sequencing
TRANSCRIPT
1. Irinne Dyah P2. Johannes Sinaga3. Marselina4. Muh. Fitriyadi Z5. Munasia Hardiyanti S6. Nelly Ariani7. Novi Helianti
Kelompok 4
DNA Sequencing
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA.
Sequencing merupakan metode menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.
Pengertian Sequencing
• Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.
• Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsionalAkibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organisme
Sekuen DNA membawa informasi
DNA mRNA ProteinTranscription Translation
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu.
Proses ini dinamakan cycle sequencing.
Prinsip Dasar DNA Sequencing
Proses Cycle Sequencing Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa
A. Metode Maxam-GilbertMetode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan .
Menggunakan chemical sequencing
B. Metode Sanger Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide
triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.
Teknik Sequencing
Metode Sanger dideoxy – ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel 1980
A lot of modern DNAsequencing is basedupon the followingmodified nucleotides.
DNA Sequencing
Metode Sanger memerlukan
DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template
Sejumlah nukeotida normalSejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)
Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.
DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template , proses polimerisasi akan terhenti dan berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.
Cara Kerja Metode Sanger
Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan dengan fragmen saat mereka melewati gel
Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna yang keluar dari gel.
Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser saat DNAs melewati jendela detektor.
Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang terlihat dibawah ini.
Proses Sequencing
DNA Sequencing
Metode original dengan menggunakan radiolabeled DNA.
Sejumlah kecil dideoxy nucleotides ditambahkan ke reaksi polymerase DNA.
DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi.
2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy.
Sehingga multiple terminated products dihasilkan (tanda panah merah)
Alat DNA Sequencing
Inside the sequencer
Capillary tubes
Sample tray goes here
Reagents
Sebuah Print Out Hasil Sequencing