8/16/2019 protokol lengkap

1/6

protokol:

a) isolasi dna dari jaringan hewan

1. Metode 1 (Phenol)

a. Disiapkan tabung eppendorf yang sudah terdapat jaringan hewan

didalamnya dan ditambahkan 600 µl TNES buffer Tris !0 m" p#

$% Na&l !'( m"%

b. )aringan hewan digerus menggunakan pestel

*. Ditambahkan '0 µl Tenderi+er ,0- shake 

d. Diinkubasi 600& selama ! jam

e. Ditambahkan / µl N1se dan di shake 

f. Diinkubasi suhu ruang selama ( menit

g. Ditambahkan '00 µl SDS !-

h. Diinkubasi ,20& selama ( menit

i. Disentrifugasi !!.000 rpm !0 menit /0&% diambil supernatan 600µl

 j. Ditambahkan 3&4 '00 µl

k. Disentrifugasi !!.000 rpm selama !0 menit /0&

l. Supernatan diambil

m. Ditambahkan isopropanol /00 µl% inkubasi 5'00& selama !( menit

n. Disentrifugasi !!.000 rpm selama !! menit /

0

&o. Supernatan dibuang

p. Ditambahkan 20- Et# !(0 µl% shake 

7. Disentrifugasi !!.000 rpm !0 menit /0&

r. Supernatan dibuang

s. Tambahkan TE !8 sebanyak (0 µl

2. Metode 2 (Zeolit)

a. )aringan hewan disiapkan dan ditambahkan STE /00 µl dan +eolitb. Sampel digerus menggunakan pastle

*. Diinkubasi 600& selama ,0 menit

d. Ditambahkan '00 µl SDS !-

e. Diinkubasi ,20& selama ( menit dan di shake per menit

f. Ditambahkan '0 µl tenderi+er ,0- shake 

g. Diinkubasi ,20& selama !0 menit

h. Ditambahkan / µl N1se dan di shake 

i. Diinkubasi suhu ruang selama ( menit

8/16/2019 protokol lengkap

2/6

 j. Disentrifugasi !0.000 rpm selama !0 menit

k. Supernatan dipindah ke tube baru

l. Ditambahkan &41 !9! dan di shake serta di diamkan ' menit

m. Disentrifugasi !0.000 rpm serta !0 menit

n. Supernatan dipindah ke tube baru

o. Ditambahkan !9! isopropanol

p. 4nkubasi pada suhu 5'00& selama !( menit

7. Sentrifugasi !'.000 rpm pada suhu 5/0& selama !0 menit

r. Supernatan dibuang

s. Natan ditambah etanol 20-

t. Disentrifugasi !'.000 rpm 5/0& selama !0 menit

u. Sisa larutan ditabung dibersihkan dan ditambahkan TE 0%( 8 (0 µl

3. Metode 3 (Chelex)

a.&hele8 buffer dibuat!00 µl *hele8 (-% !0 µl DDT% / µl

Tenderi+er ,0-

b. )aringan digerus menggunakan pastle

*. Diinkubasi selama ' jam dalam suhu (60&

d. Disentrifugasi !'.000 rpm selama !( menit dan supernatan di

pindah ke tube baru

e. Diinkubasi :(0& selama '0 menit kemudian di simpan dalam

free+er

B) isolasi dna dari jaringan tu!uhan

1. Metode 1 (Modi"kasi)

a. )aringan tanaman dipotong sekitar '8' *m% kemudian dimasukkan

ke dalam mortar% kemudian ditambahkan +eolite sekitar '5/

butir.

b. Digerus searah jarum jam. Ditambahkan &T1; !(00 µl bertahap

dan !( µl markaptoethanol.

*. Dipanaskan dalam waterbath dalam suhu 6(0& selama !( menit%

dan setiap , menit diin

8/16/2019 protokol lengkap

3/6

e. Ditambahkan &411 !9!

8/16/2019 protokol lengkap

4/6

h. &ampuran disentrifugasi selama ,0 menit pada ke*epatan !,.000

rpm suhu /0&. Supernatan dibuang dan DN1 pelet di dasar tabung

dikeringkan. Setelah kering pelet dilarutkan menggunakan TE

buffer sebanyak !00 µl.

C) isolasi dna dari konsorsiu !akteri

a. Sebanyak !%( µl kultur *air bakteri diambil dan dimasukkan ke

tabung Eppendorf

b. 4solat dalam tube disentrifugasi (.000 rpm selama ( menit

*. Supernatan dibuang

d. &T1; ditambahkan pada natan sebanyak (00 µl% dan +eolit yang

telah ditumbuk sebanyak ! gram% dan tube dibolak5balik pelan

e. 4nkubasi tube pada waterbath dengan suhu 6(0& selama !( menit

f. Tube diangkat dari waterbath dibiarkan di suhu ruang dan

ditambahkan N1se / µl selama ( menit dan ditambahkan

Tenderi+er sebanyak '0 µl% dan tube dibolak5balik

g. 4nkubasi pada suhu ,20& selama !( menit

h. Sentrifugasi !0.000 rpm selama !0 menit

i. Supernatan diambil% dan dipindahkan ke tube baru ,005600 µl j. &loroform 4soamyl 1l*ohol ditambahkan sebanyak !

8/16/2019 protokol lengkap

5/6

a. Sebanyak ! gram sampel tanah dimasukkan kedalam tube dan

ditambahkan ?eolit dan !%( ml SDS '0-@ &T1;

b. Di

8/16/2019 protokol lengkap

6/6