SISTEM PENGHANTARAN TERAPI GEN

Sistem penghantaran terapi gen menurut Lundstrom et all terbagi menjadi 2

kelompok, yakni melalui vektor viral dan non viral. Adapun yang termasuk ke dalam vektor

viral seperti menggunakan retrovirus, adenovirus, virus terkait adeno/ Adeno Associated

Viruse (AVV). Sedangkan vektor non viral dibedakan menjadi tiga kategori yakni, partikel

inorganik, bahan sintetik/partikel biodegradable, dan metode fisika. (Gascon, 2013). Ponder

dalam buku An Introduction To Molecular Medicine and Gen Therapy menyebutkan

pertimbangan utama dalam menentukan vektor dan sistem penghantaran yang optimal adalah:

1. Sel target serta kemampuannya untukdi transduksi secara viral

2. Waktu yang diperlukan gen untuk berekspresi

3. Ukuran materi Genetik yang akan ditransfer

Desain Unit Perekaman untuk Terapi Gen Sel Somatik

DNA rekombinan pelengkap (complementary DNA-cDNA) atau gen yang mengkode

protein terapeutik, seperti semua gen prokarot atau eukariot, harus mengandung seluruh

elemen yang diperlukan untuk mengarahkan rekaman gen, meliputi tempat mulai, dan

pembimbing serta penguat yang menentukan tingkat dan pengaturan sel spesifik

produksimRNA yang mengkode produk gen terapeutik. Kontrol rekaman gen yang

dimasukkan diarahkan pada rangkaian nukleotida elemen yang memerankan cis) yang

dikenali oleh protein nukleus yang terdapat pada sel sasaran.

Faktor yang memerankan trans ini mengarahkan rekaman produksi RNA dari DNA)

pada gen yang disisipkan. Elemen-elemen perekaman, yang meliputi penguat, pembimbing,

penenang, tempat awal perekaman, tempat sambungan-donor RNA, isyarat penghentian dan

poliadenilasi yang dapat digabungkan untuk mencapai tingkat mRNA yang dikehendaki,

serta spesifitas sel dan jaringan atau tanda-tanda pengaturan gen lain yang diperlukan untuk

mencapai perbaikan fisiologis yang dibawa oleh protein rekombinan.

Sistem Vektor

Vektor ideal akan mampu mengarahkan pemberian secara in vivo lewat berbagai rute,

menyediakan untuk penghantaran yang ditargetkan pada sel yang diinginkan,dengan aman

terintegrasi ke dalam genom sel somatik, dan dipindahkan ke semua sel anakan. Tempat

integrasi gen akan bersifat spesifik meliputi pemotongan gen yang tidak sempurna dan

penggantiannya dengan gen normal. Akhirnya vektor harus diintegrasikan ke tempat

nononkogenik pada genom dan memerlukan pemberian tunggal. Sementara kemajuan yang

berarti telah dibuat dalam menyelesaikan beberapa hambatan teknis, vektor yang tersedia

tidak dapoat memenuhi salah satu dari kriteria-kriteria ini. Virus, sasaran ligan, dan vektor

berselimut DNA dapat digunakan untuk menghantar gen. Setiap metode ini memiliki

keterbatasan dan kelebihan, tetapi tidak ada satupun yang telah dimanfaatkan untuk

penggunaan terapeutik.

Sistem Vektor Pada Virus

Teknik virus menggunakan berbagai kelas virus sebagai alat untuk

pengiriman gen . Virus memperkenalkan DNA mereka ke dalam sel dengan efi siensi tinggi.

Oleh karena itu untuk mengambil keuntungan ini dengan memperkenalkan gen asing ke

dalam virus dan kemudian menggunakan sifat virus untuk memberikan gen ini dengan

efisiensi tinggi ke sel target. Terapi gen vektor sedang dikembangkan oleh genetik modifi

kasi retrovirus, adenovirus, parvoviruses (adeno terkait

virus ), dan lain-lain. Vektor ini digunakan untuk mentransfer terapi gen ke dalam sel target

dan dengan demikian direkayasa dengan menghapus gen penting yang memungkinkan

replikasi , perakitan , atau infeksi. Gen ini dapat diganti dengan gen terapeutik untuk

membuat genom vektor terapi gen . Replikasi defi siensi menjamin keamanan vektor virus ,

namun di sisi lain , vektor perlu diproduksi di sejumlah besar partikel virus . Untuk tujuan

ini , ada baris sel khusus yang disebut " garis sel kemasan " ( kbs) direkayasa untuk

menggantikan fungsi dari gen virus dihapus dan untuk produksi virus rekombinan

Retrovirus, adenovirus dan vektor terkait-adeno (VTA) (adeno-associated

vector(AAV)) kini digunakan sebagai protokol terapi gen manusia. Vektor virus untuk terapi

gen harus bersifat tidak toksik, monogenik dan replikasi tidak sempurna. Penggunaan vektor

virus pada terapi gen manusia memerlukan banyak modifikasi pada genom virus sebelum

digunakan.

Vektor untuk Terapi Gen

1. DNA plasmid (liposom,kompleks DNA-ligan, telanjang)

3. Retrovirus (Virus RNA)

4. Adenovirus (Virus DNA)

5. Virus terkait Adeno (VTA/AVV)

Misalnya, retrovirus adalah onkovirus, ekspresi genomnya yang belum dimodifikasi

memungkinkan organisme yang terinfeksi paru-paru yang parah, menstimulasi sistem imun

hospes dan harus diberikan berulang untuk perbaikan gangguan genetik karena mereka tidak

dapat terintegrasi. Meskipun VTA tidak bersifat patogen pada manusia,kapasitasnya yang

kecil untuk penyisipan DNA dan persyaratan adanya adenovirus untuk menjadi pelengkap

produksinya, penggunaannya terbatas. Karena perlu membuat vektor non-patogen, banyak

bagian genom virus dibuang, sehingga melumpuhkan kapasitas replikasi virus in vivo.

Deretan sel yang memungkinkan kapasitas replikasi dan penyelimutan virus rekombinan

yang tidak sempurna secara invitro diperlukan untuk vektor-vektor ini.

Vektor-Vektor Retrovirus

Retrovirus menggambarkan desain sistem pengemasan sel yang menghasilkan virus

noninfeksius yang mampu memindahkan gen. Struktur genom dan siklus hidup retrovirus

bisa digambarkan sebagai berikut :

Virus leukimia tikus Moloney dan virus leukimia kera telah digunakan paling luas

guna menghasilkan vektor pemindah gen.Retrovirus mengenali reseptor pada permukaan sel

dan diinternalisasi lewat endositosis lewat perantara reseptor. Genom RNA retrovirus

berhasil melewati proses pencernaan di dalam endosom sel yang ditransfeksi dan

dihantarakan ke nukleus sel yang sedang membelah, dimana transkriptase-balik virus yang

dibentuk sebelumnya mensintesis sifat khusus DNA genom virus selama mitosis. Genom

virus mengarahkan proses sintesis sel hospes untuk menghasilkan genom RNA virus dan

protein kapsidnya. Setelah pembentukan kapsid, partikel virus yang telah matang lepas dari

membran plasma sel pengemas untuk menghasilkan partikel virus infeksius. Proses

penggabungan genom RNA virus serta penggunaan transkriptase balik yang dibentuk

sebelumnya ke dalam partikel virus yang lengkap disebut pengemasan dan memerlukan

rangkaian spesifik yang disebut dengan psi.

Genom retrovirus mengandung 5 elemen utama, yang mencakup terminal panjang

yang merupakan pembimbing yang kuat, rangkaian psi yang mengisyarati peristiwa

pengemasan dan tiga gen yang disebut GAG, POL, dan ENV. Tiga gen ini mengkode protein

peng-enkapsidasi, transkriptase balik dan protein pembungkus. Trankriptase balik yang

dibentuk sebelumnya, diangkut ke dalam sel dengan virus yang dibutuuhkan untuk produksi

genom DNA dari genom RNA virus sebelum replikasi virus dan produksi virus baru.

Replikasi dan ekspresi gen-gen virus dapat dipisahkan dari proses pengemasan dan produksi

partikel virus infektif. Kebanyakan genom retrovirus dan terutama gen yang megkode

infektifitas dan onkogenesis GAG, POL, dan ENV), dapat dibuang dan gen terapi disisipkan

ke dalam daerah gen yang hilang tersebut. Selama virus dikemas dengan tepat, gen virus

dihantarkan ke sel yang tepat dan trankriptase balik yang dibentuk sebelumnya menghasilkan

DNA virus untuk pengintegrasian ke genom hospes. Rekaman produk gen terapeutik

diarahkan oleh pembimbing gen, seperti LTR retrovirus atau rangkaian pembimbing-penguat

lainnya dapat direkayasa menjadi vektor. Untuk mencapai pelepasan hubungan antara

patogenesis danreproduksi vektor virus yang membawa gen yang diinginkan.

Genom retrovirus secara permanen dapat disisipkan ke dalam kromosom deretan sel

pengemas tetapi tidak memiliki rangkaian. Akibatnya, retrovirus tidak sempurna, tidak

memiliki GAG, POL, dan ENV tetapi mengandung pembimbing, rangkaian, dan gen

terapeutik dipindahkan ke dalam deretan sel pengemas. Retrovirus rekombinan yang tidak

sempurna memanfaatkan protein pengemas dan enkapsidasi dari genom deretan sel pengemas

untuk membuat partikel virus yang infeksius. Partikel virus yang dihasilkan tidak

mengandung gen yang diperlukan untuk patogenesis virus namun menggabungkan protein

berkapsul dan genom RNA virus rekombinan yang bereplikasi tidak sempurna. Titer virus

infeksius yang tinggi selanjutnya diperoleh dengan berkali-kali melewatkan melalui deretan

sel pengemas. Virus rekombinan yang “cacat” digunakan untuk transfeksi sel penerima yang

diinginkan,menggabungkan gen eksogen ke dalam genom sel hospes. Kejadian integrasi

tunggal ini tidak menghasilakn partikel virus tambahan dan disebut transfeksi.

Vektor Adenovirus

Adenovirus adalah virus DNA yang mampu menginfeksi ke banyak tipe sel dan

sedang diuji untuk terapi berbagai penyakit pada manusia. Siklus hidup adenovirus mulai

dengan infeksi pada sel hospes dengan cara berikatan pada reseptor permukaan sel, diikuti

oleh endositosis ke dalam endosom sel sasaran. Adenovirus melewati penghancuran di dalam

ruang endosom/lisosim dan mampu secara efisien memindahkan DNAnya ke dalam nukleus

sel hospes, yang selanjutnya mengarahkan replikasi dan reproduksi partikel adenovirus

infektif yang dilepaskan saat sel mengalami lisis.

Genom adenoviral terdiri dari DNA untai ganda yang menetap pada episom , yaitu di

dalam nukleus tetapi tidak terintegrasi ke dalam kromosom sel . Oleh karena itu , modifikasi

genetik dapat hilang selama proliferasi sel . Vektor adenoviral adalah vektor yang digunakan

untuk dalam transduksi vivo dari berbagai sel somatik manusia termasuk sel nonproliferasi .

Daerah penyisipan daerah coding gen terapi di atas 10 kb yang berpasangan dan tidak terkait

dengan risiko terdeteksi penambahan onkogenesis. Adenoviral dapat ditransfer dengan

inhalasi aerosol dan inflamasi.

Vektor Adeno Associated Viral (AAV)

AVV merupakan famili dari parvovirus. Terdiri dari untai tunggal DNA. Siklus

hidupnya memerlukan infeksi bersama dengan adenovirus. AAV/VTA adalah non patogen,

menginfeksi sel yang sedang membelah dan yang tidak, berintegrasi ke dalam genom

manusia, dan tidak mengeskpresikan genomnya sendiri setelah mentransfeksi sel sasaran.

AAV/VTA mampu mengintegrasi tempat spesifik pada kromosom 19. Seperti halnya

retrovirus dan adenovirus, produksi VTA memerlukan suatu deretan sel pengemas guna

replikasi vektor rekombinan yang mengandung gen yang diinginkan adenovirus harus

ditambahkan secara in vitro agar replikasi virus tercapai. Kebutuhan adenovirus yang berasal

dari siklus hidup VTA.

Perbedaan Tipe Virus sebagai Vektor Terapi Gen

Retrovirus : Sebuah kelas virus yang dapat membuat salinan DNA

beruntai ganda dari RNA genom. Salinan genom

dapat terintegrasi ke dalam kromosomal sel inang.

Adenovirus : Sebuah kelas virus dengan genom DNA untai ganda

yang menyebabkan infeksi pernafasan, pencernaan

dan infeksi mata pada manusia.

Adeno-Associated Virus : Sebuah kelas kecil, DNA beruntai tunggal yang dapat

menyisipkan material genetik pada lokasi tertentu di

kromosom 19.