Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin/7 Oktober 2013

Biokimia Waktu : 11.00 – 12.40 WIB

PJP : Inda Setyawati, S.TP, M.Si

Asisten : Sari Yuniarini, S.Si

Lusianawati, S.Si

PROTEIN II

Kelompok 8

Anggita Septi Wulandari J3L112028

Lia Haslihati J3L112175

Karinna J3L112108

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Pendahuluan

Protein ialah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang

berhubungan satu dengan yang lainya lewat ikatan amida (peptida). Protein

memainkan berbagai peran dalam sistem biologis. Beberapa protein merupakan

komponen utama dari jaringan struktur (otot, kulit, kuku, rambut). Protein lain

mengangkut molekul dari satu bagian ke bagian lain dalam makhluk hidup. Masih

ada lagi yang bertindak sebagai katalis dalam banyak reaksi biologis yang

diperlukan untuk mempertahankan hidup (Hart 2003).

Klasifikasi protein dapat menurut srtukturnya dibedakan menjadi struktur

primer, struktur sekunder dan struktur tersier protein. Struktur primer

menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino dalam molekul protein. Oleh

karena ikatan antar asam amino ialah ikatan peptida maka struktur primer protein

juga menunjukkan ikatan peptida yang urutannya diketahui (Poedjiaji 2006).

Struktur primer protein disusun oleh asam amino yang terhubung dengan asam

amino lainnya dalam ikatan peptida yang terbentuk karena adanya reaksi

kondensasi gugus karboksil pada setiap masing masing asam amino. Struktur

primer protein dapat dilihat di gambar 1.

Gambar 1. Struktur primer protein

Pada struktur sekunder, rangkaian polipeptida memiliki konformasi yang

berbeda. Bersifat reguler dan memiliki pola lipatan berulang dari rangka protein.

Dua tipe umum struktur protein sekunder yaitu α-heliks dan β-sheet. Keduanya

terbentuk karena ikatan hidrogen yang terjadi antara asam amino yang berbeda

polipeptida. Bentuk (seperti suatu spiral) yang padanya suatu molekul protein

menata kerangkanya disebut struktur sekunder (Fessenden & Fessenden 1986).

Dapat dilihat pada gambar 2 dibawah ini.

Gambar 2. Struktur sekunder protein.

Struktur polipeptida yang terjadi dari lipatan komponen struktur sekunder

polipeptida membentuk konfigurasi tiga dimensi. Bermacam macam gaya ikatan

hidrogen antar asam amino yang terjadi pada rangkaian polipetida inilah yang

disebut struktur tersier. Struktur tersier membentuk suatu bulatan (Hawab 2007).

Gambar 3. Struktur tersier protein.

Albumin adalah protein yang dapat arut dalam air serta dapat terkoagulasi

oleh panas. Albumin terdapat dalam serum darah dan putih telur (Poedjiadi 2006).

Struktur albumin meliputi struktur yang sama dengan protein, yaitu tersusun atas

rantai polipeptida yang berasal dari polymerase asam-asam amino. Asam-asam

amino tertentu seperti triptofan, arginin, trisin, fenilalanin, glutamin, alanin,

treonin dan prolin dapat merangsang proses sintesa albumin. Albumin pada

manusia terutama banyak mengandung asam aspartat dan glutamat dan sangat

sedikit triptofan (Sulistiyati 2008).

Tujuan

Tujuan dari praktikum ini mempelajari reaksi uji protein denngan

menggunakan uji pengendapan oleh logam, pengendapan oleh garam, uji

koagulasi, pengendapan oleh alkohol, dan denaturasi protein.

Metode

Alat alat yangdigunakan pada praktikum kali ini adalah tabung reaksi, rak

tabung reaksi, pipet mohr, pipet tetes, bulp, gelas piala, kertas saring, batang

pengaduk, bunsen, dan kaki tiga. Bahan bahan yang digunakan pada praktikum

kali ini adalah Albumin 2%, HgCl2 2%, Pb-asetat 5%, AgNO3 5%, (NH4)2SO4,

pereaksi Millon, pereaksi Biuret, CH3COOH, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, Buffer

asetat pH 4.7, Etanol 95% dan aquades.

Pengendapan oleh Logam. Prosedur dalam analisis dengan pengendapan

oleh logam ditambahkan 3mL albumin ke dalam HgCl2 2%. Kemudian diulangi

percobaan dengan menggunakan Pb-asetat 5% dan AgNO3 5%. Prosedur diakhiri

dengan pengamatan endapan yang terbentuk.

Pengendapan oleh Garam. Pengujian sampel dengan pengendapan oleh

garam dengan menjenuhkan 10mL larutan protein dengan (NH4)2SO4 dengan

menambahkan sedikit demi sedikit garam tersebut, diaduk hingga mencapai titik

jenuh kemudian disaring. Lalu di uji kelarutannya dengan air. Endapan diuji

dengan pereaksi Millon dan titrat diuji dengan pereaksi Biuret.

Uji Koagulasi. Prosedur dalam analisis menggunakan uji belerang dimulai

dengan menambahkan 5mL larutan protein ditambahkan 2 tetes CH3COOH 1 M.

Lalu tabung didihkan selama 5 menit. Kemudian endapan diambil dengan batang

pengaduk. Kelarutan endapan tersebut diuji didalam air dan endapan diuji dengan

pereaksi Millon sebanyak 3 tetes.

Pengendapan oleh Alkohol. Pengujian sampel menggunakan uji

pengendapan oleh Alkohol dengan menggunakan 4 tabung reaksi dan dibuat

campuran larutan sesuai dengan tabel dibawah ini.

Tabung 1 2 3 4Larutan Albumin 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mLHCl 0.1 M 0.5 mL - - -NaOH 0.1 M - 0.5 mL - -Buffer asetat pH 4.7 - - 0.5 mL -Etanol 3 mL 3 mL 3 mL 3.5 mL

Dilihat perubahan dari campuran yanng dibuat, kelarutan dan endapannya.

Denaturasi Protein. Prosedur untuk denaturasi protein dengan membuat

campuran sesuai dengan tabel dibawah ini.

Tabung 1 2 3Larutan Albumin 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mLHCl 0.1 M 0.5 mL - -NaOH 0.1 M - 0.5 mL -Buffer asetat pH 4.7 - - 0.5 mL

Ketiga tabung tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit

dan didinginkan pada temperatur kamar. Diperhatikan apa yang terjadi.

Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Pengendapan oleh Logam

Logam berat Hasil Pengamatan Perubahan warna larutan

HgCl2 ++ Putih keruhPb-asetat +++ Putih sangat keruhAgNO3 + Putih agak keruh

Keterangan : + Ada endapan++ Banyak endapan+++ Sangat banyak endapan

(a (b) (c)

Gambar 1. Hasil uji Pengendapan oleh logam pada albumin dengan larutan (a) HgCl2, (b) Pb-asetat , (c) AgNO3.

Tabel 2. Hasil uji Pengendapan oleh garamUji Hasil Pengamatan Perubahan warna larutan

Uji kelarutan + LarutUji Millon + KuningUji Biuret - Putih

Keterangan : + Larut dan ada tirosin- Tidak larut dan tidak ada tirosin

(a) (b)

Gambar 2. Hasil uji pengendapan albumin oleh garam dengan (a) Uji Milllon dan (b)Uji Biuret.

Tabel 3. Hasil Uji Koagulasi

Uji Hasil Pengamatan Perubahan warna larutan

Uji kelarutan - Tidak larutUji Millon - Tidak berwarna

Keterangan : + Larut dan ada tirosin - Tidak larut dan tidak ada tirosin

Gambar 3. Hasil uji koagulasi pada albumin

Tabel 4. Hasil Uji Pengendapan oleh alkohol

Tabung Hasil Pengamatan Perubahan warna larutan

1 ++ Putih keruh2 + Putih agak keruh3 +++ Putih sangat keruh4 + Putih agak keruh

Keterangan : + Agak keruh++ Keruh+++ Sangat keruh

(a) (b)(c) (a) (b) (c) (d)

Gambar 4. Hasil uji pengendapan albumin oleh alkohol pada campuran larutan (a) tabung 3, (b) tabung 2, (c) tabung 1, (d) tabung 4.

Tabel 5. Hasil Denaturasi Protein

Tabung Hasil Pengamatan

Perubahan warna larutan

1. NaOH - Tidak berwarna2. HCl ++ Putih sangat keruh3. Buffer asetat pH 4.7 + -

Keterangan : - Tidak berwarna + Keruh ++ Sangat keruh

(a) (b) (c)

Gambar 5. Hasil uji denaturasi protein albumin dengan larutan (a)NaOH, (b) HCl, dan (c) Buffer asetat pH 4.7

PembahasanSalah satu identifikasi protein adalah dengan cara denaturasi protein

(perubahan struktur protein). Denaturasi ini dapat dilakukan dengan penambahan

asam atau ion logam berat (Poedjiaji 2006). Pada dasarnya semua ion logam ini

akan menghasilkan gumpalan (endapan) pada larutan protein karena ion logam ini

akan membentuk kompleks dengan protein dengan adanya gaya tarik antar gugus

-NH- dengan ion logam yang bermuatan positif. Secara bersama gugus -COOH

dan gugus –NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam

berat dan membentuk senyawa kelat.

Jumlah endapan yang dihasilkan dipengaruhi oleh kereaktifan logam berat

yang ditambahkan. Dari hasil percobaan yang dilakukanendapan yang dihasilkan

paling banyak yaitu oleh Pb-asetat diikuti oleh HgCl2 dan AgNO3. Ini

berkebalikan dengan literatur, sesuai dengan kereaktifaan dari suatu unsur dapat

dilihat bahwa Ag+ dan Hg2+ merupakan logam transisi pada sistem periodik unsur

yang sangat reaktif dibandingkan dengan Pb2+. Ini dapat terjadi karena konsetrasi

dari logam berat yang digunakan pada percobaan ini tidak menggunakan larutan

dengan konsentrasi yang sama. Pb-asetat dan AgNO3 yang digunakan adalah

dengan konsentrasi 5% sedangkan larutan HgCl2 hanya 2%. Untuk pengukuran

perbandingan kekuatan logam berat dalam mendenaturasi protein yang akurat

sebaiknya dengan menggunakan larutan dengan konsentrasi yang sama.

Identifikasi protein selanjutnya dengan pengendapan oleh garam yaitu

dengan pembentukan senyawa tak larut antara protein dengan ammonium sulfat.

Apabila terdapat garam garam anorganik dalam konsentrasi tinggi dalam larutan

protein, maka kelarutan protein akan berkurang sehingga terjadi pengendapan

protein. Teori menyebutkan bahwa sifat tersebut terjadi karena ion garam mampu

mengikat air (terhidrasi) sehingga berkompetisi dengan molekul protein dalam

mengikat air. Pemisahan protein ini disebut salting out (Winarno 2002).

Sebaliknya salting in melarutnya protein dalam suatu zat dengan penambahan

garam. Ketika penambahan ammonium sulfat, ammonium sulfat akan melarut ke

dalam air atau pelarutnya dan mendesak protein keluar, kembali dalam bentuk

solidnya, sehingga terbentuklah protein yang terendapkan.

Setelah larutan albumin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan

endapan yang terbentuk dengan air menunjukkan kelarutannya terhadap air.

Kemudian direaksikan dengan pereaksi Millon dan bereaksi positif dengan

terbentuknya warna kuning dan kemudian diuji juga dengan pereaksi Biuret tetapi

tidak menghasilkan hasil positif. Pengujian endapan dengan pereaksi Millon

bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian

filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus

amida pada filtrat yang dihasilkan.

Koagulasi adalah proses penggumpalan partikel koloid karena

penambahan bahan kimia sehingga partikel-partikel tersebut bersifat netral dan

membentuk endapan karena adanya gaya grafitasi. Albumin adalah protein yang

dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. (Poedjiadi 1994).

Koagulasi dapat ditimbulkan dengan pemanasan, penambahan asam dan

perlakuan alkali.

Dalam uji koagulasi digunakan panas dan asam asetat. Panas yang

digunakan pada percobaan ini untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi

hidrofobik non polar . Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan

energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar

sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Pemanasan akan

membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya

menurun karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-

kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan

kovalennya yang berupa ikatan peptida. Sedangkan penambahan asam asetat

bertujuan agar larutan albumin mencapai pH isoelektriknya sehingga bisa

terkoagulasi (Bintang 2010).

Uji kelarutan pada endapan tersebut digunakan air dan pereaksi Mollin.

Endapan yang dilarutkan dalam air tidak dapat larut dan endapan yang dilarutkan

ke dalam pereaksi Millon tidak terjadi perubahan warna. Seharusnya di dalam

albumin terdapat tirosin yang ketika direaksikan dengan pereaksi Mollin akan

bereaksi positif. Uji biuret tidak perlu dilakukan karena pada filtrat tidak ada lagi

protein sehingga pasti akan menghasilkan reaksi yang negatif.

Uji selanjutnya adalah dengan pengendapan oleh alkohol. Apabila protein

dipanaskan atau ditambah etanol absolut, maka protein akan menggumpal

(terkoagulasi). Hal ini disebabkan etanol menarik mantel air yang melingkupi

molekul-molekul protein Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta

dapat terkoagulasi oleh panas. Kelarutan protein di dalam suatu cairan,

sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, pH, suhu,

kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya. Protein seperti asam amino

bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda. Titik Isoelektrik (TI) adalah

daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah

muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan

dalam medan listrik (Hawab 2007). Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat

mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol.

Albumin mempunyai titik isolistrk pada pH 4.7 daripada itu maka ketiak

ditambahkan buffer pH 4.7 membentuk larutan yang sangat keruh. Pada protein,

ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana

asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh

adanya endapan yang terbentuk.

Pengujian protein yang terakhir yaitu denaturasi protein. Denaturasi

protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur

sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan

ikatan-ikatan kovalen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses

terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya

lipatan atau wiru molekul protein (Winarno 2002). Protein yang terdenaturasi

akan berkurang kelarutannya. Sesuai dengan percobaan yang dilakukan Albumin

terdenaturasi pada saat di titik isolistriknya yaitu pH 4.7 sedangkan saat

penambahan NaOH tidak terjadi perubahan apapun karena tidak berada pada titik

isolistriknya.

Simpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan untuk uji pengendapan oleh

logam untuk albumin, Pb-asetat mengendapkan protein terbanyak. Selanjutnya

untuk pengendapn oleh garam albumin dapat diendapkan oleh garam kemudian

endapan yang terbentuk dapat larut di dalam air dan albumin mengandung residu

asam amino tirosin. Dalam uji koagulasi, kelarutan endapan rendah di dalam air

dan bereaksi negatif dengan pereaksi Millon. Uji pengendapan oleh alkohol

membuktikan bahwa dengan buffer pH 4.7 menunjukkan endapan terbanyak di

titik iolistriknya. Albumin akan terdenaturasi ketika menggunakan asam kuat.

Daftar Pustaka

Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta : Erlangga.

Fessenden RJ, Fessenden JS. 1986. Kimia Organik Jilid II. Ed. ke-3 . Penerjemah Aloysius Hadyana Pudjaatmaka,Ph.D . Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari buku Organic Chemistry Third Edition.

Hart, Harold. 2003. Kimia Organik. Penerjemah Suminar Setiadi Achmadi. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari buku Organic Chemistry.

Hawab, MS. 2007. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : Diadit Media.

Sulistiyati. 2008. Pengaruh suhu dan lama pemanasan dengan menggunakan ekstraktor vakum terhadap crude albumin ikan gabus (ophiocephalus striatus). Jurnal Protein. Vol. 15. No. 2.

Poedjiadi, A. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.

Winarno FG. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Gramedia.