skripsi kajian aktivitas antimikroba ekstrak...

SKRIPSI

KAJIAN AKTIVITAS ANTIMIKROBA

EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa L.)

TERHADAP BAKTERI PATOGEN DAN PERUSAK PANGAN

Oleh

EVA H. DIREJA

F 24102097

2007

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Eva H. Direja. F24102097. Kajian aktivitas antimikroba ekstrak jintan hitam (Nigella sativa L.) terhadap bakteri patogen dan perusak pangan. Dibawah bimbingan : Dr. Ir. Sedarnawati Yasni, M. Agr. dan Ir. Elvira Syamsir, MSi.

ABSTRAK

Seiring dengan banyaknya kasus keracunan pangan oleh mikroba yang menyebabkan penyakit dan kematian serta kerugian ekonomi, perlu dilakukan usaha-usaha untuk menguranginya. Salah satu usaha tersebut adalah dengan mengaplikasikan bahan yang berpotensi sebagai antimikroba pada proses pengolahan pangan. Jintan hitam yang umumnya digunakan sebagai obat-obatan diduga memiliki aktivitas antimikroba dan berpeluang untuk digunakan sebagai pengawet bahan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas antimikroba beberapa jenis ekstrak jintan hitam terhadap bakteri patogen dan bakteri perusak makanan.

Tahapan penelitian ini meliputi penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Tahapan penelitian pendahuluan mencakup persiapan kultur mikroba, ekstraksi tunggal biji jintan hitam dengan metode refluks menggunakan air dan etanol, serta penyulingan minyak atsiri. Penelitian lanjutan mencakup ekstraksi bertingkat pada ampas penyulingan minyak atsiri jintan hitam, dengan metode refluks menggunakan beberapa pelarut organik dengan polaritas yang berbeda, yaitu heksan, etil asetat dan metanol secara berurutan. Dari keseluruhan proses ekstraksi akan diperoleh ekstrak air, ekstrak etanol, minyak atsiri, ekstrak heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol. Efektivitas senyawa antimikroba dari masing-masing ekstrak jintan hitam diuji menggunakan metode difusi agar. Pada minyak atsiri, ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol selanjutnya dilakukan pengujian nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) terhadap satu jenis bakteri. Selain itu, dilakukan juga identifikasi kualitatif komponen fitokimia terhadap ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang baik, yaitu minyak atsiri, ekstrak etanol, dan ekstrak etil asetat jintan hitam.

Minyak atsiri, ekstrak etanol dan ekstrak etil asetat dapat menghambat semua bakteri uji sehingga dianggap memiliki spektrum yang luas. Ekstrak air dan ekstrak heksan kurang efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Ekstrak air dan ekstrak heksan tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Salmonella Typhimurium. Ekstrak metanol tidak dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli.

Nilai MIC ekstrak etanol terhadap Salmonella Typhimurium adalah 0.084 % (w/w), nilai MIC minyak atsiri terhadap Bacillus cereus adalah 1.72% (w/w), nilai MIC ekstrak etil asetat terhadap Staphylococcus aureus adalah 1.88 % (w/w), dan nilai MIC ekstrak metanol terhadap Pseudomonas aeruginosa adalah 1.88 % (w/w). Pada minyak atsiri menunjukkan adanya komponen fenol dan terpenoid. Identifikasi komponen fitokimia pada ekstrak etanol menunjukkan adanya komponen fenol dan steroid dan pada ekstrak etil asetat menunjukkan adanya fenol dan flavonoid.




SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

EVA H. DIREJA

F 24102097

2007




BOGOR







SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

EVA H. DIREJA

F 24102097

Dilahirkan pada tanggal 28 Oktober 1984

Di Bandung, Jawa Barat

Tanggal lulus : 19 Desember 2006

Menyetujui,

Dr. Ir. Sedarnawati Yasni, M. Agr. Ir. Elvira Syamsir, MSi. Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II

Mengetahui,

Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Ketua Departemen ITP

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 28 Oktober

1984, sebagai anak pertama dari 3 bersaudara, dari pasangan

Bapak Sortamin Purba dan Ibu Tiaman Manik. Masa kecil

penulis hingga Sekolah Menengah Umum (SMU) dilalui di

Kota Bandung. Penulis menempuh pendidikan di Taman

Kanak-Kanak Harapan Ibu (1989-1990), Sekolah Dasar ST Melania (1990-1996),

Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama Providentia (1996-1999) dan penulis

merupakan alumni Sekolah Menengah Umum Negeri 5 Bandung (1999-2002).

Penulis diterima di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan melalui jalur

Saringan Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada tahun 2002.

Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif mengikuti berbagai kegiatan

organisasi, di antaranya Pemuda Gereja Kristen Protestan Simalungun (Pemuda

GKPS) Bogor, Parsadaan Mahasiswa Simalungun (Parmasi) IPB, Komisi

Pelayanan Anak Persekutuan Mahasiswa Kristen IPB, Koran Kampus IPB

(reporter), serta pernah menjadi Asisten Mata Kuliah Agama Kristen Protestan.

Selain itu, penulis aktif mengikuti berbagai seminar yang memperluas wawasan,

di antaranya Seminar Anak Bermasalah : Apa itu autis? (2003), Seminar

Pemantapan Road Map Penganekaragaman Pangan dan Bogasari Nugraha VII

(2004), IDF International Conference of fgW Student Forum for Milk and Milk

Product (2005) serta Seminar dan Pelatihan HACCP (2005).

Pada pertengahan tahun 2005, penulis melakukan Praktek Lapangan di PT

Indomilk Jakarta dengan topik “Mempelajari proses pengolahan dan pengawasan

mutu susu bubuk di PT Indomilk”. Sebagai syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknologi Pertanian, penulis melakukan penelitian dan menyusun laporan

penelitian tersebut sebagai skripsi dengan judul “Kajian aktivitas antimikroba

ekstrak jintan hitam (Nigella sativa L.) terhadap bakteri patogen dan perusak

pangan”.

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan anugerah-

Nya sehingga penulis dapat melaksanakan dan menyelesaikan penelitian yang

berjudul “Kajian aktivitas antimikroba ekstrak jintan hitam (Nigella sativa L.)

terhadap bakteri patogen dan perusak pangan”. Skripsi ini berisi hasil penelitian

tentang aktivitas antimikroba dari beberapa ekstrak jintan hitam. Dari penelitian

ini, dapat diketahui ekstrak biji jintan hitam yang memiliki spektrum luas dalam

menghambat bakteri uji serta nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari

beberapa ekstrak jintan hitam terhadap bakteri tertentu. Selain itu, diketahui juga

komponen fitokimia yang terdapat dalam beberapa ekstrak jintan hitam.

Banyak pihak telah terlibat dalam pelaksanaan dan penyelesaian penelitian

dan penulisan skripsi ini. Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan

yang setinggi-tingginya kepada :

1. Dr. Sedarnawati. Yasni, M. Agr. selaku Dosen Pembimbing Akademik I

dan Ir. Elvira Syamsir, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik II yang

telah banyak memberi arahan dan bimbingan sejak awal perencanaan

penelitian, penyelesaian penelitian hingga penyelesaian skripsi ini.

2. Ir. Budi Nurtama, M. Agr. selaku Dosen Penguji yang juga turut

membantu dalam pengolahan data hasil penelitian ini.

3. “DEIDENG CENTER” yang telah memberikan bantuan dana untuk

pelaksanaan penelitian ini.

4. Bapatua Sudiman Purba, Bapaanggi Pandapotan Purba, Tulang Sabarman

Damanik, Oppung Dj. F. Sinaga dan Bapatua Mulia Purba atas dukungan

moril dan materiil.

5. Mama, Papa, Daus “Uus”, Ledi “Dodot”, Tante Rus dan Uda Butar, Tante

Loisi dan Uda Pea, atas kasih sayang dan dukungan moril serta materiil.

6. Dora-ku dan Deddy, untuk kerjasama kita yang menyenangkan.

7. Mba Ari, Pak Taufik, Pak Yahya, Pak Sobirin, Bu Rubiyah, Bi Entin, Bi

Sari, Pa Udin, Pak Karna/Abah, Pak Mulyono/Pak Mul, Pak Rojak, Pak

Koko, Teh Ida dan Mas Edi, atas bantuan selama penulis bekerja di

laboratorium.

ii

8. Bu Yuspi, atas bantuan selama penulis bekerja di laboratorium dan atas

peminjaman jurnal-jurnal yang terkait dengan penelitian ini. Mba Tri, Mba

Lala, Mba Hon, dan Mba Era, atas bantuan sebagai rekan kerja di

laboratorium serta Mba Santy dan Bu Asriani, atas diskusi “2 sks” kita.

9. Inda, untuk peminjaman inkubatornya. Manginar, Olga, Christ, Icha,

Mumust, Novi, Tina untuk kebersamaan di TPG.

10. Kenot, Prasna, Samsul, buat kebersamaan sebagai kelompok C6 yang

sangat berkesan.

11. Meilina, yang setia mendengar ceritaku dan anak mie lainnya..(Tukep dll).

12. Hana Bona yang baik dan Mba Agnani Marlis.

13. Eko-TPG 39 dan Yanty-Statistik 39, atas bantuan dalam pengolahan data.

14. Elma, Evrin, Fiona, Melissa, buat persahabatan yang sehat sejak kita SMA

15. Bang Apri Girsang, Bang Pirma Girsang, Bang Bruly Tarigan, Bang Jubel

Girsang, dan Bang Kristiansen Purba, atas dukungan dan bantuan selama

kuliah dan penelitian, yang juga sudah seperti abang sendiri bagi penulis.

16. Warga Wisma Jo, Mba Lia-LP, dan anak-anak Parmasi. Simalungun Jaya!

17. Pemuda GKPS Bogor, terima kasih untuk akhir yang menyenangkan di

Pesparawi Pemuda walaupun kita kalah.

18. Teman-teman Golongan C, terima kasih untuk kebersamaan yang ceria.

19. Semua yang telah bersedia mendengarkan keluh kesah dan bersedia untuk

diganggu saat menerima sms berisi keluhan penulis selama penelitian.

20. Someone who ever loved me so deep and spent time just for supported me

in my hard times.

21. Semua pihak yang belum tersebut tetapi turut membantu hingga penelitian

ini dapat terlaksana dengan baik.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari sempurna, walaupun

demikian penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi yang

membaca.

Bogor, Desember 2006

Penulis

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ...................................................................................... i

DAFTAR ISI ..................................................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ iv

DAFTAR TABEL ............................................................................................. v

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... vi

I. PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG .......................................................................... 1

B. TUJUAN DAN SASARAN .................................................................. 2

II. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 3

A. JINTAN HITAM ................................................................................... 3

B. EKSTRAKSI ......................................................................................... 6

C. KARAKTERISTIK BAKTERI PATOGEN DAN PERUSAK ............ 12

D. SENYAWA ANTIMIKROBA ............................................................. 16

E. UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA ..................................................... 19 F. SENYAWA FITOKIMIA ..................................................................... 21

III. BAHAN DAN METODE ........................................................................... 25

A. BAHAN DAN ALAT ........................................................................... 25

B. TEMPAT DAN WAKTU ..................................................................... 25

C. METODE PENELITIAN ...................................................................... 26

D. METODE ANALISIS ........................................................................... 32

E. RANCANGAN PERCOBAAN ............................................................ 37

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 38

A. PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA UMUR 24 JAM ............... 38

B. KARAKTERISTIK BAHAN BAKU .................................................... 39

C. KARAKTERISTIK EKSTRAK ........................................................... 39

D. AKTIVITAS ANTIMIKROBA ............................................................ 44

E. IDENTIFIKASI KUALITATIF SENYAWA FITOKIMIA ................. 58

F. MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC) ......................... 60

V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................... 63

A. KESIMPULAN ..................................................................................... 63

B. SARAN ................................................................................................. 64

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 65

iv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Biji jintan hitam ............................................................................. 3

Gambar 2. Bunga jintan hitam ........................................................................ 3

Gambar 3. Tanaman jintan hitam .................................................................... 3

Gambar 4. Susunan alat penyulingan uap ........................................................ 8

Gambar 5. Susunan alat ekstraksi refluks ....................................................... 12

Gambar 6. Struktur DMSO [(CH3)2SO] ......................................................... 20

Gambar 7. Penggolongan senyawa terpenoid ................................................. 23

Gambar 8. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air ......... 29

Gambar 9. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol ... 29

Gambar 10. Diagram proses ekstraksi bertingkat dengan metode refluks ........ 31

Gambar 11. Pengaruh berbagai ekstrak jintan hitam terhadap bakteri uji ........ 46

Gambar 12. Pengaruh ekstrak air terhadap bakteri uji ...................................... 47

Gambar 13. Pengaruh ekstrak metanol terhadap bakteri uji .............................. 49

Gambar 14. Pengaruh ekstrak etanol terhadap bakteri uji ................................. 50

Gambar 15. Zona penghambatan ekstrak etanol jintan hitam terhadap

Staphylococcus aureus .................................................................. 50

Gambar 16. Pengaruh ekstrak etil asetat terhadap bakteri uji ........................... 51

Gambar 17. Pengaruh minyak atsiri terhadap bakteri uji .................................. 52

Gambar 18. Pengaruh ekstrak heksan terhadap bakteri uji ............................... 54

Gambar 19. Pengaruh masing-masing ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri

Gram positif dan bakteri Gram negatif ........................................ 56

v

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Komposisi minyak atsiri jintan hitam ................................................ 5

Tabel 2. Komposisi asam amino biji jintan hitam .......................................... 6

Tabel 3. Komposisi asam lemak biji jintan hitam ........................................... 6

Tabel 4. Pelarut yang umum digunakan untuk ektraksi .................................. 10

Tabel 5. Nilai polaritas beberapa pelarut ......................................................... 11

Tabel 6. Mekanisme aksi antibiotik ................................................................ 18

Tabel 7. Jumlah sel mikroba pada umur 24 jam .............................................. 39

Tabel 8. Hasil analisis proksimat biji jintan hitam .......................................... 39

Tabel 9. Hasil penyulingan minyak atsiri biji jintan hitam ............................. 41

Tabel 10. Karakteristik ekstrak jintan hitam ..................................................... 43

Tabel 11. Hasil analisis ragam .......................................................................... 45

Tabel 12. Jenis senyawa fitokimia yang terekstrak pada berbagai pelarut ........ 58

Tabel 13. Hasil identifikasi kualitatif senyawa fitokimia ................................. 59

Tabel 14. Nilai MIC beberapa ekstrak jintan hitam .......................................... 61

vi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Skema tahapan penelitian secara keseluruhan ............................. 70

Lampiran 2. Diagram alir persiapan kultur bakteri dan uji konfirmasi jumlah

mikroba ...................................................................................... 71

Lampiran 3. Diagram alir uji difusi sumur ....................................................... 72

Lampiran 4. Contoh perhitungan penentuan jumlah mikroba ......................... 73

Lampiran 5. Hasil uji konfirmasi jumlah sel bakteri dengan metode hitungan

cawan ......................................................................................... 74

Lampiran 6. Hasil analisis minyak atsiri tanpa penghalusan bahan ................. 75

Lampiran 7. Hasil analisis minyak atsiri dengan penghalusan bahan .............. 76

Lampiran 8. Contoh perhitungan rendemen ..................................................... 77

Lampiran 9. Hasil perhitungan standar eror ..................................................... 78

Lampiran 10. Hasil analisis ragam ..................................................................... 79

Lampiran 11. Hasil uji lanjut Duncan ................................................................ 80

Lampiran 12. Zona penghambatan ekstrak-ekstrak jintan hitam terhadap bakteri

uji (Mean ± SE) ........................................................................... 81

Lampiran 13. Penentuan nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam terhadap bakteri

Salmonella Typhimurium .......................................................... 82

Lampiran 14. Penentuan nilai MIC minyak atsiri jintan hitam terhadap bakteri

Bacillus cereus ........................................................................... 83

Lampiran 15. Penentuan nilai MIC ekstrak etil asetat jintan hitam terhadap

bakteri Staphylococcus aureus ................................................... 84

Lampiran 16. Penentuan nilai MIC ekstrak metanol jintan hitam terhadap bakteri

Pseudomonas aeruginosa .......................................................... 85

1

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Penyakit infeksi yang disebabkan oleh makanan dan air merupakan

penyebab utama penyakit dan kematian di negara berkembang (Roller, 2003).

Menurut WHO (2005), diperkirakan 2.1 juta orang meninggal sepanjang tahun

2000 yang disebabkan oleh penyakit diare karena kontaminasi pada makanan

dan air minum. Di Indonesia, terdapat 7343 kasus keracunan pangan yang

dilaporkan sepanjang tahun 2004, termasuk di dalamnya 45 kasus yang

menyebabkan kematian (Badan POM, 2005).

Penyakit infeksi yang disebabkan oleh keracunan bahan pangan

menyebabkan kerugian ekonomi, berupa biaya pengobatan dan kehilangan

produktivitas. Kerusakan pangan juga memegang peranan penting terhadap

kerugian ekonomi, tetapi sulit untuk diketahui jumlahnya (Roller, 2003). Di

USA, kerugian ekonomi yang disebabkan oleh bakteri patogen diperkirakan

mencapai $ 35 milyar pada tahun 1997 (WHO, 2005). Kasus penyakit infeksi

oleh bakteri patogen dan kasus kerusakan pangan, keduanya diakibatkan oleh

pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan dalam bahan pangan. Oleh

karena itu, penting dilakukan pengendalian terhadap pertumbuhan mikroba

dalam pangan.

Menurut Thongson et. al. (2004), salah satu strategi untuk mengurangi

jumlah kasus food-borne illnesses dapat dilakukan dengan mengaplikasikan

antimikroba pada saat proses pengolahan pangan untuk menginaktifkan

ataupun untuk mencegah pertumbuhan mikroba. Penggunaan rempah-rempah

dalam makanan, tidak hanya memberi karakteristik rasa, kepedasan, dan

warna, melainkan juga memberikan aktivitas antioksidan dan antimikroba,

farmaseutikal, dan nilai gizi.

Aktivitas antimikroba adalah kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan mikroba, baik berupa bakteriostatik maupun fungistatik (Hirasa

et. al., 1998). Sifat antimikroba dari rempah-rempah sudah diketahui dan

digunakan sejak berabad-abad yang lalu, misalnya penggunaan kayu manis

dan jintan untuk mengawetkan mumi di Mesir. Saat ini aplikasi aktivitas

2

antimikroba sudah mengalami perkembangan yang pesat karena negara-

negara industri mulai menghidupkan kembali pendekatan secara tradisional

untuk melindungi ternak dan makanannya dari penyakit, binatang perusak,

dan kebusukan (Dorman et. al., 2000). Menurut Singh et. al. (2004), sifat

antimikroba pada bahan yang ditambahkan pada makanan sangat penting

untuk meningkatkan umur simpan makanan dan untuk memberikan rasa aman

pada konsumen.

Jintan hitam atau yang dikenal dengan nama black cumin (Nigella sativa

L.) merupakan tanaman yang umumnya digunakan di Timur Tengah sebagai

obat tradisional untuk memperbaiki berbagai kondisi kesehatan manusia. Di

Indonesia, biji jintan hitam digunakan untuk mengobati sakit perut (Heyne,

1987). Sakit perut merupakan salah satu gejala yang disebabkan oleh

keracunan akibat mikroba, seperti Staphylococcus aureus. Oleh karena itu,

diduga biji jintan hitam memiliki aktivitas antimikroba dan perlu dilakukan

analisis untuk mengetahui aktivitas antimikroba jintan hitam terhadap

beberapa bakteri patogen ataupun bakteri perusak pangan.

B. TUJUAN DAN SASARAN

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas antimikroba

beberapa jenis ekstrak jintan hitam terhadap bakteri patogen dan bakteri

perusak makanan. Sasaran penelitian ini adalah pengembangan pemanfaatan

jintan hitam sebagai bahan pengawet pangan alami dan atau sebagai bahan

pangan fungsional.

3

II.TINJAUAN PUSTAKA

A. JINTAN HITAM (Nigella sativa L.)

Jintan hitam atau yang dikenal dengan nama black cumin (Nigella sativa

L.) merupakan tanaman asli dari Eropa Selatan dan banyak ditemukan di

India. Jintan hitam yang ada di Indonesia berasal dari Bombay (Heyne, 1987).

Tanaman penghasil jintan hitam merupakan tanaman yang tumbuh liar sampai

pada ketinggian 1100 m dari permukaan laut. Biasanya ditanam di daerah

pegunungan ataupun sengaja ditanam di halaman atau ladang sebagai tanaman

rempah-rempah (Achyad et. al., 2000). Berikut ini adalah gambar biji, bunga

dan tanaman jintan hitam.

Gambar 1. Biji jintan hitam

Gambar 2. Bunga jintan hitam Gambar 3. Tanaman jintan hitam

(Sumber : Anonim, 2006a)

Jintan hitam merupakan tanaman herba berbunga tahunan, tingginya 20

cm hingga 30 cm. Daunnya berwarna hijau muda. Bagian yang digunakan

sebagai obat maupun bumbu adalah biji jintan hitam. Biji jintan hitam berada

dalam buah. Jika telah matang buah tersebut akan terbuka dan bijinya akan

terkena udara sehingga warnanya berubah menjadi hitam. Biji jintan hitam

berbentuk kerucut, berwarna kehitaman yang dihasilkan oleh tanaman

berbatang lembut, berbunga biru muda atau putih, jumlah kelopak bunganya

4

lima (Anonim, 2006a). Taksonomi jintan hitam menurut Hutapea (1994) yang

dikutip oleh Syamani (2001) :

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Ranunculales

Suku : Ranunculaceae

Marga : Nigella

Spesies : Nigella sativa L.

Selain jintan hitam, dikenal juga jintan putih (Cuminum cyminum L. dari

suku Apiaceae) yang lebih sering dipakai dalam masakan walaupun dipakai

juga untuk jamu-jamu tertentu, dan dalam bahasa lnggris disebut cummin.

Jintan hitam juga berbeda dengan jintan manis (Pimpinella anisum L. dari

suku Apiaceae) yang lebih dikenal sebagai adas manis (Inggris : anise ;

Belanda : anijs). Bahkan juga berbeda dengan jintan (Carum carvi L. dari

suku Apiaceae) yang dalam bahasa Inggris disebut caraway dan dalam bahasa

Belanda disebut karwijzaad (Achyad, et. al., 2000). Beberapa nama daerah

untuk jintan hitam adalah zwarte komijn, nigelle cultivee, schwarzkummel,

black cumin (Heyne, 1987).

Jintan hitam umumnya digunakan di Timur Tengah sebagai obat

tradisional untuk memperbaiki berbagai kondisi kesehatan manusia (Al-Saleh

et. al., 2006). Biji jintan hitam biasanya ditambahkan pada makanan

tradisional dan dicampur dengan roti ataupun madu sebagai pemberi citarasa

(Al-Saleh et. al., 2006 dan Al-Jabre et. al., 2003). Menurut Baytop yang

dikutip oleh Donmez (2004), biji jintan hitam biasanya digunakan sebagai

bumbu dan umumnya dibudidayakan di Afyon, Burdur, Isparta, dan Denizli

wilayah Turki. Di India, biji jintan hitam digunakan sebagai obat dan bumbu.

Jintan hitam yang ada di Indonesia didatangkan dari Bombay, setelah

dicampur dengan bahan lain digunakan sebagai obat sakit perut (Heyne,

1987).

5

Komposisi kimia jintan hitam sangat beragam. Menurut El-Alfy yang

dikutip oleh Al-Saleh et. al. (2006), berdasarkan berat keringnya, jintan hitam

mengandung 0,4 % minyak atsiri yang terdiri dari carvon, limonene, p-

cymene, trans-anethole. Jintan hitan juga mengandung selenium, DL-α-

tokoferol, DL-γ-tokoferol, all-trans-retinol, thymoquinone, dan thymol (Al-

Saleh, 2006). Berikut ini adalah komposisi minyak atsiri jintan hitam.

Tabel 1. Komposisi minyak atsiri jintan hitam

Komposisi Persentase

Carvone 21.1% Alfa-Pinene 7.4%

Sabinene 5.5% beta-pinene 7.7% p-cymene 46.8% Lain-lain 11.5%

(Sumber : Anonim, 2006b)

Menurut Achyad et. al. (2000), kandungan biji jintan hitam antara lain

minyak atsiri, minyak lemak, dan saponin melantin, zat pahit nigelin, nigelon,

dan timokuinon. Minyak atsiri pada umumnya bersifat anti-bakteri, anti-

peradangan dan dapat menghangatkan perut. Menurut Achyad et. al. (2000),

buah dan biji jintan hitam memiliki kegunaan untuk mengatasi radang pada

selaput lendir mata penyebab penglihatan berkabut, batuk rejan, keputihan

pada gadis remaja, lepra, radang hidung, sembelit, encok, digigit

serangga/ular, dan influensa. Saat ini, beberapa komponen aktif jintan hitam

yang telah berhasil diisolasi adalah thymoquinone, thymohydroquinone,

dithymoquinone, thymol, carvacrol, nigellicine, nigellidine, nigellimine-N-

oxide and alpha-hedrin (Al-Jabre et. al., 2003).

Selain komposisi kimia dan kandungan komponen aktif yang beragam,

kandungan gizi jintan hitam cukup tinggi. Hal tersebut dilihat berdasarkan

kandungan asam amino dan asam lemaknya. Jintan hitam mengandung 8 jenis

dari 10 asam amino esensial dan 7 jenis dari 10 asam amino non-esensial.

Komposisi asam amino biji jintan hitam dapat dilihat pada Tabel 2.

6

Tabel 2. Komposisi asam amino biji jintan hitam

Asam amino Persentase Asam amino Persentase

Alanin Valin Glisin Isoleusin Leusin Prolin Treonin

3.77 3.06 4.17 4.03 10.88 5.34 1.23

Serin Asam aspartat Metionin Fenilalanin Asam glutamat Tirosin Lisin arginin

1.98 5.02 6.16 7.93 13.21 6.08 7.62 19.52

(Sumber : Babayan et. al., 1978)

Komposisi asam lemak biji jintan hitam juga cukup beragam. Selain itu

mengandung juga asam lemak esensial (essential fatty acid) yaitu asam

linoleat dan asam linolenat. Komposisi asam lemak jintan hitam dapat dilihat

pada Tabel 3 berikut ini.

Tabel 3. Komposisi asam lemak biji jintan hitam

Asam lemak Persentase (%)

Miristat (C14:0) Palmitat (C16:0) Stearat (C18:0) Oleat (C18:1) Linoleat (C18:2)(Omega-6) Linolenat (18:3n-3) (Omega-3) Arakidonat (C20:0)

0.5 13.7 12.6 23.7 57.9 2.0 1.3

(Sumber : Anonim, 2006b)

Kandungan gizi yang tinggi menyebabkan jintan hitam cepat rusak pada

kadar air yang cukup tinggi. Kerusakan umumnya disebabkan oleh kapang

karena kapang dapat memanfaatkan berbagai komponen makanan yang

kompleks seperti lipida (Fardiaz, 1992). Oleh karena itu, jintan hitam harus

ditangani secepat mungkin agar tidak mengalami kerusakan.

B. EKSTRAKSI

Ekstraksi adalah proses memisahkan komponen tertentu dari dalam

suatu bahan atau campuran baik dengan cara kimia, fisika, ataupun mekanis

(WordNet, 2006). Beberapa hal yang harus diperhatikan untuk memilih

7

metode ekstraksi adalah tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat komponen yang

akan diekstrak, sifat pelarut yang akan digunakan, penggunaan ekstrak, serta

penggunaan ulang pelarut (Houghton dan Raman, 1998). Jika telah diketahui

sifat senyawa yang akan diekstrak, ekstraksi dilakukan mengikuti prosedur

yang sudah ada dengan modifikasi seperlunya. Namun, jika bahan yang akan

diekstrak belum diketahui sifatnya, ekstraksi dilakukan untuk memperoleh

senyawa kimia pada kisaran yang luas. Hal ini dapat dicapai dengan

menggunakan pelarut yang berbeda-beda.

Pemilihan metode ekstraksi harus mempertimbangkan sifat komponen

yang akan diekstrak. Sifat komponen yang akan diekstrak meliputi polaritas,

termostabilitas, dan pengaruh pH (Houghton dan Raman, 1998). Polaritas

pelarut yang akan digunakan harus disesuaikan dengan polaritas komponen

yang akan diekstrak. Termostabilitas komponen berkaitan dengan kestabilan

komponen terhadap pengaruh panas. Hal lain yang harus dipertimbangkan

adalah pH. Jika komponen yang akan diekstrak bersifat asam seperti asam

lemak, pelarut yang bersifat basa dapat digunakan untuk mengekstraknya.

Sifat pelarut berkaitan dengan polaritas, toksisitas, kemudahan terbakar,

reaktivitas, ketersediaan dan harga. Polaritas pelarut berkaitan dengan

senyawa yang diharapkan terekstrak bersama pelarut. Toksisitas pelarut

berkaitan dengan penggunaan ekstrak lebih lanjut, jika akan diaplikasikan

pada manusia, keamanan residu pelarut yang tertinggal terhadap kesehatan

manusia harus diperhitungkan. Kemudahan pelarut untuk terbakar berkaitan

dengan suhu dan sumber panas yang akan digunakan saat ekstraksi.

Reaktivitas pelarut berkaitan dengan terjadinya pembentukan senyawa baru

selama ekstraksi berlangsung. Penggunaan kembali pelarut dan harga pelarut

berkaitan dengan nilai ekonomis pelarut.

Metode ekstraksi yang paling umum dilakukan adalah ekstraksi

menggunakan pelarut pada tekanan atmosfer dan dapat disertai aplikasi panas

(Houghton dan Raman, 1998). Namun, ada beberapa metode ekstraksi lain

yang dapat dilakukan seperti distilasi uap, Supercritical Fluid Extraction

(SFE), dan ekstraksi menggunakan gas cair.

8

1. Distilasi uap (penyulingan uap)

Penyulingan uap adalah metode paling umum digunakan untuk

memperoleh minyak atsiri. Selain dengan penyulingan, minyak atsiri dapat

juga diperoleh dengan enflurasi, maserasi dan dengan pelarut menguap.

Penyulingan merupakan cara untuk memurnikan cairan (Koster, 2001). Pada

saat penyulingan akan terjadi pemisahan komponen-komponen suatu

campuran dari dua jenis campuran atau lebih berdasarkan perbedaan tekanan

uap dari masing-masing zat tersebut. Ada 3 metode penyulingan yang

dikenal dalam industri minyak atsiri, yaitu penyulingan dengan air,

penyulingan dengan air dan uap, serta penyulingan dengan uap langsung.

Perbedaan ketiga metode tersebut hanya pada cara penanganan bahan

olahannya.

Sebagian besar minyak atsiri diperoleh dengan cara penyulingan uap.

Pada proses penyulingan dengan uap langsung, bahan yang akan disuling

diletakkan di dalam rak-rak atau saringan berlubang. Uap lewat panas

bertekanan lebih dari 1 atmosfir dilewatkan melalui pipa uap melingkar

yang berpori, yang terletak di bawah bahan dan uap bergerak ke atas melalui

bahan yang terletak di atas saringan. Susunan alat penyulingan uap dapat

dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Susunan alat penyulingan uap

(Sumber : Coconut Coast Handmade Soap Co., 2006)

9

Sebelum disuling, bahan dirajang terlebih dahulu. Bila bahan dibiarkan

utuh, minyak atsiri hanya dapat diekstraksi jika uap air berhasil melalui

jaringan tanaman dan mendesaknya ke permukaan. Hal ini terjadi secara

difusi. Jika bahan dirajang, ukuran ketebalan untuk terjadinya proses difusi

akan berkurang sehingga saat penyulingan, laju penguapan minyak atsiri

dari bahan menjadi lebih cepat. Namun, perajangan memiliki kelemahan,

yaitu jumlah rendemen minyak atsiri akan berkurang seimbang dengan laju

penguapan yang terjadi selama perajangan dan setelah perajangan serta

komposisi minyak akan berubah dan akan mempengaruhi baunya (Ketaren,

1987).

Minyak atsiri adalah konsentrat berupa cairan bersifat hidrofobik yang

mengandung komponen volatil dari tanaman (Anonim, 2006c). Minyak atsiri

dikenal juga sebagai minyak eteris. Minyak atsiri terutama terdiri dari

persenyawaan kimia mudah menguap, termasuk golongan hidrokarbon

asiklik dan hidrokarbon isosiklik serta turunan hidrokarbon yang telah

mengikat oksigen. Beberapa persenyawaan mengandung nitrogen dan

belerang. Senyawa-senyawa dalam minyak atsiri tersebut dapat digolongkan

ke dalam 4 kelompok besar yang dominan menentukan sifat minyak atsiri,

yaitu terpen, persenyawaan berantai lurus, tidak mengandung rantai cabang,

turunan benzena, dan bermacam-macam persenyawaan lainnya (Ketaren,

1987).

Bagian utama minyak atsiri adalah terpenoid, biasanya terpenoid

terdapat pada fraksi atsiri yang tersuling uap. Zat inilah yang menyebabkan

timbulnya wangi, harum, atau bau yang khas pada banyak tumbuhan

(Harborne, 1996). Beberapa komponen terpenoid yang terdapat dalam

minyak atsiri jintan hitam adalah carvone, alfa-pinene, sabinene, beta-

pinene, p-cymene (Anonim, 2006b).

Secara kimia, terpene minyak atsiri dapat dipilah menjadi dua

golongan yaitu monoterpene dan seskuiterpena. Monoterpene dan

seskuiterpen adalah isoprenoid, perbedaannya terletak pada titik didihnya.

Monoterpena memiliki titik didih 140-180 oC, sedangkan seskuiterpena

memiliki titik didih lebih tinggi dari 200 oC.

10

2. Ekstraksi dengan pelarut

Ekstraksi menggunakan pelarut dilakukan dengan mengkontakkan

bahan baku pada pelarut selama periode waktu tertentu, kemudian

dilanjutkan dengan pemisahan larutan dari ampas. Pelarut yang digunakan

dalam ekstraksi disesuaikan dengan sifat komponen yang ingin diekstrak.

Hal ini berdasarkan prinsip like dissolve like. Oleh karena itu, komponen

yang terekstrak akan memiliki kepolaran yang mirip dengan pelarut yang

digunakan dalam ekstraksi. Jika telah diketahui kepolaran senyawa yang

akan diekstrak, akan lebih mudah menentukan metode ekstraksi dan pelarut

yang digunakan. Namun, jika belum diketahui kepolaran senyawa yang akan

diekstrak, umumnya dilakukan ekstraksi bertingkat dengan beberapa pelarut

yang memiliki kepolaran yang berbeda-beda. Beberapa pelarut yang umum

digunakan untuk ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Pelarut yang umum digunakan untuk ekstraksi

Heksan Benzen, toluene Dietileter Kloroform, diklorometan Etil asetat Butanon Aseton Butanol Etanol Metanol Air Larutan asam, larutan basa

(Sumber : Houghton dan Raman, 1998) Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah heksan, etil asetat,

etanol, metanol, dan air. Berdasarkan perbandingan nilai polaritasnya, dalam

penelitian ini heksan digolongkan sebagai pelarut yang bersifat non polar,

etil asetat dan etanol digolongkan sebagai pelarut yang bersifat semi polar,

serta air dan metanol digolongkan sebagai pelarut yang bersifat polar. Nilai

polaritas beberapa pelarut dapat dilihat pada Tabel 5.

semakin ke bawah kepolaran semakin meningkat

11

Tabel 5. Nilai polaritas beberapa pelarut

Pelarut Polaritas (ε) Pelarut Polaritas (ε) Karbondioksida 0.00 Etil asetat 0.38 Pentana 0.00 Aseton 0.47 Heksan 0.00 Etanol 0.68 Toluen 0.29 Metanol 0.73 Benzen 0.32 Air 0.90

(Sumber : Moyler, 1995 dalam Ardiansyah, 2001) Metode yang sederhana dari ekstraksi dengan pelarut adalah perkolasi.

Pada perkolasi, bahan dikontakkan langsung dengan pelarut pada suhu ruang

ataupun di atas suhu ruang. Bahan yang akan diekstrak dimasukkan ke

dalam tabung yang memiliki keran dan saringan di bagian bawahnya,

kemudian pelarut dituang di atas bahan tersebut. Pada saat keran dibuka,

pelarut akan mengalir melewati bahan dan menetes sedikit demi sedikit.

Oleh karena adanya saringan, bahan tidak ikut terbawa oleh pelarut, tetapi

senyawa kimia yang diinginkan akan ikut terbawa dalam pelarut.

Hal yang menjadi kelebihan metode perkolasi adalah tidak perlu

dilakukan proses penyaringan. Kelemahan metode perkolasi adalah waktu

kontak antara bahan dan pelarut terbatas serta suhu yang digunakan rendah

sehingga komponen tidak terekstrak sempurna. Selain itu, suhu pelarut yang

digunakan kemungkinan sudah berkurang sehingga kurang efektif dalam

mengekstrak komponen.

Selain dengan cara perkolasi, ekstraksi dapat dilakukan dengan cara

refluks. Pada ekstraksi refluks, bahan yang akan diekstrak dikontakkan

langsung dengan pelarut, yaitu dengan direndam selama waktu tertentu.

Refluks digunakan jika ekstraksi dilakukan dengan aplikasi panas secara

kontinyu. Pada beberapa proses ekstraksi diperlukan aplikasi panas secara

kontinyu untuk meningkatkan ekstraksi ataupun agar terjadi reaksi kimia

tertentu, misalnya hidrolisis glikosida (Houghton dan Raman, 1998).

Pemberian panas secara kontinyu dan waktu ekstraksi yang cukup lama akan

menyebabkan pelarut berkurang karena terjadi penguapan. Untuk

menghindari hal ini, digunakan kondensor yang akan mendinginkan uap

pelarut sehingga pelarut kembali ke dalam tabung ekstraksi. Susunan alat

ekstraksi metode refluks dapat dilihat pada Gambar 5.

12

Gambar 5. Susunan alat ekstraksi refluks

Jika pelarut yang digunakan adalah air, asam, ataupun basa, sumber

panas dapat berasal dari nyala api. Namun, jika digunakan pelarut yang

memiliki titik didih kurang dari 100 oC, digunakan penangas air (water bath)

sebagai sumber panas.

C. KARAKTERISTIK BAKTERI PATOGEN DAN BAKTERI PERUSAK

PANGAN

Bahan pangan mengandung bakteri dengan jumlah dan jenis yang

berbeda-beda. Jumlah dan jenis bakteri yang terdapat dalam bahan pangan

akan menentukan umur simpan dan keamanan bahan pangan tersebut jika

dikonsumsi. Umur simpan bahan pangan cenderung dipengaruhi oleh

keberadaan bakteri pembusuk, sedangkan keamanan bahan pangan

dipengaruhi oleh keberadaan bakteri patogen. Bakteri pembusuk/perusak

pangan adalah bakteri yang dapat memecah komponen-komponen yang ada

dalam bahan pangan menjadi senyawa yang lebih sederhana dan

menyebabkan perubahan citarasa, penampakan, rasa ataupun aroma yang tidak

dapat diterima oleh konsumen. Bakteri patogen adalah bakteri yang dapat

menyebabkan penyakit pada manusia, baik secara infeksi ataupun intoksikasi.

Berdasarkan susunan dinding sel-nya, bakteri dapat digolongkan

menjadi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan susunan

dinding sel tersebut paling menyolok terlihat pada komposisi lapisan

peptidoglikan. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari 90% lapisan

peptidoglikan dan lapisan tipisnya adalah asam teikoat, sedangkan dinding

Sumber

Kondens

Tetesan

Pelarut dan

13

bakteri Gram negatif, hanya 5-20% terdiri dari lapisan peptidoglikan dan

lapisan lainnya terdiri dari protein, lipopolisakarida, dan lipoprotein (Fardiaz,

1992). Perbedaan susunan dinding sel ini akan menyebabkan perbedaan

kesensitifan bakteri terhadap senyawa tertentu, seperti antibiotik penisilin.

Penisilin adalah senyawa antimikroba/antibiotik yang yang bekerja dengan

mencegah sintesis peptidoglikan pada sel yang sedang tumbuh. Oleh karena

bagian yang dipengaruhi adalah peptidoglikan, bakteri Gram positif akan

menjadi lebih sensitif terhadap penisilin daripada bakteri Gram negatif karena

kandungan peptidoglikannya lebih banyak.

1. Bacillus cereus

Bacillus cereus merupakan bakteri Gram positif, bersifat anaerobik

fakultatif, dan bersifat motil karena memiliki flagela peritrik. Secara

mikroskopik, Bacillus cereus berbentuk batang, mempunyai ukuran sel yang

besar, sekitar 1.0-1.2 µm dengan panjang 3.0-5.0 µm. Sebagian besar strain

Bacillus cereus bersifat mesofilik dan mampu tumbuh pada pangan berasam

rendah pada suhu 15 oC hingga 55 oC. Bacillus cereus bersifat patogen

meskipun sebagian besar golongan Bacillus bersifat non-patogen.

Bacillus cereus dapat membentuk spora yang tahan terhadap

pemanasan sehingga pemanasan tidak dapat menghilangkan Bacillus cereus

secara maksimum. Bacillus cereus ditemukan pada susu pasteurisasi, daging

beku, dan sayur-sayuran (Granum et. al., 2000). Selain itu, Bacillus cereus

sering menyebabkan masalah pada nasi dan nasi goreng dan menyebabkan

keracunan pangan. Keracunan pangan oleh Bacillus cereus terjadi secara

intoksikasi, yaitu masuknya enterotoksin yang diproduksi oleh Bacillus

cereus ke dalam tubuh manusia. Gejala yang muncul adalah diare atau

muntah dalam jangka waktu 2-16 jam setelah makanan dikonsumsi (Brooks

et. al. dalam Prescott et. al., 2003).

2. Staphylococus aureus

Staphylococus aureus merupakan bakteri Gram positif, non-motil,

tidak membentuk spora dan bersifat katalase positif. Sebagian besar galur

Staphylococus aureus tumbuh secara aerobik pada suhu antara 7-48 oC,

14

dengan suhu optimum 35-40 oC. Dinding sel Staphylococus aureus

mengandung 3 komponen utama, yaitu peptidoglikan, asam teikoat, dan

protein A yang berikatan secara kovalen dengan peptidoglikan (Baird-

Parker, 2000). Staphylococus aureus ditemukan pada kulit dan membran

mukous hewan berdarah panas. Selain itu ditemukan juga pada permukaan

kulit manusia (Baird-Parker, 2000).

Staphylococus aureus bersifat patogen, yaitu dengan memproduksi

enterotoksin yang akan menyebabkan penyakit jika dikonsumsi manusia.

Enterotoksin diproduksi pada suhu antara 10-46 oC, optimum pada 40-45 oC

(Jay, 2005). Gejala keracunan enterotoksin meliputi mual, muntah-muntah,

keram perut, dan diare. Gejala tersebut muncul 1 hingga 8 jam setelah

enterotoksin masuk ke dalam tubuh (Brooks et. al. dalam Prescott et. al.,

2003). Staphylococus aureus ditemukan pada daging sapi mentah, daging

ayam mentah, seafood, dan produk bakery (Baird-Parker, 2000).

Staphylococus aureus dapat bertahan dalam debu sehingga dapat

ditemukan pada siklon ataupun ventilasi. Secara umum, Staphylococus

aureus tidak mampu berkompetisi dengan biota normal yang banyak

terdapat pada pangan. Staphylococus aureus tidak kuat bersaing dengan

bakteri lainnya, sehingga tidak memberikan efek yang cukup berarti pada

makanan yang telah dimasak. Sel Staphylococus aureus lebih sensitif

terhadap panas dibandingkan dengan toksinnya. Bakteri yang diketahui

antagonis terhadap Staphylococus aureus adalah Acinetobacter, Aeromonas,

Baccili, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, dan Lactobaccilaceae (Jay,

2005).

3. Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk

batang, termasuk famili Enterobacteriaceae. Enterobacteriaceae merupakan

bagian dari flora usus manusia dan Escherichia coli merupakan

predominannya. Panjang sel Escherichia coli adalah sekitar 2.0-6.0 µm dan

lebarnya 1.1-1.5 µm, bersifat motil atau non motil dengan flagela peritrikat

bersifat fakultatif anaerob. Kisaran suhu untuk pertumbuhannya adalah 10-

40 oC, dengan suhu optimum pertumbuhannya adalah 37 oC.

15

Keberadaan Escherichia coli dalam bahan pangan mengindikasikan

bahwa telah terjadi kontaminasi dari feses/kotoran manusia atau hewan

karena Escherichia coli secara normal ditemukan sebagai bagian dari flora

usus manusia segera setelah manusia dilahirkan (Willshaw et. al., 2000).

Kontaminasi bakteri Escherichia coli pada makanan biasanya berasal dari

kontaminasi air yang digunakan.

Tidak semua Escherichia coli mampu memproduksi toksin yang dapat

menyebabkan penyakit, hanya galur Enteropatogenik Escherichia coli

(EEC) saja yang dapat menyebabkan penyakit. Dosis yang dapat

menimbulkan gejala infeksi Escherichia coli berkisar antara 108-109 sel.

Berdasarkan karakteristik penyakitnya, Escherichia coli dapat dibedakan

menjadi Enteropatogenik Escherichia coli, Enteroinvasive Escherichia coli,

Enterotoxigenic Escherichia coli, Vero Cytotoxin-Producing (Shiga Toxin

producing) Escherichia coli (VTEC) (STEC), Enteroaggregative and

Diffusely Adherent Escherichia coli (Willshaw et. al., 2000). Gejala yang

terjadi umumnya adalah diare yang kadang-kadang disertai muntah dalam

jangka waktu 24-72 jam setelah makanan dikonsumsi (Brooks et. al. dalam

Prescott et. al., 2003).

4. Salmonella enterica serovar Typhimurium

Salmonella merupakan bakteri Gram negatif, fakultatif anaerob,

berbentuk batang, berukuran kecil, dan tidak membentuk spora. Salmonella

sulit dibedakan dengan Esherichia coli di bawah mikroskop ataupun pada

media pertumbuhan yang tidak selektif (umum). Salmonella digolongkan

menjadi dua spesies, yaitu Salmonella enterica dan Salmonella bongori

(D’Aoust, 2000). Kedua spesies tersebut dikelompokkan lagi menjadi

subspecies-subspesies dan subspesies dikelompokkan lagi menjadi serovar.

Salmonella Typhimurium tergolong dalam spesies enterica serovar

Typhimurium. Suhu minimum untuk pertumbuhan Salmonella

Typhimurium adalah 6-20 oC, sedangkan suhu maksimum untuk

pertumbuhan Salmonella Typhimurium adalah 45oC. Suhu pertumbuhan

optimum Salmonella Typhimurium adalah pada 35-37 oC (D’Aoust, 2000).

16

Bakteri dari genus Salmonella merupakan bakteri penyebab infeksi

yang jika tertelan dan masuk ke dalam tubuh akan menimbulkan gejala yang

disebut salmonellosis. Salmonellosis yang paling sering terjadi adalah

gastroenteritis yang disebabkan oleh Salmonella Typhimurium. Makanan

yang sering terkontaminasi oleh Salmonella adalah telur dan hasil

olahannya, ikan dan hasil olahannya, daging ayam, daging sapi, susu dan

hasil olahannya. Keracunan pangan oleh Salmonella disebabkan karena

makanan mengandung jumlah Salmonella dalam jumlah yang signifikan

yaitu 107 sel.

5. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas merupakan bakteri Gram negatif dari famili

Pseudomonadaceae. Pseudomonas secara alami terdapat pada tanah dan air.

Menurut Madigan et. al. (2000), secara ekologi Pseudomonas penting untuk

mendegradasi sisa-sisa komponen dari hewan ataupun tanaman.

Pseudomonas banyak ditemukan pada bahan pangan segar seperti sayuran,

daging, unggas, dan seafood (Jay, 2005) dan sering menimbulkan kebusukan

makanan (Fardiaz, 1992). Bakteri ini bersifat motil dengan flagela polar.

Pseudomonas aeruginosa tumbuh dengan baik pada suhu 37 oC.

Pseudomonas aeruginosa ditemukan pada telur dan memproduksi senyawa-

senyawa yang menimbulkan bau busuk dan pigmen piosianin yang berwarna

biru (Fardiaz, 1992). Pseudomonas spp. menyebabkan perubahan warna

pada keju dan ditemukan juga pada susu.

D. SENYAWA ANTIMIKROBA

Zat antimikroba adalah senyawa biologis atau senyawa kimia yang dapat

menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Mekanisme kerja senyawa

yang bersifat antimikroba ada beberapa macam, yaitu merusak dinding sel

mikroorganisme hingga terjadi lisis, mengubah permeabilitas membran

sitoplasma sehingga menyebabkan kebocoran nutrien dari dalam sel,

menyebabkan terjadinya denaturasi protein sel, dan menghambat kerja enzim

di dalam sel, merusak molekul protein dan asam nukleat, bersifat sebagai

antimetabolit, menghambat sintesa asam nukleat (Fardiaz, 1987).

17

Zat-zat yang digunakan sebagai antimikroba harus mempunyai beberapa

kriteria ideal, antara lain aman, ekonomis, tidak menyebabkan perubahan

citarasa dan aroma pada makanan, tidak mengalami penurunan aktivitas

karena adanya komponen makanan, tidak menyebabkan timbulnya galur

resisten, sebaiknya bersifat membunuh daripada hanya menghambat

pertumbuhan mikroba serta memiliki spektrum yang luas karena jenis mikroba

dalam pangan umumnya beragam jenis.

Menurut Branen dan Davidson (1993), senyawa kimia yang memiliki

sifat sebagai antimikroba adalah sodium benzoat, asam benzoat, asam sorbat,

sorbat, asam organik, sulfit, sulfur dioksida, nitrit, paraben, komponen fenolik,

asam lemak rantai sedang/medium, ester, dimetil dikarbonat, dietil dikarbonat,

nisin, natamisin, bakteriosin, halogen, senyawa surfaktan dan peroksida.

Selain itu, senyawa fitokimia yang terdapat dalam tumbuhan seperti golongan

fenolik, alkaloid, dan terpenoid juga memiliki aktivitas antimikroba.

Masing-masing senyawa antimikroba memiliki mekanisme yang

berbeda-beda. Sebagian besar mekanisme senyawa fenolik sebagai

antimikroba adalah dengan mempengaruhi membran sel (Branen dan

Davidson, 1993). Hal ini didukung juga oleh pernyataan Sikkema dalam

Lambert (2001) yang menyebutkan bahwa komponen fenol dapat

mempengaruhi membran sel bakteri. Menurut Vas dalam Branen dan

Davidson (1993), komponen fenol dapat merusak membran sitoplasma

mikroba dan menyebabkan kehilangan komponen sitoplasma. Judi dalam

Branen dan Davidson (1993) juga menyebutkan bahwa komponen fenolik

dapat menyebabkan kerusakan fisik pada membran sel ataupun pada penahan

permeabilitas. Komponen fenol juga dapat mendenaturasi enzim yang

bertanggung jawab terhadap germinasi spora atau berpengaruh terhadap asam

amino yang terlibat dalam proses germinasi (Nychas dalam Ardiansyah,

2001). Senyawa fenolik bermolekul besar mampu menginaktifkan enzim

esensial di dalam sel mikroba meskipun pada konsentrasi yang sangat rendah.

Mekanisme antimikroba golongan aldehid, seperti formaldehid dan

glutaraldehid, adalah ikatan rangkap pada rantai karbon dapat meningkatkan

elektronegativitas yang akan mempengaruhi transfer elektron dan bereaksi

18

dengan komponen nitrogen seperti asam amino dan protein, sehingga dapat

menghambat pertumbuhan sel. Menurut Knobloch et. al. dalam Dorman et. al.

(2000), komponen terpenoid dapat mempengaruhi mekanisme biokimia,

seperti penghambatan transpor elektron, penghambatan translokasi protein,

penghambatan fosforilasi ataupun penghambatan reaksi yang terkait dengan

enzim.

Menurut Helander dalam Lambert (2001), senyawa thymol dan

carvacrol dapat menghancurkan plasma membran sel. Selain itu, senyawa

thymol dan carvacrol dapat memecahkan membran luar Escherichia coli dan

Salmonella Typhimurium pada konsentrasi mendekati nilai MIC. Menurut

Tranter et. al., Gonzalez et. al., Ultee et. al., dan Tassou et. al. dalam Lambert

et. al., (2001), minyak atsiri, komponen fenol, dan bakteriosin dapat

menyebabkan kebocoran sel sehingga akan kehilangan berbagai komponen

seperti ion, ATP, asam nukleat, dan asam amino.

Antibiotik adalah senyawa yang diproduksi oleh mikroba dan

mempunyai kemampuan untuk menghambat atau membunuh bakteri dan

mikroba lainnya, digunakan terutama untuk mengobati penyakit infeksi pada

manusia, hewan dan tanaman. Antibiotik adalah suatu senyawa kimia yang

diturunkan dari atau diproduksi oleh organisme hidup, yang dalam kadar kecil

mampu menghambat proses hidup mikroorganisme. Suatu senyawa dapat

digolongkan sebagai antibiotik jika merupakan produk metabolisme

(walaupun dapat dibuat secara sintetis), suatu produk sintetik dengan struktur

serupa dengan antibiotik yang terdapat di alam, mengantagoniskan

pertumbuhan dan atau kelangsungan hidup satu atau lebih jenis

mikroorganisme, serta efektif dalam kadar rendah. Beberapa mekanisme aksi

antibiotik yang umum dapat dilihat pada Tabel 7 berikut ini.

Tabel 7. Mekanisme aksi beberapa antibiotik

Tempat aksi Antibiotik Proses yang diganggu Tipe aktivitas

Dinding sel Basitrasin Sikloserin Penisilin

Sintesis mukopeptida Sintesis peptid dinding sel Ikatan silang dinding sel

Bakterisidal Bakterisidal Bakterisidal

Membran sel Polimiksin Integritas membran Bakterisidal

19

Antibiotik yang mengganggu sistem metabolik mikroorganisme dan

tidak pada sel mamalia merupakan zat antiinfeksi yang paling berhasil,

misalnya zat yang mengganggu sintesis dinding sel bakteri akan berpotensi

tinggi untuk toksisitas selektif. Sifat sidal dan statik penting untuk pengobatan

infeksi yang serius, terutama jika mekanisme pertahanan penderita menjadi

berkurang atau meluap-luap oleh infeksi.

Antibiotik beta-laktam merupakan antibiotik yang mengandung cincin

beta-laktam dalam strukturnya. Antibiotik beta-laktam terbagi menjadi dua

golongan yaitu penisilin dan sefalosforin. Antibiotik beta-laktam memiliki

spektrum antimikroba yang luas, memiliki aksi sidal yang kuat dan cepat

melawan bakteri dalam fase pertumbuhan serta sangat rendah kejadian toksik

dan reaksi buruk lainnya pada inang. Mekanisme aksi letal zat ini adalah

dengan menghambat sintesis dinding sel bakteri. Hambatan terhadap

biosintesis peptidoglikan, yang dibutuhkan untuk membuat dinding sel bakteri

menjadi tegar, merupakan mekanisme dasar. Dengan tidak terbentuknya

peptidoglikan, ketegaran dinding sel tidak terbentuk penuh dan terjadi lisis

karena naiknya tekanan osmosis internal yang merupakan efek perkembangan

sel bakteri.

E. UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA

Aktivitas antimikroba adalah kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan mikroba, termasuk bakteriostatik maupun fungistatik (Hirasa et.

al., 1998). Metode untuk menganalisis aktivitas antimikroba dipengaruhi oleh

media analisis, senyawa antimikroba, prosedur analisis. Komponen

antimikroba dapat saja berhasil pada kondisi pengujian, tetapi tidak

menunjukkan aktivitas yang cukup baik saat diaplikasikan pada produk

pangan. Sel vegetatif yang sedang tumbuh lebih sensitif daripada spora

terhadap tekanan lingkungan dari senyawa antimikroba.

Metode untuk menganalisis aktivitas antimikroba dapat dibedakan

menjadi dua, yaitu in vitro dan aplikasi pada produk pangan (Branen dan

Davidson, 1993). Metode in vitro tidak mengaplikasikan senyawa antimikroba

pada produk pangan, hanya menunjukkan adanya potensi antimikroba pada

20

CH3

CH3

bahan. Metode in vitro dapat dibedakan lagi menjadi 3, yaitu metode

pengenceran (dilution methods), metode difusi agar, dan metode turbidimetri.

Masing-masing metode tersebut memiliki kekurangan dan kelebihan.

Metode difusi agar memiliki kelebihan yaitu sederhana untuk dilakukan,

kekurangannya adalah senyawa antimikroba yang akan diuji harus bersifat

hidrofilik agar dapat berdifusi dengan baik ke dalam agar. Metode

pengenceran memiliki keunggulan, yaitu dapat diketahui terjadinya

kontaminasi, dan dapat dilakukan untuk bahan yang warnanya keruh (Barry

dalam Branen dan Davidson, 1993). Metode turbidimetri memiliki kelebihan,

yaitu cepat, tidak destruktif dan tidak mahal, sedangkan kekurangannya, yaitu

sensitivitasnya rendah. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah

metode in vitro, yaitu dengan difusi agar.

Metode difusi agar dilakukan dengan memasukkan komponen

antimikroba ke dalam agar baik dengan kertas saring ataupun dalam sumur.

Komponen akan berdifusi ke dalam agar dan akan menghambat pertumbuhan

mikroba yang terkandung dalam agar. Namun, untuk komponen antimikroba

yang hidrofobik, akan sulit berdifusi ke dalam agar karena agar bersifat polar /

hidrofilik. Oleh karena itu digunakan DMSO yang bersifat seperti emulsifier,

memiliki gugus hidrofilik dan hidrofobik agar senyawa yang bersifat

hidrofobik dapat larut dalam agar. Sruktur DMSO dapat dilihat pada Gambar

6 berikut ini.

Gambar 6. Struktur DMSO [(CH3)2SO]

Hasil analisis menggunakan metode difusi agar bersifat kualitatif.

Menurut Branen dan Davidson (1993), jika diameter penghambatan lebih

besar dari 30 mm, aktivitas antimikroba digolongkan besar. Jika diameter

penghambatan antara 20 mm-30 mm, aktivitas antimikroba digolongkan

sedang dan jika diameter penghambatan kurang dari 20 mm, aktivitas

antimikrobanya digolongkan kecil. Namun, menurut Harris et. al. dan

Lewus&Montville seperti dikutip oleh Branen dan Davidson (1993), uji

21

dengan difusi agar biasanya banyak memberikan kesalahan negatif. Selain

untuk uji bersifat kualitatif, metode difusi agar dapat dilakukan untuk

memperoleh data kuantitatif, misalnya untuk menentukan nilai konsentrasi

minimum dari senyawa antimikroba.

F. SENYAWA FITOKIMIA

Fitokimia merupakan suatu disiplin ilmu yang mempelajari struktur

kimia, biosintesis, perubahan dan metabolisme, penyebaran secara ilmiah dan

fungsi dari ragam senyawa organik yang dibentuk oleh tumbuhan.

Berdasarkan biogenesisnya, yaitu sumber bahan baku dan jalur biosintesisnya,

senyawa kimia dapat dibedakan menjadi metabolit primer dan metabolit

sekunder. Metabolit primer adalah senyawa yang merupakan penyusun utama

makhluk hidup, seperti polisakarida, protein, lemak, dan asam nukleat.

Metabolit sekunder adalah senyawa yang tidak berperan sebagai penyusun

utama makhluk hidup, tetapi memiliki peranan lain misalnya untuk pertahanan

diri. Croteau et. al. (2000) dalam Still (2002) mendefinisikan senyawa

fitokimia sebagai metabolit sekunder dari tumbuhan. Berdasarkan

biosintesisnya, Still (2002) mengelompokkan metabolit sekunder menjadi 3

golongan, yaitu golongan terpen dan terpenoid, golongan alkaloid dan

golongan fenilpropanoid.

1. Fenol

Senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari

tumbuhan, yang memiliki cincin aromatik yang mengandung satu atau dua

gugus hidroksil (Harborne, 1996). Senyawa fenol cenderung larut dalam air,

banyak yang berikatan dengan gula sebagai glikosida. Senyawa fenolik

sangat luas, mulai dari senyawa fenol dengan struktur yang sederhana

hingga polifenol. Beberapa senyawa fenol juga ada yang bersifat lipofilik.

Kelompok fenolik terdiri dari fenol, asam fenolat, fenilpropanoid, pigmen

flavonoid, antosianin, flavonol dan flavon, flavonoid minor, xanton, dan

stilbena, tanin, serta pigmen kuinon (Harborne, 1996).

22

Senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan besar karena

mampu membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hidrogen.

Akibatnya kerja enzim dapat terganggu (Harborne, 1996). Jika dikelilingi

oleh oksidator, komponen fenolik umumnya bertindak sebagai ligan untuk

ion logam. Dengan demikian, saat ditambahkan ion feri pada larutan yang

mengandung fenol akan terbentuk kompleks berwarna hijau tua, biru atau

biru kehitaman (Houghton dan Raman, 1998). Komponen fenolik dapat

melignifikasi dinding sel bakteri sehingga keberadaan komponen fenolik

dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol. Flavonoid

umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan

aglikon flavonoid. Dalam satu tumbuhan mungkin terdapat dalam beberapa

kombinasi glikosida (Harborne, 1996). Flavonoid terdapat dalam tumbuhan

sebagai campuran. Jarang ditemukan flavonoid tunggal dalam jaringan

tumbuhan.

Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam

angiospermae terdapat khusus dalam jaringan kayu. Tanin dapat bereaksi

dengan protein membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air

(Harborne, 1996). Dalam tumbuhan, letak tanin terpisah dari protein dan

enzim sitoplasma tetapi jika jaringan rusak, misalnya dimakan oleh hewan,

terjadi reaksi penyamakan.

2. Terpenoid

Terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan. Terpenoid

terdiri atas beberapa macam senyawa mulai dari komponen minyak atsiri,

yaitu monoterpena dan seskuiterpena yang mudah menguap, diterpena yang

lebih sukar menguap serta senyawa yang tidak menguap, yaitu triterpenoid

dan sterol serta pigmen karotenoid.

Kebanyakan ’terpenoid’ alam memiliki struktur siklik dan mempunyai

satu gugus fungsi atau lebih (hidroksil, karbonil, dll). Secara kimia,

terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat di dalam sitoplasma sel

tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstrak menggunakan eter minyak bumi,

eter atau kloroform.

23

Mudah menguap

Sulit menguap

Tidak menguap

Terpenoid merupakan bagian utama minyak atsiri. Secara kimia,

terpena minyak atsiri dapat dipilah menjadi dua golongan, yaitu

monoterpena dan seskuiterpena. Monoterpena dapat dipilah lagi menjadi

tiga golongan yaitu asiklik (misalnya geraniol), monosiklik (misalnya

limonena) dan bisiklik (misalnya alfa pinena dan beta pinena). Monoterpena

sederhana tersebar luas dan cenderung merupakan bagian dari kebanyakan

minyak atsiri. Secara lebih sederhana, penggolongan senyawa terpenoid

dapat dilihat pada Gambar 7 berikut ini.

Gambar 7. Penggolongan senyawa terpenoid Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari

enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon

asiklik, yaitu skualena. Triterpenoid merupakan senyawa tidak berwarna,

berbentuk kristal, seringkali bertitik didih tinggi dan aktif optik. Triterpenoid

dapat dipilah menjadi empat golongan senyawa, yaitu triterpena, steroid,

saponin, dan glikosida jantung. Saponin dan glikosida jantung merupakan

triterpena atau steroid yang terdapat sebagai glikosida. Sterol adalah

triterpena yang kerangka dasarnya sistem cincin siklopentana

penhidrofenantrena. Tiga senyawa yang umum disebut sebagai fitosterol

mungkin terdapat di setiap tumbuhan tinggi yaitu sitosterol, stigmasterol,

dan kampesterol.

Saponin adalah glikosida triterpena dan sterol, merupakan senyawa

aktif permukaan dan bersifat seperti sabun serta dapat dideteksi berdasarkan

kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis darah. Pembentukan

busa yang mantap (tahan lama) sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau

Terpenoid Diterpenoid

Monoterpen (C10)

Triterpenoid & steroid

Seskuiterpen (C15)

Minyak atsiri

24

sewaktu memekatkan tumbuhan. Saponin, baik triterpen maupun steroidal,

memiliki sifat antimikroba (Naidu, 2000). Menurut Zablotowicz et. al. dan

Hoagland et. al. seperti dikutip oleh Naidu (2000), efek yang umum dari

aktivitas saponin pada bakteri adalah kebocoran sel sehingga terjadi

kehilangan protein dan enzim dari sel.

3. Alkaloid

Alkaloid merupakan golongan terbesar dari metabolit sekunder

tanaman. Alkaloid seringkali beracun bagi manusia dan memiliki banyak

kegiatan fisiologi yang menonjol sehingga digunakan secara luas dalam

bidang pengobatan (Harborne, 1996). Semua alkaloid mengandung

setidaknya 1 buah atom nitrogen. Banyak alkaloid yang bersifat terpenoid

(misalnya solanin, alkaloid-steroid kentang) sehingga dari segi biosintesis

sebaiknya ditinjau sebagai terpenoid termodifikasi. Pada kebanyakan kasus,

komponen alkaloid bersifat basa sehingga jika ditambahkan asam akan

membentuk garam. Untuk membuat bahan benar-benar basa, dilakukan

penambahan amonia. Setelah itu, ditambahkan asam. Setelah penambahan

asam, alkaloid akan membentuk garam yang akan mengion dan larut dalam

air.

25

III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN

A. BAHAN DAN ALAT

Bahan baku berupa biji jintan hitam kering diperoleh dari Pasar Tanah

Abang, Jakarta. Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi meliputi

aquades, heksana teknis, etil asetat teknis, metanol teknis, etanol teknis 96 %

diperoleh dari CV. Panca Pratama Bogor. Kultur bakteri Staphylococus

aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas

aeruginosa, dan Bacillus cereus diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi

Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB. Bahan-bahan yang

dibutuhkan untuk uji aktivitas antimikroba dan uji fitokimia meliputi media

Nutrient Broth (NB), media Nutrient Agar (NA), antibiotik amoxycillin, NaCl,

Dimetil Sulfoksida (DMSO), HgCl2, Kalium Iodida, asam sulfat pekat, larutan

FeCl3, kloroform, amoniak, gelatin, aquades, eter, asam asetat glasial. Bahan-

bahan lain yang dibutuhkan adalah parafilm, spiritus, alkohol 70 %, kertas

saring Whatman No 1, aluminium foil, kapas, korek api, kertas label, gas N2,

es batu, tissue, aluminium foil, dan plastik tahan panas (High Density

Polietilen / HDPE).

Peralatan yang digunakan meliputi alat refluks (tabung refluks, penangas

air dan kondensor), alat penyaring vakum, alat rotavapor, oven vakum, oven,

otoklaf, inkubator, refrigerator, hot plate, blender kering, neraca analitik, alat

vorteks, gelas ukur, gelas piala, labu erlenmeyer, labu lemak, cawan petri,

tabung reaksi tanpa tutup, tabung reaksi bertutup, botol berwarna gelap ukuran

150 ml, botol kecil berwarna gelap ukuran 10-25 ml, pipet mikron, pipet

Mohr, pipet tetes, jangka sorong, sudip, sendok, bunsen, bulb, ose, mangkok,

baskom, keranjang, loyang, dan spidol waterproof.

B. TEMPAT DAN WAKTU

Pelaksanaan penelitian ini dimulai pada bulan Februari 2006 hingga

bulan Agustus 2006 di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Pusat Antar

Universitas, Institut Pertanian Bogor dan di Laboratorium Kimia Pangan,

Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor.

26

C. METODE PENELITIAN

Dalam pelaksanaannya, penelitian ini dibagi dalam dua tahapan, yaitu

penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Tahapan penelitian secara

keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 1.

1. Penelitian pendahuluan

a. Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jam (Metode

Hitungan Cawan)

Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jam bertujuan untuk

mengetahui jumlah sel dari satu ose kultur mikroba, setelah ditumbuhkan

selama 24 jam dalam 10 ml Nutrient Broth. Setelah diketahui jumlah sel

mikroba dalam 10 ml Nutrien Broth, dapat ditentukan pengenceran yang

perlu dilakukan untuk memperoleh sekitar 105 sel per ml media agar.

Kultur dari agar miring digores sebanyak satu ose dan dimasukkan

ke dalam 10 ml NB steril, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu

37 ºC. Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke

dalam 9 ml NB steril kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC.

Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke dalam 9

ml larutan pengencer steril.

Seri pengenceran dibuat dari 1:101, 1:102, 1:103 hingga 1 : 108. Pada

pengenceran ke-5, pengenceran ke-6, pengenceran ke-7 dan pengenceran

ke-8, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian

dituang agar. Agar digoyang pelan supaya sel mikroba menyebar rata di

dalam agar. Setelah agar membeku, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48

jam. Setelah waktu inkubasi tercapai, dilakukan penghitungan jumlah

mikroba. Proses persiapan kultur mikroba secara rinci dapat dilihat pada

Lampiran 2.

b. Ekstraksi komponen antimikroba secara ekstraksi tunggal

Tahap ini bertujuan untuk mengekstrak komponen antimikroba yang

terdapat dalam biji jintan hitam. Ekstrak yang ingin diperoleh dari proses

ekstraksi tunggal adalah ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri.

Ekstrak air dan ekstrak etanol akan diperoleh dari proses ekstraksi

27

menggunakan pelarut dengan metode refluks, sedangkan minyak atsiri

akan diperoleh dari proses distilasi uap. Proses ekstraksi menggunakan

pelarut air dan pelarut etanol dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan,

Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, sedangkan destilasi uap

dilakukan di Balai Tanaman Rempah dan Obat (Balitro), Bogor.

Setelah diperoleh ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri,

masing-masing ekstrak akan diuji aktivitas antimikrobanya dengan metode

difusi agar terhadap bakteri Staphylococus aureus, Escherichia coli,

Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, dan Bacillus cereus.

Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang baik, yaitu

memiliki spektrum yang luas dan nilai diameter penghambatan yang besar,

akan diuji lanjut dengan penentuan nilai Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) dan diidentifikasi komponen fitokimianya.

Metode refluks dilakukan dengan mengkontakkan bahan secara

langsung dengan pelarut, yaitu dengan memasukkan bahan dan pelarut ke

dalam tabung refluks. Sebelum tabung refluks yang berisi bahan dan

pelarut dipasang pada alat refluks, alat refluks dipanaskan mendekati suhu

titik didih pelarut. Untuk pelarut air, alat refluks dipanaskan hingga

mendekati suhu 100 oC (98-99 oC), sedangkan untuk pelarut etanol alat

refluks dipanaskan hingga mendekati suhu 70 oC (68-69 oC).

Pada saat suhu yang diinginkan sudah tercapai, tabung refluks yang

berisi bahan dan pelarut dipasang pada alat refluks. Pelarut akan

mengekstrak komponen antimikroba dari bahan. Pada saat titik didih

pelarut tercapai, pelarut akan menguap. Untuk mengurangi kehilangan

pelarut, kondensor dipasang di atas tabung refluks. Dengan demikian, saat

pelarut yang menguap melewati kondensor yang dingin, pelarut tersebut

akan jatuh kembali ke dalam tabung refluks.

Ekstraksi dengan metode refluks ini dilakukan dua kali. Ekstraksi

pertama dilakukan selama 3 jam, sedangkan ekstraksi kedua dilakukan

selama 2 jam. Setelah waktu ekstraksi pertama tercapai (3 jam), tabung

refluks diangkat dan cairan yang diperoleh disaring dengan kertas saring

dan dituang ke dalam botol. Ampas dimasukkan kembali ke dalam tabung

28

refluks untuk diekstrak kedua kalinya. Ampas ditambah pelarut dengan

jumlah yang sama seperti pada ekstraksi pertama. Tabung refluks dipasang

kembali pada alat refluks dan dioperasikan selama 2 jam. Setelah waktu

refluks tercapai, cairan yang diperoleh disaring dan digabungkan dengan

filtrat pertama.

Bahan yang digunakan dalam ekstraksi pertama dalam keadaan

kering, sedangkan bahan yang digunakan pada ekstraksi kedua masih

mengandung sebagian pelarut yang tersisa setelah ekstraksi pertama. Ratio

bahan dan pelarut pada ekstraksi pertama adalah 1:3. Jumlah pelarut yang

ditambahkan pada ekstraksi kedua sama dengan jumlah pelarut yang

ditambahkan pada ekstraksi pertama sehingga ratio bahan dan pelarut pada

ekstraksi kedua tidak tepat 1:3.

Setelah proses refluks selesai dilakukan dua kali, filtrat yang

diperoleh dikurangi jumlah pelarutnya dengan cara diuapkan

menggunakan rotavapor. Untuk filtrat air, penguapan pelarut dilakukan

pada suhu 50 oC, sedangkan untuk filtrat etanol, penguapan pelarut

dilakukan pada suhu 40-45 oC. Setelah di-rotavapor, sebagian pelarut

masih tertinggal dalam ekstrak sehingga dilakukan penghembusan gas N2

untuk menguapkan seluruh pelarut. Penghembusan gas N2 dilakukan

hingga ekstrak mencapai berat stabil, yaitu pengurangan bobot ekstrak

kurang dari 0,001 g. Ekstrak yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu

kurang dari 4 oC (suhu refrigerator).

Air sangat sulit diuapkan seluruhnya dari ekstrak. Walaupun telah di-

rotavapor pada suhu 50 oC dan dihembus gas N2, belum semua kandungan

air dalam ekstrak menguap. Setelah dihembus gas N2 selama kurang lebih

3 jam, tidak diperoleh pengurangan bobot ekstrak yang cukup berarti. Oleh

karena itu, khusus untuk ekstrak air, ekstrak yang digunakan tidak benar-

benar pekat. Untuk mengetahui kepekatan ekstrak air secara kuantitatif,

dilakukan pengukuran kadar air. Bagan proses ekstraksi tunggal

menggunakan pelarut air dapat dilihat pada Gambar 8, sedangkan bagan

proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol dapat dilihat pada

Gambar 9.

29

Ulangan Direfluks dengan air (100 oC, 3 jam) (100 ºC, 2 jam)

`

Dipekatkan (50 oC)

Dihembus N2

Disimpan dalam refrigerator (suhu 4oC)

hingga proses analisis

Gambar 8. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air

Ulangan Direfluks dengan etanol (70 oC, 3 jam) (70 ºC, 2 jam)

`

Dipekatkan (40-45 oC)

Dihembus N2

Disimpan dalam refrigerator (suhu 4oC) hingga proses analisis

Gambar 9. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol

Ampas Filtrat

Ekstrak etanol

Bubuk jintan hitam

Ampas Filtrat

Ekstrak air

Bubuk jintan hitam

Ekstrak etanol pekat

30

2. Penelitian Lanjutan

Penelitian lanjutan dilakukan dengan mengekstraksi komponen

antimikroba secara ekstraksi bertingkat. Ekstraksi bertingkat dengan pelarut

organik akan memisahkan komponen antimikroba dalam jintan hitam secara

lebih spesifik dan komponen antimikroba akan lebih terkonsentrasi. Dengan

ekstraksi secara bertingkat, diharapkan diperoleh konsentrasi komponen

antimikroba yang lebih tinggi lagi pada masing-masing ekstrak.

Proses ekstraksi bertingkat dilakukan terhadap biji jintan hitam yang

telah dihilangkan/diambil minyak atsirinya. Ampas hasil destilasi uap

minyak atsiri diekstrak bertingkat secara refluks menggunakan tiga pelarut

yang kepolarannya berbeda yaitu heksan, etil asetat dan metanol secara

berurutan sehingga diperoleh ekstrak heksan, ekstrak heksan-etil asetat, dan

ekstrak heksan-etil asetat-metanol. Selanjutnya, ekstrak heksan-etil asetat

akan disebut sebagai ekstrak etil asetat dan ekstrak heksan-etil asetat-

metanol akan disebut ekstrak metanol.

Teknik refluks secara ekstraksi bertingkat pada dasarnya sama dengan

teknik refluks yang dilakukan secara ekstraksi tunggal. Untuk setiap pelarut,

ekstraksi dilakukan dua kali. Ekstraksi pertama dilakukan selama 3 jam dan

ekstraksi kedua dilakukan selama 2 jam. Bahan yang digunakan dalam

ekstraksi pertama dalam keadaan kering, sedangkan bahan yang digunakan

pada ekstraksi kedua masih mengandung sebagian pelarut yang tersisa

setelah ekstraksi pertama. Ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi pertama

adalah 1:3. Jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi kedua sama

dengan jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi pertama sehingga

ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi kedua tidak tepat 1:3. Setelah proses

refluks selesai dilakukan dua kali, filtrat yang diperoleh di-rotavapor untuk

mengurangi jumlah pelarutnya. Setelah di-rotavapor, filtrat dihembus gas

N2 untuk menguapkan seluruh pelarut. Ekstrak disimpan pada suhu 4 oC

(suhu refrigerator) sampai proses analisis. Ekstrak siap diuji aktivitas

antimikrobanya secara difusi agar. Selain itu, beberapa ekstrak terpilih akan

diuji nilai MIC dan diuji secara kualitatif komponen fitokimianya.

31

Ulangan

(60 ºC, 2 jam)

Perbedaan antara proses refluks secara tunggal dan proses refluks

secara bertingkat terletak pada suhu yang digunakan saat refluks, suhu yang

digunakan saat rotavapor dan perlakuan terhadap bahan. Suhu yang

digunakan saat refluks adalah 60 oC dan suhu yang digunakan saat

rotavapor adalah 40 oC. Perbedaan perlakuan pada ekstraksi bertingkat

adalah ampas bahan setelah ekstraksi tidak dibuang melainkan digunakan

kembali untuk ekstraksi menggunakan pelarut yang lain. Setelah ekstraksi

kedua, ampas dikering-anginkan minimal selama satu malam dan di-oven

vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak

kembali menggunakan pelarut yang berbeda. Gambaran lebih sederhana

mengenai proses ekstraksi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 10.

Ulangan Direfluks dengan pelarut heksan (60 oC, 3 jam) (60 ºC, 2 jam)

`

Ulangan Direfluks dengan etil asetat (60 oC, 3 jam) Dipekatkan (40-45 oC)

(60 ºC, 2 jam)

Direfluks dengan metanol Dipekatkan (40-45 oC) Dihembus gas N2

(60 oC, 3 jam)

Dipekatkan Dihembus gas N2

Dihembus gas N2

Ampas Filtrat

Ekstrak heksan Ampas Filtrat

Ampas Filtrat Ekstrak

etil asetat

Ekstrak metanol

Ampas hasil destilasi uap

Ekstrak etil asetat pekat

Ekstrak heksan pekat

Ekstrak metanol pekat

Gambar 10. Diagram proses ekstraksi bertingkat dengan metode refluks

32

Suhu yang digunakan pada saat refluks menggunakan heksan adalah

60 oC dan suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak

tersebut adalah 40 oC. Ampas sisa ekstraksi menggunakan heksan tidak

dibuang, melainkan dikering-anginkan minimal selama semalam dan di-

oven vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak

kembali menggunakan pelarut etil asetat. Ampas dikering-anginkan untuk

menguapkan heksan dari ampas. Ampas di-oven vakum untuk benar-benar

memastikan bahwa seluruh heksan sudah menguap dari ampas.

Suhu yang digunakan pada saat refluks menggunakan etil asetat adalah

60 oC dan suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak

tersebut adalah 40 oC. Ampas sisa ekstraksi menggunakan heksan tidak

dibuang, melainkan dikering-anginkan minimal selama semalam dan di-

oven vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak

kembali menggunakan pelarut metanol. Tujuan ampas dikering-anginkan

dan dioven vakum adalah untuk menguapkan etil asetat dari ampas. Suhu

yang digunakan pada saat refluks menggunakan metanol adalah 60 oC dan

suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak tersebut adalah

40 oC.

D. METODE ANALISIS

1. Analisis kadar air pada ekstrak air jintan hitam (Metode distilasi

azeotropik) (Apriantono et. al., 1989)

Analisis kadar air dilakukan dengan metode azeotropik karena sampel

mengandung senyawa yang mudah menguap. Air akan dikeluarkan dari

sampel dengan cara distilasi azeotropik kontinyu menggunakan pelarut

immicible. Air akan terkumpul dalam labu Bidwel-Sterling dan akan selalu

berada pada bagian bawah karena berat jenisnya lebih berat dari berat jenis

pelarut.

Pemanas berjaket, tabung penerima “Bidwel Sterling”, kondensor tipe

“cold finger” dirangkai. Setelah alat selesai dirangkai, sebanyak 2 gram

sampel dimasukkan ke dalam labu didih ataupun erlenmeyer yang sudah

dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC. Kemudian ditambahkan pelarut

33

(toluena, silena ataupun pelarut lain). Labu didih ataupun erlenmeyer

dirangkaikan pada alat distilasi azeotropik.

Campuran bahan dan pelarut tersebut dipanaskan dengan pemanas

listrik dan refluks perlahan-lahan dengan suhu rendah selama 45 menit.

Setelah itu, dilanjutkan pada suhu yang lebih tinggi selama 1-1.5 jam.

Setelah waktu distilsi tercapai, baca volume air yang terdistilasi pada Labu

Bidwel-Sterling. Kadar air adalah perbandingan volume air yang diperoleh

dengan jumlah sampel yang diambil, kemudian dikalikan 100.

2. Pengujian aktivitas antimikroba (Garriga et. al., 1993 yang

dimodifikasi)

Sebelum diuji aktivitas antimikrobanya, ekstrak pekat diencerkan

terlebih dahulu menggunakan DMSO hingga konsentrasinya sebesar 28 %

(w/w). Kultur uji yang telah disiapkan, yaitu yang telah disegarkan dalam

NB selama 24 jam, diinokulasikan sejumlah A (sesuai hasil yang didapat

pada persiapan kultur pada Lampiran 2) ke dalam media NA. Campuran

antara media dan kultur tersebut kemudian dituang ke dalam cawan petri dan

ditunggu hingga membeku. Setelah agar membeku, dibuat lubang-lubang

sumur dengan diameter sekitar 6 mm. Setiap cawan petri dibuat 6 sumur, 2

sumur diisi kontrol negatif (DMSO), 2 sumur diisi kontrol positif

(Amoxycillin 0.01% w/v) dan 2 sumur lagi diisi ekstrak rempah, masing-

masing sebanyak 50 µl. Cawan kemudian dimasukkan ke dalam refrigerator

selama kurang lebih satu jam untuk memberi kesempatan agar ekstrak

meresap terlebih dahulu ke dalam agar. Setelah itu, diinkubasikan pada suhu

37 oC selama 24 jam. Pengukuran uji aktivitas antimikroba dilakukan

sebanyak dua kali ulangan dan duplo. Dua kali ulangan dengan pengertian

ekstrak yang sama diuji aktivitas antimikrobanya pada 2 cawan yang

berbeda, sedangkan duplo dengan pengertian dalam 1 cawan terdapat 2

lubang yang berisi sampel yang sama.

Setelah waktu inkubasi selesai, diamati dan diukur zona/diameter

penghambatan berupa areal bening di sekeliling sumur. Diameter

penghambatan adalah selisih antara lebar areal bening dengan diameter

sumur. Untuk menghilangkan pengaruh DMSO terhadap mikroba uji, ada

34

satu lubang yang hanya berisi DMSO sebagai kontrol negatif. Tahapan

difusi agar secara lebih jelas dapat dilihat pada Lampiran 3. Pada saat

melakukan difusi agar, dilakukan juga penghitungan jumlah mikroba seperti

pada persiapan kultur (pada Lampiran 2) sebagai uji konfirmasi untuk

mengetahui jumlah mikroba yang benar-benar dimasukkan ke dalam media

agar.

3. Penentuan nilai Minimum Inhibitory Concentration (modifikasi metode

Bloomfield, 1991)

Penentuan nilai MIC dengan metode Bloomfield (1991) dilakukan

seperti uji aktivitas antimikroba dengan metode difusi agar. Jumlah mikroba

yang harus berada dalam agar, penghitungan zona bening/zona

penghambatan dan cara pengerjaannya sama dengan ketentuan pada metode

difusi agar. Perbedaannya hanya terletak pada konsentrasi ekstrak yang

dimasukkan ke dalam sumur. Jika hanya ingin mengetahui aktivitas

antimikroba, ekstrak yang dimasukkan ke dalam sumur terdiri dari satu

konsentrasi. Jika ingin mengetahui nilai MIC, ekstrak yang dimasukkan ke

dalam sumur terdiri dari beberapa konsentrasi. Pada penelitian ini dibuat

konsentrasi, yaitu 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, dan 50 %. Pengecualian untuk

ekstrak metanol, hanya dibuat 3 konsentrasi yaitu 10 %, 20 % dan 28 %.

Kultur uji yang telah disiapkan, yaitu yang telah disegarkan dalam NB

selama 24 jam, diinokulasikan sejumlah A (sesuai hasil yang didapat pada

persiapan kultur pada Lampiran 2) ke dalam media NA. Campuran antara

media dan kultur tersebut kemudian dituang ke dalam cawan petri dan

ditunggu hingga membeku. Setelah agar membeku, dibuat lubang-lubang

sumur dengan diameter sekitar 6 mm. Setiap cawan petri dibuat 6 sumur, 2

sumur diisi kontrol negatif (DMSO), 4 sumur diisi ekstrak, masing-masing

sebanyak 50 µl. Keempat sumur yang diisi ekstrak, setiap dua sumur diisi

dengan konsentrasi yang sama. Setelah semua sumur terisi, cawan

dimasukkan ke dalam refrigerator selama kurang lebih satu jam untuk

memberi kesempatan agar ekstrak meresap terlebih dahulu ke dalam agar.

Setelah itu, diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24 jam.

35

Pengukuran uji aktivitas antimikroba dilakukan sebanyak dua kali

ulangan dan duplo. Dua kali ulangan dengan pengertian ekstrak yang sama

diuji aktivitas antimikrobanya pada 2 cawan yang berbeda, sedangkan duplo

dengan pengertian dalam 1 cawan terdapat 2 lubang yang berisi sampel yang

sama. Untuk menghilangkan pengaruh DMSO terhadap mikroba uji, ada

sumur yang hanya berisi DMSO sebagai kontrol negatif. Pada saat

penentuan nilai MIC, tetap dilakukan juga penghitungan jumlah mikroba

seperti pada persiapan kultur (pada Lampiran 2) sebagai uji konfirmasi

untuk mengetahui jumlah mikroba yang benar-benar dimasukkan ke dalam

media agar. Setelah waktu inkubasi selesai, diamati dan diukur

zona/diameter penghambatan berupa areal bening di sekeliling sumur.

Diameter penghambatan adalah selisih antara lebar areal bening dengan

diameter sumur. Setelah diukur diameter penghambatannya, ditentukan nilai

MIC-nya.

Penentuan nilai MIC dilakukan secara regresi linier. Dihitung nilai Ln

dari masing-masing konsentrasi yang digunakan. Nilai Ln dari masing-

masing konsentrasi akan dianggap sebagai nilai pada sumbu X. Besar

diameter penghambatan yang diperoleh, dikuadratkan dan akan dianggap

sebagai nilai pada sumbu Y. Setelah nilai pada sumbu X dan nilai pada

sumbu Y diketahui (sumbu X dari Ln konsentrasi dan sumbu Y dari kuadrat

besar diameter penghambatan), ditentukan persamaan regresinya. Setelah

diketahui persamaan regresinya, dicari nilai X pada saat nilai Y=0. Setelah

diketahui nilai X saat nilai Y=0, dilakukan ekponensial pada nilai X

tersebut. Nilai X yang telah dieksponensialkan akan disebut sebagai nilai

Mt. Nilai MIC adalah 0.25 x nilai Mt. Untuk lebih jelas, dapat dilihat contoh

perhitungan pada Lampiran 7 hingga Lampiran 10.

4. Identifikasi komponen fitokimia secara kualitatif

a. Uji golongan fenolik (Houghton dan Raman, 1998)

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan FeCl3 1%. Terbentuknya warna

biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan terdapatnya komponen fenol.

36

b. Uji golongan tanin (Houghton dan Raman, 1998)

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan gelatin 10%. Jika ekstrak

menggumpal, berarti ekstrak mengandung tanin.

c. Uji golongan flavonoid (Harborne, 1996)

Sebanyak 1 ml ekstrak ditetesi Pb-asetat. Hasil uji positif untuk

flavon bila terbentuk warna jingga atau krem.

d. Uji golongan alkaloid (Houghton and Raman yang dimodifikasi, 1998)

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan beberapa

tetes amoniak, kemudian diasamkan dengan beberapa tetes asam sulfat 2

M. Akan terbentuk 2 fase, fase asam diambil dan dibagi ke dalam 3 buah

tabung reaksi. Ke dalam tabung pertama ditambahkan 3 tetes pereaksi

Dragendorf, ke dalam tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer,

dan ke dalam tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Wagner. Hasil

uji positif untuk uji dengan pereaksi Dragendorf jika terdapat endapan

berwarna jingga. Hasil uji positif untuk uji dengan pereaksi Mayer jika

terdapat endapan berwarna putih. Hasil uji positif untuk uji dengan

pereaksi Wagner jika terdapat endapan berwarna merah kecoklatan.

e. Uji golongan terpenoid dan steroid (Uji Lie-Bermann-Burchard)

(Harborne, 1996)

Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam 2 ml kloroform, kemudian

ditambahkan 10 tetes asam asetat glasial dan 3 tetes asam sulfat pekat.

Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Hasil uji positif

untuk terpenoid bila terbentuk warna merah atau ungu. Hasil uji positif

untuk steroid bila terbentuk warna merah yang kemudian berubah menjadi

biru atau hijau.

f. Uji golongan saponin (Harborne, 1996)

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml air panas lalu

didinginkan. Selanjutnya di-vorteks selama 10 detik. Bila ekstrak

mengandung senyawa saponin, akan terbentuk buih yang mantap selama

sekitar 10 menit. Buih dikatakan mantap jika tingginya 1-10 cm dan tidak

hilang bila ditambah HCl 2 N.

37

E. RANCANGAN PERCOBAAN

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

rancangan percobaan faktorial dua faktor. Faktor yang digunakan adalah jenis

ekstrak dan jenis mikroba. Faktor ekstrak terdiri dari enam taraf, sedangkan

faktor mikroba terdiri dari lima taraf. Dalam percobaan faktorial ini, perlakuan

yang ada merupakan komposisi dari semua kemungkinan kombinasi dari taraf.

Dengan rancangan faktorial dapat diketahui respon dari taraf masing-masing

faktor (pengaruh utama) serta interaksi antar dua faktor (pengaruh sederhana).

Jika diplotkan pada diagram, dapat dilihat respon setiap faktor pada

berbagai kondisi faktor lain. Jika respon suatu faktor berubah pada berbagai

kondisi tertentu ke kondisi yang lain, faktor tersebut dapat dikatakan

berinteraksi. Sedangkan jika tidak ada perubahan pola, dapat dikatakan tidak

ada interaksi. Jika jenis ekstrak dianggap sebagai faktor A dan jenis bakteri

sebagai faktor B, model linier aditif dari rancangan ini secara umum adalah

sebagai berikut.

Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk

Yijk adalah nilai pengamatan pada faktor A taraf ke-i faktor B taraf ke-j dan

ulangan ke-k; µ, αi, βj merupakan komponen aditif dari rataan, pengaruh

utama faktor A dan pengaruh utama faktor B; (αβ)ij merupakan komponen

interaksi dari faktor A dan faktor B; εijk merupakan pengaruh acak yang

menyebar normal (0,σ2).

Untuk mengetahui efektivitas setiap ekstrak dan juga untuk mengetahui

ketahanan setiap bakteri uji, dilakukan analisis statistik dengan analisis ragam

(ANOVA). Namun, karena ulangan yang digunakan pada setiap ekstrak tidak

sama maka digunakan menggunakan metode General Linear Model (GLM)

pada taraf nyata 0.05. Metode GLM merupakan suatu prosedur SAS yang

didesain untuk keperluan yang lebih global. Metode GLM dapat digunakan

untuk mengerjakan data yang tidak seimbang atau jumlah ulangan yang tidak

sama (Mattjik dan Sumertajaya, 2000). Jika setelah diolah dengan metode

GLM hasilnya berbeda nyata, dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf

kepercayaan 0.05. Analisis statistik dilakukan menggunakan program SAS

(Statistical Analysis System).

38

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebelum dilakukan uji aktivitas antimikroba, dilakukan penghitungan

jumlah sel mikroba pada umur 24 jam agar terdapat jumlah sel mikroba yang

sama pada setiap cawan. Senyawa antimikroba yang terdapat di dalam ekstrak biji

jintan hitam diperoleh dengan cara distilasi uap, ekstraksi tunggal menggunakan

air dan etanol serta ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut organik dengan

tingkat kepolaran berbeda. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi bertingkat

adalah heksan teknis, etil asetat teknis, dan metanol teknis. Bahan yang diekstrak

secara bertingkat menggunakan pelarut organik adalah biji jintan hitam yang telah

dihilangkan minyak atsirinya.

Ekstrak yang diperoleh dari proses distilasi uap adalah minyak atsiri,

sedangkan ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi tunggal menggunakan pelarut

adalah ekstrak air dan ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi

bertingkat menggunakan pelarut adalah ekstrak heksan, ekstrak heksan-etil asetat,

dan ekstrak heksan-etil asetat-metanol. Ekstrak heksan-etil asetat selanjutnya

disebut sebagai ekstrak etil asetat dan ekstrak heksan-etil asetat-metanol

selanjutnya disebut sebagai ekstrak metanol. Pada masing-masing ekstrak tersebut

dilakukan uji aktivitas antimikroba menggunakan metode difusi agar. Ekstrak

yang menunjukkan aktivitas antimikroba dengan spektrum luas, akan diuji nilai

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) terhadap bakteri tertentu dan

diidentifikasi secara kualitatif komponen fitokimia-nya.

A. PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA PADA UMUR 24 JAM

Penghitungan jumlah mikroba dilakukan terhadap semua kultur mikroba

yang digunakan dalam penelitian ini. Metode yang digunakan adalah metode

hitungan cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan

sel mikroba yang masih hidup pada medium agar, sel tersebut akan

berkembang biak membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung

dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1992). Dengan

menggunakan metode hitungan cawan, jumlah sel mikroba yang digunakan

dapat diketahui dengan lebih pasti karena yang dihitung adalah sel yang

39

memang benar-benar masih hidup. Berikut ini adalah hasil penghitungan

jumlah sel bakteri uji pada umur 24 jam.

Tabel 7. Jumlah sel mikroba pada umur 24 jam

Jenis mikroba Jumlah mikroba umur 24 jam

Bacillus cereus 5.3 x 108 Staphylococcus aureus 1.2 x 108 Esherichia coli 4.5 x 108 Salmonella Typhimurium 5.4 x 108 Pseudomonas aeruginosa 1.2 x 108

Dari Tabel 7, dapat diketahui bahwa jumlah sel masing-masing mikroba

pada umur 24 jam adalah sekitar 108 sel/ml NB. Jumlah mikroba yang

diinginkan untuk dimasukkan ke dalam agar (NA) adalah 105 sel/ml agar

sehingga perlu dilakukan pengenceran hingga 1/1000 kali. Cara penentuan

jumlah mikroba yang dimasukkan ke dalam agar (NA) dapat dilihat pada

Lampiran 4.

B. KARAKTERISTIK BAHAN BAKU

Biji jintan hitam yang digunakan berwarna hitam, berbentuk bulat lonjong,

dengan panjang sekitar 2 mm dan tebal sekitar 1 mm. Biji jintan hitam

memiliki aroma yang khas jintan hitam dan rasanya pahit. Biji jintan hitam

mengandung kadar karbohidrat dan lemak yang tinggi seperti terlihat pada

Tabel 8 berikut ini.

Tabel 8. Hasil analisis proksimat biji jintan hitam

Komposisi Persentase (%) Air 5.52 Protein 19.69 Lemak 31.68 Abu 4.28 Karbohidrat 38.83

C. KARAKTERISTIK EKSTRAK JINTAN HITAM

Proses ekstraksi senyawa antimikroba dilakukan dengan metode

ekstraksi tunggal dan ekstraksi bertingkat. Ekstraksi tunggal untuk

memperoleh senyawa antimikroba dari jintan hitam dilakukan dengan distilasi

40

uap dan ekstraksi menggunakan pelarut air dan etanol. Distilasi uap dilakukan

untuk memperoleh hanya komponen volatil biji jintan hitam, yaitu dalam

bentuk minyak atsiri. Ekstraksi tunggal dengan air dan etanol dimaksudkan

untuk mengekstrak komponen volatil dan komponen non-volatil yang terdapat

dalam biji jintan hitam. Ekstraksi bertingkat dilakukan terhadap biji jintan

hitam yang telah diambil minyak atsirinya, menggunakan heksan, etil asetat,

dan metanol secara berurutan.

Proses ekstraksi dengan pelarut, baik ekstraksi tunggal maupun ekstraksi

bertingkat dilakukan dengan metode refluks, yaitu dengan mengkontakkan

langsung bahan dan pelarut. Dalam metode refluks, campuran bahan dan

pelarut diberi panas mendekati titik didih pelarut. Proses ekstraksi dilakukan

dua kali agar jumlah yang rendemen diperoleh dapat optimal. Ekstraksi

pertama dilakukan selama 3 jam, sedangkan ekstraksi kedua dilakukan selama

2 jam. Filtrat dari masing-masing proses digabungkan kemudian dipekatkan

dan dihembus gas N2 untuk menghilangkan pelarut yang terbawa dalam filtrat

sehingga diperoleh ekstrak pekat tanpa residu pelarut. Pengecualian untuk

ekstrak air, pelarut air tidak diuapkan seluruhnya.

Proses ekstraksi secara bertingkat dilakukan untuk memisahkan senyawa

antimikroba secara lebih spesifik berdasarkan polaritasnya. Menurut

Adawiyah (1998), ekstrak yang diperoleh dengan ekstraksi secara bertingkat

memberikan aktivitas antimikroba yang lebih baik dibandingkan dengan

ekstraksi tunggal. Ekstrak hasil ekstraksi bertingkat memiliki aktivitas

antimikroba yang lebih baik karena senyawa antimikroba akan terpisah sesuai

dengan polaritas pelarutnya sehingga konsentrasi senyawa antimikroba pada

masing-masing pelarut akan lebih tinggi.

Penyulingan minyak atsiri (distilasi uap) dilakukan dua kali dengan

menggunakan biji jintan hitam yang berbeda dan ulangan yang berbeda juga.

Pada penyulingan pertama dilakukan tanpa penghalusan biji jintan hitam

karena dianggap sudah cukup halus, sedangkan pada penyulingan yang kedua

dilakukan dengan penghalusan biji jintan hitam. Dari penyulingan pertama

diperoleh minyak atsiri dengan rendemen sebesar 0.16 % (v/w), sedangkan

dari penyulingan kedua diperoleh minyak atsiri dengan rendemen sebesar

41

0.34% (v/w). Rendemen yang diperoleh pada penyulingan minyak atsiri bahan

bakunya dihaluskan terlebih dahulu ternyata lebih tinggi daripada rendemen

penyulingan minyak atsiri yang bahan bakunya tidak dihaluskan. Terjadi

perubahan besar rendemen yang cukup besar, yaitu dua kali lipat dari

rendemen yang pertama. Hasil penyulingan minyak atsiri secara lebih rinci

dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9. Hasil penyulingan minyak atsiri biji jintan hitam

Sampel Bobot bahan yang

disuling (kg)*

Kadar air (%)*

Ukuran (mesh)

Rendemen (% v/w)*

1 1.90 12.97 10 0.16

2 0.92 2.50 20 0.34

Keterangan : *) Laporan hasil uji dapat dilihat pada Lampiran 6 dan Lampiran 7.

Peningkatan rendemen pada minyak atsiri jintan hitam yang telah

dihaluskan disebabkan oleh proses penghalusan akan meningkatkan luas

permukaan bahan sehingga minyak atsiri akan lebih mudah terekstrak. Bila

bahan dibiarkan utuh, minyak atsiri hanya dapat diekstraksi jika uap air

berhasil melalui jaringan tanaman dan mendesaknya ke permukaan. Hal ini

terjadi secara difusi. Jika bahan dihaluskan, ukuran ketebalan untuk terjadinya

proses difusi akan berkurang sehingga saat penyulingan, laju penguapan

minyak atsiri dari bahan menjadi lebih cepat (Ketaren, 1987).

Selain disebabkan oleh perbedaan perlakuan, peningkatan rendemen

minyak atsiri dapat juga disebabkan oleh kadar air jintan hitam yang disuling.

Jintan hitam yang dihaluskan terlebih dulu sebelum disuling memiliki kadar

air (2.50 %) lebih rendah daripada kadar air jintan hitam yang disuling tanpa

dilakukan penghalusan (12.97 %). Menurut Ketaren (1987), penyulingan

minyak atsiri tidak sempurna jika bahan mengandung kadar air tinggi. Pada

penelitian ini, minyak atsiri yang diuji aktivitas antimikrobanya adalah minyak

atsiri yang diperoleh dari biji jintan hitam yang dihaluskan terlebih dulu.

Komponen antimikroba yang akan diekstrak dari biji jintan hitam belum

diketahui sifatnya. Oleh karena itu, dilakukan ekstraksi kembali secara

bertingkat pada ampas hasil penyulingan minyak atsiri. Ekstraksi bertingkat

42

dilakukan menggunakan berbagai pelarut organik dengan polaritas yang

berbeda-beda. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi bertingkat adalah

heksan, etil asetat, dan metanol. Heksan sebagai pelarut yang bersifat non

polar, etil asetat sebagai pelarut yang bersifat semi polar dan metanol sebagai

pelarut yang bersifat polar. Senyawa antimikroba akan terekstrak sesuai

polaritas pelarutnya sehingga senyawa antimikroba yang terdapat dalam jintan

hitam akan terpisah berdasarkan kepolarannya.

Ekstraksi tunggal dan ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut,

dilakukan dengan metode refluks pada suhu mendekati titik didih pelarutmya

dalam keadaan murni (bukan titik didih pelarut teknis). Titik didih air, etanol

murni, heksan murni, etil asetat murni dan metanol murni pada tekanan 1

atmosfir secara berturut-turut adalah 100 oC, 78 oC, 69 oC, 77-78 oC, dan 65 oC. Penggunaan suhu tinggi dalam ekstraksi akan meningkatkan kelarutan

komponen karena suhu tinggi akan mempermudah penetrasi pelarut ke dalam

struktur selular bahan (Houghton dan Raman, 1998). Komponen yang

terekstrak dengan metode refluks merupakan komponen yang tahan panas. Hal

ini terkait dengan termostabilitas komponen, komponen yang tidak tahan

panas akan hilang selama proses refluks.

Pelarut etanol, heksan, etil asetat dan metanol yang digunakan dalam

ekstraksi merupakan pelarut bersifat teknis. Pemilihan pelarut teknis ini terkait

dengan pertimbangan ekonomis jika akan diaplikasikan dalam industri.

Pelarut yang paling mudah diperoleh dan paling murah adalah air karena air

tersedia melimpah di muka bumi. Selain itu, air merupakan pelarut bagi semua

sistem kehidupan, digunakan oleh manusia dalam memasak dan menyiapkan

makanan sehingga residunya tidak memiliki pengaruh toksik terhadap tubuh

manusia.

Ekstrak air sangat sulit dipekatkan jika dibandingkan dengan ekstrak

etanol, ekstrak heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Pemekatan

ekstrak air dilakukan menggunakan rotavapor pada suhu 50 oC, sedangkan

ekstrak yang lain dipekatkan pada suhu 40-45 oC. Pemekatan ekstrak air tidak

dilakukan pada suhu yang lebih tinggi lagi dengan tujuan untuk menghindari

kerusakan komponen dalam ekstrak. Walaupun dipekatkan pada suhu yang

43

lebih tinggi daripada ekstrak lainnya, pemekatan tetap masih sulit dilakukan.

Hal ini diduga disebabkan oleh ke-vakum-an alat yang digunakan kurang baik.

Semakin rendah tekanan udara alat (semakin vakum) maka titik didih pelarut

akan semakin rendah. Tekanan vakum alat yang digunakan cukup untuk

mencapai titik didih etanol, heksan, etil asetat dan metanol pada suhu 40oC,

tetapi tidak cukup vakum untuk mencapai titik didih air. Ekstrak air berwarna

coklat susu dan masih ada aroma jintan hitam. Rendemen ekstrak air adalah

82.73 %, tetapi tidak berupa ekstrak pekat. Kadar air dari ekstrak air adalah

86.85 %. Karakteristik ekstrak yang dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 10.

Tabel 10. Karakteristik berbagai ekstrak jintan hitam

Ekstrak Rendemen (%)*

Penampakan/ Warna

Aroma

Ekstraksi tunggal : • Minyak atsiri • Ekstrak air

• Ekstrak etanol

0.34

82.73

8.39

Coklat jernih

Coklat susu

Coklat kehitaman

Menyengat, khas

jintan hitam Ada aroma jintan

hitam Ada aroma jintan

hitam

Ekstraksi bertingkat** : • Ekstrak heksan • Ekstrak heksan-

etil asetat • Ekstrak heksan- metanol

25.55

8.60

5. 08

Coklat kehijauan, agak keruh Coklat tua

Coklat tua

Tidak ada aroma

jintan hitam Tidak ada aroma

jintan hitam

Tidak ada aroma jintan hitam

Keterangan : *) Rendemen = (Bobot ekstrak / Bobot bahan awal) x 100; contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 8

**) Sampel telah dihilangkan minyak atsirinya dan dalam penghitungan rendemen yang dijadikan bobot bahan awal adalah bobot bahan (ampas) yang digunakan

Heksan bersifat non polar sehingga akan melarutkan senyawa-senyawa

yang bersifat non polar juga. Senyawa yang umumnya terekstrak oleh heksan

adalah lilin, lemak, minyak, dan minyak atsiri. Ekstrak heksan dalam

penelitian ini sudah tidak mengandung minyak atsiri karena sudah dipisahkan

terlebih dulu. Ekstrak heksan memiliki rendemen tertinggi. Tingginya

44

rendemen ekstrak heksan menunjukkan kandungan lemak biji jintan hitam

cukup tinggi. Berdasarkan hasil analisis proksimat yang dilakukan, kadar

lemak biji jintan hitam adalah sebesar 31.68 %.

Etanol dan etil asetat tergolong bersifat semi polar. Berdasarkan asas like

dissolve like, senyawa yang akan larut dalam etanol dan etil asetat adalah

senyawa yang bersifat semi polar juga. Walaupun ekstrak etanol diperoleh

secara ekstraksi tunggal dan ekstrak etil asetat diperoleh secara ekstraksi

bertingkat, rendemen ekstrak etanol (8.39 %) tidak berbeda jauh dengan

rendemen ekstrak etil asetat (8.60 %). Senyawa yang umum larut dalam etanol

adalah glikosida, sedangkan senyawa yang umum larut dalam etil asetat

adalah alkaloid, aglikon, dan glikosida.

Minyak atsiri memiliki aroma yang menyengat, khas jintan hitam.

Ekstrak air dan etanol masih memberikan aroma jintan hitam karena sebelum

proses ekstraksi tidak dilakukan pemisahan komponen volatil (seperti

penyulingan minyak atsiri). Ekstrak heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak

metanol sudah tidak memberikan aroma jintan hitam. Hal tersebut disebabkan

komponen yang memberikan aroma jintan hitam sudah terekstrak pada

minyak atsiri. Menurut Belitz et. al. (1999), komponen aroma dalam rempah-

rempah umumnya terdapat dalam minyak atsiri.

D. AKTIVITAS ANTIMIKROBA

Uji aktivitas antimikroba dilakukan menggunakan metode difusi agar.

Metode difusi agar dilakukan dengan memasukkan komponen antimikroba ke

dalam lubang pada agar. Komponen akan berdifusi ke dalam agar dan akan

menghambat pertumbuhan mikroba yang terkandung dalam agar. Namun,

untuk komponen antimikroba yang hidrofobik, akan sulit berdifusi ke dalam

agar karena agar bersifat polar / hidrofilik. Oleh karena itu digunakan DMSO

yang bersifat seperti emulsifier, memiliki gugus hidrofilik dan hidrofobik agar

senyawa yang bersifat hidrofobik dapat larut dalam agar. Untuk

menghilangkan pengaruh DMSO terhadap ekstrak, DMSO digunakan sebagai

kontrol negatif pada saat dilakukan uji difusi agar. Berdasarkan hasil

penelitian ini, DMSO tidak menunjukkan adanya aktivitas antimikroba.

45

Ekstrak yang menjadi hasil ekstraksi tunggal adalah ekstrak air, ekstrak

etanol dan minyak atsiri. Ekstrak yang menjadi hasil ekstraksi bertingkat

adalah ekstrak heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol. Untuk

mengetahui pengaruh jenis ekstrak dan jenis mikroba terhadap besar diameter

penghambatan (aktivitas antimikroba), dilakukan pengolahan statistik dengan

analisis ragam dengan rancangan faktorial pada taraf nyata 0.05. Hasil analisis

ragam dapat dilihat pada Tabel 11.

Tabel 11. Hasil analisis ragam

Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah Nilai F Nilai p

Ekstrak 5 152.720 30.544 75.58 0.0001 Mikroba 4 158.829 39.707 98.25 0.0001 Interaksi 20 105.653 5.283 13.07 0.0001 Galat 53 21.419 0.404 Total 82 459.294

Dari Tabel 11 dapat dilihat bahwa baik ekstrak maupun mikroba

memiliki nilai peluang lebih kecil dari taraf nyata yang digunakan dalam

penelitian ini (p<0.05). Dengan demikian jenis ekstrak dan jenis mikroba akan

berpengaruh secara nyata terhadap besar diameter penghambatan (aktivitas

antimikroba). Untuk mengetahui jenis ekstrak dan jenis mikroba yang

memberikan pengaruh yang berbeda terhadap diameter penghambatan,

dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf nyata 0.05. Hasil uji lanjut Duncan

dapat dilihat pada Lampiran 11. Nilai peluang terjadinya interaksi antara jenis

ekstrak dan jenis mikroba lebih kecil dari 0.05 sehingga ada interaksi antara

jenis ekstrak dan jenis mikroba dalam mempengaruhi besar diameter

penghambatan.

Berdasarkan hasil uji lanjut Duncan pada taraf nyata 0.05, yang dapat

dilihat pada Lampiran 11, diketahui bahwa ekstrak biji jintan hitam yang

paling baik dalam menghambat semua bakteri uji adalah ekstrak etanol.

Aktivitas antimikroba minyak atsiri lebih rendah jika dibandingkan dengan

aktivitas antimikroba ekstrak etanol, tetapi lebih tinggi jika dibandingkan

dengan ekstrak biji jintan hitam yang lainnya. Ekstrak etil asetat dan ekstrak

metanol memberikan pengaruh yang tidak berbeda dalam menghambat

46

pertumbuhan bakteri uji, sedangkan ekstrak air dan ekstrak heksan adalah

ekstrak biji jintan hitam yang paling tidak efektif dalam menghambat bakteri

uji. Ekstrak air dan ekstrak heksan memberikan pengaruh yang tidak berbeda

dalam menghambat semua mikroba uji. Hasil uji lanjut Duncan terhadap jenis

bakteri pada taraf nyata 0.05 menunjukkan bahwa setiap bakteri uji

memberikan pengaruh yang berbeda-beda terhadap besar diameter

penghambatan. Bakteri uji yang paling dihambat oleh semua ekstrak jintan

hitam adalah Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri uji yang paling tahan

(paling tidak dihambat) terhadap semua ekstrak jintan hitam adalah

Escherichia coli.

1. Aktivitas antimikroba berbagai ekstrak jintan hitam

Berdasarkan hasil penelitian ini, biji jintan hitam mengandung

senyawa antimikroba yang bersifat polar, semi polar dan non polar. Pada

Gambar 11 terlihat bahwa semua jenis ekstrak baik yang bersifat polar, semi

polar dan tidak polar menunjukkan adanya aktivitas antimikroba walaupun

tidak semua ekstrak tersebut dapat menghambat semua bakteri uji. Ekstrak

yang bersifat polar adalah ekstrak air dan ekstrak metanol. Ekstrak yang

bersifat semi polar adalah ekstrak etanol dan ekstrak etil asetat. Ekstrak yang

bersifat non polar dari ekstrak adalah ekstrak heksan. Keefektifan masing-

masing ekstrak tersebut tergantung pada jenis bakteri yang dihambat.

Gambar 11. Pengaruh berbagai ekstrak jintan hitam terhadap bakteri uji.

47

Ekstrak air tidak begitu efektif dibandingkan dengan ekstrak metanol

dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hal ini dapat dilihat dari nilai

diameter penghambatan yang kecil, bahkan tidak menunjukkan

penghambatan terhadap Escherichia coli dan Salmonella Typhimurium.

Diameter penghambatan ekstrak air terhadap Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas aeruginosa secara berturut-turut

adalah 1.65±0.150 mm, 3.37±0.190 mm, dan 2.93±0.025 mm. Hasil uji

aktivitas antimikroba ekstrak air terhadap bakteri uji dapat dilihat pada

Gambar 12.

Gambar 12. Pengaruh ekstrak air terhadap bakteri uji

Keterangan : Batang dan garis vertikal di atasnya menunjukkan nilai mean ± SE, dengan n=2.

Ketidakefektifan ekstrak air dalam menghambat pertumbuhan bakteri

uji dapat disebabkan oleh keadaan ekstrak air yang tidak pekat sehingga

konsentrasi ekstrak yang dimasukkan ke dalam agar belum efektif

menghambat pertumbuhan bakteri uji. Kadar air ekstrak air adalah 86.85 %

sehingga sebenarnya konsentrasi ekstrak air hanya sekitar satu per tujuh dari

konsentrasi ekstrak jintan hitam yang lainnya. Jika ekstrak air digunakan

dalam bentuk pekat, mungkin aktivitas antimikrobanya akan lebih baik lagi.

Selain disebabkan oleh keadaan yang tidak pekat, ketidakefektifan

ekstrak air dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji dapat disebabkan

oleh sifat air yang terlalu polar, sedangkan sifat komponen antimikroba yang

48

terdapat dalam biji jintan hitam hanya sedikit yang bersifat polar. Menurut

Ahmad et. al. (1998) dalam Ahmad et. al. (2001), etanol merupakan pelarut

yang lebih baik dibandingkan air dan heksan jika akan mengekstrak

komponen antimikroba. Hasil penelitian lain yang menunjukkan bahwa

aktivitas antimikroba ekstrak etanol lebih baik daripada ekstrak air adalah

hasil penelitian Nair et. al. (2006). Menurut Nair, et. al. (2006), aktivitas

antimikroba ekstrak air yang lebih rendah dibandingkan aktivitas ekstrak

etanol diduga karena konsentrasi komponen aktif yang jenisnya sama, yang

terdapat pada ekstrak air dan ekstrak etanol, terdapat lebih rendah dalam

ekstrak air atau karena komponen aktif bahan lebih larut dalam pelarut

organik sehingga tidak terdapat dalam ekstrak air.

Penelitian yang menggunakan air untuk mengekstrak senyawa

antimikroba adalah penelitian Al-hebshi et. al. (2005) yang menyatakan

bahwa ekstrak air dari khat memiliki aktivitas antimikroba pada bakteri

tertentu. Adanya aktivitas antimikroba pada ekstrak air khat menunjukkan

bahwa dalam khat terdapat komponen antimikroba yang larut dalam air,

seperti tanin. Leelapornpisid et. al (2006) juga menyatakan bahwa ekstrak

air dari Excoecaria cochinchinensis Lour dan Salvia officinalis Lour

memiliki aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus dengan nilai

MIC 1.56 mg/ml untuk Excoecaria cochinchinensis Lour dan 3.13 mg/ml

untuk Salvia officinalis Lour.

Ekstrak metanol tidak menunjukkan penghambatan terhadap

pertumbuhan terhadap Escherichia coli. Diameter penghambatan ekstrak

metanol terhadap Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus, dan Salmonella Typhimurium secara berturut-turut

adalah 5.56±0.432 mm, 4.33±0.494 mm, 4.18±0.710 mm, dan 3.08±0.245

mm. Walaupun tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap

pertumbuhan Escherichia coli, berdasarkan hasil uji lanjut Duncan pada

taraf nyata 0.05, ekstrak metanol tidak berbeda dengan ekstrak etil asetat

dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji secara keseluruhan. Hasil uji

aktivitas antimikroba ekstrak metanol terhadap bakteri uji dapat dilihat pada

Gambar 13.

49

0123456789

10

B. cereus S.aureus E coli S.Typhimurium P.aeruginosa

Jenis bakteri

Dia

met

er p

engh

amba

tan

(mm

)

Gambar 13. Pengaruh ekstrak metanol terhadap bakteri uji


Metanol tergolong pelarut bersifat polar jika dibandingkan dengan

heksan, etanol, dan etil asetat. Berdasarkan asas like dissolve like, senyawa

yang larut dalam metanol akan cenderung bersifat polar juga. Menurut

Houghton dan Raman (1998), senyawa yang umumnya larut dalam metanol

sama dengan senyawa yang umumnya larut dalam air, yaitu gula, asam

amino, dan glikosida. Biji jintan hitam mengandung saponin melantin

(Achyad et. al., 2000) sehingga kemungkinan aktivitas antimikroba ekstrak

air dan ekstrak metanol jintan hitam disebabkan oleh adanya senyawa

glikosida, yaitu saponin. Saponin memiliki aktivitas antimikroba yang dalam

mekanismenya akan menyebabkan kebocoran protein dan enzim-enzim dari

sel bakteri (Naidu, 1998). Selain glikosida, tanin juga larut dalam air dan

metanol. Mekanisme tanin sebagai antimikroba adalah dengan mengkelat

ion-ion logam yang penting dalam metabolisme, yang terdapat di permukaan

sel bakteri (Scalbert, 1991).

Ekstrak etanol dapat menghambat seluruh bakteri uji sehingga

merupakan ekstrak yang memiliki spektrum yang luas. Diameter

penghambatan ekstrak etanol terhadap Bacillus cereus, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, dan Pseudomonas

aeruginosa secara berturut-turut adalah 5.32±0.135 mm, 9.34±0.308 mm,

1.67±0.020 mm, 5.20±0.190 mm, dan 7.05±0.217 mm. Hasil uji aktivitas

50

antimikroba ekstrak etanol terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Gambar

14.

0123456789

10


Jenis bakteri

Dia

met

er p

engh

amba

tan

(mm

)

Gambar 14. Pengaruh ekstrak etanol terhadap bakteri uji

Keterangan : Batang dan garis vertikal di atasnya menunjukkan nilai mean ± SE Dari kecenderungan data yang diperoleh, seperti terlihat pada Gambar

14, Staphylococcus aureus adalah bakteri yang paling sensitif dihambat oleh

ekstrak etanol. Hasil penelitian yang dilakukan Ahmad et. al. (2001)

mendukung bahwa Staphylococcus aureus merupakan mikroba yang paling

sensitif dihambat oleh ekstrak etanol jintan hitam. Gambar zona

penghambatan bakteri Staphylococcus aureus oleh ekstrak etanol jintan

hitam dapat dilihat pada Gambar 15 berikut ini.

Kontrol

Kontrol Ekstrak etanol

51

Gambar 15. Zona penghambatan ekstrak etanol jintan hitam terhadap Staphylococcus aureus

Menurut Houghton dan Raman (1998), komponen yang larut dalam

etanol adalah glikosida. Diduga aktivitas antimikroba ekstrak etanol biji

jintan hitam disebabkan oleh adanya senyawa glikosida, yaitu saponin.

Selain glikosida, tanin juga larut dalam etanol dan memiliki aktivitas

antimikroba.

Etil asetat tergolong sebagai pelarut yang bersifat semi polar. Menurut

Adawiyah (1998), sifat etil asetat yang semi polar menyebabkan ekstrak etil

asetat akan memiliki dua sifat kelarutan, yaitu hidrofilik dan lipofilik. Gugus

lipofilik dan hidrofilik, keduanya diperlukan untuk kerja senyawa

antimikroba. Gugus hidrofilik dibutuhkan agar zat antimikroba dapat larut

dalam air yang menjadi tempat tumbuh mikroba, sedangkan sifat lipofolik

diperlukan agar zat tersebut bereaksi dengan membran dari mikroba (Branen

dan Davidson, 1993).

Ekstrak etil asetat memiliki spektrum luas karena dapat menghambat

semua bakteri uji. Besar diameter penghambatan ekstrak etil asetat terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli,

Salmonella Typhimurium, dan Pseudomonas aeruginosa secara berturut-

turut adalah 3.17±0.215 mm, 3.04±0.703 mm, 2.15±0.189 mm, 5.07±0.477

mm, dan 4.19±0.365 mm. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat

terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 16.

0123456789

10


Jenis bakteri

Dia

met

er p

engh

amba

tan

(mm

)

52

Gambar 16. Pengaruh ekstrak etil asetat terhadap bakteri uji


Senyawa fitokimia yang umum larut dalam etil asetat adalah alkaloid,

aglikon, dan glikosida (Houghton dan Raman, 1998). Aktivitas antimikroba

pada ekstrak etil asetat jintan hitam diduga disebabkan oleh adanya

komponen alkaloid dan glikosida karena menurut Al-Saleh (2006), biji

jintan hitam mengandung alkaloid dan menurut Achyad et. al. (2000), biji

jintan hitam mengandung glikosida yaitu saponin melantin. Alkaloid dan

glikosida merupakan senyawa yang sudah diketahui memiliki aktivitas

antimikroba.

Minyak atsiri biji jintan hitam menunjukkan efektifitas yang cukup

baik dalam menghambat semua bakteri uji. Diameter penghambatan minyak

atsiri terhadap Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Salmonella Typhimurium dan Pseudomonas aeruginosa secara berturut-

turut adalah 6.07±0.175 mm, 7.36±0.334 mm, 3.25±0.225 mm, 4.23±0.406

mm, dan 2.29±0.227 mm. Hasil uji aktivitas antimikroba minyak atsiri

terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 17.

0123456789

10


Jenis bakteri

Dia

met

er p

engh

amba

tan

(mm

)

Gambar 17. Pengaruh minyak atsiri terhadap bakteri uji


53

Berdasarkan Gambar 17, bakteri yang paling dihambat

pertumbuhannya oleh minyak atsiri adalah Staphylococcus aureus. Hasil

penelitian lain yang menyebutkan tentang sensitivitas Staphylococcus

aureus terhadap minyak atsiri adalah hasil penelitian Rota et. al. (2004)

yang menyebutkan bahwa Staphylococcus aureus lebih sensitif terhadap

minyak atsiri dibandingkan dengan Escherichia coli dan Salmonella

Typhimurium.

Senyawa yang terdapat dalam minyak atsiri bersifat volatil, umumnya

dari golongan terpenoid (monoterpen dan seskuiterpen) dan golongan

fenolik (Houhgton dan Raman, 1998). Terpenoid merupakan komponen

yang memiliki aktivitas antimikroba (Dorman, 2000). Salah satu komponen

yang termasuk golongan terpenoid adalah thymol. Thymol merupakan salah

satu komponen dalam minyak atsiri yang sangat efektif dalam menghambat

pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Staphylococus aureus, dan

Pseudomonas aeruginosa (Hirasa, 1998). Menurut Al-Saleh (2006), biji

jintan hitam mengandung thymol. Oleh karena itu, efektivitas minyak atsiri

biji jintan hitam dalam menghambat semua bakteri uji dapat disebabkan oleh

adanya thymol dalam minyak atsiri biji jintan hitam. Menurut Dorman dan

Deans (2000), thymol merupakan senyawa antimikroba berspektrum luas.

Berdasarkan Gambar 17, bakteri yang paling sulit dihambat

pertumbuhannya oleh minyak atsiri jintan hitam adalah Pseudomonas

aeruginosa. Jika dikaitkan dengan keberadaan thymol dalam minyak atsiri,

tidak sensitifnya Pseudomonas aeruginosa terhadap minyak atsiri didukung

oleh hasil penelitian Lambert et. al. (2001) yang menyatakan bahwa

Pseudomonas aeruginosa tidak terlalu sensitif terhadap thymol

dibandingkan dengan Staphylococus aureus.

Besar diameter penghambatan ekstrak heksan terhadap Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus cereus secara berturut-turut

adalah 4.02±0.361 mm, 3.72±0.826 mm dan 2.08±0.460 mm. Ekstrak

heksan tidak menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap bakteri Esherichia

coli dan Salmonella Typhimurium. Hasil serupa diperoleh Thongson et. al.

(2004) yang menunjukkan bahwa ekstrak heksan dari Zingiber officinale

54

Rose (jahe), Boesenbergia pandurata Holtt (fingerroot), dan Curcuma longa

Linn. (kunyit) tidak menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Salmonella

Typhimurium. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak heksan terhadap

bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 18.

0123456789

10


Jenis bakteri

Dia

met

er p

engh

amba

tan

(mm

)

Gambar 18. Pengaruh ekstrak heksan terhadap bakteri uji

Keterangan : Batang dan garis vertikal di atasnya menunjukkan nilai mean ± SE, dengan n=3

Heksan merupakan pelarut yang bersifat paling tidak polar jika

dibandingkan dengan pelarut lain yang digunakan dalam penelitian ini

sehingga ekstrak heksan bersifat non polar. Ketidakefektifan ekstrak heksan

dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji diduga disebabkan oleh sifat

heksan yang sangat tidak polar sehingga hanya sedikit komponen

antimikroba yang dapat larut di dalamnya. Komponen antimikroba dalam

ekstrak bahan alami umumnya adalah golongan fenolik yang bersifat polar.

Komponen yang umumnya larut dalam heksan adalah lilin, lemak,

komponen terpenoid.

Sampel yang diekstrak menggunakan heksan sudah dihilangkan

minyak atsiri-nya (komponen volatil) sehingga senyawa antimikroba yang

larut dalam heksan adalah senyawa antimikroba yang tidak volatil. Diduga

komponen antimikroba yang terdapat dalam ekstrak heksan adalah golongan

terpenoid yang tidak volatil, yaitu steroid dan triterpenoid. Adanya aktivitas

antimikroba pada minyak atsiri dan ekstrak heksan menunjukkan bahwa

55

komponen antimikroba yang terdapat dalam jintan hitam ada yang tergolong

terpenoid mudah menguap dan terpenoid yang tidak menguap.

Selain disebabkan oleh adanya komponen steroid dan triterpenoid,

adanya aktivitas antimikroba ekstrak heksan terhadap beberapa bakteri uji

dapat juga disebabkan adanya asam-asam lemak. Menurut Hinton et. al.

(2000) dalam Ji et. al. (2002), aktivitas antimikroba asam lemak disebabkan

oleh kemampuan asam lemak untuk menghancurkan membran sel bakteri

dan menyebabkan lisis sel. Menurut Ji et. al. (2002), asam linoleat memiliki

aktivitas antibakteri terhadap Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus.

Asam linolenat diduga menyebabkan abnormalitas permukaan sel ataupun

pada bagian intraselular (Ji et. al., 2002). Kemampuan senyawa non polar

untuk menghambat pertumbuhan mikroba diduga karena senyawa non polar

dapat menyebabkan perubahan komposisi membran sel, sehingga membran

sel mengalami kerusakan. Selain itu, komponen non polar juga dapat

bereaksi dengan protein membran yang menyebabkan kebocoran isi sel

(Sikkema dalam Ardiansyah, 2001).

Ekstrak heksan maupun minyak atsiri merupakan ekstrak yang bersifat

non polar. Namun, minyak atsiri memiliki aktivitas antimikroba yang lebih

baik daripada ekstrak heksan. Hal ini terkait dengan jenis asam lemak yang

terkandung dalam masing-masing ekstrak tersebut. Minyak atsiri

mengandung asam lemak-asam lemak rantai pendek, sedangkan ekstrak

heksan cenderung mengandung asam lemak dengan rantai yang lebih

panjang. Dalam menghambat pertumbuhan bakteri, asam lemak rantai

pendek lebih efektif daripada asam lemak rantai panjang karena strukturnya

yang pendek menyebabkan asam lemak rantai pendek lebih mudah masuk

ke dalam sel bakteri.

2. Ketahanan bakteri terhadap berbagai ekstrak jintan hitam

Berdasarkan uji lanjut Duncan pada taraf nyata 0.05, setiap bakteri uji

memberikan pengaruh yang berbeda-beda terhadap besar diameter

penghambatan. Bakteri uji yang paling dihambat oleh semua ekstrak jintan

hitam adalah Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri uji yang paling

tahan (paling tidak dihambat) terhadap semua ekstrak jintan hitam adalah

56

Escherichia coli. Ketahanan Escherichia coli terhadap semua ekstrak jintan

hitam dapat disebabkan Escherichia coli tahan hidup dan berkembang baik

pada kondisi tidak baik dan kekurangan gizi (Pelczar et. al. dalam

Ardiansyah, 2001).

Bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif memiliki ketahanan

yang berbeda terhadap senyawa antimikroba. Dapat dilihat pada Gambar 19

bahwa pertumbuhan bakteri Gram positif cenderung lebih dihambat

daripada pertumbuhan bakteri Gram negatif, kecuali pada ekstrak etil asetat.

Pola penghambatan terhadap bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif

dari ekstrak-ekstrak jintan hitam ini mirip dengan pola penghambatan

antibiotik penisin G. Menurut Prescott et. al. (2003), penisilin G lebih aktif

menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif daripada bakteri Gram

negatif.

Gambar 19. Pengaruh masing-masing ekstrak terhadap pertumbuhan

bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Keterangan : Batang menunjukkan nilai rata-rata dari diameter penghambatan

bakteri uji yang telah dikelompokkan berdasarkan jenis Gram.

Bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap senyawa antimikroba

dibandingkan dengan bakteri Gram negatif karena struktur dinding sel

bakteri Gram negatif yang berlapis-lapis, yaitu lipopolisakarida,

peptidoglikan dan lipoprotein. Pada lapisan lipopolisakarida tersebut Gram

negatif memiliki sistem seleksi (screening) terhadap zat-zat asing (Branen

dan Davidson, 1993). Bakteri Gram negatif umumnya lebih sensitif terhadap

57

senyawa antimikroba yang bersifat polar karena dinding sel bakteri Gram

negatif bersifat polar sehingga lebih mudah dilewati oleh senyawa

antimikroba yang bersifat polar.

Sebaliknya dari bakteri Gram negatif, bakteri Gram positif lebih

sensitif terhadap senyawa antimikroba yang bersifat non polar. Kesensitifan

bakteri Gram positif terhadap senyawa antimikroba yang bersifat non polar

disebabkan komponen terbesar penyusun dinding sel bakteri Gram positif

adalah peptidoglikan yang salah satu penyusunnya adalah asam amino

alanin yang bersifat hidrofobik/non polar. Hal inilah yang menyebabkan

dinding sel bakteri Gram positif menjadi lebih mudah dilewati dan diserang

oleh senyawa antimikroba yang bersifat non polar.

3. Efektivitas senyawa antimikroba ekstrak biji jintan hitam

Ekstrak biji jintan hitam yang menunjukkan spektrum antimikroba

yang luas adalah ekstrak etanol, minyak atsiri dan ekstrak etil asetat karena

dapat menghambat semua bakteri uji. Ekstrak etanol dan ekstrak etil asetat

mengandung komponen antimikroba yang cenderung bersifat semi polar,

sedangkan minyak atsiri mengandung komponen antimikroba yang

cenderung bersifat non polar. Hal ini menunjukkan bahwa kepolaran tidak

menentukan adanya aktivitas antimikroba. Namun, dalam mengekstrak

senyawa antimikroba penting untuk mengetahui polaritas komponen

antimikroba yang terdapat dalam bahan agar dapat ditentukan metode yang

tepat untuk mengekstraknya.

Jika dilakukan perbandingan antara ekstrak-ekstrak yang memiliki

spektrum luas, ekstrak etanol dapat dianggap sebagai ekstrak terbaik untuk

menghambat semua bakteri uji. Ekstrak etanol mengandung komponen

volatil dan non-volatil dari biji jintan hitam, minyak atsiri hanya

mengandung komponen volatil, dan ekstrak etil asetat hanya mengandung

komponen non-volatil. Efektivitas ekstrak etanol disebabkan ekstrak etanol

mengandung senyawa antimikroba yang bersifat volatil dan non-volatil.

Dengan demikian, jumlah dan jenis senyawa antimikroba yang terkandung

dalam ekstrak etanol akan lebih banyak dan lebih lengkap daripada jumlah

dan jenis senyawa antimikroba yang terdapat pada minyak atsiri (hanya

58

mengandung komponen volatil) ataupun pada ekstrak etil asetat (hanya

mengandung komponen non-volatil).

Menurut Houghton dan Raman (1998), etil asetat memiliki kepolaran

sedang (medium) sehingga senyawa antimikroba yang terdapat dalam

ekstrak etil asetat jintan hitam akan cenderung memiliki kepolaran sedang.

Dengan demikian, senyawa antimikroba dalam jintan hitam yang bersifat

non-volatil dan memiliki spektrum luas adalah senyawa yang bersifat semi

polar.

Berdasarkan efektivitas dalam menghambat bakteri uji dan

kesederhanaan melakukan ekstraksi, ekstraksi tunggal menggunakan pelarut

etanol dapat dianggap sebagai cara terbaik untuk mengekstrak komponen

antimikroba dari biji jintan hitam. Namun, jika ingin dilihat dari segi

ekonomis, distilasi uap yang dilanjutkan dengan ekstraksi bertingkat akan

menjadi cara yang lebih menguntungkan. Distilasi uap akan menghasilkan

minyak atsiri yang bernilai ekonomis tinggi dan ekstraksi bertingkat akan

meningkatkan nilai ekonomis ampas penyulingan minyak atsiri tersebut.

Ampas penyulingan minyak atsiri tersebut masih bisa dimanfaatkan lebih

lanjut, yaitu dengan diekstrak komponen antimikrobanya.

E. IDENTIFIKASI KUALITATIF SENYAWA FITOKIMIA

Komponen fitokimia merupakan senyawa metabolit sekunder yang telah

banyak diketahui memiliki aktivitas antimikroba. Proses ekstraksi

menggunakan pelarut yang memiliki kepolaran yang berbeda akan

mengekstrak senyawa yang berbeda juga. Kelarutan komponen aktif dalam

bahan/sampel akan menentukan komposisi ekstrak yang diperoleh (Thongson

et. al., 2004). Penggolongan senyawa kimia yang terekstrak pada beberapa

pelarut dapat dilihat pada Tabel 12.

Tabel 12. Jenis senyawa fitokimia yang terekstrak pada berbagai pelarut

Polaritas Pelarut Senyawa kimia yang terekstrak

Rendah Heksan Lilin, lipid, minyak atsiri Kloroform Alkaloid, aglikon, minyak atsiri

Sedang/medium Etil asetat Alkaloid, aglikon, glikosida Aseton Alkaloid, aglikon, glikosida

59

Etanol Glikosida Metanol Gula, asam amino, glikosida

Tinggi Air Gula, asam amino, glikosida Cairan asam Gula, asam amino, glikosida basa Cairan basa Gula, asam amino, glikosida asam

(Sumber : Houghton dan Raman, 1998)

Uji kualitatif komponen fitokimia hanya dilakukan terhadap ekstrak

yang dianggap memiliki aktivitas antimikroba dengan spektrum luas dan nilai

yang cukup besar. Ekstrak-ekstrak tersebut adalah ekstrak etanol, minyak

atsiri, dan ekstrak etil asetat. Hasil uji kualitatif komponen fitokimia dapat

dilihat pada Tabel 13.

Tabel 13. Hasil identifikasi kualitatif senyawa fitokimia

Ekstrak Fenol Tanin Flavonoid Terpenoid Steroid

Saponin Alkaloid

Ekstrak etanol + - - - + - -

Minyak atsiri + - - + - - -

Ekstrak etil asetat

+ - + TD* TD* TD* TD*

Keterangan : *)TD artinya tidak diujikan karena keterbatasan jumlah sampel Uji kualitatif komponen fitokimia terhadap ekstrak etanol menunjukkan

pada ekstrak etanol terdeteksi adanya komponen fenol dan steroid. Tanin dan

flavonoid termasuk dalam golongan fenolik. Walaupun uji fitokimia

menunjukkan adanya komponen fenolik dalam ekstrak etanol, uji fitokimia

menunjukkan bahwa tanin dan flavonoid tidak terdeteksi dalam ekstrak etanol,

padahal menurut Leelapornpisid et. al. (2006), tanin dan komponen fenol akan

ditemukan pada ekstrak air dan ekstrak etanol.

Hasil uji yang menunjukkan tidak terdeteksinya senyawa tanin dalam

ekstrak etanol jintan hitam, bertentangan dengan hasil yang diperoleh Ahmad

et. al. (2001), menggunakan metode Thin Layer Chromatography (TLC).

Ahmad et. al (2001), menyebutkan bahwa ekstrak etanol jintan hitam

mengandung tanin. Hasil yang berbeda ini dapat disebabkan sampel yang diuji

pada penelitian ini terlalu sedikit sehingga keberadaan tanin tidak terdeteksi.

60

Pada minyak atsiri terdeteksi adanya komponen fenol dan komponen

terpenoid. Komponen fenol dan komponen terpenoid sudah diketahui

memiliki aktivitas antimikroba. Beberapa senyawa terpenoid merupakan

komponen fenol, seperti eugenol dan thymol, sehingga mekanisme aktivitas

antimikroba senyawa terpenoid tersebut diduga mirip dengan mekanisme

antimikroba senyawa fenol. Mekanisme senyawa fenolik sebagai antimikroba

sebagian besar adalah dengan mempengaruhi membran sel (Branen dan

Davidson, 1993). Senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan

besar karena mampu membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan

hidrogen. Akibatnya kerja enzim dapat terganggu (Harborne, 1996).

Komponen fenolik dapat melignifikasi dinding sel bakteri sehingga

keberadaan komponen fenolik dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

Ekstrak etanol jintan hitam tidak menunjukkan adanya komponen

flavonoid. Hasil ini didukung oleh hasil penelitian Ahmad et. al. (2001). Uji

fitokimia menunjukkan bahwa flavonoid terdeteksi hanya pada ekstrak etil

asetat. Menurut Houghton dan Raman (1998), etanol dan etil asetat sama-sama

bersifat semi polar, tetapi etanol lebih polar dibandingkan etil asetat. Oleh

karena itu, flavonoid yang terdapat dalam biji jintan hitam memiliki sifat

kepolaran yang mirip dengan etil asetat sehingga tidak larut dalam etanol.

Ekstrak etil asetat menunjukkan hasil positif pada uji fenol dan uji flavonoid.

Biji jintan hitam mengandung alkaloid (Al-Saleh, 2006). Menurut Hu, et.

al. (2000) dan Faizi, et. al. (2003) dalam Al-hebshi (2005), senyawa alkaloid

memiliki aktivitas antimikroba. Hasil uji fitokimia menunjukkan alkaloid

tidak terdeteksi pada semua ekstrak yang diuji. Hal ini dapat disebabkan

komponen alkaloid terdapat pada ekstrak lain yang tidak dianalisis komponen

fitokimianya atau dapat juga disebabkan oleh jumlah sampel yang terlalu

sedikit. Uji fitokimia ekstrak etanol jintan hitam menggunakan metode Thin

Layer Chromatography (TLC) menunjukkan tidak adanya alkaloid (Ahmad et.

al., 2001).

F. MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC)

61

Minimum Inhibitory Concentration adalah konsentrasi terendah ekstrak

yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Pada penelitian ini, pemilihan

ekstrak dan bakteri yang akan diuji dalam penentuan nilai MIC tidak hanya

didasarkan pada ukuran diameter terbesar melainkan juga berdasarkan

pertimbangan ukuran diameter, jumlah ekstrak dan variasi ekstrak yang akan

diuji. Penentuan nilai MIC dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar

(Bloomfield, 1991). Hasil penentuan nilai MIC beberapa ekstrak jintan hitam

dapat dilihat pada Tabel 14 berikut ini.

Tabel 14. Nilai MIC beberapa ekstrak jintan hitam

Ekstrak Bakteri Nilai MIC (% w/w)

Nilai MIC (ppm)

Ekstrak etanol Salmonella

Typhimurium 0.084 840

Minyak atsiri Bacillus

cereus 1.72 1720

Ekstrak etil asetat Staphylococcus

aureus 1.88 1880

Ekstrak metanol Pseudomonas

aeruginosa 1.88 1880

Semakin kecil nilai MIC maka semakin baik ekstrak tersebut, terutama

berkaitan dengan ambang batas jumlah komponen antimikroba yang

diperbolehkan masuk ke dalam tubuh dan nilai ekonomisnya jika akan

diaplikasikan dalam industri. Nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam (0.084 %

w/w) terhadap Salmonella Typhimurium dalam penelitian ini lebih kecil

daripada nilai MIC ekstrak teh (94,1 mg/ml) terhadap Salmonella

Typhimurium (Tiwari et. al., 2005). Berdasarkan data tersebut, dapat

diperkirakan secara kasar bahwa ekstrak etanol jintan hitam lebih baik

daripada ekstrak teh dalam menghambat pertumbuhan Salmonella

Typhimurium.

Perbedaan jenis ekstrak serta jenis rempah akan memberikan nilai MIC

yang berbeda. Nilai MIC ekstrak isopropanol Zingiber officinale Rose,

62

Boesenbergia pandurata Holtt, dan Curcuma longa Linn. terhadap Salmonella

Typhimurium berturut-turut adalah 7-8%(v/v), 4-5% (v/v), dan 5-6% (v/v)

(Thongson, et. al., 2004). Nilai MIC ekstrak isopropanol-heksan Zingiber

officinale Rose (jahe), Boesenbergia pandurata Holtt (fingerroot), dan

Curcuma longa Linn. (kunyit) terhadap Salmonella Typhimurium berturut-

turut adalah 8-9 %(v/v), 8 %(v/v), dan 5-8 %(v/v) (Thongson, et. al., 2004).

Selain dipengaruhi jenis ekstrak dan jenis rempah, nilai MIC

dipengaruhi juga oleh jenis mikroba. Nilai MIC dari minyak atsiri tanaman

Lavandin ‘Grosso’ terhadap Salmonella Typhimurium adalah 1 µl/ml

sedangkan terhadap Staphylococcus aureus adalah 2 µl/ml (Rota et. al., 2004).

Nilai MIC minyak atsiri tanaman Rosmarinus officinalis terhadap Salmonella

Typhimurium adalah 1.5 µl/ml sedangkan terhadap Staphylococcus aureus

adalah 3-5 µl/ml (Rota et. al., 2004). Namun, tetap tidak menutup

kemungkinan bahwa ekstrak yang sama memiliki nilai MIC yang sama

terhadap bakteri yang berbeda. Hal ini diperoleh Rota et. al. (2004) yang

menunjukkan nilai MIC minyak atsiri tanaman Thymus vulgaris (L) terhadap

Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus adalah 2 µl/ml.

Nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam (0.084 % w/w) lebih kecil

daripada nilai MIC minyak atsiri tanaman Lavandin ‘Grosso’ terhadap

Salmonella Typhimurium (1 µl/ml) (Rota et. al., 2004). Nilai MIC terhadap

Staphylococcus aureus dari ekstrak etil asetat jintan hitam (1.88 % w/w) lebih

kecil daripada nilai MIC ekstrak metanol kulit kayu Alstonia macrophylla

(>2000 µg/ml) (Chattopadhyay, et. al., 2001). Nilai MIC terhadap

Pseudomonas aeruginosa dari ekstrak metanol jintan hitam (1.88 % w/w)

lebih kecil daripada nilai MIC minyak atsiri Oreganum scabrum (1.27 mg/ml)

(Aligiannis, et. al., 2001). Nilai MIC ekstrak-ekstrak dari biji jintan hitam,

tergolong lebih kecil jika dibandingkan dengan ekstrak rempah-rempah

lainnya sehingga ekstrak jintan hitam memiliki peluang yang baik untuk

diteliti lebih lanjut aktivitas antimikrobanya dan diaplikasikan dalam bahan

pangan baik sebagai pengawet maupun sebagai pangan fungsional.

63

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Biji jintan hitam mengandung senyawa antimikroba yang bersifat volatil

dan non-volatil dengan berbagai kepolaran. Senyawa antimikroba biji jintan

hitam memiliki kelarutan tinggi pada pelarut semi polar, yaitu etanol dan etil

asetat, sedikit larut dalam pelarut polar dan pelarut non-polar. Keefektifan

masing-masing senyawa antimikroba tergantung pada jenis bakteri yang

dihambat.

Ekstrak biji jintan hitam menunjukkan aktivitas antimikroba dengan

spektrum yang luas terutama pada ekstrak etanol, minyak atsiri dan ekstrak

etil asetat karena dapat menghambat semua bakteri uji. Diameter

penghambatan terbesar ekstrak etanol dan minyak adalah dalam menghambat

pertumbuhan Staphylococcus aureus, sedangkan diameter penghambatan

terbesar ekstrak etil asetat adalah dalam menghambat pertumbuhan

Pseudomonas aeruginosa. Ekstrak air dan ekstrak heksan kurang efektif

dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Ekstrak air dan ekstrak heksan

tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan

Salmonella Typhimurium. Ekstrak metanol tidak dapat menghambat

pertumbuhan Escherichia coli.

Nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ekstrak etanol terhadap

Salmonella Typhimurium adalah 0.084 % (w/w). Nilai Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) minyak atsiri terhadap Bacillus cereus adalah 1.72%

(w/w). Nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ekstrak etil asetat

terhadap Staphylococcus aureus adalah 1.88 % (w/w). Nilai Minimum

Inhibitory Concentration (MIC) ekstrak metanol terhadap Pseudomonas

aeruginosa adalah 1.88 % (w/w). Pada minyak atsiri terdeteksi adanya

komponen fenol dan terpenoid. Uji fitokimia pada ekstrak etanol

menunjukkan adanya komponen fenol dan steroid. Pada ekstrak etil asetat

terdeteksi adanya fenol dan flavonoid.

64

B. SARAN

Penelitian yang telah dilakukan hingga saat ini masih banyak

kekurangan dan perlu diteliti lebih lanjut antara lain :

• Untuk mengetahui komponen penyusun dari masing-masing ekstrak yang

menunjukkan aktivitas antimikroba yang baik, perlu dilakukan identifikasi

fitokimia dengan metode High Performance Layer Chromatoraphy

(HPLC).

• Optimalisasi proses ekstraksi untuk memperoleh rendemen minyak atsiri

dan ekstrak jintan hitam yang tinggi, yaitu dengan mencoba metode

ekstraksi yang lain atau melakukan beberapa perubahan pada parameter

ekstraksi, seperti suhu dan jenis pelarut.

• Penentuan nilai MIC dengan metode pengenceran untuk memperoleh nilai

MIC yang lebih tepat.

• Aplikasi ekstrak biji jintan hitam pada model sistem pangan.

65

DAFTAR PUSTAKA

Achyad, D. E. dan R. Rasyidah. 2000. Jintan Hitam (Nigella sativa L.). www.asiamaya.com. [20 Januari 2006].

Adawiyah, D. R. 1998. Kajian pengembangan metode ekstraksi komponen

antimikroba biji buah atung (Parinarium glaberium Hassk.). Tesis. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Ahmad, I. dan A. Z. Beg. 2001. Antimicrobial and phytochemical studies on 45

Indian medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. Journal of Ethnopharmacology. 74:113-123.

Ahmad, I., Z. Mehmood, dan F. Mohammad. 1998. Screening of some Indian

medicinal plants for their antimicrobial properties. Journal of Ethnopharmacology. 62:183-193.

Al-hebshi, N., M. Al-haroni, dan N. Skaug. 2005. In vitro antimicrobial and

resistance-modifying activities of aqueous crude khat extracts against oral microorganisms. Archives of Oral Biology. www.bora.uib.no/bitstream. [12 Agustus 2006].

Aligiannis, N., E. Kalpoutzakis, S. Mitaku, dan I. B. Chinou. 2001. Composition

and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum spesies. Journal of Agricultural Food Chemistry. 49:4168-4170.

Al-Jabre, S., O. M. Al-Akloby, A. R. Al-Qurashi, N. Akhtar, A. Al-Dossary, dan

M. A. Randhawa. 2003. Thymoquinone, an active principle of Nigella sativa, inhibited Aspergillus niger. Pakistan Journal Medical Research, 42 (3). www.pmrc.org.pk. [15 Agustus 2006].

Al-Saleh, I. A., G. Billedo, dan I. I. El-Doush. 2006. Levels of selenium, DL-α-

tocopherol, DL-γ-tocopherol, all-trans-retinol, thymoquinone and thymol in different brands of Nigella sativa seeds. Journal of Food Composition and Analysis. 19:167-175.

Anonim. 2006a. Nigella sativa. www.en.wikipedia.com. [13 Maret 2006]. Anonim. 2006b. Chemical analysis of Black seed Oil. www.blackseed.com. [20

Maret 2006]. Anonim. 2006c. Essential Oil. www.wikipedia.com. [9 November 2006]. Apriantono, A., D. Fardiaz, N. L. Puspitasari, S. Yasni dan S. Budiyanto. 1989.

Petunjuk Laboratorium Analisis Pangan. Bogor, IPB Press.

66

Ardiansyah. 2001. Teknik ekstraksi komponen antimikroba andaliman (Zanthoxylum acanthopodicum) dan antarasa (Litsea cubeba). Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Babayan, V. K., D. Koottungal dan G. A. Halaby. 1978. Proximate analysis, fatty

acid and amino acid composition of Nigella sativa L. seeds. Journal of Food Science. 43:1314-1315.

Badan Pengawas Obat dan Makanan RI (Badan POM RI). 2005. Foodwatch

Sistem Keamanan Pangan Terpadu. Sekretariat Jenderal Jejaring Intelijen Pangan, Jakarta.

Baird-Parker, T. C. 2000. Staphylococcus aureus. Di dalam : Lund, B. M., Baird-

Parker, T. C., dan G. W. Gould (eds.). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume II. Aspen Publisher Inc., Maryland.

Belitz, H. D. dan W. Grosch. 1999. Food Chemistry. Springer-Verlag, Berlin. Bloomfield, S. F. 1991. Methods for assesing antimicrobial activity. Di dalam

Denyer S. P. dan W. B. Hugo. (eds.). Mechanism of Action of Chemical Biocides their Study and Exploitation. Blackwell Scientific Publication, London.

Branen A. L. dan P. J. Davidson. 1993. Antimicrobials in Foods. Marcel Dekker,

New York. Cahattopadhyay, D., K. Maiti, A. P. Kundu, M. S. Chakraborty, R. Bhadra, S. C.

Mandal, dan A. B. Mandal. 2001. Antimicrobial activity of Alstonia macrophylla : a folklore of bay islands. Journal of Ethnopharmacology. 77:49-55.

Coconut Coast Handmade Soap Co. 2006. Steam Distillation.

www.ccnphawaii.com.htm. [20 September 2006]. D’Aoust J. Y. 2000. Samonella. Di dalam : Lund, B. M., Baird-Parker, T. C., dan

G. W. Gould (eds.). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume II. Aspen Publisher Inc., Maryland.

Donmez, A. A. dan B. Mutlu. 2004. A new species of Nigella (Ranunculaceae)

from Turkey. Botanical Journal of the Linnean Society. 146 : 251-255. Dorman H. J. D. dan S. G. Deans. 2000. Antimicrobial agents from plants :

antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology. 88 : 308-316.

Faizi S, R. A. Khan, S. Azher, S. A. Khan, S. Tauseef, dan A. Ahmad. 2003. New

antimicrobial alkaloids from the roots of Polyalthia longifolia var. pendula. Planta Medical. 69:350—5.

67

Fardiaz, S., Suliantari, dan R. Dewanti. 1987. Bahan Pengajaran Senyawa Antimikroba. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, IPB, Bogor.

Fardiaz, S. 1989. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar

Universitas Pangan dan Gizi, IPB, Bogor. -------------. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia, Jakarta. Garigga, M., M. Hugas, T. Aymerich dan J. M. Monfort. 1993. Bacteriocinogenic

Activity of Lactobacilli from Fermentation Sausages. Journal of Applied Microbiology. 7:142-148.

Granum, P. E. dan T. C. Baird-Parker. 2000. Bacillus species. Di dalam : Lund, B.

M., Baird-Parker, T. C., dan G. W. Gould (eds.). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume II. Aspen Publisher Inc., Maryland.

Harbone, J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Terjemahan. K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit ITB, Bandung.

Hart, H. 1983. Kimia Organik : Suatu kuliah singkat. Terjemahan. S. Achmadi.

Penerbit Erlangga, Jakarta. Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid II. Yayasan Sarana Wana

Jaya, Jakarta. Hinton, A. dan K. D. Ingram. 2000. Use of oleic acid to reduce the population of

the bacterial flora of poultry skin. Journal Food Protection. 9:1282-1286. Hirasa, K. dan M. Takemasa. 1998. Spice Science and Technology. Marcell

Dekker, Inc., New York. Houghton P. J. dan A. Raman. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation

of Natural Extracts. Chapman and Hall, London. Hu J. P. , N. Takahashi, dan T. Yamada. 2000. Coptidis rhizoma inhibits growth

and proteases of oral bacteria. Oral Dis. 6:297—302. Hutapea, J. R. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (III). Badan Penelitian

dan Pengembangan Kesehatan, Depkes RI. Javidnia, K., R. Miri, R. B. Najafi, dan N. K. Jahromi. 2003. A preliminary study

on the biological activity of Daphne mucronata Royle. DARU, 11 (1). www.diglib.tums.ac.ir. [28 Juli 2006].

Ji, Y. L. , S. K. Yong dan H. S. Dong. 2002. Antimicrobial synergistic effect of

linolenic acid and monoglyceride against Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Journal Agricultural and Food Chemistry. 50 (7).

68

Ketaren, S. 1987. Minyak Atsiri Jilid 1. UI Press, Jakarta. Koster, S. K. 2001. Distillation. www.ulwax.edu.htm. [20 September 2006]. Lambert, R. J. W., P. N. Skandamis, P. J. Coote, dan G. J. E. Nychas. 2001. A

study of the minimum inhibitory concentration of action oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology. 91:453-462.

Leelapornpisid, P., S. Chansakao, T. Ittiwittayawat, S. Pruksakorn. 2006.

Antimicrobial activity of herbal extracts on Staphylococus aureus and Propionibacterium acnes. www. actahort.com.

Lund, B. M., T. C. Baird-Parker, dan G. W. Gould. 2000. The Microbiological

Safety and Quality of Food. Volume II. Aspen Publisher Inc., Maryland. Mattjik, A. A. dan M. Sumertajaya. 2000. Perancangan Percobaan dengan

Aplikasi SAS dan Minitab. IPB Press, Bogor. Mashhadian, N. V. dan H. Rakhshandeh. 2005. Antibacterial and antifungal

effects of Nigella sativa extracts against S. aureus, P.aeroginosa, and C. albicans. Pakistan Journal Medical Science. 21 (1):47-52. www.pjms.com. [28 Juli 2006].

Meral, G. dan N. U. Karabay. 2002. In vitro antibacterial activities of three

hypericum species from west anatolia. Turkish Electronic Journal of Biotechnology. http://www.biyotekder.hacettepe.edu.tr/dergi.html. [28 Juli 2006].

Moyler, D. A. 1994. Spices Recent Advances. Di dalam Charalambous (Ed.).

Spices, Herbs and Edible Fungi. Elsevier, Amsterdam. Naidu, A. S. 2000. Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, New York. Nair, R. dan S. Chanda. 2006. Activity of some medicinal plants against certain

pathogenic bacterial strains. Indian Journal of Pharmacology. www.findarticles.com. [28 Juli 2006].

Nikaido, H. dan M. Vaara. 1985. Molecular basis of bacterial outer membran

permeability. Microbiology Review. 49:1-32.

Prescott, L. M., J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2003. Microbiology. Mc Graw-Hill,

Singapore.

Pelczar, M. J. and R. D. Reid. 1979. Microbiology. Mc. Graw Hill Book Co., New

York.

Roller, S. 2003. Natural Antimicrobials for Minimal Processing of Foods. CRC Press, New York.

69

Rota, C., J.J. Carraminana, J. Burillo, A. Herrera. 2004. In vitro antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants against selected foodborne pathogens. Journal of Food protection. 67:1252-1256.

Scalbert, A. 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry Review.

30 (12): 3875-3883. Singh, G., P. Marimuthu, H. S. Murali, dan A. S. Bawa. 2005. Antioxidative and

antibacterial potentials of essential oils and extracts isolated from various spice materials. Journal of Food Safety. 25:130-145.

Still, D. W. 2002. Bioengineering and Breeding Approaches. Dalam :

Phytochemicals in Nutrition and Health. Meskin, M. S, W. R Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omeya (Eds.). CRC Press, USA, pp. 122-127.

Syamani, F. A. 2001. Kajian ekstraksi oleoresin jinten hitam (Nigella sativa L.).

Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Thongson, C., P. M. Davidson, W. Mahakarnchanakul dan J. Weiss. 2004.

Antimicrobial activity of ultrasound-assisted solvent-extracted spices. Letters in Applied Microbiology. 39:401-406.

Tiwari, R. P., S. K. Bharti, H. D. Kaur, R. P. Dikshit & G. S. Hoondal. 2005.

Synergistic antimicrobial activity of tea & antibiotics. Indian Journal Medical Research. 122:80-84.

WHO. 2005. Food safety and foodborne illness. www.who.int.com. [27 Maret

2006]. Willshaw, G. A., T. Cheasty, dan H. R. Smith. 2000. Escherichia coli. Di dalam :

Lund, B. M., Baird-Parker, T. C., dan G. W. Gould (eds.). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume II. Aspen Publisher Inc., Maryland.

WordNet. 2006. Extraction. www.answers.com/extraction. [20 November 2006]. .

Lampiran 1. Skema tahapan penelitian

Digiling

Didistilasi uap Ulangan Direfluks dengan pelarut air Ulangan Direfluks dengan pelarut etanol (100 ºC, 2 jam) (100 ºC, 3 jam) (80 ºC, 2 jam) (80 ºC, 3 jam) Disaring Disaring Direfluks dengan pelarut organik (heksana, etil asetat, metanol) (60 ºC, 3 jam dan 2 jam) dikeringkan dikeringkan (oven vakum) (oven vakum) Dihembus gas N2 Ditimbang

Jintan hitam

Bubuk jintan hitam

Minyak atsiri (Komponen volatil)

Ampas (Komponen non-volatil)

Ekstrak Ampas Ampas Ekstrak • Dianalisa aktivitas

antimikroba • Dianalisa kualitatif

komponen alkaloid, flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin

Ekstrak heksan, ekstrak metanol, ekstrak etil asetat

Ekstrak pekat Ekstrak pekat

• Dianalisa aktivitas antimikroba • Dianalisa kualitatif komponen alkaloid,

flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin • Dianalisa aktivitas antimikroba • Dianalisa kualitatif komponen alkaloid,

flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin

71

Lampiran 2. Diagram alir persiapan kultur bakteri dan uji konfirmasi jumlah mikroba

Diambil satu ose

Dimasukkan ke dalam 10 ml NB steril

Diinkubasi 24 jam, suhu 37 ºC

Diambil 1 ml

Dimasukkan ke dalam 9 ml NB steril

Diinkubasi 24 jam, suhu 37 ºC

Diamati kekeruhannya

Keruh Agak bening

Dipipetl 1 ml Dipipet 1 ml

Dimasukkan ke dalam Dimasukkan ke dalam 9 ml pengencer steril 9 ml pengencer steril

Dilakukan pengenceran dari 101-108 Dilakukan pengenceran dari 100-105

Dipipet masing-masing 1ml Dipipet masing-masing 1 ml dari pengenceran 105-108 dari pengenceran 100-105 Masing-masing dimasukkan Masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril ke dalam cawan petri steril

Dituang agar

Didiamkan hingga agar membeku

Diinkubasi 48 jam, 37 ºC

Diamati dan dihitung jumlah koloni

Ditentukan jumlah µl NB yang akan dimasukkan

ke dalam 25 ml NA cair ( A )

Kultur bakteri

72

Lampiran 3. Diagram alir uji difusi sumur

Dipipet sejumlah A

(sesuai hasil pada persiapan kultur)

Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril

Dituang ke dalam cawan petri steril

Dibiarkan beku

Dibuat 4 lubang/sumur

Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl DMSO lar antibiotik sampel sampel

Diinkubasi 37 ºC, 24 jam

Diamati dan diukur area penghambatan tiap sumur

Ditentukan ekstrak yang akan diuji nilai MIC

Kultur mikroba yang telah disegarkan

Lubang A Lubang B Lubang D Lubang C

73

Lampiran 4. Contoh perhitungan penentuan jumlah mikroba

Jumlah mikroba umur 24 jam = 108 sel/ml NB.

Jumlah sel yang diinginkan dalam agar (NA) = 105 sel/ml agar

Jumlah agar dalam 1 cawan = 25 ml

Jumlah NB (yang mengandung 108 sel) yang dimasukkan = 105 sel / ml NA x 25 ml NA 108 sel / ml NB

= 25 x 10-3 ml NB

= 25 µl NB

74

Lampiran 5. Hasil uji konfirmasi metode hitungan cawan

Jenis bakteri Jumlah sel bakteri yang

digunakan saat pengujian

Bacillus cereus 2.1 x 108

Escherichia coli 3.9 x 108

Salmonella Typhimurium 6.2 x 108

Pseudomonas aeroginosa 4.1 x 108

Staphylococcus aureus 4.2 x 108

75

Lampiran 6. Hasil analisis minyak atsiri jintan hitam tanpa penghalusan bahan

77

Lampiran 8. Contoh perhitungan rendemen • Rendemen ekstrak etanol

Bobot jintan hitam halus = 34.58 gr Bobot ekstrak etanol pekat = 2.9005 gr Rendemen ekstrak etanol = Bobot ekstrak etanol pekat x 100

Bobot jintan hitam halus = (2.9005/34.58) x 100 = 8.39 %

• Rendemen ekstrak etil asetat

Bobot ampas ekstrak heksan = 18.60 gr Bobot ekstrak etil asetat pekat = 0.9454 gr Rendemen ekstrak etil asetat = Bobot ekstrak etil asetat pekat x 100

Bobot ampas ekstrak heksan = (0.9454/18.60) x 100 = 5.08 %

• Rendemen ekstrak metanol

Bobot ampas ekstrak etil asetat = 21.92 gr Bobot ekstrak metanol pekat = 1.8855 gr Rendemen ekstrak metanol = Bobot ekstrak metanol pekat x 100

Bobot ampas ekstrak etil asetat = (1.8855/21.92) x 100 = 8.60 %

78

Lampiran 9. Hasil penghitungan standar eror (SE)

Mikroba Simbol Bacillus cereus 1 Escherichia coli 2 Salmonella Typhimurium 3 Pseudomonas aeroginosa 4 Staphylococcus aureus 5

Ekstrak air 14:10 Tuesday, December 10, 1996 1 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 2 1.6500000 0.1500000 MIKROBA2 2 0 0 MIKROBA3 2 0 0 MIKROBA4 2 2.9250000 0.0250000 MIKROBA5 2 3.3700000 0.1900000 --------------------------------------- Ekstrak etanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 2 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 2 5.3150000 0.1350000 MIKROBA2 2 1.6700000 0.0200000 --------------------------------------- Ekstrak etanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 3 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA3 3 5.2000000 0.1903506 MIKROBA4 3 7.0533333 0.2167436 MIKROBA5 3 9.3366667 0.3075350 --------------------------------------- minyak_atsiri 14:10 Tuesday, December 10, 1996 4 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 3 6.0666667 0.1748650 MIKROBA2 3 3.2500000 0.2250185 MIKROBA3 3 4.2300000 0.4063250 MIKROBA4 3 2.2866667 0.2265931 MIKROBA5 3 7.3600000 0.3340659 --------------------------------------- Ekstrak heksan 14:10 Tuesday, December 10, 1996 5 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 3 2.0800000 0.4600000 MIKROBA2 3 0 0 MIKROBA3 3 0 0 MIKROBA4 3 3.7166667 0.8264449 MIKROBA5 3 4.0233333 0.3608478 --------------------------------------- Ekstrak etil_asetat 14:10 Tuesday, December 10, 1996 6 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 3 3.0366667 0.7033570 MIKROBA2 3 2.1466667 0.1894143 MIKROBA3 3 4.1900000 0.3652853 MIKROBA4 3 5.0700000 0.4772141 MIKROBA5 3 3.1700000 0.2151743 --------------------------------------- Ekstrak metanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 7 Variable N Mean Std Error --------------------------------------- MIKROBA1 3 4.1766667 0.7096556 MIKROBA2 3 0 0 MIKROBA3 3 3.0800000 0.2454248 MIKROBA4 3 5.5633333 0.4318307 MIKROBA5 3 4.3333333 0.4935698 ---------------------------------------

79

Lampiran 10. Hasil analisis ragam Rancangan Faktorial Acak Lengkap 1 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Class Level Information Class Levels Values EKSTRAK 6 1 2 3 4 5 6 MIKROBA 5 1 2 3 4 5 Number of observations in data set = 83 Rancangan Faktorial Acak Lengkap 2 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Dependent Variable: DIAMETER Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 29 437.87556667 15.09915747 37.36 0.0001 Error 53 21.41883333 0.40412893 Corrected Total 82 459.29440000 R-Square C.V. Root MSE DIAMETER Mean 0.953366 17.70784 0.63571136 3.59000000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F EKSTRAK 5 175.75671308 35.15134262 86.98 0.0001 MIKROBA 4 156.46550143 39.11637536 96.79 0.0001 EKSTRAK*MIKROBA 20 105.65335216 5.28266761 13.07 0.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F EKSTRAK 5 152.72013515 30.54402703 75.58 0.0001 MIKROBA 4 158.82907781 39.70726945 98.25 0.0001 EKSTRAK*MIKROBA 20 105.65335216 5.28266761 13.07 0.0001

80

Lampiran 11. Hasil uji lanjut Duncan

Ekstrak Simbol Ekstrak air 1 Ekstrak etanol 2 Minyak atsiri 3 Ekstrak heksan 4 Ekstrak etil asetat 5 Ekstrak metanol 6

Mikroba Simbol Bacillus cereus 1 Escherichia coli 2 Salmonella Typhimurium 3 Pseudomonas aeroginosa 4 Staphylococcus aureus 5

Rancangan Faktorial Acak Lengkap 3 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: DIAMETER NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.404129 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 13.52601 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range .4903 .5157 .5325 .5446 .5539 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N EKSTRAK A 6.0569 13 2 B 4.6387 15 3 C 3.5227 15 5 C 3.4307 15 6 D 1.9640 15 4 D 1.5890 10 1 Rancangan Faktorial Acak Lengkap 4 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: DIAMETER NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.404129 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 16.58537 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .4428 .4657 .4808 .4918 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MIKROBA A 5.3771 17 5 B 4.5247 17 4 C 3.7506 16 1 D 2.9471 17 3 E 1.2206 16 2

82

Lampiran 13. Penentuan nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam terhadap bakteri Salmonella Typhimurium

Konsentrasi (% w/w)

Diameter penghambatan (mm)

Rata-rata diameter

penghambatan (mm)

Ln konsentrasi

Kuadrat zona penghambatan

(mm2) Ulangan 1 Ulangan 2

10 5.87 5.8 6.48 7.23 6.35 2.30 40.3225 20 8.97 8.82 8.87 8.98 8.91 3.00 79.3881 30 8.8 8.62 8.67 8.5 8.65 3.40 74.8225 40 8.55 8.58 7.43 7.6 8.04 3.69 64.6416 50 8.55 8.13 9.07 7.73 8.37 3.91 70.0569

Keterangan : Nilai yang ditampilkan merupakan hasil pembulatan. Y = a + bX ; Y = Kuadrat zona penghambatan (mm2) dan X = Ln konsentrasi

y = 15.118x + 16.537

0102030405060708090

0 1 2 3 4 5

ln konsentrasi

kuad

rat z

ona

ham

bat (

mm

)

Kurva (i) Penentuan nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam terhadap bakteri Salmonella

Typhimurium Y = 15.118X + 16.537 Jika Y=0; X= -1.09386 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 0.3349 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*0.3349 MIC = 0.0837 = 0.084 % (w/w)

83

Lampiran 14. Penentuan nilai MIC minyak atsiri jintan hitam terhadap bakteri Bacillus cereus

Konsentrasi (% w/w)


Rata-rata diameter

penghambatan(mm)

Ln konsentrasi



10 4.83 5.3 4.13 4.43 4.68 2.30 21.8556 20 8.8 9.77 7.9 8.2 8.67 3.00 75.1111 30 8.33 8.52 9.17 8.77 8.69 3.40 75.6175 40 11.15 11.93 10.32 10.22 10.90 3.69 118.9009 50 12.37 11.63 10.03 10.2 11.06 3.91 122.2867


y = 62.27x - 120.25R2 = 0.9367

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5

ln konsentrasi

kuad

rat z

ona

ham

bat (

mm

)

Kurva (ii) Penentuan nilai MIC minyak atsiri jintan hitam terhadap bakteri Bacillus cereus Y = 62.27X – 120.25 Jika Y=0; X= 1.931106 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 6.897138 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*6.897138 MIC = 1.724284 = 1.72% (w/w)

84

Lampiran 15. Penentuan nilai MIC ekstrak etil asetat jintan hitam terhadap bakteri Staphylococcus aureus

Konsentrasi (% w/w)


Rata-rata diameter

penghambatan (mm)

Ln konsentrasi



10 3.67 3.72 4.33 3.40 3.78 2.30 14.2884 20 4.82 4.57 5.67 4.5 4.89 3.00 23.9121 30 4.63 5.15 4.45 5.63 4.96 3.40 24.6016 40 7.3 6.82 6.27 6.9 6.82 3.69 46.5124 50 9.23 7.3 7.7 7.73 7.99 3.91 63.8401


y = 27.903x - 56.322

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5

l n konsent r asi

Kurva (iii). Penentuan nilai MIC ekstrak etil asetat jintan hitam terhadap bakteri

Staphylococcus aureus Y = 27.903X – 56.322 Jika Y=0; X= 2.0185 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 7.5269 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*7.5269 MIC = 1.8817= 1.88 % (w/w)

85

Lampiran 16. Penentuan nilai MIC ekstrak metanol jintan hitam terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa

Konsentrasi (% w/w)


Rata-rata diameter

penghambatan(mm)

Ln konsentrasi



10 3.23 - 4.12 - 3.68 2.30 13.5056 20 6.4 6.52 6.37 6.27 6.32 3.00 39.9424 28 8.83 7.55 7.37 - 7.78 3.33 60.5284


y = 44.719x - 90.375

R2 = 0.9891

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

l n k onse nt r a si

Kurva (iv). Penentuan nilai MIC ekstrak methanol jintan hitam terhadap bakteri Pseudomonas

aeruginosa Y = 44.719X - 90.375 Jika Y=0; X= 2.0209 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 7.5455 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*7.5455 MIC = 1.8864 = 1.88 % (w/w)

76

Lampiran 7.Hasil analisis minyak atsiri jintan hitam dengan penghalusan bahan

skripsi kajian aktivitas antimikroba ekstrak...

Documents