morfologi isolat A1, B2, dan C3 menunjukkankarakter dari spesies Trichoderma sp., sedangkan hasil karakterisasi molekulerfragmen rDNA isolat A1, B2, dan C3 diidentifikasi sebagai anggota dari spesiesTrichoderma asperellum.

Kata kunci : Trichodermasp., karakteristik morfologi, fragmen rDNA

xvii

Characterization of Morphology and ITS Fragment Trichoderma sp. FromKonawe Cacao Plantation

By :Muhamad Azwar Syah

F1D112001

ABSTRACT

The aim of this research is to know the characteristics of morphology andmolecular of rDNA fragment of Trichoderma sp. found in the cacao plantation ofKonawe Southeast Sulawesi. Morphology characterization of Trichoderma sp.isolate included of morphology and cell characterizations, while molecularcharacterization of rDNA fragment contained of amplification ITS fragment atITS1, 5.8S, and ITS2 regions. Morphology of Trichoderma sp. isolate wascharacterized by slide culture and point methods, while rDNA fragment wasamplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) technique. The result ofmorphology characterization of Trichoderma sp. isolate showed that isolate ofA1, B2, and C3 had whitish green colony, line radial and zone area, branches ofconidiophore mostly regularly, phialides were like thermos shape, and greenconidia. Nucleotide of rDNA fragment amplified by Tricho-F and Tricho-Rprimers showed that A1 isolate was 528 bp, dan nucleotide of rDNA fragment B2and C3 isolates were 529 bp. The result of morphology characterization of A1,B2, and C3 showed species character of Trichoderma sp., while molecularcharacterization rDNA fragment of A1, B2, dan C3 isolates identified as memberof Trichoderma asperellum species.

Key Words : Trichoderma sp., morphology chracteristic, rDNA fragment

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pengembangan produksi kakao tersebar hampir di seluruh wilayah

Indonesia, salah satunya Sulawesi Tenggara. Tanaman kakao menjadi salah

satu komoditas unggul di kawasan ini. Namun, beberapa tahun terakhir, nilai

produksi kakao di kawasan ini masih rendah. Sulawesi Tenggara

memproduksi kakao sebanyak 213.691 ton dengan luas lahan perkebunan

kakao mencapai 29.880 ha tidak produktif pada tahun 2014 (Badan Pusat

Statistik Sulawesi Tenggara, 2015). Pada tahun 2015 produktivitas kakao

Sulawesi Tenggara diestimasi mengalami penurunan drastis dengan produksi

sekitar 117.035 ton (Direktorat Jenderal Perkebunan, 2014).

Penurunan produktivitas ini disebabkan karena menurunnya produksi

kakao di sentra-sentra penghasil kakao, termasuk di Kabupaten Konawe.

Kabupaten Konawe hanya memproduksi kakao sebanyak 10.171,8 ton pada

tahun 2014, padahal potensinya dapat mencapai 11.597,7 ton (Badan Pusat

Statistik Konawe, 2015). Rendahnya produktivitas kakao selain disebabkan

oleh pohon yang sudah tidak produktif, juga disebabkan karena adanya

serangan organisme pengganggu tanaman, salah satunya fungi patogen.

Fungi patogen yang banyak menyerang tanaman kakao, diantaranya

Phytophtora palmivora dan Oncobasidium theobromae. Fungi ini

mengakibatkan membusuknya buah kakao. Pembasmian fungi patogen pada

tanaman kakao saat ini masih dilakukan dengan penggunaan fungisida. Namun,

penggunaan fungisida memiliki dampak negatif karena residunya terabsorbsi

2

ke dalam jaringan tanaman (Wiryadiputra, 2013). Pengendalian hayati

diharapkan mampu mengurangi dampak negatif dari penggunaan fungisida.

Salah satu agen hayati yang dapat digunakan sebagai biokontrol pengendali

tanaman dari infeksi fungi patogen adalah Trichoderma sp.

Trichoderma sp. merupakan kelompok fungi multiseluler yang

kosmopolitan di tanah. Menurut Kubicek dan Herman (2002), Trichoderma sp.

digolongkan ke dalam kelas Deuteromycetes, tetapi setelah dilakukan

reidentifikasi oleh Charerri et al. (2015), Trichoderma sp. dikelompokkan ke

dalam kelas Sordariomycetes dan subdivisi Ascomycota . Mikroba ini memiliki

kemampuan menghambat fungi patogen pada tanaman (Singh et al., 2014), dan

dapat ditemukan di tanah sekitar perkebunan kakao (Nurahmi dkk., 2012).

Karakteristik sel Trichoderma sp. diantaranya adalah hifa yang bersepta,

konidiofor bercabang dan biasanya menyerupai bentuk piramida, dan konidia

melekat pada fialid. Selain itu, warna koloni Trichoderma sp. bervariasi setiap

spesies tergantung pada media pertumbuhannya dan kebanyakan berwarna

kehijauan pada media PDA (Munir et al., 2013). Karakteristik morfologi

tersebut dapat diketahui melalui proses karakterisasi.

Hasil karakterisasi dapat digunakan untuk mengidentifikasi organisme.

Identifikasi organisme dapat dilakukan dengan proses karakterisasi morfologi

dan molekuler. Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengetahui

karakteristik bagian luar tubuh organisme, sedangkan karakterisasi molekuler

berperan dalam mengetahui karakteristik organisme berdasarkan molekul-

molekul tertentu yang terdapat dalam sel, seperti protein dan asam nukleat.

3

Karakterisasi molekuler dapat dilakukan dengan mengamati komposisi

nukleotida pada rantai DNA dari tiap organisme. DNA merupakan molekul

penyusun gen yang menyandi karakter organisme, diantaranya rDNA. rDNA

adalah penyandi gen komponen RNA ribosom. Pada organisme eukariot,

rDNA memiliki daerah konservatif yaitu berturut-turut gen penyandi rRNA

18S, 5.8S, dan 28S yang diselingi oleh daerah ITS (Internal Transcribed

Spacer). Daerah ITS spesifik untuk setiap spesies fungi (Eldenary et al., 2013),

sehingga dapat dijadikan sebagai kunci identifikasi.

Isolat Trichoderma yang digunakan pada penelitian ini berasal dari

Badan Penerapan Teknologi Pertanian (BPTP) Sulawesi Tenggara yang

diisolasi dari perkebunan kakao Konawe. Isolat tersebut belum dilakukan

identifikasi. Oleh karena itu, identitas isolat tersebut perlu diketahui untuk

mempelajari karakteristiknya. Identifikasi kapang dapat dilakukan dengan

proses karakterisasi morfologi dan molekuler (Budi dkk., 2010; Rahayu dkk.,

2015). Karakterisasi secara morfologi belum optimal dalam mengidentifikasi

spesies organisme. Hal ini disebabkan karena perbedaan morfologi kapang

dapat dipengaruhi oleh faktor lingkungan, meskipun dalam satu spesies.

Teknologi molekuler dapat diterapkan dalam identifikasi spesies

organisme yang lebih akurat. Hal ini disebabkan karena sekuen DNA yang

terdapat dalam sel lebih stabil dan tidak mudah berubah. Oleh karena itu, isolat

Trichoderma sp. yang terdapat di perkebunan kakao Konawe Sulawesi

Tenggara perlu diidentifikasi melalui proses karakterisasi berdasarkan

morfologi dan fragmen rDNA.

4

B. Perumusan Masalah

Masalah yang akan dikaji pada penelitian ini dapat dirumuskan sebagai

berikut :

1. Bagaimana karakteristik morfologi beberapa isolat Trichoderma sp. yang

terdapat di kawasan perkebunan kakao Konawe Sulawesi Tenggara ?

2. Bagaimana karakteristik molekuler fragmen rDNA beberapa isolat

Trichoderma sp. yang terdapat di kawasan perkebunan kakao Sulawesi

Tenggara ?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan yang ingin dicapai melalui penelitian ini adalah:

1. Mengetahui karakteristik morfologi beberapa isolat Trichoderma sp. yang

terdapat di kawasan perkebunan kakao Konawe Sulawesi Tenggara.

2. Mengetahui karakteristik molekuler fragmen rDNA beberapa isolat

Trichoderma sp. yang terdapat di kawasan perkebunan kakao Konawe

Sulawesi Tenggara.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh setelah melakukan penelitian ini adalah

sebagai berikut :

1. Sebagai bahan informasi tentang spesies Trichoderma sp. yang terdapat di

perkebunan kakao Konawe Sulawesi Tenggara.

2. Sebagai bahan acuan bagi penelitian selanjutnya, khususnya yang meneliti

masalah-masalah yang relevan dengan penelitian ini.

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Tanaman Kakao

1. Deskripsi Tanaman Kakao

Klasifikasi tanaman kakao menurut Tjitrosoepomo (2005) adalah

sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Class : Dicotyledoneae

Ordo : Malvales

Family : Sterculiaceae

Genus : Theobroma

Spesies : Theobroma cacao L.

Tanaman kakao yang sudah mencapai tinggi 0.9-1.5 meter akan berhenti

tumbuh ke atas dan membentuk jorket. Jorket adalah tempat percabangan dari

percabangan ortotrop ke plagiotrop dan khas hanya pada tanaman kakao.

Kakao termasuk tanaman dengan laju fotorespirasi yang cukup tinggi dengan

menggunakan 20-50% dari hasil total fotosintesis. Air yang diserap tanaman

sebagian besar hilang lewat proses transpirasi (penguapan). Proses ini cukup

penting karena berkaitan dengan penyerapan unsur hara dan menjaga suhu

tubuh tanaman (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia, 2004).

Buah kakao memiliki dua macam warna, yaitu hijau dan merah. Buah

muda yang berwarna hijau akan mengalami perubahan menjadi berwarna

kuning saat mengalami proses pematangan. Sementara itu, buah yang muda

6

berwarna merah akan mengalami perubahan menjadi berwarna jingga. Kulit

buah kakao memiliki 10 alur dalam dan dangkal yang letaknya berselang-

seling. Buah akan mengalami pematangan setelah berumur enam bulan. Biji

kakao tidak memiliki masa dorman dan diselimuti oleh daging buah yang

mengandung zat penghambat perkecambahan (Pusat Penelitian Kopi dan

Kakao Indonesia, 2004).

2. Ekologi Tanaman Kakao

Banyak faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan kakao,

diantaranya adalah faktor fisik dan kimia tanah.Faktor fisik tanah terdiri dari

suhu, tekstur tanah, dan kadar air, sedangkan faktor kimia tanah adalah pH,

salinitas, dan kadar organik tanah. Suhu yang optimum yang mendukung

pertumbuhan kakao berkisar 30-32oC, sedangkan pH tanah yang ideal untuk

tanaman kakao berkisar 6-7.5. Kakao merupakan tanaman C3 yang mampu

berfotosintesis pada suhu rendah, jika dikelompokkan berdasarkan tipe

fotosintesisnya. Hal ini berkaitan dengan proses membukanya stomata lebih

besar bila cahaya matahari yang diterima lebih banyak (Rubiyo dkk., 2012).

3. Penyakit pada Tanaman Kakao

Pohon kakao adalah tanaman yang rentan terhadap penyakit yang

disebabkan oleh serangan organisme pengganggu tanaman (OPT). Sekitar 20-

30 % perkebunan kakao dapat mengalami kegagalan produksi akibat serangan

OPT. Organisme pengganggu tanaman (OPT) yang banyak menyerang

tanaman kakao, diantaranya adalah fungi patogen. Fungi patogen merupakan

7

kelompok fungi multiseluler yang ditandai dengan adanya hifa (Tanuhadi,

2012).

Penyakit berpengaruh besar terhadap penurunan produktivitas tanaman

kakao. Phytopthora palmivora adalah salah satu penyebab penyakit busuk

buah, kanker batang, dan busuk pucuk serta penyakit hawar daun. Penyakit

hawar daun merupakan salah satu kendala pembibitan kakao di Indonesia.

Gejala hawar daun terlihat seperti terbakar yang dimulai dari tepi daun.

Pengendalian penyakit ini umumnya menggunakan fungisida sintetik, namun

memiliki dampak negatif. Hal ini menimbulkan pencemaran lingkungan dan

gangguan keseimbangan ekologis. Penggunaan Trichoderma sp. untuk

mengendalikan penyakit yang disebabkan Phytopthora spp. cukup potensial

(Azis dkk., 2013).

Permukaan buah kakao dapat menjadi tempat pertumbuhan spora

Phytopthora palmivora. Hal ini disebabkan karena spora patogen ini bersifat

hidrofilik. Fugni ini dapat menginfeksi tanaman kakao melalui lubang stomata.

Stomata merupakan derivat sel epidermis yang menjadi lubang pertukaran gas

pada tanaman. Perbedaan morfologi stomata diduga dapat berperan dalam

ketahanan prapenetrasi (Rubiyo dkk., 2010).

Masalah utama penyakit busuk buah adalah fungi Phytopthora palmivora

yang dapat bertahan di dalam jaringan buah yang terinfeksi. Penggunaan

fungisida belum efektif dalam menghambat pertumbuhan Phytopthora

palmivora karena fungisida tidak mampu menjangkau keberadaan hifa fungi

tersebut. Selain itu, fungisida tidak terdegradasi oleh lingkungan kecuali

8

mikroorganisme tertentu sehingga fungisida terakumulasi di sel organisme

dengan konsentrasi yang berbeda-beda, dapat menyebabkan pencemaran

lingkungan, terjadinya resistensi patogen, kematian pada organisme antagonis

dan meninggalkan residu pada buah kakao (Asrul, 2009).

Phytopthora palmivora dapat bertahan hidup dalam kondisi tanah yang

kering atau ketersediaan air yang sangat sedikit. Bentuk pertahanan fungi ini

terhadap kondisi tersebut dengan membentuk sista. Sista merupakan spora

yang membentuk dinding sel yang tebal. Hal inilah yang menyebabkan

sukarnya pembasmian penyakit busuk buah pada kakao (Motulo dkk., 2007).

Penyebaran penyakit busuk buah dapat melalui berbagai cara,

diantaranya dengan percikan air hujan, persinggungan antara buah sakit dengan

buah sehat, dan dapat melalui binatang penyebar seperti bekicot. Gejala

penyakit busuk buah dapat terlihat pada buah muda hingga buah dewasa. Buah

yang terinfeksi akan membusuk disertai bercak coklat kehitaman dengan batas

yang jelas. Gejala tersebut kebanyakan muncul dari ujung atau pangkal buah.

Hal ini disebabkan adanya lekukan pada pangkal buah yang menjadi tempat

tergenangnya air sehingga spora dengan mudah tumbuh dan berkembang

(Motulo dkk., 2007).

Penyakit pembuluh kayu atau Vascular Streak Dieback (VSD)

merupakan salah satu penyakit terpenting pada kakao di Indonesia. Penyakit

VSD disebabkan oleh fungi Oncobasidium theobromae. Fungi ini

memproduksi basidiospora dan biasanya berkembang pada kondisi yang sangat

lembab. Basidiospora disebarkan oleh angin dan jika spora menempel pada

9

permukaan yang kering, akan mengalami kehilangan viabilitas. Basidiospora

mulai menetrasi di jaringan epidermis dan masuk ke jaringan xilem (Dhana

dkk., 2013).

4. Perkebunan Kakao Indonesia

Indonesia dikenal sebagai negara pengekspor biji kakao terpenting di

dunia. Tahun 2010, Indonesia menjadi negara pengekspor biji kakao terbesar

ketiga di dunia dengan produksi biji kering 550.000 ton. Luas lahan

perkebunan kakao mencapai 1.651.539 ha dengan 94% dari lahan tersebut

merupakan perkebunan rakyat. Hal ini mengindikasikan peran penting kakao

sebagai sumber lapangan kerja dan pendapatan petani. Areal dan produksi

kakao Indonesia meningkat pesat pada dekade terakhir, dengan laju 5.99% per

tahun (Rubiyo dkk., 2012).

Permintaan biji kakao di dunia terus meningkat, terutama dari Amerika

Serikat dan negara-negara Eropa Barat. Tahun 2010, jumlah kebutuhan biji

kakao di seluruh dunia adalah 3,7 juta ton, sedangkan jumlah ketersediaan biji

kakao dari seluruh perkebunan di dunia hanyalah 3,6 juta ton (Tanuhadi, 2012).

Indonesia sebagai salah satu produsen kakao perlu memanfaatkan peluang

tersebut untuk meningkatkan devisa negara. Beberapa hasil studi menunjukkan

bahwa daya saing produk kakao Indonesia, khususnya biji kakao masih baik

sehingga Indonesia mempunyai peluang untuk meningkatkan ekspor dan

mengembangkan di kancah pasar domestik (Rubiyo dkk., 2012).

Negara Jepang telah memberlakukan batas maksimum residu pestisida

pada bahan makanan dengan sangat ketat, termasuk bahan baku yang berasal

10

dari biji kakao. Banyaknya jenis pestisida yang diperbolehkan untuk digunakan

pada komoditas kakao di Indonesia dapat menyebabkan penurunan nilai ekspor

kakao, khususnya Jepang. Tahun 2011, sebanyak lebih dari 290 pestisida

dengan jumlah bahan aktif sekitar 70 jenis, diizinkan untuk digunakan pada

perkebunan kakao (Wiryadiputra, 2013).

5. Kondisi Perkebunan Kakao Sulawesi Tenggara

Produksi tanaman kakao menjadi hasil perkebunan paling unggul di

Sulawesi Tenggara dibandingkan dengan hasil perkebunan lainnya. Sentra

produksi kakao terdapat di empat wilayah, yaitu Kabupaten Kolaka, Kolaka

Utara, Konawe, dan Konawe Selatan. Produktivitas tanaman kakao Sulawesi

Tenggara mengalami fluktuasi tiap tahun. Tahun 2009, Sulawesi Tenggara

memproduksi kakao sebanyak 131.830 ton, dan tahun 2011 produksi kakao

mengalami peningkatan mencapai 161.064 ton. Namun, tahun 2012 produksi

kakao menurun drastis hingga 140.645 ton (Tabel 1). Penurunan produksi ini

disebabkan karena adanya serangan organisme pengganggu tanaman (OPT)

(Badan Pusat Statistik Sulawesi Tenggara, 2015).

Tabel 1. Produksi kakao perkebunan kakao tahun 2009-2014No. Tahun Produksi (Ton) Luas (ha)1 2 3 41 2009 131.830 230.1752 2010 145.818 237.9163 2011 161.064 249.2344 2012 140.645 260.4475 2013 185.201 245.6246 2014 213.691 217.025

Sumber : (Badan Pusat Statistik Sulawesi Tenggara, 2015).

Pemerintah Sulawesi Tenggara terus berupaya dalam meningkatkan

produksi kakao dengan melalui program gerakan nasional kakao. Upaya

11

tersebut berhasil meningkatkan laju produksi hingga mencapai 185.201 ton

pada tahun 2013. Namun, produksi tersebut masih rendah karena tanaman

kakao yang ditanam pada lahan perkebunan seluas 28.568 ha tidak produktif

(Badan Pusat Statistik Sulawesi Tenggara, 2014). Selain itu, tahun 2013

Kabupaten Konawe hanya memproduksi kakao sebanyak 12.561 ton dengan

tanaman kakao yang ditanam pada lahan perkebunan seluas 1.893 ha

mengalami gagal panen (Badan Pusat Statistik Kabupaten Konawe, 2014).

B. Agen Hayati Trichoderma sp.

1. Deskripsi Trichoderma sp.

Klasifikasi Trichoderma sp. menurut Charerri et al., (2015) adalah

sebagai berikut:

Kingdom : Fungi

Divisi : Pezizomycotina

Class : Sordariomycetes

Ordo : Hypocrales

Family : Hypocraceae

Genus : Trichoderma

Spesies : Trichoderma sp.

Trichoderma sp. merupakan kelompok fungi multiseluler dari kelompok

kapang. Karakteristik sel Trichoderma sp. diantaranya adalah hifa bersepta,

memiliki konidiofor yang bercabang dan menyerupai bentuk piramida, dan

konidia melekat pada fialid. Ujung sel konidiofor tidak mengalami pembesaran

dan tidak berwarna (hialin) serta percabangannya cenderung teratur (Kubicek

12

et al., 2002). Selain itu, warna koloni Trichoderma sp. bervariasi setiap spesies

tergantung pada media pertumbuhan yang digunakan. Koloni Trichoderma sp.

kebanyakan berwarna kehijauan pada media PDA (Potato Dextrose Agar)

(Munir et al., 2013).

Trichoderma sp. dapat ditemukan di tanah dan ekosistem akar, serta

memiliki kemampuan biokontrol terhadap beberapa fungi patogen tanaman.

Biokontrol dapat didefinisikan sebagai penggunaan organisme alami, atau

modifikasi secara genetik, gen atau produk gen, untuk mengurangi dampak

negatif organisme tertentu sehingga bermanfaat bagi manusia. Beberapa

spesies Trichoderma sp. yang efektif sebagai penghambat pertumbuhan

patogen di tanah dan meningkatkan kesehatan tanaman, diantaranya adalah

Trichoderma harzianum dan Trichoderma asperellum (Singh et al., 2014).

Trichoderma asperellum dapat tumbuh dengan baik pada media PDA (Potato

Dextrose Agar) pada suhu 28oC. Koloni berwarna hijau konsetris (terbentuk

dua lingkaran) dengan bundaran kecil berwarna putih di tengah koloni (Santos

et al., 2012).

2. Ekologi Trichoderma sp.

Salah satu kendala dalam pemanfaatan Trichoderma sp. sebagai agen

pengendalian hayati penyakit tanaman adalah rendahnya kemampuan

kolonisasi pada akar tanaman akibat faktor lingkungan yang kompleks dan

tidak tersedianya isolat yang cukup virulen sehingga pengendalian tidak dapat

berkelanjutan. Beberapa hasil penelitian menunjukkan tingkat kolonisasi akar

13

oleh Trichoderma sp. sangat menentukan keberhasilan pengendalian patogen

tanaman (Nurbailis dan Martinius, 2011).

Kemampuan kolonisasi Trichoderma sp. di tanah tidak hanya tergantung

pada strain fungi tetapi tergantung juga pada faktor biotik dan abiotik

lingkungan. Selain itu, kolonisasi Trichoderma sp. pada permukaan akar dan

jaringan akar kemungkinan besar tidak hanya tergantung pada strain fungi

tetapi juga jenis spesies tanaman. Pemberian berbagai spesies Trichoderma sp.

pada tanaman tertentu mampu mengurangi patogen tanaman dengan efektif

(Akrami et al., 2013).

3. Peranan Trichoderma sp.

Beberapa fungi telah terbukti memiliki kemampuan dalam menyerap

logam, salah satunya Trichoderma sp. Biosorpsi logam terjadi karena adanya

gugus amino yang terdapat pada fungi yang dapat mengikat logam seperti Pb2+.

Peristiwa biosorpsi pada fungi terjadi dengan mekanisme perpindahan logam

melewati membran sel (Heltina dkk., 2009). Kemampuan Trichoderma sp.

untuk mengurangi penyakit tanaman biasanya dilakukan secara langsung

dengan mekanisme antagonis, dan khususnya dengan mensekresikan enzim

kitinase dan β-1,2-glukanase. Enzim ini menghidrolisis dinding sel patogen

sehingga menghambat pertumbuhan fungi patogen (Komy et al., 2015).

Kitinase merupakan salah satu enzim yang memiliki kemampuan

menghidrolisis kitin. Salah satu aplikasi enzim kitinase dalam bidang

bioteknologi adalah sebagai biokontrol. Tumbuhan mensekresikan enzim ini

sebagai pertahanan dalam melawan serangan organisme patogen yang dinding

14

selnya tersusun dari kitin. Hal ini karena kitin merupakan komponen utama

dinding sel fungi yang dapat didegradasi oleh enzim kitinase (Herdyastuti dkk.,

2009).

C. Karakteristik Molekuler

1. Teori DNA (Deoxyribonucleic acid)

Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah polimer nukleotida yang berisi

informasi genetik yang terdapat di dalam sel. Setiap sel organisme tertentu

memiliki urutan sekuen DNA yang spesifik. Prinsip inilah yang mendasari

identifikasi secara molekuler. Identifikasi organisme berdasarkan urutan

sekuen DNA merupakan karakterisasi urutan sekuen DNA pada genom

organisme (Syukriani, 2012).

Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan

Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang

dirancang oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick

membuat model struktur DNA yang disebut untai-ganda (double helix),

berdasarkan atas data kimia dan fisik. Untai-ganda DNA tersusun oleh dua

rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang

berlawanan (antiparalel), yaitu orientasi 5’ ke 3’ dan berorientasi 3’ ke 5’.

Kedua rantai tersebut berikatan dengan ikatan hidrogen antara basa adenin (A)

dengan timin (T), dan antara guanin (G) dengan sitosin (C). Ikatan antara

adenin dengan timin terdiri dua ikatan hidrogen, sedangkan antara guanin

dengan sitosin terdiri tiga ikatan hidrogen (Yuwono, 2005).

15

2. rDNA (DNA ribosomal)

Salah satu data molekuler yang dapat digunakan untuk mengkarakterisasi

organisme adalah urutan nukleotida rDNA. rDNA merupakan DNA yang

menyandi rRNA (18S rRNA, 5.8S rRNA, dan 28S rRNA) penyusun ribosom.

Susunan gen penyandi rRNA dalam genom organisme eukariot dibatasi oleh

daerah ITS (Internal Transcribed Spacer) sehingga urutannya berturut-turut

adalah 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, dan 28S rRNA (Muzuni, 2014).

DNA ribosomal digunakan untuk mengidentifikasi isolat fungi di tingkat

spesies. rDNA merupakan gen penyandi ribosom pada sel makhluk hidup.

Ribosom terdiri dari dua komponen, yaitu ribosom subunit kecil dan ribosom

subunit besar. rDNA menyandi ribosom subunit kecil 18S, dan subunit besar

5.8S dan 28S (Chakraborty et al., 2011).

Keakuratan dan kepastian identifikasi fungi adalah kepastian terhadap

kebenaran dalam diagnosa penyakit dan proses asosiasi dalam infeksi fungi.

Karakterisasi spesies fungi berdasarkan karakter morfologi tidak sama

spesifiknya dengan menggunakan pendekatan molekuler. Teknik molekuler

melibatkan amplifikasi gen rDNA. rDNA pasti berada di semua sel dan

memiliki nilai konservatif yang tinggi pada fungi dan kingdom lainnya

(Shahid et al., 2014).

16

3. Metode Karakterisasi Molekuler

Salah satu metode karakterisasi molekuler yang dapat dilakukan untuk

menentukan spesies/genus organisme adalah metode PCR, dengan urutan

sebagai berikut :

a. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dalam menganalisis DNA. DNA

dapat ditemukan baik pada inti sel maupun pada organel mitokondria dan

kloroplas. Ekstraksi DNA dilakukan dengan beberapa langkah yang dimulai

dengan pelisisan dinding sel dan membran inti, dan pemisahan komponen dari

berbagai komponen sel lainnya. Setiap langkah tersebut, kondisi DNA harus

stabil agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang

(Fatchiyah dkk., 2011).

Isolasi DNA dapat dilakukan dengan empat tahapan, yaitu pelisisan

dinding sel dan membran sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, dan pencucian

DNA. Pelisisan dinding sel dan membran sel dapat dilakukan secara kimia dan

secara mekanik. Secara kimia dengan menggunakan larutan buffer lisis CTAB

(Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide), sedangkan secara fisik dilakukan dengan

penggerusan. Tahapan selanjutnya, ekstraksi DNA dengan menggunakan fenol

kloroform untuk memisahkan kontaminan protein dan senyawa-senyawa

organik dari DNA. Presipitasi DNA merupakan proses pengendapan DNA

yang dapat dilakukan dengan pemberian larutan etanol 100% dan sodium

asetat. Tahap terakhir, pencucian DNA dengan menggunakan larutan etanol

17

70%. Pencucian dilakukan untuk menghilangkan garam sodium asetat sisa dari

pengendapan DNA (Muzuni, 2014).

b. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Teknologi PCR merupakan terobosan dibidang biologi molekuler yang

memungkinkan dilakukannya beragam analisis molekuler. Teknik PCR sangat

bermanfaat dalam pemeriksaan forensik DNA. Kary Mullis, seorang ahli

kimia, meraih hadiah nobel karena temuan besarnya tersebut (Syukriani, 2012).

Teknik PCR merupakan proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi

nukleotida secara in vitro. Teknik PCR dapat meningkatkan sejumlah urutan

DNA sebanyak ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107

pasang basa. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi

dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan teknik PCR adalah

menemukan cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan

meminimalkan amplifikasi urutan DNA non-target (Fatchiyah dkk., 2011).

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang, meliputi denaturasi,

penempelan primer, dan pemanjangan rantai DNA. Denaturasi merupakan

tahap pemutusan ikatan hidrogen pada DNA untai ganda, sehingga terbentuk

DNA untai tunggal. Ikatan hidrogen pada DNA dapat terputus dengan

perlakuan panas pada suhu 94oC (Syukriani, 2012).

Penempelan primer (annealing) merupakan proses menempelnya primer

pada urutan DNA target. Optimalisasi suhu annealing dilakukan dengan

menentukan suhu melting dengan mengikuti persamaan; (Tm) =

{(G+C)x4}+{(A+T)x2}. Suhu annealing biasanya 5oC di bawah Tm primer.

18

Primer yang sudah menempel pada sekuen DNA target mengindikasikan

bahwa sintesis DNA baru sudah dimulai. Faktor-faktor yang mempengaruhi

penempelan primer, diantaranya adalah banyaknya kandungan basa nitrogen

GC dan konsentrasi primer (Campbell et al., 2002).

Tahap ekstensi terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari

posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target yang

akan bergerak dari ujung-5’ menuju ujung-3’ dari untai tunggal DNA. Proses

pemanjangan DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa

nukleotida yang ditargetkan. Setiap satu kilobasa (1000 bp) yang akan

diamplifikasi, memerlukan waktu 1 menit; bila kurang dari 500 bp, hanya

diperlukan waktu 30 detik; dan pada kisaran 500-1000 bp perlu waktu 45 detik,

namun apabila lebih dari 1 kb, akan memerlukan waktu 2 menit di setiap

siklusnya. Adapun suhu ekstensi berkisar 70-72oC (Fatchiyah dkk., 2011).

Urutan nukleotida gen tertentu dapat diketahui dengan menggunakan

metode terminasi rantai dideoksiribonukleotida (atau metode Sanger). Metode

dideoksi dikembangkan oleh ahli biokimia Inggris, Frederick Sanger. Metode

ini menyintesis seperangkat untai DNA yang komplementer terhadap fragmen

DNA awal. Setiap untai diawali oleh primer yang sama dan diakhiri sebuah

dideoksiribonukleotida (ddNTP). ddNTP merupakan deoksiribonukleotida

yang tidak memiliki oksigen pada atom nomor 3. Penggabungan ddNTP

memutus untai DNA yang diisolasi, sebab ddNTP tidak memiliki gugus 3’-OH

(Campbell dan Reece, 2010).

19

Gambar 1. Proses sekuensing menggunakan metode Sanger

Ilmuwan menggunakan bioinformatika untuk menganalisis genom dan

fungsinya. Beberapa lembaga-lembaga bioinformatika yang mengelola terkait

data sekuen DNA, diantaranya adalah National Center for Biotechnology

Information (NCBI), European Molecular Biology (EMB), dan DNA Data

Bank Of Japan. Hasil sekuen DNA dapat dianalisis dengan mengunjungi salah

satu situs yang ada pada lembaga tersebut. Lembaga tersebut menyediakan

beberapa aplikasi-aplikasi yang memberikan informasi seputar DNA yang

dianalisis (Campbell dan Reece, 2010).

Beberapa aplikasi bioinformatika telah digunakan dalam menganalisis

beragam informasi terkait dengan sekuen DNA, seperti aplikasi Bioedit dan

aplikasi MEGA. Aplikasi ini dapat memberikan informasi terkait dengan

hubungan kekerabatan (filogenetik) diantara organisme. Hubungan

kekerabatan (filogenetik) diantara organisme dapat diketahui dengan

menentukan nilai similaritas sekuen DNA yang dianalisis. Nilai similaritas

DNA lebih dari 95% menunjukkan bahwa organisme yang dibandingkan

merupakan satu spesies (Henry et al., 2000). Selain itu, aplikasi ini dapat

20

menentukan situs enzim restriksi sekuen DNA organisme tertentu. Situs

pemotongan enzim restriksi yang sama pada sekuen DNA dapat

mengindikasikan bahwa sekuen DNA yang dianalisis merupakan organisme

yang sama (Muzuni, 2014).

21

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai bulan Juni

tahun 2015 di Laboratorium Unit Mikrobiologi dan Unit Genetika, Jurusan

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Halu Oleo (UHO) Kendari.

B. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksplorasi dengan

menggunakan pendekatan mikrobiologi dan molekuler.

C. Bahan Penelitian

Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat

Trichoderma sp. yang diperoleh dari koleksi Badan Penerapan Teknologi

Pertanian (BPTP) Provinsi Sulawesi Tenggara yang diisolasi dari perkebunan

kakao Konawe.

Bahan-bahan pendukung yang digunakan pada penelitian ini disajikan

pada Tabel 2.

Tabel 2. Bahan Pendukung penelitian dan fungsinyaNo Bahan Satuan Fungsi1 2 3 41 PDB (Potato Dextrose Broth) mL Sebagai media cair pertumbuhan

Trichoderma sp.2 Agar g Sebagai bahan pemadat media PDB3 PDA (Potato Dextrose Agar) - Sebagai media padat pertumbuhan

Trichoderma sp.4 Akuades mL Sebagai bahan pelarut5 Buffer CTAB (Cetyl Trimetyl

Ammonium Bromide)mL Sebagai larutan buffer lisis

6 PC (Phenol Chloroform) mL Untuk mendenaturasi protein

22

Tabel 2. (Lanjutan)No Bahan Satuan Fungsi1 2 3 47 Sodium asetat mL Untuk menambah berat jenis DNA8 Etanol 100% mL Untuk mengendapkan DNA9 Etanol 70% mL Untuk menghilangkan garam pada

DNA10 Loading dye µL Sebagai pewarna, pemberat, dan

penanda DNA saat migrasi11 Enzim RNAse µL Untuk mendegradasi RNA12 Primer µL Untuk amplifikasi gen target/bahan

sekuensing DNA13 Master Mix (dNTP, MgCl2,

buffer, Taq DNA)µL Sebagai reagen PCR (Polymerase

Chain Reaction)14 Agarose g Sebagai media migrasi DNA15 (TAE) Tris Acetat EDTA mL Sebagai larutan buffer

elektroforesis16 Etidium bromida mL Untuk memendarkan DNA

D. Alat/Instrumen Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3. Alat dan fungsi yang digunakan pada penelitianNo Alat Satuan Fungsi

1 2 3 41 Autoklaf - Untuk sterilisasi alat dan bahan secara

panas basah2 Mikroskop - Untuk mengamati sel Trichoderma sp.

3 Spektrofotometer - Untuk menentukan nilai absorbansiDNA

4 Laminar air flow - Tempat pengerjaan secara aseptis

5 Magnetic stirrer - Untuk mengaduk media secaraotomatis

6 Hot plate - Untuk memanaskan danmengencerkan media

7 Water bath - Tempat menginkubasi8 Timbangan analitik g Untuk menimbang sampel dan media

dengan ketelitian sampai 0,0000 g9 Gelas kimia mL Sebagai tempat mencampur bahan

untuk membuat media10 Cawan petri - Sebagai wadah menumbuhkan

Trichoderma sp.11 Tabung reaksi - Sebagai wadah

menumbuhkan Trichoderma sp.12 Gelas ukur mL Untuk mengukur volume larutan13 Jarum inokulasi - Untuk menginokulasi biakan14 Lampu spritus - Untuk sterilisasi dengan pemijaran

23

Tabel 3. (Lanjutan)No Alat Satuan Fungsi1 2 3 4

15 Kaca objek - Sebagai wadah menumbuhkan isolatdengan teknik slide culture

16 Kaca penutup - Untuk menutup biakan yang akandiamati

17 Rak tabung reaksi - Tempat menyimpan tabung reaksi18 Pipet tetes - Untuk memindahkan larutan19 Alu dan mortal - Sebagai alat pengerus bahan20 Sentrifugasi - Untuk memisahkan suspensi

berdasarkan berat molekul21 Mikropipet - Untuk mengambil larutan dalam

volume yang kecil (≤ 1 mL)22 Tip - Sebagai penampung larutan pada

mikropipet23 Eppendorf - Sebagai tempat mereaksikan larutan

dalam volume yang kecil (≤ 1 mL)24 Vorteks - Untuk menghomogenkan larutan25 Spin down - Untuk mengendapkan/menyatukan

larutan26 Fotoforesis - Untuk menvisualisasi pita DNA27 Bak elektroforesis - Sebagai tempat elektroforesis DNA28 Oven - Untuk menguapkan sisa larutan yang

terdapat pada DNA29 Mesin PCR - Sebagai alat reaksi PCR (Polymerase

Chain Reaction)30 Elektroforesis - Untuk memisahkan zat berdasarkan

berat molekul

E. Variabel Penelitian, Definisi Operasional, dan Indikator Penelitian

1. Variabel Penelitian

Variabel yang akan diteliti beserta data yang akan dikumpulkan dalam

penelitian ini sebagai berikut.

a. Variabel bebas : Isolat Trichoderma sp. yang diisolasi dari perkebunan

kakao Konawe

b. Variabel terikat : Karakteristik morfologi dan molekuler fagmen rDNA

isolat Trichoderma sp.

24

2. Definisi Operasional

Definisi atau batasan dari variabel yang telah ditetapkan pada penelitian

ini sebagai berikut.

a. Isolat Trichoderma sp. adalah isolat fungi yang diperoleh dari koleksi

Badan Penerapan Teknologi Pertanian (BPTP) provinsi Sulawesi

Tenggara yang diisolasi dari perkebunan kakao Konawe.

b. Karakteristik morfologi adalah karakter atau ciri isolat Trichoderma sp.

yang ditumbuhkan pada media PDA yang meliputi karakter morfologi

koloni dan karakter morfologi sel.

c. Karakteristik fragmen rDNA (ribosomal DNA) adalah karakter fragmen

rDNA hasil amplifikasi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR),

yang meliputi uji kualitas dan kuantitaas DNA genom, hasil amplifikasi

fragmen rDNA (Daerah ITS1, 5.8S, dan ITS2), urutan sekuen fragmen

rDNA, hasil penyejajaran fragmen rDNA, situs pemotongan enzim

restriksi, dan analisis pohon filogenetik.

3. Indikator Penelitian

Indikator yang digunakan dalam penelitian adalah hasil karakterisasi

morfologi koloni, morfologi sel isolat Trichoderma sp., dan hasil

amplifikasi fragmen rDNA isolat Trichoderma sp., serta hasil sekuensing.

25

F. Prosedur Penelitian

Prosedur kerja pada penelitian yaitu:

1. Sterilisasi Alat dan Media

Peralatan dan bahan yang akan digunakan pada penelitian, terlebih

dahulu disterilkan dengan metode pemanasan basah. Sterilisasi dengan

pemijaran digunakan untuk sterilisasi ose. Sterilisasi alat menggunakan

autoklaf bertekanan 1 atm 1210C, selama 30 menit. Alat-alat yang disterilkan

umumnya terbuat dari gelas. Sterilisasi media menggunakan autoklaf

bertekanan 1 atm 1210C, selama ±15-20 menit.

2. Penyiapan dan Pembuatan Media

a. Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Media yang digunakan untuk peremajaan isolat Trichoderma sp.

adalah PDA (Potato Dextrose Agar). Komposisi media PDA yaitu Agar

20 g, PDB {Potato Dextrose Broth (DifcoTM)} 24 g, dan akuades 1000

mL. Proses pembuatan media PDA yaitu sebanyak 24 g PDB, 20 g agar

dilarutkan dalam 1000 mL akuades, lalu dipanaskan di hot plate dan

dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer kemudian

disterilisasi dengan autoklaf.

b. Media PDB

Media PDB sebanyak 24 g dilarutkan dalam 1000 mL akuades.

Media dipanaskan dan dihomogenkan dengan menggunakan magnetic

stirrer, lalu disterilisasi dengan menggunakan autoklaf.

26

3. Karakterisasi Morfologi

a. Peremajaan Isolat

Ketiga isolat Trichoderma sp. diinokulasikan pada media PDA

miring dengan menggunakan jarum ose. Isolat diinkubasi pada suhu

ruang hingga terbentuk spora. Ketiga isolat Trichodema sp. yang sudah

membentuk spora diletakkan di dalam kulkas untuk menghambat

pertumbuhannya. Karakterisasi morfologi Trichoderma sp. dapat

menggunakan isolat yang terdapat PDA miring tersebut.

b. Karakterisasi Morfologi Koloni

Media PDA dipanaskan dengan menggunakan hot plate hingga

berwujud cair. Media PDA yang telah cair dituang pada cawan petri

steril dan dibiarkan hingga berwujud padat. Selanjutnya, Trichoderma

sp. diinokulasi pada cawan petri dengan menggunakan metode titik.

Isolat diinkubasi dengan suhu ruang selama 24 jam, dan diamati bentuk

koloni, warna koloni, diameter, tekstur, dan permukaan koloni.

Pengamatan dilakukan tiap 24 jam selama interval waktu 5 hari.

c. Karakterisasi Morfologi Sel

Karakterisasi morfologi sel dilakukan dengan menggunakan

metode slide culture. Media PDA dipanaskan dengan menggunakan hot

plate hingga berwujud cair. Selanjutnya, isolat diinokulasi di kaca

preparat steril dan isolat diteteskan dengan media PDA yang telah

berwujud cair serta ditutup dengan menggunakan kaca penutup. Isolat

diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, dan diamati bentuk konidia,

27

konidiofor, dan fialid. Pengamatan dilakukan setiap 24 jam selama 3

hari.

4. Karakterisasi Molekuler

a. Isolasi DNA Genom Trichoderma

Isolasi DNA genom Trichoderma sp. menggunakan metode Cetyl

Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB) yang telah dimodifikasi

(Muzuni, 2014). Sebanyak 0.2 gram miselium Trichoderma sp. digerus

dan dimasukan ke dalam eppendorf 1.5 ml. Sampel ditambahkan

dengan 600 µl buffer lisis CTAB dan larutan diinkubasi selama 30

menit pada suhu 65°C sambil dibolak-balik setiap 5 menit. Sampel

diinkubasi ke dalam es selama 5 menit lalu disentrifugasi pada 10.000

rpm, suhu 4°C, selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan

dengan 1x Volume Phenol Clorofom (PC). Selanjutnya sampel

disentrifugasi pada 10.000 rpm, suhu 4°C, selama 10 menit. Supernatan

diambil dan ditambahkan dengan 0,1 volume sodium asetat 3 M pH 5,2

kemudian ditambahkan dengan 2x volume etanol 100% lalu diinkubasi

pada suhu -20°C selama 2 jam dan disentrifugasi 10.000 rpm, suhu 4°C,

selama 20 menit. Selanjutnya pelet DNA dicuci dengan 0,5 ml etanol

70 %, lalu dikeringkan dan dilarutkan dalam 20 µl H2O.

b. Desain Primer

Sekuen rDNA dikumpulkan dari berbagai spesies Trichoderma

sp. yang diperoleh dari data GeneBank pada situs

http://www.ncbi.nlm.gov. Sekuen disejajarkan dengan program

28

ClustalW Alignment Bioedit, dan ditentukan sekuen yang memiliki

daerah homologi tinggi. Desain primer spesifik yang digunakan dalam

penelitian ini diambil dari bagian ujung 3’ 18S rRNA dan bagian ujung

5’ 28S rRNA (Gambar 2). Sekuen yang dijadikan primer terdiri dari 22

bp. Primer yang digunakan adalah Tricho-F (5’-CCGAGTTTACAACT

CCCAAACC-3’) dan Tricho-R (5’-CTGAAATGTTGACCTCGGA

TCA-3’). Primer tersebut dapat mengamplifikasi daerah ITS1, 5S

rRNA, dan ITS2. Perbedaan urutan nukleotida pada daerah tersebut

dapat mengindikasikan perbedaan spesies.

Daerah Amplifikasi

Gambar 2. Struktur Gen rRNA

c. Amplifikasi Fragmen rDNA dengan Teknik PCR

Fragmen rDNA Trichoderma sp. diamplifikasi dengan teknik

PCR. Volume total PCR sebanyak 10 µl yang terdiri dari DNA

genom/template (100 ng) sebanyak 1 µl (10µM), primer Tricho-F dan

Tricho-R masing-masing 0.5 µl, 2x master mix 5 µl, dan dH2O

sebanyak 3 µl. Program PCR terdiri atas pre-PCR pada suhu 94°C

selama 5 menit; proses PCR sebanyak 35 siklus yang meliputi

denaturasi 94°C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) 59°C

selama 30 detik, pemanjangan rantai 72°C selama 90 detik; dan post-

PCR pada suhu 72°C selama 5 menit.

Tricho-F Tricho-R

3’ 5’

29

d. Uji Kuantitas dan Kualitas DNA

1. Pembuatan Agarose 1%

Agarose ditimbang sebanyak 0.3 gram, dan agarose ditambahkan

dengan 30 ml larutan TAE (Tris Acetat EDTA). Selanjutnya, agarose

dipanaskan dengan hot plate, dan larutan dituang di bak cetakan hingga

membentuk lempengan agar yang memiliki sumuran. Lempengan agar

tersebut dimasukan ke dalam bak elektroforesis dengan posisi sumuran

berada pada kutub negatif.

2. Migrasi DNA (Teknik Elektroforesis)

DNA dengan volume 3 µL ditambahkan dengan 1 µL larutan

loading dye, dan suspensi dihomogenkan dengan menggunakan

mikropipet. Selanjutnya, suspensi dimasukan ke dalam sumuran agar,

dan diberi larutan buffer TAE 1x (Tris Acetat EDTA) hingga

lempengan agar terendam. Bak elektroforesis diberi arus listrik 1A 80

volt selama 30 menit. Lempengan agar direndam di dalam larutan

etidium bromida selama 5 menit, lalu agar direndam pula di larutan

akuades selama 5 menit. Agar divisualisasi menggunakan fotoforesis

dengan bantuan sinar ultraviolet. Pita yang berpendar di lempengan

agar mengindikasi adanya pita DNA.

3. Spektrofotometer

DNA dengan volume 5 µL dilarutkan kedalam 995 µL akuades

dengan menggunakan kuvet. Suspensi dihitung jumlah absorbansinya

30

pada gelombang 260 nm (DNA) dan gelombang 280 nm (protein).

Konsentrasi DNA dapat dihtung dengan rumus:

[DNA]= A260 x 50 µg/mL x FP (Rumus 1)

Keterangan : [DNA] : Konsentrasi DNA

A260 : Nilai absorbansi panjang gelombang 260 nm

50µg/mL : Konstanta DNA

FP : Faktor Pengenceran

e. Sekuensing

Sekuensing dilakukan dengan menggunakan alat DNA sequencer

ABI Prism 377 yang terdapat di PT. Genetika Science. Sekuensing

dilakukan dengan 1 sampel DNA yang dikombinasikan dengan primer

forward dan primer reverse. Proses pengurutan basa nukleotida dengan

mengikuti metode Sanger.

G. Analisis Data

Data yang diperoleh dari hasil karakterisasi morfologi dianalisis secara

deskriptif untuk menjelaskan karakteristik variabel penelitian, khususnya

variabel terikat. Data yang diperoleh dari hasil karakterisasi molekuler

dianalisis dengan empat jenis program, yaitu Bioedit, Nebcutter 2.0, MAFFT

(Multiple Sequence Alignment Program), dan Phydit. Aplikasi Bioedit dengan

program ClustalW Alignment untuk menganalisis kesejajaran fragmen rDNA

sampel, sedangkan aplikasi Nebcutter 2.0 untuk menganalisis situs enzim

restriksi fragmen rDNA.

Hubungan filogenetik dikonstruksi dengan program MAFFT (Multiple

31

Sequence Alignment Program) yang tersedia pada situs (http://mafft

katoh.com) untuk menganalisis filogenetik sekuen sampel. Jumlah sekuen yang

dianalisis terdiri dari 3 sekuen sampel dan 9 sekuen pembanding. Sekuen

pembanding terdiri dari Trichoderma asperellum (LC057426.1), Trichoderma

koningiopsis (FN369563.1), Trichodema gamsii (FN396558.1), Trichoderma

petersenii (Z95923.1), Trichoderma viridarium (X93987.1), Trichoderma

hamatum (FN396561.1), Trichoderma citrinoviride (AJ230663.1), Fusarium

oxsporum (LN835265.1), dan Phytophthora palmivora (AY208126.1). Jumlah

nukleotida yang berbeda pada isolat yang dibandingkan digunakan aplikasi

Phydit.

32

H. Bagan Alur Sistematika Penelitian

Skema tahapan kegiatan pada penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3. Skema Tahapan Penelitian

MorfologiSel

Koloni

Diamati

Karakter GenrRNA

Isolat Trichoderma sp.

Diremajakan

Metode Titik Slide Culture Isolasi DNA

MorfologiKoloni

Koloni

Diamati

KarakteristikMorfologi danMolekuler gen

rRNATrichoderma

PCR

Sekuensing

KarakterMorfologi

AnalisisSekuen

33

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Karakteristik Morfologi Koloni Trichoderma sp.

Isolat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari tiga isolat

Trichoderma sp. yang merupakan koleksi dari Badan Penerapan Teknologi

Pertanian (BPTP) Provinsi Sulawesi Tenggara yang diisolasi dari perkebunan

kakao Konawe. Tiga isolat Trichoderma sp. yang digunakan pada penelitian ini

diberi simbol A1, B2, dan C3.

Pengamatan morfologi koloni ketiga isolat Trichoderma sp. dilakukan

setiap hari selama 4 hari inkubasi. Parameter yang diamati pada proses

karakterisasi morfologi koloni isolat Trichoderma sp. terdiri dari bentuk

koloni, warna koloni, tekstur, diameter pertumbuhan, garis-garis radial, dan

zonasi (Gusnawaty, 2014). Karakteristik morfologi koloni dari ketiga isolat

Trichoderma sp. berdasarkan pengamatan pada media PDA tercantum pada

Tabel 4.

Tabel 4. Karakteristik morfologi koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp.pada media PDA

No. Kode Isolat A1 B2 C31 Bentuk koloni Bulat Bulat Bulat2 Warna koloni Hijau

keputihanHijaukeputihan

Hijaukeputihan

3 Tekstur Menyerupaitepung

Menyerupaitepung

Menyerupaitepung

4 Diameter 88 mm 79 mm 88,08 mm5 Garis radial Ada Ada Ada6 Zonasi Ada Ada Ada

Tabel 4 menunjukkan bahwa karakteristik morfologi koloni dari isolat

A1, B2, dan C3 memiliki persamaan dan perbedaan karakter. Persamaan

34

karakter dari ketiga isolat Trichoderma sp. meliputi bentuk koloni, warna

koloni, tekstur, garis-garis radial, dan zonasi, sedangkan perbedaan karakter

dari ketiga isolat tersebut hanya terletak pada diameter pertumbuhan koloni.

Karakteristik morfologi ketiga isolat tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.

Isolat A1, B2, dan C3 memiliki koloni yang berbentuk bulat (Gambar 4).

Bentuk koloni yang bulat disebabkan karena arah pertumbuhan hifa/miselium

vegetatif Trichoderma sp. menyebar ke segala arah pada media PDA. Hal ini

mengindikasikan pula bahwa tiap hifa/miselium Trichoderma sp. memiliki laju

pertumbuhan yang hampir sama. Hal ini sesuai dengan hasil karakterisasi

Trichoderma sp. yang dilakukan oleh Sriram et al. (2013).

Ketiga isolat Trichoderma sp. memperlihatkan warna koloni hijau

keputihan pada media PDA selama masa pertumbuhan 4 hari. Pola warna

koloni yang terbentuk pada pertumbuhan hifa ketiga isolat Trichoderma sp.

awalnya berwarna putih, dan selanjutnya membentuk warna hijau di tengah

koloni. Kedua warna koloni tersebut selalu terbentuk secara bergantian selama

pertumbuhan isolat Trichoderma sp. (Gambar 4). Warna putih pada koloni

ketiga isolat Trichoderma sp. menandakan pertumbuhan hifa vegetatif yang

mengabsorbsi nutrisi pada media PDA. Selain itu, warna hijau pada koloni

ketiga isolat Trichoderma sp. menandakan pertumbuhan hifa generatif yang

mengalami sporulasi atau memproduksi spora.

35

Gambar 4. Pengamatan karakteristik morfologi koloni isolat Trichoderma sp.pada media PDA, a: Isolat A1, b: isolat B2, c: isolat C3, 1: Zonasi,2: Garis radial.

Pola warna koloni yang terbentuk pada masa pertumbuhan koloni ketiga

isolat Trichoderma sp. menunjukkan bahwa pertumbuhan hifa vegetatif dan

hifa generatif Trichoderma sp. terjadi secara bergantian. Pola pertumbuhan hifa

ini terus berlanjut hingga seluruh permukaan media PDA tertutupi oleh hifa

Trichoderma sp. Pada akhirnya, hifa generatif isolat Trichoderma sp.

membentuk spora di semua bagian koloni. Pembentukan warna koloni tersebut

dipengaruhi media pertumbuhan yang digunakan.

Tekstur koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp. menyerupai tepung

(Gambar 4). Hal ini merupakan implikasi dari serabut-serabut hifa yang

menyerupai benang-benang dan di ujung hifa tersebut terdapat butiran-butiran

spora. Selain itu, selama pertumbuhan ketiga isolat Trichoderma sp. terbentuk

daerah zonasi dan garis-garis radial.

36

Gambar 4 yang diberi simbol angka 1 menunjukkan area zonasi yang

terbentuk pada koloni ketiga isolat Trichoderma sp. berwarna putih. Daerah

zonasi merupakan zona yang terbentuk pada bagian koloni tertentu yang

memiliki karakteristik yang berbeda dengan bagian koloni yang lain.

Terbentuknya zonasi ini disebabkan karena pola pertumbuhan hifa vegetatif

dan hifa generatif terjadi secara bergantian. Pola zonasi yang terbentuk pada

koloni dipengaruhi oleh warna spora yang diproduksi oleh kapang tertentu.

Gambar 4 yang diberi simbol angka 2 menunjukkan garis radial yang

terbentuk pada ketiga koloni Trichoderma sp. Garis radial ini merupakan garis

lurus yang terbentuk dari pusat koloni menuju ke tepi koloni. Karakter ini

dapat dijadikan salah satu bagian dari ciri khas yang dimiliki oleh koloni

Trichoderma sp. Menurut Shofiana dkk. (2015), garis radial yang berbentuk

garis lurus dari tengah koloni menuju ke tepi koloni merupakan salah satu

karakter khas dari koloni Trichoderma sp. Garis radial ini terbentuk seiring

dengan peningkatan diameter koloni Trichoderma sp.

Pengamatan diameter koloni ketiga isolat Trichoderma sp. menunjukkan

bahwa isolat A1, B2, dan C3 memiliki diameter koloni yang berturut-turut

mencapai 20,75 mm, 15,9 mm, dan 21 mm pada hari pertama. Diameter koloni

ketiga isolat Trichoderma sp. pada hari kedua mengalami peningkatan yang

dratis hingga berturut-turut mencapai 48,05 mm, 45,55 mm, dan 47,1 mm. Hari

ketiga diameter koloni ketiga isolat tersebut berturut-turut 79,15 mm, 65 mm,

74,54 mm, sedangkan hari keempat diameter koloni ketiga isolat Trichoderma

sp. berturut-turut mencapai 88 mm, 79 mm, dan 88,08 mm (Tabel 5).

37

Tabel 5. Diameter koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp. pada media PDA

IsolatDiameter (mm)

Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4A1 20,75 48,05 79,15 88B2 15,9 45,55 65 79C3 21 47,1 74,54 88,08

Tabel 5 menunjukkan bahwa pertambahan diameter koloni isolat A1, B2,

dan C3 pada hari kedua inkubasi mencapai lebih dari 2 kali lipat ukuran

diameter koloni pada hari sebelumnya, sedangkan pertambahan diameter

koloni pada hari ketiga dan keempat hanya mencapai sekitar 1 kali lipat dari

diameter koloni hari sebelumnya. Peningkatan ukuran diameter koloni pada

hari kedua disebabkan karena pada waktu tersebut Trichoderma sp. lebih fokus

pada pembentukan hifa vegetatif. Hifa vegetatif merupakan hifa yang

menempel pada substrat media dan berperan dalam mengabsorbsi nutrisi,

sehingga memperluas area penyebaran hifa tersebut.

Pertambahan ukuran diameter koloni ketiga isolat pada hari ketiga dan

keempat inkubasi dipengaruhi oleh pertumbuhan hifa generatif. Hifa generatif

merupakan hifa yang pertumbuhanya mengarah ke atas. Hifa ini berperan

dalam memproduksi spora dan mengambil oksigen dari udara. Pembentukkan

hifa ini menyebabkan penurunan pertumbuhan hifa vegetatif Trichoderma sp.

Selain itu, hari keempat inkubasi hifa vegetatif ketiga isolat Trichoderma sp.

sudah memenuhi permukaan media.

Pertambahan diameter koloni dari ketiga isolat Trichoderma sp.

mengindikasikan bahwa laju pertumbuhan koloni ketiga isolat Trichoderma sp.

tergolong cepat. Pertumbuhan koloni yang cepat merupakan salah satu ciri

yang dimiliki oleh genus Trichoderma sp. (Munir et al., 2013). Hal inilah yang

38

menjadi salah satu keunggulan yang dimiliki oleh Trichoderma sp. untuk

berkompetisi dengan fungi patogen dalam mengabsorbsi nutrisi.

B. Karakteristik Morfologi Sel Trichoderma sp.

Karakter morfologi sel yang diamati pada ketiga isolat Trichoderma sp.

terdiri dari jenis spora aseksual, bentuk konidia, warna konidia, tepi konidia,

rhizoid, tipe hifa, percabangan konidiofor, warna konidiofor, letak massa spora,

bentuk fialid, dan perkembangan spora membentuk hifa. Karakter tersebut

dapat digunakan untuk mengidentifikasi genus Trichoderma (Siddiquee et al.,

2007). Pengamatan morfologi sel ketiga isolat Trichoderma sp. dilakukan

dengan menggunakan metode slide culture. Karakteristik morfologi sel ketiga

isolat Trichoderma sp. tercantum pada Tabel 6.

Tabel 6. Karakteristik morfologi sel dari ketiga isolat Trichoderma sp. padamedia PDA

No. Karaktermikroskopis

Kode isolatA1 B2 C3

1 Spora aseksual Konidia Konidia Konidia2 Bentuk konidia Oval Oval Oval3 Warna konidia Hijau Hijau Hijau4 Tepi konidia Rata dan

HalusRata danHalus

Rata danHalus

5 Rhizoid Tidak ada Tidak ada Tidak ada6 Tipe hifa Septa Septa Septa7 Percabangan

konidioforTeratur Teratur Teratur

8 Warna konidiofor Tidakberwarna

Tidakberwarna

Tidakberwarna

9 Letak massa spora Ujung fialid Ujung fialid Ujung fialid10 Bentuk fialid Menyerupai

termosMenyerupaitermos

Menyerupaitermos

11 Perkembangankonidiosporamembentuk hifa

Membesar Membesar Membesar

39

Data pada Tabel 6 menunjukkan bahwa ketiga isolat Trichoderma sp.

yang diamati memiliki karakteristik morfologi sel yang sama. Isolat A1, B2,

dan C3 memiliki spora aseksual dengan membentuk konidia, dan belum

diketahui jenis spora seksualnya. Hal inilah yang menyebabkan Trichoderma

sp. dikelompokkan ke dalam kelas Deuteromycetes (Umrah dkk., 2009). Hasil

pengamatan karakteristik morfologi sel ketiga isolat tersebut ditampilkan pada

Gambar 5 - 7.

Gambar 5. Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat A1 menggunakanperbesaran 400x, a: Konidiofor dan massa spora, b: Fialid, C:Konidia, d: Hifa septa, e: Konidia membentuk hifa.

a b

c d e

40

Gambar 6. Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat B2 menggunakanperbesaran 400x, a: Konidiofor dan massa spora, b: Fialid, C:Konidia, d: Hifa septa, e: Konidia membentuk hifa.

a b

d e

c

41

Gambar 7. Hasil pengamatan morfologi sel pada isolat C3 menggunakanperbesaran 400x, a: Konidiofor dan massa spora, b: Fialid, C:Konidia, d: Hifa septa, e: Konidia membentuk hifa.

Gambar 5 – 7 membuktikan bahwa morfologi sel isolat A1, B2, dan C3

mempunyai karakteristik yang sama. Hal ini dapat mengindikasikan ketiga

isolat tersebut merupakan spesies yang sama. Gambar 5a, 6a, dan 7a

menunjukkan bahwa percabangan konidiofor ketiga isolat tersebut cenderung

teratur dan tidak berwarna (hialin), dan tidak terdapat rhizoid serta massa spora

terbentuk di ujung fialid. Bagian konidiofor ini berfungsi sebagai tempat

melekatnya fialid dan saluran penyebaran nutrisi ke bagian tubuh fungi yang

lain (Choi et al., 2003). Percabangan konidiofor berhubungan erat dengan

pembentukan fialid. Banyaknya percabangan konidiofor berbanding lurus

dengan peningkatan jumlah fialid. Konidia terbentuk di ujung fialid, sehingga

semakin banyak percabangan konidiofor maka laju reproduksi Trichoderma sp.

a b c

d

e

42

semakin tinggi pula. Hal inilah yang menyebabkan Trichoderma sp. memiliki

pertumbuhan yang cepat (Jayalal dan Adikaram, 2007).

Konidiofor akan berkembang membentuk fialid. Semua spesies kapang

yang tergolong ke dalam genus Trichoderma pasti memiliki fialid (Kubicek

dan Harman, 2004). Gambar 5b, 6b, dan 7b menunjukkan bahwa karakteristik

fialid pada isolat A1, B2, dan C2 memiliki fialid yang menyerupai bentuk

termos, ujungnya meruncing, dan pangkal fialid yang tumpul. Pangkal fialid

yang tumpul membantu dalam berlekatan dengan konidiofor. Massa spora

terletak di ujung fialid, dan spora akan terlepas dari fialid ketika akan

melakukan reproduksi. Isolat A1, B2, dan C3 memiliki spora dengan tipe

konidia.

Gambar 5c, 6c, dan 7c menunjukkan bahwa isolat A1, B2, dan C3

memiliki konidia yang berbentuk oval, tepi rata dan halus serta berwarna hijau.

Jenis warna yang terbentuk pada konidia dipengaruhi oleh zat pigmen dan jenis

media pertumbuhannya. Satu spesies Trichoderma sp. dapat menghasilkan

beberapa jenis warna konidia. Hal ini disebabkan karena pembentukan warna

oleh zat pigmen pada Trichoderma sp. dipengaruhi oleh faktor lingkungan

yang di sekitarnya, salah satunya adalah cahaya. Hal ini sesuai dengan hasil

karakterisasi Trichoderma sp. yang dilakukan oleh Singh et al., (2014).

Konidia pada isolat A1, B2, dan C3 berkembang membentuk hifa dengan

memperbesar ukurannya.

Konidia berperan penting dalam proses reproduksi Trichoderma sp. dan

spesies kapang lainnya yang termasuk dalam kelas Deuteromycetes. Pada

43

kondisi yang cukup nutrisi, konidia akan berkembang membentuk hifa. Hifa

merupakan kumpulan sel yang membentuk benang atau filamen pada fungi

multiseluler (kapang). Kapang mengabsorbsi nutrisi dan mengambil oksigen di

lingkungan dengan menggunakan hifa (Arora, 2004).

Gambar 5d, 6d, dan 7d menunjukkan bahwa isolat A1, B2, dan C3

memiliki hifa bersepta. Hal ini ditandai dengan terbentuknya garis horizontal

pada hifa. Menurut Hanson (2008), tipe hifa bersepta merupakan salah satu ciri

sel yang dimiliki oleh setiap spesies Trichoderma sp.

Ada beberapa tipe hifa lain pada kapang, diantaranya dapat dibagi

berdasarkan fungsinya. Hifa dapat dibedakan menjadi dua tipe, jika dibagi

berdasarkan fungsinya, yaitu hifa vegetatif dan hifa generatif. Hifa vegetatif

merupakan hifa yang menempel di permukaan substrat atau media, sedangkan

hifa generatif merupakan hifa yang mengarah ke atas yang berperan dalam

proses sporulasi dan pengambilan oksigen di udara (Misra dan Deshmukh,

2009). Pada awal pertumbuhan Trichoderma sp. hifa terbentuk dari hasil

perkembangan konidia.

Gambar 5e, 6e, dan 7e menunjukkan bahwa konidia isolat A1, B2, dan

C3 membentuk struktur filamen hifa dari konidia. Konidia berperan penting

dalam mengabsorbsi nutrisi selama pembentukan hifa tersebut. Hasil

perkembangan hifa akan membentuk miselium sehingga struktur konidia tidak

akan terlihat lagi. Konidia akan terbentuk lagi setelah terbentuk hifa generatif.

44

C. Karakteristik Molekuler fragmen rDNA Trichoderma

1. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Genom

Isolasi DNA genom ketiga isolat Trichoderma sp. dilakukan dengan

menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) yang telah

dimodifikasi. Kualitas dan kuantitas hasil isolasi DNA genom ketiga isolat

dapat diketahui dengan pengujian menggunakan metode elektroforesis dan

spektrofotometri. Elektroforesis merupakan proses pergerakan (migrasi) DNA

berdasarkan ukuran molekulnya dengan bantuan arus listrik (Yuwono, 2005).

Spektrofotometri merupakan metode pengukuran nilai absorbansi sinar ultra

violet (UV) terhadap larutan DNA.

Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa isolat A1, B2, dan C3 terbentuk

adanya pita yang tegas, tetapi masih terdapat pola smear dengan jumlah yang

sedikit (Gambar 8). Pola smear yang terbentuk dari proses visualisasi

elektroforesis DNA genom ketiga isolat Trichoderma sp. menunjukkan masih

adanya senyawa- senyawa kontaminan baik RNA maupun protein.

Terbentuknya pita (band) menunjukkan bahwa DNA genom ketiga isolat

Trichoderma sp. telah berhasil diisolasi. Pita yang tegas pada hasil

elektroforesis menunjukkan bahwa ketiga isolat Trichoderma sp. memiliki

kualitas yang baik. Selain itu, ketebalan pita yang terbentuk pada elektroforesis

dapat menunjukkan kuantitas konsentrasi DNA genom.

45

Gambar 8. Hasil elektroforesis DNA genom isolat Trichoderma sp. pada gelagarose 1%, 1: Isolat A1, 2: Isolat B2, 3: Isolat C3.

Gambar 8 menunjukkan bahwa hasil isolasi DNA genom ketiga isolat

Trichoderma sp. memiliki konsentrasi DNA yang cukup tinggi. Konsentrasi

DNA mempengaruhi keberhasilan proses PCR. Ketebalan pita pada masing-

masing isolat Trichoderma sp. berbeda-beda. Pita DNA yang terbentuk, jika

dilihat dari ketebalanya berturut-turut adalah isolat A1, C3, dan B2 (Gambar

8). Isolat A1 terbentuk pita yang lebih tebal, dibandingkan dengan kedua isolat

C3 dan B2. Ketebalan pita DNA genom pada hasil elektroforesis

mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA genom A1 lebih tinggi dibandingkan

dengan kedua isolat lainnya, sedangkan konsentrasi DNA genom B2 paling

rendah diantaranya kedua isolat lainnya. Selain itu, kualitas dan kuantitas DNA

genom dapat ditentukan berdasarkan nilai absorbansi pada alat

spektrofotometer.

Kualitas dan kuantitas DNA genom dapat ditentukan berdasarkan

kemurnian dan konsentrasi DNA. Kemurnian DNA genom dapat dihitung

berdasarkan perbandingan nilai absorbansi DNA dengan nilai absorbansi

protein. Pengukuran nilai absorbansi DNA genom dan protein menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang masing-masing λ 260 nm dan λ

1 2 3

Pita DNA

Pola smear

46

280 nm. Penggunaan panjang gelombang tersebut karena proses penyerapan

maksimum sinar UV terhadap pita DNA dan protein masing-masing dengan

panjang λ 260 nm dan panjang λ 280 nm. DNA murni dapat menyerap cahaya

ultraviolet karena adanya basa purin dan pirimidin.

Hasil pengukuran spektrofotometer menunjukkan bahwa nilai kemurnian

DNA genom isolat A1 adalah 1,73, sedangkan kemurniaan DNA genom isolat

B2 dan C3 masing-masing 1,74 (Tabel 7). Hal ini menunjukkan bahwa hasil

isolasi DNA genom ketiga isolat tersebut masih mengandung senyawa

kontaminan berupa protein. Nilai tersebut membuktikan bahwa pola smear

yang terbentuk pada hasil elektroforesis DNA genom ketiga isolat merupakan

kontaminan protein. Konsentrasi DNA genom isolat A1 sebesar 1.710 ng/µL,

sedangkan konsentrasi DNA genom isolat B2 dan C3 masing-masing sebesar

1.420 ng/µL dan 1.480 ng/µL (Tabel 7).

Nilai kemurniaan DNA berdasarkan hasil perbandingan nilai absorbansi

DNA dan protein terletak pada rasio 1,8-2,0. Nilai rasio >2,0 menunjukkan

bahwa DNA genom yang diisolasi masih mengandung senyawa kontaminan

berupa RNA, sedangkan nilai rasio <1,8 menunjukkan bahwa DNA genom

yang diisolasi masih mengandung senyawa kontaminan berupa protein

(Fatchiyah dkk., 2011).

Tabel 7. Hasil penghitungan spektrofotometri DNA genom

No SampelAbsorbansi

Kemurnian DNA(ng/µl)λ 260 λ 280

1 Blanko 0,00 0,00 - -2 Isolat A1 0,171 0,099 1,73 1.7103 Isolat B2 0,142 0,082 1,74 1.4204 Isolat C3 0,148 0,085 1,74 1.480

47

2. Amplifikasi Fragmen rDNA dengan Teknik PCR

Hasil visualisasi elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen rDNA

ketiga isolat Trichoderma telah berhasil diamplifikasi dengan teknik PCR

menggunakan primer Tricho-F dan Tricho R. Hal ini ditandai dengan

terbentuknya pita (band) yang jelas pada gel elektroforesis (Gambar 9).

Nukleotida rDNA yang diamplifikasi oleh primer tersebut hanya pada daerah

ITS1, 5.8S rRNA, dan ITS2.

Gambar 9. Hasil elektroforesis amplifikasi fragmen rDNA ketiga isolatmeng- gunakan primer Tricho-F dan Tricho-R pada gel agarose1%. M : Marker 1 kb, 1: Isolat A1, 2: Isolat B2, 3: Isolat C3.

Hasil amplifikasi fragmen rDNA dengan teknik PCR menggunakan

primer Tricho-F dan Tricho R menunjukkan bahwa ketiga isolat Trichoderma

sp. memiliki urutan nukleotida sekitar 500 bp. Hal ini sesuai dengan dugaan

bahwa produk PCR berukuran sekitar 500 bp karena primer Tricho-F dan

Tricho-R yang digunakan dalam teknik PCR didesain mengapit daerah ITS1,

5S rRNA, dan ITS2 rRNA dengan ukuran total 532 bp.

Keberhasilan amplifikasi DNA dengan menggunakan teknik PCR dapat

dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya adalah kemurnian DNA

cetakan/template dan spesifitas primer. Tingkat kemurnian DNA cetakan

sangat penting, karena tingkat kemurnian suspensi DNA yang rendah dapat

1000 bp750 bp

500 bp

250 bp

M 1 2 3

Pita fragmenrDNA

48

mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim DNA

polimerase (Fatchiyah, 2011). Secara umum, panjang primer berkisar antara

18-30 basa. Ukuran primer yang kurang dari 18 basa akan menyebabkan

spesifitas primer rendah dan memungkinkan terjadinya penempelan primer di

tempat lain yang tidak diinginkan (mispriming), sehingga berpengaruh

terhadap spesifisitas dan efisiensi proses PCR (Handoyo dan Rudiretna, 2001).

3. Urutan Sekuen Fragmen rDNA Isolat Trichoderma sp.

Hasil sekuensing dengan menggunakan alat sequencer ABI Prism

menunjukkan bahwa nukleotida yang berhasil diamplifikasi oleh primer

Tricho-F dan Tricho-R terdiri daerah ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, dan beberapa

nukleotida 28S rRNA. Nukleotida isolat A1 yang berhasil diamplifikasi 528

bp, sedangkan isolat B2 dan C3 nukleotida yang teramplifikasi masing-masing

sebanyak 529 bp (lampiran 7).

Isolat A1 dan B2 memiliki fragmen ITS 1 masing-masing sebanyak 183

bp, sedangkan fragmen isolat C3 sebanyak 182 bp. Perbedaan urutan fragmen

ITS1 isolat A1, B2, dan C3 terletak pada urutan ke 09-12 berdasarkan hasil

penyejajaran menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit (Gambar 10).

Urutan nukleotida ke 09-12 fragmen ITS1 isolat A1 terdiri dari TACA,

sedangkan isolat B2 dan C3 memiliki urutan nukleotida yang ke 09-12 masing-

masing ACAA dan ACA (Gambar 10).

Gambar 10. Hasil penyejajaran sekuen fragmen ITS1 isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit

49

Isolat A1, B2, dan C3 memiliki urutan nukleotida gen 5.8S rRNA dan

fragmen ITS2 yang sama. Gen 5.8S rRNA ketiga isolat tersebut memiliki

urutan nukleotida masing-masing sebanyak 156 bp (Gambar 11). Isolat A1, B2,

dan C3 memiliki fragmen ITS2 masing-masing sebanyak 175 bp (Gambar 12).

Persamaan urutan nukleotida pada urutan ITS diantara organisme dapat

mengindikasikan tingkat kekerabatan yang sangat dekat.

Gambar 11. Hasil penyejajaran sekuen gen 5.8S rRNA isolat A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit

Gambar 12. Hasil penyejajaran sekuen fragmen ITS2 A1, B2, dan C3menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit

Beberapa urutan nukleotida gen 28S rRNA ketiga isolat teramplifikasi

oleh primer Tricho-F dan Tricho-R. Gen 28S rRNA bukan merupakan sekuen

target pada penelitian ini. Hal ini disebabkan karena beberapa urutan

nukleotida gen 28S rRNA termasuk dalam urutan nukleotida primer Tricho-R.

Gen 28S rRNA Isolat A1 yang teramplifikasi oleh primer tersebut sebanyak 14

bp, sedangkan isolat B2 dan C3 masing-masing sebanyak 15 bp dan 16 bp

(Gambar 13). Perbedaan beberapa nukleotida gen 28S rRNA pada isolat A1,

B2, dan C3 disebabkan oleh adanya proses sekuensing. Hal ini didukung

karena ketiga isolat tersebut menggunakan satu primer yang sama.

50

Gambar 13. Hasil penyejajaran beberapa nukleotida gen 28S rRNA isolat A1,B2, dan C3 yang teramplifikasi oleh primer Tricho-F dan Tricho-Rmenggunakan program ClustalW Alignment Bioedit

4. Hasil Penyejajaran Fragmen rDNA

Hasil penyejajaran fragmen rDNA ketiga sampel dari berbagai spesies

Trichoderma sp. dengan menggunakan program ClustalW Alignment Bioedit

menunjukkan terbentuknya tanda gap (-) (Gambar 14). Tanda gap tersebut

mengindikasikan terjadinya mutasi pada fragmen rDNA sampel. Mutasi gen

merupakan perubahan yang terjadi pada nukleotida DNA yang mengkode suatu

gen tertentu. Mutasi gen pada dasarnya merupakan mutasi titik. Mutasi titk

merupakan perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan basa dalam

satu gen tunggal.

Gambar 14. Hasil Penyejajaran fragmen rDNA isolat dengan berbagai sekuenfragmen rDNA spesies Trichoderma menggunakan programClustalW Alignment Bioedit

Hasil penyejajaran dengan menggunakan program ClustalW Alignment

Bioedit sekuen fragmen rDNA dimulai dengan urutan nukleotida ke-50.

51

fragmen rDNA A1 dan C3 urutan nukleotida ke-58 dan ke-614 terlihat adanya

tanda gap. Hal ini menunjukkan bahwa kedua gen tersebut diestimasi

mengalami mutasi dalam tipe delesi, karena hilangnya salah satu nukleotida

pada gen tersebut (Hidayat dkk., 2008). Selain itu, urutan nukleotida ke-58

pada sekuen B2 berupa basa nitrogen timin (T), sedangkan pada gen rRNA

spesies yang lain berupa basa nitrogen adenin (A). Perbedaan tersebut

kemungkinan besar menunjukkan bahwa fragmen rDNA B2 mengalami proses

mutasi dengan tipe substitusi. Mutasi tipe substitusi menunjukkan bahwa

terjadinya pergantian urutan nukleotida yang bukan urutan nukleotida

normalnya. Peristiwa mutasi dapat menimbulkan terjadinya keragaman genetik

pada makhuk hidup.

5. Situs Pemotongan Enzim Restriksi

Situs pemotongan enzim restriksi fragmen rDNA ketiga isolat

Trichoderma sp. dengan menggunakan program Nebcutter menunjukkan

bahwa ketiga isolat memiliki situs pemotongan enzim restriksi yang sama.

Enzim restriksi merupakan enzim yang memiliki kemampuan memotong

fragmen DNA pada urutan basa nukleotida tertentu. Situs-situs pemotongan

enzim restriksi dapat digunakan sebagai penanda molekuler organisme spesies

lokal tertentu, sehingga membantu dalam proses identifikasi secara cepat tanpa

melakukan proses sekuensing. Hasil analisis program NEBcutter menunjukkan

bahwa fragmen ITS A1, B2, dan C3 memiliki situs pemotongan enzim restriksi

endonuklease yang sama. Enzim-enzim restriksi endonuklease yang memotong

fragmen rDNA, diantaranya adalah HaeII, AleI, dan EcoRI (Gambar 15).

52

Posisi pemotongan yang dapat dikenali tiap enzim restriksi bersifat khas.

Hal inilah yang menyebabkan situs pemotongan enzim restriksi dapat

digunakan untuk mengidentifikasi organisme tertentu. Situs pemotongan yang

dikenali oleh enzim restriksi EcoRI pada ketiga isolat tersebut terletak pada

urutan nukleotida yang ke-261, sedangkan enzim restriksi AleI dan HaeII

mampu memotong pada urutan nukleotida berturut-turut yang ke-394 dan 97.

Situs pemotongan ketiga enzim restriksi tersebut berbeda-beda tiap organisme.

Gambar 15. Enzim restriksi fragmen rDNA pada daerah ITS1, 5S, ITS2 isolatA1, B2, dan C3 menggunakan program NEBcutter 2.0

6. Analisis Pohon Filogenetik

Pohon filogenetik merupakan ilustrasi evolusi yang terjadi pada

sekelompok organisme tertentu yang berasal dari nenek moyang yang sama,

yang disusun berdasarkan kesamaan dalam beberapa hal, seperti gen dan

protein (Ochieng et al., 2007). Hal ini bertujuan untuk mengetahui hubungan

53

kekebaratan antar organisme. Hubungan kekerabatan ketiga isolat Trichoderma

sp. dianalisis dengan menggunakan program MAFFT yang tersedia pada situs

(http://mafft katoh.com).

Konstruksi pohon filogenetik pada penelitian ini berdasarkan urutan

sekuen fragmen rDNA yang terdiri dari daerah ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 dengan

menggunakan metode algoritma Neighbour-joining 1000x replikasi. Nilai yang

tertera pada percabangan pohon filogenetik merupakan nilai bootstrap. Nilai

bootstrap menunjukkan tingkat keakuratan percabangan pada pohon

filogenetik (Muzuni, 2014).

Jumlah sekuen yang dianalisis pada pohon filogenetik ini berjumlah 12

sekuen yang terdiri atas 3 sekuen sampel, dan 9 sekuen pembanding. Sekuen

pembanding terdiri dari 7 isolat spesies Trichoderma, yang terdiri dari

Trichoderma asperellum. T. koningiopsis, T. gamsii, T. petersenii, T.

viridarium, T. hamatum, dan T. citrinoviride, dan 2 sekuan dari genus lain yang

termasuk fungi patogen, yang terdiri dari Fusarium oxysporum dan

Phytophthora palmivora (Gambar 16).

54

Gambar 16. Pohon filogenetik yang menunjukkan hubungan kekerabatan antaraisolat A1, B2, dan C3 dengan beberapa spesies pembandingberdasarkan urutan sekuen ITS1, 5.8S rRNA, dan ITS2. Angkapada percabangan menunjukkan nilai bootstrap (%) berdasarkanalgoritma Neighbour-joining dengan 1000x replikasi, I : Kelompokpertama, II: Kelompok kedua.

Gambar 16 menunjukkan bahwa hasil konstruksi pohon filogenetik isolat

sampel dengan 9 isolat pembanding berdasarkan urutan sekuen ITS1, 5.8S

rRNA, dan ITS2 terbentuk enam kelompok. Klad pertama terdiri dari isolat A1,

isolat B2, isolat C3, dan Trichoderma asperellum (LC057426.1), klad kedua

terdiri dari T. koningiopsis (FN396563.1), T. gamsii (FN396558.1), T.

petersenii (Z95923.1), dan T. viridarium (X93987.1). Klad ketiga, keempat,

kelima, dan keenam merupakan kelompok tunggal dengan anggotanya masing-

masing terdiri dari T. hamatum (FN396561.1), T. citrinoviride (AJ230663.1),

Fusarium oxysporum (LN835265.1), Phytophthora palmivora (AY208126.1).

I

II

III

IV

V

VI

55

Isolat A1, B2, C2, dan Trichoderma asperellum (LC057426.1)

membentuk satu kelompok (Gambar 16). Hal ini menunjukkan bahwa ketiga

isolat sampel memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan anggota

spesies Trichoderma asperellum daripada isolat pembanding lainnya.

Klad pertama pada pohon filogenetik tersebut terbentuk tiga sub-klad,

yakni sub-klad pertama terdiri dari isolat B2 dengan Trichoderma asperellum,

sub-klad kedua terdiri dari anggota sub-klad pertama dengan isolat C3 (Nilai

bootstrap 97%), dan sub-klad ketiga terdiri dari anggota sub-klad kedua

dengan isolat A1 (Nilai bootstrap 92%). Hal ini menunjukkan bahwa isolat B2

memiliki tingkat kemiripan yang lebih tinggi dengan Trichoderma asperellum,

dibandingkan dengan isolat A1 dan C3.

Sub-klad kedua mengindikasikan bahwa isolat C3 memiliki tingkat

kemiripan yang lebih tinggi dengan Trichoderma asperellum dibandingkan

dengan isolat A1. Nilai bootstrap pada percabangan yang terbentuk pada sub-

kelompok kedua dan ketiga masing-masing sebesar nilai 97% dan 92%. Hal ini

menunjukkan bahwa peluang terjadinya perubahan susunan percabangan pada

sub-kelompok kedua dan ketiga masing-masing sebesar 3% dan 8%. Nilai

bootstrap ≥ 85% menunjukkan bahwa susunan kelompok bersifat konsisten

dan peluang perubahan susunan kelompok sangat rendah (Lestari, 2013).

Dua kelompok isolat pembanding yang termasuk fungi patogen

membentuk jarak kelompok yang jauh dengan tiga isolat sampel (Gambar 16).

Hal ini menunjukkan bahwa ketiga isolat sampel memiliki hubungan

kekerabatan yang cukup jauh dengan Phytophthora plamivora dan Fusarium

56

oxysporum. Kekerabatan organisme yang cukup jauh dapat mengindikasikan

bahwa tingkat similaritas diantara organisme tersebut semakin rendah pula.

Kekerabatan yang dekat antara isolat A1, B2, C3 dan Trichoderma

asperellum (LN057426.1) didukung dengan nilai similaritas dan nukleotida

yang berbeda. Isolat A1, B2, dan C3 memiliki kemiripan terhadap

Trichoderma asperellum (LN057426.1) dengan nilai similaritas berturut-turut

99,42%, 100%, dan 99,61%. Nilai similaritas tersebut diperoleh dengan

menggunakan aplikasi Phydit dengan ketentuan bahwa tanda gap (-)

dinyatakan sebagai sekuen yang berbeda.

Nilai tersebut merupakan nilai similaritas paling tinggi diantara isolat-

isolat pembanding lainnya. Selain itu, jumlah nukleotida yang berbeda antara

isolat A1, B2, dan C3 dengan Trichoderma asperellum (LN057426.1) berturut-

turut sebanyak 3 bp, 0 bp, dan 2 bp (Tabel 8). Hal ini membuktikan bahwa

ketiga isolat tersebut memiliki kemiripan yang sangat tinggi dengan

Trichoderma asperellum (LN057426.1), dan nilai tersebut mengindikasikan

kesesuaian antara susunan percabangan pohon filogenetik isolat sampel dengan

isolat pembanding.

Kekerabatan yang cukup jauh antara isolat A1, B2, dan C3 dengan fungi

patogen Fusarium oxysporum (LN835265.1) dan Phytophthora palmivora

(AY208126.1) didukung dengan nilai similaritas antara isolat A1, B2, dan C3

dengan kedua fungi patogen tersebut hanya mencapai masing-masing sekitar

84% dan 55% (Tabel 8). Kekerabatan tiap organisme yang semakin jauh dapat

mengindikasikan semakin banyak pula perbedaan karakteristik organisme

57

tersebut. Hal ini dapat ditunjukkan pada karakteristik Trichoderma sp. yang

bersifat antagonis, sedangkan Fusarium oxysporum dan Phytophtora palmivora

bersifat sebagai patogen terhadap tanaman.

Menurut Henry et al. (2000), nilai similaritas 95–100% dinyatakan

sebagai satu spesies yang sama. Hasil penyejajaran ini diidentifikasi bahwa

isolat Trichoderma A1, B2, dan C3 merupakan anggota spesies Trichoderma

asperellum.

58

Tabel 8. Nilai similaritas (%) dan jumlah nukleotida berbeda dalam sequence gen rRNA (ITS 1, 5.8S, ITS 2) antara ketiga isolatTrichoderma sp. dan isolat pembanding.

ISOLAT

Tri

chod

erm

aas

pere

llum

LC

0574

26.1

B2

A1

C3

T. h

amat

umF

N39

6561

.1

T. c

itrin

ovir

ide

AJ2

3066

3.1

T.v

irid

ariu

mX

9398

7.1

T.p

eter

seni

iZ

9592

3.1

T.

koni

ngio

psis

FN

3965

63.1

T.g

amsi

iF

N39

6558

.1

F.o

xysp

orum

FN

8352

65.1

P. p

alm

ivor

aA

Y20

8126

.1

T. asperellumLC057426.1

--- 0/514 3/514 2/513 5/511 38/508 12/513 10/513 10/512 10/512 68/453 213/480

B2 100.00 --- 3/514 2/513 5/511 38/508 12/513 10/513 10/512 10/512 68/453 213/480

A1 99.42 99.42 --- 1/513 8/511 41/508 15/513 13/513 13/512 13/512 69/453 213/480

C3 99.61 99.61 99.81 --- 7/510 40/507 14/512 12/512 12/511 12/511 69/453 213/480

T. hamatum FN396561.1 99.02 99.02 98.43 98.63 --- 41/506 16/511 13/511 13/511 13/511 69/453 212/478T. citrinovirideAJ230663.1

92.52 92.52 91.93 92.11 91.90 --- 46/507 44/508 44/507 44/507 80/463 254/526

T. viridarium X93987.1 97.66 97.66 97.08 97.27 96.87 90.93 --- 3/515 3/514 3/514 68/455 213/480

T. petersenii Z95923.1 98.05 98.05 97.47 97.66 97.46 91.34 99.42 --- 0/515 0/515 69/456 211/481T. koningiopsisFN396563.1

98.05 98.05 97.46 97.65 97.46 91.32 99.42 100.00 --- 0/515 69/456 211/481

T. gamsii FN396558.1 98.05 98.05 97.46 97.65 97.46 91.32 99.42 100.00 100.00 --- 69/456 212/482F. oxysporumFN835265.1

84.99 84.99 84.77 84.77 84.77 82.72 85.05 84.87 84.87 84.87 --- 207/449

P. palmivora AY208126.1 55.63 55.63 55.63 55.63 55.65 51.71 55.63 56.13 56.13 56.02 53.90 ---

Keterangan : Angka yang berwarna kuning menunjukkan nilai similaritas, sedangkan angka yang berwara biru menunjukkan jumlahnukleotida yang berbeda.

59

V. PENUTUP

A. Simpulan

Berdasarkan pembahasan dari hasil penelitian ini, maka dapat

disimpulkan sebagai berikut:

1. Karakteristik morfologi koloni isolat A1, B2, dan C3 berwarna hijau

keputihan, tekstur menyerupai tepung, terdapat garis radial dan zonasi serta

zona pertumbuhan, sedangkan karakteristik morfologi sel Isolat A1, B2, dan

C3 memiliki konidia yang oval dan berwarna hijau, fialid menyerupai

bentuk termos, tipe hifa bersepta, percabangan konidiofor yang cenderung

teratur dan tidak berwarna, dan konidia akan membesar ketika membentuk

hifa. Karakteristik ini mencirikan karakter dari spesies Trichoderma sp.

2. Urutan nukleotida fragmen rDNA isolat A1 sebanyak 528 bp, dan urutan

nukleotida fragmen rDNA isolat B2 dan C3 masing-masing 529 bp. Hasil

karakterisasi molekuler fragmen rDNA ketiga isolat diidentifikasi sebagai

anggota dari spesies Trichoderma asperellum.

B. Saran

Penelitian ini hanya sebatas mengidentifikasi spesies Trichoderma sp.

lokal yang terdapat di perkebunan kakao Konawe, sehingga saran yang dapat

diajukan dari hasil penelitian ini adalah perlunya penelitian lebih lanjut tentang

uji fisiologis dan uji antagonis serta isolasi gen unggul Trichoderma sp. untuk

menentukan efektivitas pembasmian fungi patogen pada tanaman kakao yang

terdapat di perkebunan kakao Konawe Sulawesi Tenggara.

60

DAFTAR PUSTAKA

Akrami, M., Khiavi, H. K., Shikhlinski, H., and Khoshvahgtei, H., 2013,Biocontrolling Two Pathogens of Chickpea Fusarium solani and Fusariumoxysporum by Different Combinations of Trichoderma harzianum,Trichoderma asperellum and Trichoderma virens Under Field Condition,International Journal of Microbiology Research, 1 (2) : 51

Arora, D. K., 2004, Fungal Biotechnology in Agricultural, Food, andEnviromental Applications, Marcell Dekker, New York.

Asrul, 2009, Uji Daya Hambat Jamur Antagonis Trichoderma spp. dalamFormulasi Kering Berbentuk Tablet Terhadap Luas Bercak Phytoptorapalmivora pada Buah Kakao, J. Agrisains, 10 (1) : 22

Azis, A. I., Rosmana, A., dan Dewi, V. S., 2013, Pengendalian Penyakit HawarDaun Phytoptora pada Bibit Kakao dengan Trichoderma asperellum, JurnalFitopatologi Indonesia, 9 (1) : 15-16

Badan Pusat Satistik Konawe, 2014, Konawe dalam Angka, Primatama Sultra,Kendari.

Badan Pusat Statistik Sulawesi Tenggara, 2014, Sulawesi Tenggara dalam Angka,Primatama Sultra, Kendari.

, 2015, Sulawesi Tenggara dalam Angka, Primatama Sultra, Kendari.

Budi, S. W., Santoso, E., Wahyudi, A., 2010, Identifikasi Jenis-Jenis Fungi yangPotensial terhadap Pembentukan Gaharu dari Batang Aquilaria spp., JurnalSilvikultur Tropika, 1 (1) : 2-3

Charerri, P., Rocha, F.B., Druzhinina, I., and Degentolb, T., 2015, Systematic ofThe Trichoderma harzianum Species Complex and The Re-Identification ofCommercial Biocontrol Strains, Journal of Mycologia, 107 (3) : 568

Campbell, N. A., and Reece, J. B., 2010, Biologi Edisi Kedelapan Jilid Satu,Erlangga, Jakarta.

Campbell, N. A., Reece, J. B., and Mitchell, L. G., 2002, Biologi Edisi KelimaJilid Satu, Erlangga, Jakarta.

Chakraborty, B. N., Chakraborty, U., Sunar, K., and Dey, P. L, 2011, RAPDProfile and rDNA Sequence Analysis of Talaromyces flavus andTrichoderma species, Indian Journal of Biotechnology, 10 : 490

61

Coi, Y., Joung, G. T., Ryu, J., Choi, J. K., and Geun, Y., 2003, PhysiologicalCharacteristics of Green Mold (Trichoderma spp.) Isolated from OysterMushroom (Pleurotus spp.), Journal of Microbiology, 31 (3) : 139-140

Dhana, N. P., Lubis, L., and Lisnawita, 2013, Isolasi Jamur Oncobasidiumtheobromae P.H.B Talbot dan Keane Penyebab Penyakit Vascular StreakDieback pada Tanaman Kakao di Laboratorium, Jurnal Agroekoteknologi, 2(1) : 289

Direktorat Jenderal Perkebunan, 2014, Statistik Perkebunan Indonesia 2013-2015Kakao (Cocoa), Direktorat Jenderal Perkebunan, Jakarta.

Eldenary, M. E., El-Bondkly, A. M., Alfiky, A. E. G., and Dora, S. A., 2013, ITSSequence Analysis and Genome Shuffling of Trichoderma sp. forImproving Cellulase Activities, Journal of American Science, 9 (10): 364

Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., dan Rahayu, S., 2011, BiologiMolekular Prinsip Dasar Analisis, Erlangga, Jakarta.

Gusnawaty, H. S., Taufik, M., Triana, L., dan Asniah, 2014, KarakterisasiMorfologi Trichoderma spp. Indigenus Sulawesi Tenggara, JurnalAgroteknos, 4 (2): 89-90

Handoyo, D., dan Rudiretna, A., 2001, Prinsip Umum dan PelaksanaanPolymerase Chain Reaction (PCR), J. Unitas, 9 (1): 20-24

Hanson, J. R., 2008, The Chemistry of Fungi, The Royal Society of Chemistry,Inggris.

Heltina, D., Evelyn, dan Indriani, R., 2009. Biosorpsi Pb (II) pada JamurTrichoderma asperellum TNJ-63, Jurnal Rekayasa Proses, 3 (1): 1

Henry, T., Iwen, P. C., and Hinrichs, S. H., 2000, Identification of AspergillusSpecies Using Internal Transcribed Spacer Regions 1 and 2, Journal ofClinical Microbiology, 38 (4) : 1510-1515

Herdyastuti, N., Raharjo, T. J., Mudasir, and Marsjeh, S., 2009, Kitinase danMikroorganisme Kitinolitik: Isolasi, Karakterisasi dan Manfaatnya, Indo J.Chem, 9 (1) : 45

Hidayat, T., Kusumawaty, D., Kusdianti, Yati, D. D., Muchtar, A. A., danMariana, D., 2008, Analisis Filogenetik Molekuler pada Phyllanthus niruriL. (Euphorbiaceae) Menggunakan Urutan Basa DNA Daerah InternalTranscribed Spacer (ITS), Jurnal Matematikan dan Sains, 13 (1): 18

62

Jayalal, R. G. U., and Adikaram, N. K. B., 2007, Influence of Trichodermaharzianum Metabolites on the Development of Green Mould Disease in theOyster Mushroom, Cey. J. Sci, 36 (1) : 54-55

Komy, M. H. E., Saleh, A. A., Eranthodi, A., and Molan, Y. Y., 2015,Characterization of Novel Trichoderma asperellum Isolates to SelectEffective Biocontrol Agents Against Tomato Fusarium Wilt, Plant PatholgyJournal, 31 (1): 50

Kubicek, C. P. and Herman, G. E., 2002. Trichoderma and Gliocladium Volume 1Basic Biology, Taxonomy and Genetics, Taylor & Francis, New York.

Lestari, W. S., 2013, Keanekaragaman dan Hubungan Kekerabatan MargaAdiantum dari Kepulauan Sunda Kecil Berdasarkan Variasi Sekuen padaDNA Kloroplas (rbcL dan trnL-F), Universitas Udayana, Denpasar.

Misra, J. K. and Deshmukh, S. K., 2009, Fungi From Different Environments,Science Publisher, New York.

Motulo, H. F., Sinaga, M. S., Hartana, A., Suastika, G., dan Aswidinnoor, H.,2007, Karakter Morfologi dan Molekuler Isolat Phytoptora palmivora AsalKelapa dan Kakao, Jurnal Littri, 13 (3) : 112-113

Munir, S., Jamal, Q., Bano, K., Sherwani, S. K., Bokhari, T. Z., Khan, T. A.,Khan, R. A., Jabbar, A., and Anees, M., 2013, Biocontrol Ability ofTrichoderma, International Journal of Agriculture and Crops Sciences, 6(18) : 1246-1247

Mustafa, Z., 2011, Pengaruh Aplikasi Trichoderma spp. Terhadap Penyakit RebahBatang Rhizoctonia solani pada Persemaian Bibit Kopi Robusta, Skripsi,Universitas Jember, Hal. 7

Muzuni, 2014, Karakterisasi rDNA Anodonta sp. di Rawa Moramo Desa SumberSari Kecamatan Moramo Provinsi Sulawesi Tenggara, Jurnal Paradigma,18 (2) : 35

Nurahmi, E., Susanna, dan Sriwati, R., 2012, Pengaruh Trichoderma TehadapPerkecambahan dan Pertumbuhan Bibit Kakao, Tomat, dan Kedelai, J.Floratek, 7 : 58

Nurbailis dan Martinius, 2011, Pengaruh Kolonisasi Trichoderma spp. pada AkarBibit Pisang Terhadap Perkembangan Penyakit Layu Fusarium (Fusariumoxysporum f. Sp. Cubense), Jurnal Natur Indonesia, 13 (3) : 220

63

Ochieng, J. W., Muigai, A. W. T., and Ude, G. N., 2007, Phylogenetics in PlantBiotechnology: Principles, Obstacles and Opportunities for Resources Poor.African Journal of Biotechnology, 6 (6) : 639

Rahayu, F., Saryono, Nugroho, T. T., 2015, Isolasi DNA dan Amplifikasi PCRDaerah ITS rDNA Fungi Endofit Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis)LBKURCC69, JOM, 2 (1) : 103

Rubiyo, Purwanto, A., dan Sudarsono, 2010, Aktivitas Kitinase dan Peroksidase,Kerapatan Stomata serta Ketahanan Kakao Terhadap Penyakit Busuk Buah,Jurnal Pelita Perkebunan, 26 (12) : 104-108

Rubiyo dan Siswanto, 2012, Peningkatan Produksi dan Pengembangan Kakao(Theobroma cacao L.) di Indonesia, Buletin RISTRI, 3 (1) : 33

Tanuhadi, L., 2012, Chocology, Gramedia Widiasarana Indonesia, Jakarta.

Santos, S. D. L., Hernandez, L. E., Villasenor, F., and Pena, J. J., 2012.Production of Trichoderma asperellum T8a Spores by a Home Made SolidState Fermentation on Mango Industrial Wastes, Journal of bioresources, 7(4) : 4942

Shahid, M., Srivastava, M., Kumar, V., Singh, A., Sharma, A., Pandey, S.,Rastogi, S., Pathak, N., and Srivastava, A.K., 2014, Phylogenetic DiversityAnalysis of Trichoderma Species Based on Internal Transcribed Spacer(ITS) Marker, African Journal of Biotechnology, 13 (3) : 450

Shofiana, R. H., Sulistyowati, L., dan Muhibuddin, A., 2015, Eksplorasi JamurEndofit dan Khamir pada Tanaman Cengkeh (Syzgium aromaticum) sertaUji Potensi Antagonismenya Terhadap Jamur Akar Putih (Rigidoporusmicroporus), Jurnal HPT, 3 (11) : 79

Siddiquee, S., Guan, F. A. T. S., and Aziz, E. R., 2007, PhylogeneticRelationships of Trichoderma harzianum Based on the Sequence Analysisof the Internal Transcribed Spacer Region-1 the rDNA, Journal of AppliedScience Research, 3 (9) : 896

Singh, A., Shahid, M., and Srivastava, M., 2014, Phylogenetic Relationship ofTrichoderma asperellum Tasp/8940 Using Internal Transcribed Spacer(ITS) Sequences, International Journal of Advenaced Research, 2 (3) : 979.

Singh, A., Shahid, M., Srivastava, M., Pandev, S., Sharma, A., and Kumar, V.,2014, Optimal Physical Parameters for Growth of Trichoderma Spesies atVarying pH, Temperature and Agitation, Journal of Virology and Mycology,3 (1) : 2-4

64

Syukriani, Y., 2012, DNA Forensik, Sagung Seto, Jakarta.

Tjitrosoepomo, G., 2005, Taksonomi Umum (Dasar-Dasar Takson Tumbuhan,Universitas Gadja Mada, Yogyakarta.

Umrah, Anggraeni, T., Esyanti, R. R., dan Aryantha, I. N. P., 2009, Antagonisitasdan Efektivitas Trichoderma sp. dalam Menekan PerkembanganPhytopthora palmivora pada Buah Kakao, Jurnal Agroland, 16 (11) : 9-10

Wiryadiputra, S., 2013, Residu Pestisida pada Biji Kakao Indonesia dan ProdukVariannya, serta Upaya Penanggulannya, Jurnal Penelitian Kopi danKakao, 1 (1) : 40

Yuwono, T., 2005, Biologi Molekular, Erlangga, Jakarta.

65

LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil pengamatan morfologi koloni ketiga isolat

Gambar 17. Hasil pengamatan morfologi koloni isolat A1 pada media PDA

Gambar 18. Hasil pengamatan morfologi koloni isolat B2 pada media PDA

Gambar 19. Hasil pengamatan morfologi koloni isolat C3 pada media PDA

Hari Ke-1 Hari Ke-2 Hari Ke-3 Hari Ke-4

20.75 mm 48.05 mm 79.15 mm 88 mm

15.9 mm 54.55 mm 65 mm 79 mm

21 mm 47.1 mm 74.54 mm 88.08 mm



66

Lampiran 2. Desain primer Tricho-F dan Tricho-R

Gambar 20. Hasil penyejajaran fragmen rDNA dari berbagai spesiesTrichoderma sp. dengan menggunakan program ClustalWAlignment Bioedit, a: Tricho-F, b: Tricho-R.

a b

67

Lampiran 3. Penghitungan nilai absorbansi DNA menggunakan spektrofotometer

[DNA] = A260 x 50 µg/mL x FP

1. Isolat A1, A260 = 0,171, A280 = 0,090, FP = 200

[DNA] = 0,171 x 50 x 200

= 1.710 ng/µL

2. Isolat B2, A260 = 0,142, FP = 200

[DNA] = 0,142 x 50 x 200

= 1.420 ng/µL

3. Isolat C3, A260 = 0,148, FP = 200

[DNA] = 0,148 x 50 x 200

= 1.480 ng/µL

68

Lampiran 4. Elektroferogram hasil sequencing fragmen rDNA isolat A1

Gambar 21. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatA1 dengan primer forward

Gambar 22. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatB2 dengan primer reverse

69

Lampiran 5. Elektroferogram hasil sequencing fragmen rDNA isolat B2

Gambar 23. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatB2 dengan primer forward

Gambar 24. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatB2 dengan primer reverse

70

Lampiran 6. Elektroferogram hasil sequencing fragmen rDNA isolat C3

Gambar 25. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatC3 dengan primer forward

Gambar 26. Elektroferogram hasil pengurutan (sequencing) fragmen rDNA isolatC3 dengan primer reverse

71

Lampiran 7. Hasil multiple alignment sequences fragmen rDNA isolat A1, B2dan C3 menggunakan program MAFFT

73

Lampiran 8. Hasil penyejajaran fragmen rDNA isolat A1 menggunakan programBLASTn pada situs GeneBank NCBI

Gambar 27. Skor hasil alignment sekuen A1 dengan sekuen yang terdapat padaGeneBank

Gambar 28. Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat A1

74

Gambar 29. Hasil alignment sekuen A1 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank.

75

Lampiran 9. Hasil penyejajaran fragmen rDNA isolat B2 menggunakan programBLASTn pada situs GeneBank NCBI

Gambar 30. Skor hasil alignment sekuen B2 dengan sekuen yang terdapat padaGeneBank

Gambar 31. Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat B2

76

Gambar 32. Hasil alignment sekuen B2 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank.

77

Lampiran 10. Hasil penyejajaran fragmen rDNA isolat C3 menggunakanprogram BLASTn pada situs GeneBank NCBI

Gambar 33. Skor hasil alignment sekuen C3 dengan sekuen yang terdapat padaGeneBank

Gambar 34. Identitas isolat pada GeneBank yang paling similar dengan isolat B2

78

Gambar 35. Hasil alignment sekuen C3 dengan sekuen paling similar yangterdapat pada GeneBank.

79

Lampiran 11. Dokumentasi penelitian

Gambar 36. Preparasi bahandan alat

Gambar 37. Proses peremajaan isolat

Gambar 38. Pengamatan morfologikoloni isolat

Gambar 39. Pengamatan morfologi selisolat

Gambar 40. Tahap pengerusan sel Gambar 41. Pemberian larutan CTAB

Gambar 42. Proses sentrifugasilarutan

Gambar 43. Tahap pemberian PC

80

Gambar 44. Proses spindown Gambar 45. Tahap penghilanganetanol 70%

Gambar 46. Tahap pembuatan gelagarosa

Gambar 47. Tahap pencetakan gelagarosa

Gambar 48. Pemasukan sampelDNA pada agarosa

Gambar 49. Proses elektroforesis DNA

Gambar 50. Proses visualisasi DNA Gambar 51. Pemograman mesin PCR

skripsi - sitedi.uho.ac.idsitedi.uho.ac.id/uploads_sitedi/f1d112001_sitedi_skripsi muhamad... ·...

Documents