produksi dan pemurnian enzim pektinase …repository.unair.ac.id/25746/1/rohishoh, nur.pdf ·...

PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM PEKTINASE(POLIGALAKTURONASE) DARI BAKTERI Pseudomonas stutzeri

SKRIPSI

NUR ROHISHOH

DEPARTEMEN KIMIAFAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA2012

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri

Nur Rohishoh

ii

PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM PEKTINASE (POLIGALAKTURONASE) DARI BAKTERI Pseudomonas stutzeri

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk MemperolehGelar Sarjana Sains Bidang KimiaPada Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga

Disetujui oleh:

Pembimbing I

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.SiNIP. 19630615 198701 2 001

Pembimbing II

Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MPNIP. 19690912 199702 2 001



Nur Rohishoh

iii

HALAMAN PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul : Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase(Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri

Penyusun : Nur RohishohNIM : 080810123Tanggal ujian : 16 Juli 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.SiNIP. 19630615 198701 2 001

Pembimbing II

Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MPNIP. 19690912 199702 2 001

Mengetahui :

Ketua Departemen KimiaFakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEANIP. 19671115 199102 2 001



Nur Rohishoh

iv

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam

lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi

kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penulis dan harus menyebutkan

sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah.

Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga.



Nur Rohishoh

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga

penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi dengan judul “Produksi dan Pemurnian

Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri” yang

disusun sebagai syarat akademis untuk memperoleh gelar sarjana di Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Airlangga.

Penulisan naskah skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai

pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I

dan Ibu Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP selaku pembingbing II yang telah

meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, masukan dan saran

kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini.

2. Ibu Dr. Afaf Baktir, MS selaku dosen penguji I dan bapak Drs. Hamami, M.Si

selaku dosen penguji II atas masukan dan saran yang telah diberikan dalam

perbaikan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku Ketua Departemen Kimia yang

senantiasa memberikan motivasi kepada penulis.

4. Ibu Dra. Usreg Sri Handajani, M.Si selaku dosen wali atas bimbingan dan

motivasi yang telah diberikan.

5. Seluruh dosen pengajar Program Studi S1 Kimia atas segala ilmu yang telah

diberikan.

6. Bapak, ibu dan adik-adikku yang selalu memberikan dukungan, semangat dan

doa kepada penulis selama menempuh pendidikan di Universitas Airlangga



Nur Rohishoh

vi

7. Teman–teman angkatan 2008 dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan

satu persatu yang selalu memberikan semangat kepada penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam

penyusunan naskah skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan

saran yang bersifat membangun untuk kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi

ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Surabaya, Juli 2012

Penulis,

Nur Rohishoh



Nur Rohishoh

Rohishoh, Nur, 2012, Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri, Skripsi ini di bawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

vii

ABSTRAK

Telah dilakukan produksi dan pemurnian enzim pektinase khususnya poligalakturonase dari bakteri Pseudomonas stutzeri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim pektinase dan mengetahui berat molekul enzim pektinase melalui analisis SDS-PAGE. Proses pemurnian enzim diawali dengan pengendapan ammonium sulfat 70% dan diikuti dengan proses dialisis untuk menghilangkan sisa-sisa ammonium sulfat. Selanjutnya dilakukan kromatografi penukar anion dengan matriks DEAE Toyopearl 650 M,untuk memisahkan protein enzim berdasarkan muatannya. Enzim dielusi dengan larutan NaCl [0-1] M dalam buffer tris HCl pH 7 bergradien dari konsentrasi rendah ke tinggi. Hasil yang diperoleh menunjukkan terjadi peningkatan kemurnian enzim setelah dilakukan kromatografi penukar anion sebesar 77,7 kali dibandingkan ekstrak kasarnya. Hasil pemurnian enzim pektinase selanjutnya dikonfirmasi melalui analisis SDS-PAGE. Berdasarkan analisis SDS-PAGE, diperoleh 2 pita protein dengan berat molekul masing-masing pita yaitu 44,95 kDa dan 46,73 kDa.

Kata kunci: pektinase, poligalakturonase, Pseudomonas stutzeri, kromatografi penukar anion, SDS-PAGE



Nur Rohishoh

Rohishoh, Nur, 2012, Production and Purification of Pectinase (Polygalacturonase) from Pseudomonas stutzeri, This final project is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si and Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

viii

ABSTRACT

Polygalacturonase was one of types of pectinase from Pseudomonas stutzeri was partially purified by anion exchange chromatography. The objectives of this study are determining the purity level of pectinase and estimating the molecular weight of pectinase by SDS-PAGE analysis. The partial purification was started by 70%ammonium sulfate precipitation and followed by dialysis to remove the remains of ammonium sulfate. After that, the anion exchange chromatography with DEAE Toyopearl 650 M as matrix is used to separate the enzyme protein based on its anion. The enzyme was eluted with NaCl solution [0-1] M in Tris HCl buffer pH 7 from low to high concentration. The results of anion exchange chromatography indicated purification level 77.7 from crude extract. Based on SDS-PAGE analysis, the result of enzyme purification by anion exchange chromatography obtained two protein bands with molecular weight of protein bands are 44.95 kDa and 46.73 kDa.

Keywords: pectinase, polygalacturonase, Pseudomonas stutzeri, anion exchange chromatography, SDS-PAGE



Nur Rohishoh

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................... iHALAMAN PERNYATAAN ....................................................................... iiHALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iiiLEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI..................................... ivKATA PENGANTAR................................................................................... vABSTRAK .................................................................................................... viiABSTRACT .................................................................................................. viiiDAFTAR ISI ................................................................................................. ixDAFTAR GAMBAR..................................................................................... xiDAFTAR TABEL ......................................................................................... xiiiDAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xiv

BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang Masalah ............................................................... 11.2 Rumusan Masalah......................................................................... 51.3 Tujuan Penelitian .......................................................................... 51.4 Manfaat Penelitian ........................................................................ 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Enzim .......................................................................................... 7

2.1.1 Mekanisme kerja enzim ...................................................... 82.1.2 Aktivitas enzim................................................................... 11

2.1.2.1 Konsentrasi enzim.................................................... 112.1.2.2 Konsentrasi substrat ................................................. 112.1.2.3 Pengaruh suhu.......................................................... 122.1.2.4 Pengaruh pH ............................................................ 13

2.2 Pektin........................................................................................... 132.3 Enzim Pektinase........................................................................... 152.4 Pseudomonas stutzeri................................................................... 172.5 Pemurnian Enzim......................................................................... 19

2.5.1 Pemekatan enzim ............................................................... 20 2.5.2 Kromatografi kolom........................................................... 22

2.5.2.1 Kromatografi filtrasi gel........................................... 232.5.2.2 Kromatografi penukar ion ........................................ 232.5.2.3 Kromatografi afinitas ............................................... 252.5.2.4 Kromatografi interaksi hidrofobik ............................ 25

2.6 SDS-PAGE .................................................................................. 26

BAB III METODE PENELITIAN3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 283.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian .............................................. 28

3.2.1 Sampel penelitian ............................................................... 283.2.2 Bahan penelitian................................................................. 28



Nur Rohishoh

x

3.2.3 Alat penelitian .................................................................... 293.3 Prosedur Kerja.............................................................................. 30

3.3.1 Diagram alir penelitian........................................................ 303.3.2 Pembuatan media ................................................................ 31

3.3.2.1 Media padat ............................................................. 313.3.2.2 Media cair................................................................ 31

3.3.3 Kultivasi bakteri Pseudomonas stutzeri .............................. 313.3.4 Produksi enzim pektinase ................................................... 323.3.5 Uji aktivitas enzim pektinase .............................................. 323.3.6 Penentuan kadar protein ..................................................... 333.3.7 Pemurnian enzim pektinase ................................................ 34

3.3.7.1 Pengendapan dengan amonium sulfat ..................... 343.3.7.2 Dialisis ................................................................... 353.3.7.3 Pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi

penukar anion......................................................... 363.3.8 Analisis SDS-PAGE........................................................... 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Hasil Produksi Enzim Pektinase dari Pseudomonas stutzeri .......... 384.2 Uji Aktivitas Enzim Pektinase ...................................................... 394.3 Uji Kadar Protein.......................................................................... 414.4 Hasil Pemurnian Enzim Pektinase ................................................ 42

4.4.1 Hasil pengendapan enzim pektinase dengan amonium sulfat.................................................................................. 42

4.4.2 Hasil dialisis enzim pektinase ............................................. 444.4.3 Hasil pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi

penukar anion .................................................................... 464.5 Hasil Analisis SDS-PAGE............................................................ 49

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN5.1 Kesimpulan .................................................................................. 534.2 Saran ............................................................................................ 53

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 54LAMPIRAN



Nur Rohishoh

xi

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

2.1 Model interaksi enzim substrat Lock and Key ............................ 10

2.2 Model interaksi enzim substrat Induced Fit. .............................. 10

2.3 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi. ...................... 11

2.4 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi..................... 12

2.5 Pengaruh suhu terhadap laju reaksi ............................................ 13

2.6 Pengaruh pH terhadap laju reaksi .............................................. 13

2.7 Struktur molekul pektin ............................................................. 14

2.8 Mekanisme kerja enzim pektinase: pektin metil esterase (PME),pektin liase (PL), poligalakturonase (PG), dan pektat liase(PAL)........................................................................................ 17

2.9 Uji pewarnaan gram negatif Pseudomonas stutzeri .................... 18

2.10 Pemisahan dengan dialisis ......................................................... 22

2.11 Kromatografi filtrasi gel ............................................................ 23

2.12 Kromatografi penukar ion (a); matriks penukar kation dananion (b).................................................................................... 24

2.13 Kromatografi afinitas................................................................. 25

2.14 Teknik SDS-PAGE.................................................................... 27

3.1 Diagram alir penelitian ............................................................. 30

4.1 Isolat bakteri penghasil enzim pektinase .................................... 38

4.2 Hasil isolasi enzim pektinase, sebelum disentrifugasi (a) dan. sesudah disentrifugasi (b) .......................................................... 39

4.3 Reaksi reduksi asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat............................................................................ 39



Nur Rohishoh

xii

4.4 Optimasi pengendapan ekstrak kasar enzim pektinase denganamonium sulfat.......................................................................... 44

4.5 Profil elusi enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion 47

4.6 Hasil analisis SDS-PAGE; marker protein (M), ekstrak kasar enzim (CE), pengendapan dengan ammonium sulfat (AS), dialisis (D), dan fraksi ke-18 kromatografi penukar anion ................................... 51



Nur Rohishoh

xiii

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman

4.1 Pemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) ........................ 48



Nur Rohishoh

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Lampiran

1 Pembuatan reagen

2 Pembuatan kurva standar asam galakturonat

3 Pembuatan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin)

4 Penentuan aktivitas poligalakturonase dengan metode DNS

5 Perhitungan kadar protein

6 Data optimasi pengendapan enzim dengan (NH4)2SO4

7 Hasil elusi kromatografi penukar anion

8 Pembuatan buffer sampel dan gel SDS-PAGE

9 Penentuan berat molekul relatif (Mr) protein enzim



Nur Rohishoh

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Pengetahuan dan penggunaan enzim dalam berbagai bidang saat ini telah

mengalami perkembangan yang sangat pesat. Enzim berfungsi sebagai katalis

untuk proses biokimia yang terjadi di dalam maupun di luar sel. Melalui aktivitas

katalitiknya, enzim mampu mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat

dibandingkan dengan reaksi tanpa katalis (Poedjiadi, 1994). Hal ini menjadi salah

satu alasan enzim banyak digunakan sebagai katalis pada laboratorium dan

industri.

Pektinase merupakan salah satu jenis enzim yang luas penggunaannya

dalam bidang industri dan lapangan ilmu pengetahuan lainnya. Fakta

menyebutkan bahwa 25% enzim pangan dunia yang digunakan dalam proses

industri adalah pektinase (Tari et al., 2008). Enzim pendegradasi pektin ini

digunakan dalam proses industri pangan khususnya industri sari buah-buahan dan

sayuran, yang fungsinya antara lain untuk menjernihkan sari buah, menurunkan

kekentalan, memudahkan penyaringan, mempercepat pengendapan sedimen,

mempertahankan tekstur dan penampakan produk akhir, mencegah presipitasi

pektin selama penyimpanan, dan meningkatkan efisiensi ekstraksi sari buah

(Alkorta et al., 1998).

Enzim pektinase dapat dihasilkan secara alami oleh bebarapa tanaman dan

mikroba. Enzim pektinase yang diproduksi secara komersial umumnya dihasilkan

1



Nur Rohishoh

2

oleh mikroba. Hal tersebut disebabkan karena enzim dari mikroba memiliki

kelebihan, di antaranya biaya produksi relatif ringan, dapat diproduksi dalam

jumlah besar dan dalam waktu yang singkat, serta produktivitasnya lebih mudah

ditingkatkan (Stanbury and Whitaker, 1995).

Langkah pertama dalam pengembangan proses produksi enzim pektinase

adalah mencari galur mikroba yang produktif menghasilkan enzim pektinase.

Banyak penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa spesies Aspergillus dan

Rhizopus merupakan galur mikroba produktif dari jenis kapang yang

menghasilkan enzim pektinase komersial dengan aktivitas pektinolitik tinggi

dalam skala industri (Fawole and Odunfa, 2003). Tidak hanya dari jenis kapang,

enzim pektinase juga banyak dihasilkan dari berbagai jenis bakteri seperti dari

genus Pseudomonas dan Bacillus (Kobayashi et al., 2000).

Beberapa jenis bakteri pektinolitik dapat diisolasi dari perairan tambak, di

antaranya yaitu Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas

fluorescens, Bacillus sp., Micrococcus sp., dan Flavobacterium sp. Bakteri-

bakteri tersebut merupakan pengendali hayati dari pertumbuhan Microcystis

aeruginosa yang merupakan alga pengganggu perairan tambak di mana dinding

selnya sebagian besar tersusun atas pektin. Bakteri pektinolitik tersebut bekerja

melalui aktivitas enzim ekstaseluler yang dihasilkan dari sel-sel bakteri untuk

mendegradasi molekul pektin penyusun dinding sel Microcystis aeruginosa. Hal

ini dibuktikan dengan penambahan ekstrak kasar enzim pektinase yang diproduksi

dari isolat bakteri perairan tambak ke dalam kultur murni Microcystis aeruginosa



Nur Rohishoh

3

dan terjadi penurunan kepadatan populasi Microcystis aeruginosa secara

eksponensial hingga hari ke-14 (Masithah, 2008).

Bakteri dengan genus Pseudomonas dipilih pada penelitian ini karena

berdasarkan hasil penelitian Masithah (2008) menunjukkan bahwa isolat terbesar

dari perairan tambak yaitu bakteri Pseudomonas sekitar 70-90% dan mempunyai

aktivitas pektinase yang tinggi. Salah satu dari jenis bakteri tersebut yaitu

Pseudomonas stutzeri. Bakteri jenis ini banyak ditemukan dalam perairan tambak

udang dan lele dengan jumlah sekitar 97,81% (Rahardja, 2010). Bakteri

Pseudomonas mampu menghasilkan enzim pektinase dengan jenis

poligalakturonase (PG, EC 3.2.1.15), pektat liase (PAL, EC 4.2.2.2), dan pektin

liase (PL, EC 4.2.2.10) (Masithah, 2008).

Poligalakturonase mendegradasi asam poligalakturonat (poligalakturonat

acid) yaitu pektin dengan derajat esterfikasi yang sangat tinggi (lebih dari 50%)

atau disebut juga dengan asam pektinat. Poligalakturonase bekerja dengan

memutus ikatan α-1,4 glikosidik pada rantai asam poligalakturonat secara

hidrolisis (Ortega et al., 2004). Pektin liase mendegradasi pektin dengan derajat

esterfikasi yang cukup tinggi (50%) sedangkan pektat liase mendegradasi pektin

yang dengan derajat esterfikasi rendah atau yang tidak teresterfikasi. Pektin liase

dan pektat liase bekerja dengan memutus ikatan α-1,4 glikosidik pada pektin

melalui reaksi β-eliminasi (Mayans et al., 1997).

Dari ketiga jenis enzim pektinase yang dihasilkan oleh isolat bakteri

perairan tambak, poligalakturonase memiliki aktivitas tertinggi pada pH rendah

(4-6). Poligalakturonase menunjukkan aktivitasnya dalam mendegradasi pektin



Nur Rohishoh

4

lebih cepat dibanding dengan pektat liase dan pektin liase. Berdasarkan hasil

karakterisasi, waktu inkubasi poligalakturonase lebih pendek (45 menit)

dibanding dengan pektin liase (60 menit) dan pektat liase (90 menit). Sehingga

produk yang dihasilkan lebih cepat melalui degradasi oleh poligalakturonase

(Masithah, 2008).

Ekstrak kasar enzim pektinase yang diproduksi dari berbagai isolat bakteri

memiliki aktivitas yang sangat rendah. Hal ini disebabkan di dalam ekstrak kasar

enzim masih mengandung beberapa protein maupun kontaminan selain protein

target. Aktivitas spesifik dari suatu enzim dapat meningkat setelah dilakukan

berbagai tahapan pemurnian enzim melalui pengendapan enzim dan serangkaian

kromatografi kolom (Stryer, 2002). Aktivitas spesifik poligalakturonase

meningkat 18,64 kali setelah pemurnian dengan kromatografi penukar anion

(Yadav et al., 2008), 54,9 kali setelah pemurnian menggunakan kromatografi

kolom afinitas Sephadex G-100 (Jacob et al., 2008), dan 61 hingga 3200 kali

setelah pemurnian dengan kromatografi kolom afinitas Sepharose (Shen et al.,

1995).

Pada penelitian sebelumnya telah berhasil dilakukan isolasi dan

karakterisasi enzim pektinase dari isolat bakteri perairan tambak yang meliputi

pH optimum, suhu optimum, dan waktu inkubasi optimum (Masithah, 2008).

Namun yang diperoleh masih dalam bentuk ekstrak kasarnya. Untuk

meningkatkan aktivitas spesifik enzim pektinase khususnya poligalakturonase

perlu dilakukan pemisahan dan pemurnian enzim. Tahap awal pemurnian ini



Nur Rohishoh

5

dilakukan dengan pengendapan enzim menggunakan ammonium sulfat optimum,

selanjutnya dilakukan dialisis dan kromatografi penukar anion.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dapat dirumuskan

permasalahan sebagai berikut :

a. Bagaimanakah tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) yang

diisolasi dari bakteri Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan pemurnian

dengan pengendapan ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi penukar

anion?

b. Berapakah perkiraan berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari

bakteri Pseudomonas stutzeri?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :

a. Mengetahui tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) yang

diisolasi dari bakteri Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan pemurnian

dengan pengendapan ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi penukar

anion.

b. Memperkirakan berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari

bakteri Pseudomonas stutzeri.



Nur Rohishoh

6

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini untuk memperoleh enzim pektinase

(poligalakturonase) dengan tingkat kemurnian yang tinggi, sehingga dapat

digunakan untuk perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, serta dapat

diaplikasikan dalam bidang industri yang memanfaatkan enzim pektinase.



Nur Rohishoh

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

Enzim merupakan katalisator organik (biokatalisator) yang dihasilkan oleh

sel hidup. Fungsi enzim yaitu mempercepat reaksi kimia 108 sampai 1011 di dalam

maupun di luar sel dengan menurunkan energi aktivasi dan tanpa mengubah hasil

akhir (produk). Enzim bekerja dengan urut-urutan yang teratur, mengkatalisis

ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang

menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel

dari prekusor sederhana (Lehninger, 1993). Keunggulan enzim sebagai

biokatalisator antara lain daya katalitik dan spesifitas yang tinggi, dapat bekerja

pada kondisi suhu dan pH yang tidak eksterm, aktivitas katalitik beberapa enzim

dapat dikendalikan dan dapat diproduksi sehingga memudahkan penyediaan

(Stryer, 2002).

Berdasarkan tempat digunakannya, enzim terdiri atas dua tipe yaitu enzim

intraselular yang berfungsi di dalam sel dan enzim ekstraselular yang berfungsi di

luar sel. Fungsi utama enzim intraselular adalah mensintesis bahan selular dan

juga menguraikan nutrien untuk menyediakan energi yang dibutuhkan oleh sel.

Sedangkan fungsi utama dari eksoenzim adalah melangsungkan terjadinya

perubahan tertentu pada nutrien yang ada di sekitarnya sehingga memungkinkan

nutrien tersebut memasuki sel (Pelczar dan Chan, 2007). Molekul-molekul enzim

memiliki efisiensi yang tinggi dalam mempercepat reaksi pengubahan substrat

7



Nur Rohishoh

8

menjadi produk akhir. Namun, enzim bersifat tidak stabil, yakni aktivitasnya

dapat berkurang atau rusak oleh berbagai faktor baik fisik maupun kimia.

Molekul enzim adalah protein yang dihasilkan oleh sel hidup berupa

protein globular yang terbentuk dari rantai polipeptida yang berlipat secara

kompak. Konformasi tersier protein globular merupakan bentuk yang paling stabil

karena ditunjang oleh berbagai ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein.

Jenis-jenis ikatan tersebut antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat di antara

gugus R residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara

gugus R yang berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino

hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Ottoway

dan Apps, 1984).

2.1.1 Mekanisme kerja enzim

Mekanisme katalis enzim merupakan reaksi-reaksi yang melibatkan

gugus-gugus fungsi dari residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim.

Sebelum melakukan fungsi katalitiknya, enzim terlebih dahulu membentuk ikatan

dengan substrat, seperti yang ditunjukkan oleh reaksi berikut:

E + S kompleks ES EP E + P

Setelah substrat terikat pada enzim, baru kemudian terjadi proses katalisis

yaitu pembentukan ikatan kimia. Mengingat molekul enzim berukuran lebih besar

daripada molekul substrat maka tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan

dengan substrat. Hubungan antara substrat dengan enzim hanya terjadi pada

bagian atau tempat yang disebut dengan sisi aktif (active site) (Poedjiaji, 1994).



Nur Rohishoh

9

Ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat merupakan ikatan yang

lemah seperti ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun

interaksi hidrofobik. Interaksi yang terjadi antara molekul enzim dan substrat

melibatkan gugusan reaktif, baik dari enzim maupun dari substrat. Enzim hanya

dapat mengikat substrat yang memiliki gugusan-gugusan reaktif yang sama.

Gugusan reaktif enzim yang terlibat dalam pengikatan substrat disebut gugusan-

gugusan pengikat (binding group). Proses katalitik melibatkan sejumlah gugusan-

gugusan reaktif lain yang disebut gugusan katalitik (catalytic group). Gugusan

tersebut terletak pada gugusan samping (Poedjiaji, 1994).

Menurut Winarno (1990), ada dua model interaksi enzim substrat yaitu :

1. Model Lock and Key (lubang dan anak kunci)

Model Lock and Key (lubang dan anak kunci) dikemukakan oleh Emil Fisher

pada tahun 1890. Pada model ini, substrat harus mempunyai ukuran atau

bentuk yang sesuai dengan sisi aktif enzim. Dalam model Fisher, tempat

katalitik dianggap terbentuk terlebih dahulu agar sesuai dengan substratnya.

Walaupun model Lock and Key ini merupakan model cetakan yang kaku,

tetapi dapat dipakai untuk memahami sifat-sifat tertentu dari enzim, misalnya

pengikatan secara berurutan dua atau lebih substrat atau kinetika suatu kurva

kejenuhan substrat yang sederhana.

2. Model Induced Fit

Daniel G. Koshland pada tahun 1958 mengemukakan bahwa ukuran atau

bentuk sisi aktif enzim dapat mengalami modifikasi oleh adanya pengikatan

substrat. Pada model ini, sisi aktif enzim diasumsikan cocok dengan



Nur Rohishoh

10

substratnya sesaat setelah enzim mengikat substrat. Jadi substrat dianggap

mampu menginduksi perubahan bentuk dalam sisi aktif enzim. Perubahan ini

menempatkan residu asam amino pada sisi aktif enzim yang memungkinkan

terjadinya pengikatan substrat selama proses katalisis.

Gambar 2.1 Model interaksi enzim substrat Lock and Key (Stryer, 2002)

Gambar 2.2 Model interaksi enzim substrat Induced Fit (Stryer, 2002)

Struktur protein enzim dapat mempengaruhi aktivitas katalitik. Aktivitas

katalitik enzim akan hilang bila terjadi denaturasi protein. Denaturasi protein

adalah perubahan struktur protein yang menyebabkan hilangnya fungsi alamiah

protein. Akibat yang ditimbulkan dari suatu denaturasi adalah hilangnya sifat



Nur Rohishoh

11

biologis protein tersebut. Penyebab terjadunya denaturasi antara lain : kondisi pH

ekstrem, suhu tinggi, dan pengaruh senyawa lain seperti detergen, pelarut organik,

urea konsentrat, anion besar dari asam kuat dan ion chaotropic (I-, SCN-)

(Ottoway dan Apps, 1984).

2.1.2 Aktivitas enzim

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi

enzim, konsentrasi substrat, suhu dan pH.

2.1.2.1 Konsentrasi enzim

Kecepatan reaksi suatu enzim secara langsung dapat dipengaruhi oleh

konsentrasi enzim. Jika konsentrasi enzim banyak, maka reaksi akan lebih cepat.

Jika jumlah enzim dua kali lipat, maka kecepatan reaksi akan menjadi dua kali

lipat. Jadi ada hubungan linier antara kecepatan reaksi enzim dengan jumlah

enzim (Poedjiadi, 1994).

Gambar 2.3 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994)

2.1.2.2 Konsentrasi substrat

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang

tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi.



Nur Rohishoh

12

Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan

walaupun konsentrasi substrat diperbesar (Poedjiadi, 1994).

Gambar 2.4 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994)

2.1.2.3 Pengaruh suhu

Reaksi yang menggunakan katalis enzim dipengaruhi oleh suhu. Pada

suhu rendah reaksi berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi

reaksi berlangsung lebih cepat. Kenaikan suhu menyebabkan terjadinya proses

denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu sehingga konsentrasi

efektivitas enzim berkurang dan kecepatan reaksinya pun menurun. Kenaikan

suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi.

Namun kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan

mengurangi kecepatan reaksi. Oleh karena adanya dua pengaruh yang

berlawanan, maka akan terjadi suatu titik optimum, yaitu suhu yang paling tepat

bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim tertentu (Poedjiadi, 1994).



Nur Rohishoh

13

Gambar 2.5 Pengaruh suhu terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994)

2.1.2.4 Pengaruh pH

Enzim mempunyai pH tertentu yang pada pH tersebut aktivitas enzim

optimum. Perubahan pH lingkungan berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif

enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. pH yang rendah atau tinggi

dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan mengakibatkan turunnya

aktivitas enzim (Poedjiadi, 1994).

Gambar 2.6 Pengaruh pH terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994)

2.2 Pektin

Pektin adalah komponen utama yang terdapat pada lamella tengah dan

dinding sel primer tanaman (Alkorta et al., 1998). Pektin merupakan polisakarida



Nur Rohishoh

14

yang tersusun atas residu asam D-galakturonat yang dihubungkan oleh ikatan α-

1,4 glikosidik (Quiroga et al., 2009). Menurut Nussinovitch (1997), komponen

utama dari senyawa pektin tidak hanya asam D-galakturonat tetapi terdapat juga

D-galaktosa, L-arabinosa, dan L-ramnosa dalam jumlah yang beragam dan

terkadang terdapat gula lain dalam jumlah yang kecil. Beberapa gugus

karboksilnya dapat teresterifikasi dengan metanol. Polimer asam galakturonat

tersebut dapat berupa rantai lurus atau tidak bercabang.

Gambar 2.7 Struktur molekul pektin (Alkorta et al., 1998)

American Chemical Society telah menetapkan istilah baku untuk

menyeragamkan pektin yang hingga kini masih dipakai (Nussinovitch, 1997),

yaitu :

1. Substansi pektat merupakan kelompok zat turunan karbohidrat kompleks

berbentuk koloid yang dihasilkan dari tumbuh-tumbuhan dan sebagian besar

mengandung asam anhidrogalakturonat dalam suatu kombinasi turunannya

menyerupai rantai. Gugus karboksil asam-asam poligalakturonat dapat

teresterifikasi sebagian dengan gugus metil dan sebagian atau seluruhnya

dapat dinetralkan oleh satu atau lebih jenis basa.

2. Protopektin adalah zat pektat yang tidak larut dalam air dan jika dihidrolisis

menghasilkan asam pektinat atau pektin.



Nur Rohishoh

15

3. Asam pektinat adalah istilah yang digunakan bagi asam poligalakturonat yang

mengandung gugus metil ester dalam jumlah yang banyak (lebih dari 50%).

Asam pektinat dalam keadaan yang sesuai mampu membentuk gel dengan

ion-ion logam.

4. Pektin adalah istilah yang digunakan untuk asam-asam pektinat yang dapat

larut dalam air dengan kandungan metil ester dan derajat netralisasi beragam

dan dapat membentuk gel dengan asam dan gula pada kondisi yang sesuai.

5. Asam pektat adalah zat pektat yang seluruhnya tersusun dari asam

poligalakturonat yang bebas dari gugus metil ester.

2.3 Enzim Pektinase

Pektinase adalah enzim yang digunakan dalam degradasi molekul pektin

(Jacob et al., 2008). Enzim pektinase dibagi menjadi tiga kelompok besar yaitu

enzim yang melakukan deesterifikasi (pektinesterase), enzim yang melakukan

depolimerisasi (hidrolase dan liase) dan protopektinase. Enzim deesterifikasi

memotong ikatan ester antara gugus karboksil dari unit asam poligalakturonat

dengan gugus metil. Enzim depolimerisasi membelah ikatan α-1,4 glikosidik pada

senyawa pektin. Sedangkan protopektinase adalah enzim pektinase yang

melarutkan protopektin (Alkorta et al., 1998).

Berdasarkan cara kerjanya enzim depolimerisasi dibagi menjadi dua yaitu

hidrolase dan liase. Hidrolase memotong ikatan α-1,4 glikosidik asam

poligalakturonat dengan hidrolisis, sedangkan liase memotong ikatan α-1,4

glikosidik asam poligalakturonat dengan β-eliminasi pada posisi C(4) dan C(5).



Nur Rohishoh

16

Pemecahan hidrolisa atau β-eliminasi dapat berlangsung secara acak (endo enzim)

atau hanya memutus pada bagian ujung (ekso enzim) (Alkorta et al., 1998).

Klasifikasi enzim pektinase berdasarkan mekanisme kerjanya pada

molekul pektin, yaitu: pektinesterase atau pektin metilesterase (PME, EC

3.1.1.11), poligalakturonase (PG, EC 3.2.1.15), pektat liase (PAL, EC 4.2.2.2),

dan pektin liase (PL, EC 4.2.2.10) (Debing et al., 2006).

Pektinesterase atau pektin metilesterase (PME) merupakan enzim yang

yang memutus ikatan antara gugus karboksil dengan gugus metil pada asam

poligalakturonat teresterifikasi. Poligalakturonase (PG) merupakan golongan

enzim hidrolase yaitu enzim yang menghidrolisis molekul pektin dengan derajat

esterifikasi yang sangat tinggi dengan membuka ikatan α-1,4-glikosidik pada

rantai asam poligalakturonat (Shen et al., 1995). Pektat liase (PAL) dan pektin

liase (PL) merupakan enzim depolimerase yang memutus ikatan α-1,4-glikosidik

pada asam poligalakturonat melalui mekanisme reaksi β-eliminasi menghasilkan

oligogalakturonat dengan ikatan C4-C5 tak jenuh. Pektat liase bekerja pada pektin

dengan derajat esterifikasi yang rendah atau tidak teresterifikasi dan memerlukan

Ca2+ untuk meningkatkan aktivitasnya. Sedangkan pektin liase bekerja pada

pektin dengan derajat esterifikasi yang cukup tinggi dan aktivitasnya tidak

dipengaruhi oleh Ca2+ (Mayans et al., 1997).



Nur Rohishoh

17

Gambar 2.8 Mekanisme kerja enzim pektinase: pektin metil esterase (PME), pektin liase (PL), poligalakturonase (PG), dan pektat liase (PAL) (Alkorta et al., 1998)

2.4 Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas stutzeri memiliki klasifikasi sebagai berikut:

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria



Nur Rohishoh

18

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas stutzeri

Gambar 2.9 Uji pewarnaan gram negatif Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas stutzeri adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, dan

memiliki flagel kutub tunggal. Bakteri ini berukuran 1-3 µm, berdiameter 0,5

µm, dan koloninya membentuk cakram. Pseudomonas stutzeri dapat ditemukan

hampir di semua jenis perairan dan dapat tumbuh pada berbagai macam

karbohidrat termasuk pati, pektin, dan maltosa. Bakteri ini biasanya hidup

bersama-sama dengan bakteri Pseudomonas pseudomallei dalam habitatnya. Pada

perairan tambak udang ditemukan sekitar 77% spesies Pseudomonas stutzeri dan

97,81% di perairan tambak lele dumbo (Rahardja, 2010). Hasil eksplorasi

penelitian Herlina (2010) diketahui bahwa Pseudomonas stutzeri merupakan

bakteri yang memiliki sifat proteolitik, amilolitik, pektinolitik, dan lipolitik.

Selain itu, Pseudomonas stutzeri juga bersifat denitrifier (Van and Allen, 1995).



Nur Rohishoh

19

2.5 Pemurnian Enzim

Pemurnian bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari

senyawa yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian tergantung dari tujuan

akhir, apakah untuk tujuan komersial atau tujuan riset. Enzim yang kasar atau

yang dimurnikan sebagian masih dapat dipakai untuk komersial, sedangkan enzim

yang murni atau hampir murni digunakan dalam riset atau dipakai dalam produk

analitik. Untuk tujuan riset, biasanya digunakan untuk mempelajari aktivitas

enzim, struktur dan fungsinya. Jumlah dari protein yang telah dimurnikan tidak

hanya bergantung pada material awal tetapi juga proses. Ada protein yang hilang

pada setiap tahap pemurnian. Karena itu, untuk memaksimalkan proses

diusahakan sesedikit mungkin tahap pemurnian yang digunakan (Harris dan

Angal, 1993).

Harris (1989) menyebutkan ada tiga strategi dalam pemurnian enzim yang

harus diperhatikan : 1) kualitas ; perlu tindakan untuk mempertahanakan aktivitas

protein dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi, 2) kuantitas ;

pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kualitas enzim yang

diperlukan, 3) ekonomis merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam

industri atau diterapkan dalam skala laboratorium. Pemurnian protein dilakukan

berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan afinitas pengikat spesifik dari protein

itu sendiri. Oleh karena itu, campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan

berbagai seri pemisahan.



Nur Rohishoh

20

2.5.1 Pemekatan enzim

Pemekatan protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemurnian

enzim sebelum tahap pemurnian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk

keperluan analisis enzim (Harris, 1989). Pemekatan protein dapat dilakukan

dengan dua metode, yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik

menggunakan pemekatan asam (asam trikloroasetat), pemekatan organik (aseton

dan etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein.

Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan

aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif misalnya

pemekatan dengan garam, pemekatan dengan pelarut organik, pemekatan dengan

polimer organik, ultrafiltrasi, dan dialisis (Bollag & Edelstein, 1991). Metode

pemekatan protein enzim yang biasa dilakukan adalah dengan menggunakan

garam ammonium sulfat dan pelarut organik aseton.

Prinsip pemekatan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang

berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan

daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein pada pH dan

suhu tertentu meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan

kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan

garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (salting out).

Molekul air yang berikatan dengan garam-garam semakin banyak yang

menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein.

Peristiwa ini menyebabkan protein saling berinteraksi, beragregasi kemudian

mengendap (Harris, 1989). Ammonium sulfat merupakan garam yang paling



Nur Rohishoh

21

sering digunakan untuk mengendapkan protein karena memilki daya larut tinggi

di dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam larutan

ammonium sulfat (2M-3M) tahan bertahun-tahun (Scopes, 1993).

Pemekatan protein dengan menggunakan pelarut organik aseton

berdasarkan pada pengurangan kelarutan protein dan konstanta dielektrika

pelarut. Semakin banyak pelarut organik yang ditambahkan, semakin kurang daya

solvasi air dan muatan pada permukaan molekul protein yang hidrofilik. Hal ini

akan mengakibatkan molekul-molekul protein cenderung berinteraksi dengan

sesamanya, hingga akhirnya protein mengendap. Prosedur pemekatan pelarut

organik aseton dilakukan pada suhu di bawah 0oC. Pada suhu di atas 10oC,

konformasi protein akan segera berubah yang memungkinkan molekul-molekul

pelarut organik mendapatkan jalan masuk ke bagian dalam struktur protein,

kemudian merusak interaksi hidrofobik dan akhirnya akan terjadi denaturasi

(Harris, 1989; Scopes, 1993).

Kelebihan garam yang terdapat dalam larutan enzim setelah tahap

pemurnian dapat dihilangkan dengan cara dialisis, diafiltrasi, dan filtrasi gel. Pada

tahap dialisis, protein ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel

yang direndam di dalam larutan buffer tertentu. Molekul yang berukuran kecil

akan keluar melalui membran, sedangkan molekul yang berukuran besar akan

tertahan di dalam membran dialisis. Sedangkan diafiltrasi dilakukan dengan

menggunakan air atau buffer yang ditambahkan ke dalam larutan protein,

selanjutnya dikonsentrasikan dengan ultrafiltrasi sehingga prosesnya akan

berjalan lebih cepat bila dibandingkan dengan dialisis.



Nur Rohishoh

22

Gambar 2.10 Pemisahan dengan dialisis (Stryer,2002)

Berbeda dengan dialisis dan diafiltrasi, penghilangan garam dengan filtrasi

gel diterapkan untuk jumlah sampel yang sedikit, yaitu tidak melampaui 25-30%

volume kolom untuk mendapatkan resolusi yang memadai antar protein dan

garam. Pada umumnya matriks filtrasi gel yang biasa digunakan memiliki pori

berukuran kecil, misalnya (Sephadex G-25) (Pharmacia). Kekurangan metode ini

adalah terjadi pengenceran sampel protein.

2.5.2 Kromatografi kolom

Kromatografi merupakanmetode utama dalam pemisahan senyawa

organik yang mana senyawa tersebut terdistribusi di antara 2 fase, yaitu fase diam

dan fase gerak. Fase gerak berupa pelarut dan molekul yang akan dipisahkan,

sedangkan fase diam berupa padatan atau larutan yang mendukung padatan atau

gel. Fase gerak bergerak kontinyu terhadap fase diam.

Ada beberapa macam kromatografi kolom, antara lain kromatografi filtrasi

gel, kromatografi penukar ion, kromatografi afinitas, kromatografi interaksi

hidrofobik.

Tabung dialisis

Larutan pekat

Larutan buffer



Nur Rohishoh

23

2.5.2.1 Kromatografi filtrasi gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan

makromolekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul. Matriks filtrasi gel

berupa gel yang berpori seperti dekstran, agarosa atau poliakrilamida. Contoh

matriks komersial tersebut adalah Sepharose, Sephadex, dan Biogel, kemudian

dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair. Pori-pori matriks dapat

menampung molekul berukuran lebih kecil. Molekul berukuran lebih kecil akan

memasuki pori-pori matriks, namun molekul yang besar tidak terperangkap ke

dalam pori kolom. Hasil yang dicapai adalah molekul besar akan keluar dari

kolom lebih dulu dibanding molekul yang lebih kecil (Scopes, 1993).

Gambar 2.11 Kromatografi filtrasi gel (Stryer,2002)

2.5.2.2 Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan molekul-molekul

ion polar yang didasarkan pada perbedaan muatan, yaitu antara molekul

bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang muatannya

berlawanan sebagai pengisi kolom. Permukaan protein terdiri dari muatan positif

dan negatif tergantung dari rantai samping asam amino asam atau basa. pH

Sampel protein

Eksklusi molekul gel

Polimerkarbohidrat

Molekul kecil melewati pori

matriks

Molekul besar tertahan



Nur Rohishoh

24

protein dengan jumlah muatan positif dan negatif sama disebut titik isoelektrik

(pI). Titik isoelektrik sebagian besar protein di antara 5-9. Protein yang memiliki

pH di atas pI akan bermuatan negatif, sedangkan pH di bawah pI akan bermuatan

positif (Harris and Angal, 1993).

Pengerjaan kromatografi penukar ion didahului dengan mengelusi protein

enzim dengan pH buffer awal yang telah diatur. Protein diharapkan terikat kuat

pada kolom dan protein lain dibiarkan terelusi terlebih dahulu. Protein yang

terikat pada kolom dilepaskan dengan cara mengubah pH buffer atau kekuatan

ion pelarut. Matriks penukar ion mengikat secara kovalen gugus fungsional yang

bermuatan negatif pada penukar kation atau gugus fungsional yang bermuatan

positif pada penukar anion. Matriks berupa polimer elastis dan mengandung

senyawa resin sintetik terbuat dari bahan dekstran, selulosa atau sephadex.

Contoh matriks penukar kation dan anion masing-masing adalah karboksimetil

selulosa (CMC) dan dietilaminoetil (DEAE) selulosa (Scopes, 1993).

Gambar 2.12 Kromatografi penukar ion (a); matriks penukar kation dan anion(b) (Stryer,2002)

Muatan positif berikatan dengan muatan negatif

Muatan negatif keluarterlebih dahulu

(a) (b)



Nur Rohishoh

25

2.5.2.3 Kromatografi afinitas

Pemisahan protein dengan kromatografi afinitas berdasarkan interaksi

spesifik di antara makromolekul biologi dengan pasangannya, sebagai contoh

enzim dengan substrat atau inhibitor dan antibodi dengan antigen. Kromatografi

afinitas menggunakan suatu ligan alami, yang secara khusus berinteraksi dengan

protein yang diinginkan (Scopes, 1993). Ligan akan terikat secara kovalen pada

matriks. Komponen protein yang memiliki afinitas spesifik terhadap ligan akan

diserap, sedangkan komponen lainnya (protein kontaminan) yang tidak memiliki

afinitas akan terelusi terlebih dahulu.

Gambar 2.13 Kromatografi afinitas (Stryer,2002)

2.5.2.4 Kromatografi interaksi hidrofobik

Kromatografi interaksi hidrofobik banyak digunakan untuk pemisahan

protein dan peptida. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat pada

matriks melalui interaksi hidrofobik. Matriks bersifat nonpolar. Campuran protein

dimasukkan ke dalam kolom dengan buffer konsentrasi garam tinggi. Setelah

protein yang tidak terikat keluar terlebih dahulu, protein yang terikat dielusi

dengan eluen yang polaritasnya diturunkan (konsentrasi garam lebih rendah)

(O’Farrel, 1998). Kromatografi interaksi hidrofobik didasarkan pada gaya Van

Kompleks glukosa-protein menyerang residu glukosa

Penambahan glukosa

Kompleks glukosa protein dibebaskan dari adisi glukosa



Nur Rohishoh

26

Der Waals antara protein dengan ligan yang terikat fasa diam yang dipengaruhi

struktur air pada penambahan garam (Builder, 1993).

2.6 SDS – PAGE

SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-sodium dodesil sulfat

adalah teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk

memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya. Sodium

Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul

hidrofobik yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein.

Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan

merusak ikatan hidrogen (Davis et al., 1994). Metode SDS-PAGE digunakan

untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan

biologi molekuler (Boyer, 1993).

Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel

bermuatan sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen

sampel dalam gel. Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein

menggunakan SDS dan memutus ikatan disulfida pada struktur protein

menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan

memanaskan sampel. Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan

cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu. Setelah

sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga komponen

yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat

molekulnya (Davis et al., 1994).



Nur Rohishoh

27

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan

pewarna khusus. Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE

adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining. Commasie Brilliant Blue

mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt Staining

memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan proses yang lebih

lama (Boyer, 1993).

Gambar 2.14 Teknik SDS-PAGE (Stryer, 2002)

Campuran makromolekul

Elektroforesis

Pori-pori gel



Nur Rohishoh

28

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik dan Biokimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. Waktu penelitian ini dimulai

pada bulan Februari sampai dengan Juni 2012.

3.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian

3.2.1 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan adalah isolat bakteri Pseudomonas stutzeri yang

telah diisolasi dari perairan tambak yang mengalami blooming Microcystis

aeruginosa di Gresik (Masithah, 2008).

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bacto pepton, yeast

extract, K2HPO4, CaCl2, MgSO4, Na2CO3, pektin, bacto agar, NaCl, substrat

Polygalcturonic Acid (PGA-SIGMA), EDTA, HCl, NaOH, asam 3,5-

dinitrosalisilat, asam galakturonat, asam sitrat, Na2HPO4.7H2O, tris

(hidroksimetil) aminometan, Bovine Serum Albumin (BSA), Coomassie brilliant

blue G-250, etanol 96 %, asam fosfat 85%, DEAE-Toyopearl 650 M, metanol,

asam asetat glasial, glisin, akuades, ammonium sulfat, ammonium persulfat

(APS), sodium dodesil sulfat (SDS), N,N,N’,N’ tetrametil-etilendiamin

(TEMED), akrilamid, bisakrilamid, marker protein LMW.

28



Nur Rohishoh

29

3.2.3 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer 100

dan 250 ml, cawan petri, pipet mikro, autoclave (Ogawa Seiki, CO. LTD. Osk

6508), sentrifuge (Beckmann model TJ-6), shaker incubator (Heidolph Unimax

1010, Inkubator 1000), water bath (Sanyo Rikogaku-kikai), oven (Isotemp* oven

model 655F), freezer, lemari es (Sharp matric), spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu UV-1700), timbangan analitik (OHAUS), laminar air flow cabinet

(Kottermann), pH meter (Metrohm 744), tabung Eppendorf, piranti elektroforesis

Wealtec (Biorad), seperangkat alat kromatografi penukar ion, tabung selofan, dan

alat-alat gelas yang biasa dipakai di laboratorium.



Nur Rohishoh

30

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Diagram alir penelitian

Gambar 3.1 Diagram alir penelitian

Analisis :

Uji aktivitas enzim

SDS-PAGE

Pengendapan dengan

ammonium sulfat

Ekstrak kasar

enzim pektinase

Kromatografi

penukar ion

Dialisis

Kultivasi isolat bakteri Pseudomonas stutzeri

Produksi enzim pektinase dari bakteri

Pseudomonas stutzeri

Penentuan

aktivitas spesifik



Nur Rohishoh

31

3.3.2 Pembuatan media

3.3.2.1 Media padat

Media padat terdiri dari 0,2 g bacto pepton, 0,2 g yeast extract, 0,1 g

K2HPO4, 0,01 g CaCl2, 0,05 g MgSO4, 0,5 g Na2CO3, 1,0 g pektin, dan 1,5 g

bacto agar. Semua bahan dilarutkan dengan 100 ml akuades dalam labu

Erlenmeyer 250 ml. Kemudian labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan

alumunium foil lalu disterilkan dengan autoclave selama 45 menit pada suhu

121oC dan tekanan 1 atm. Setelah dikeluarkan dari autoclave campuran atau

medium ditunggu sampai suam-suam kuku, lalu medium dituang ke dasar cawan

petri dan dibiarkan sampai menjadi dingin dan memadat.

3.3.2.2 Media cair

Media cair terdiri dari 0,2 g bacto pepton, 0,2 g yeast extract, 0,1 g

K2HPO4, 0,01 g CaCl2, 0,05 g MgSO4, 0,5 g Na2CO3, dan 1,0 g pektin. Semua

bahan dilarutkan dengan 100 ml akuades dalam labu Erlenmeyer 250 ml.

Kemudian labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu

disterilkan dengan autoclave selama 45 menit pada suhu 121oC dan tekanan 1

atm.

3.3.3 Kultivasi bakteri Pseudomonas stutzeri

Bakteri Pseudomonas stutzeri asal isolat perairan tambak yang mengalami

blooming Microcystis aeruginosa di Gresik dibiakkan dalam media padat yang

mengandung pektin. Sebanyak satu ose koloni tunggal bakteri dipindahkan ke

dalam media padat kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.

Selanjutnya dilakukan pengamatan adanya daerah bening (halo) di sekitar koloni



Nur Rohishoh

32

kemudian dipilih salah satu isolat dengan daerah bening terbesar yang

menunjukkan aktivitas pektinase tertinggi. Supaya zona bening yang terbentuk

lebih jelas maka dilakukan pewarnaan pada media padat dengan Congo red.

Bidang halo akan tampak berwarna kuning bening, sedangkan media berwarna

merah kecoklatan. Selanjutnya koloni-koloni tunggal dari media pektin padat

dibuat inokulum dengan cara memasukkan isolat bakteri ke dalam 20 ml media

cair di Erlenmeyer 100 ml, diinkubasi pada suhu kamar selama 12 jam dengan

kecepatan 150 rpm.

3.3.4 Produksi enzim pektinase

Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan 1% inokulum dalam 100

ml media pektin cair dan diinkubasi dengan shaker incubator pada suhu kamar

dengan kecepatan 150 rpm. Panen dilakukan pada jam ke-12 dengan cara

sentrifugasi 6000 rpm selama 15 menit, selanjutnya supernatan yang mengandung

enzim pektinase diambil dan diuji aktivitasnya.

3.3.5 Uji aktivitas enzim pektinase

Sebanyak 100 µL ekstrak enzim ditambah 100 µL substrat (1% asam

poligalakturonat dalam buffer asetat pH 4,5) (Zheng et al., 2000), dimasukkan

dalam tabung Ependorf dan diinkubasi dalam penangas air pada 40oC selama 30

menit. Sejumlah gula pereduksi yang terbentuk diukur aktivitas enzimnya

menggunakan metode asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) yaitu dengan

menambahkan 600 µL DNS ke dalam tabung, lalu dimasukkan dalam penangas

air mendidih selama 15 menit bersama-sama dengan kontrol (mengandung 100

µL enzim ditambah 600 µL DNS dan 100 µL substrat tetapi tanpa inkubasi)



Nur Rohishoh

33

kemudian didinginkan dalam air es selama 20 menit. Selanjutnya absorbansi

diukur dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 546,5 nm dan

dihitung aktivitasnya menggunakan persamaan berikut :

Aktivitas enzim (unit/ml) =

Keterangan :

C = konsentrasi asam galakturonat

T = waktu inkubasi

Fp = faktor pengenceran

BM asam galakturonat = 274

Sebagai standar digunakan asam galakturonat masing-masing dengan

konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 mg/ml. Sebanyak 1 ml larutan standar asam

galakturonat ditambah dengan 3 ml larutan DNS dan dihomogenkan. Campuran

kemudian dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit dan didinginkan dalam

air es selama 20 menit. Selanjutnya absorbansi diukur dengan Spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 546,5 nm.

3.3.6 Penentuan kadar protein

Metode yang digunakan dalam menentukan kadar protein pada penelitian

ini yaitu metode Bradford dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumin

(BSA). Langkah awal yang dilakukan yaitu menyiapkan reagen Bradford yang

terdiri dari 50 mg Coomassie brilliant blue G-250 yang dilarutkan dalam 25 ml

etanol 96%, kemudian ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% dan diencerkan

dengan akuades sampai volume 500 ml. Analisis sampel dilakukan dengan cara

memasukkan 10 µL sampel dalam tabung Eppendorf kemudian ditambahkan



Nur Rohishoh

34

akuades sampai volume 100 µL lalu ditambahkan reagen Bradford. Blanko yang

digunakan terdiri dari 100 µL akuades dan 1 µL reagen Bradford. Setelah itu,

larutan dihomogenkan dengan vortex kemudian absorbansi dibaca menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

Standar BSA dibuat pada kisaran 100-500 µg/ml dari stok BSA dengan

kadar 1 mg/ml. Dari stok tersebut dilakukan pengenceran dengan akuades untuk

memperoleh konsentrasi yang diinginkan. Blanko yang digunakan adalah 100 µL

akuades dan 1 ml reagen Bradford. Selanjutnya absorbansi dibaca menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

3.3.7 Pemurnian enzim pektinase

Tahapan pemurnian enzim pektinase diawali dengan pemekatan

pengendapan ammonium sulfat, dialisis menggunakan tabung selofan, dan

selanjutnya dimurnikan kromatografi penukar anion menggunakan DEAE-

Toyopearl 650 M (Tosoh, Jepang). Hasil pemurnian dianalisis dengan SDS-

PAGE.

3.3.7.1 Pengendapan dengan ammonium sulfat

Tahapan awal pemurnian enzim adalah pemekatan garam. Ekstrak kasar

enzim pektinase dari bakteri Pseudomonas stutzeri dengan berbagai prosentase

kejenuhan ammonium sulfat untuk memperoleh kondisi optimum pengendapan

pektinase. Prosentase kejenuhan ammonium sulfat yang digunakan dari 40-100%.

Tabel kejenuhan ammonium sulfat yang digunakan berdasarkan Scopes (1993).

Penentuan kadar kejenuhan ammonium sulfat yang optimum terlebih dahulu

dilakukan dalam skala kecil di dalam ependorf. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar



Nur Rohishoh

35

enzim pektinase diendapkan dengan ammonium sulfat kemudian tabung dibolak-

balik hingga garam larut dalam enzim pektinase. Selanjutnya disentrifugasi

dengan kecepatan 6000 rpm pada 4oC selama 20 menit. Setelah dilakukan

sentrifugasi akan diperoleh endapan dan supernatan, endapan hasil sentrifugasi

tersebut dilarutkan dalam buffer fosfat sitrat pH 7, kemudian diuji aktivitasnya.

Setelah didapatkan kadar kejenuhan ammonium sulfat yang optimum,

pengendapan enzim pektinase dilanjutkan dalam skala besar, yaitu sebanyak 500

ml ekstrak kasar enzim pektinase dijenuhkan dengan ammonium sulfat.

Pengendapan dalam skala besar dilakukan dengan merendam ekstrak

kasar enzim pektinase dalam penangas es, selanjutnya dimasukkan sejumlah

ammonium sulfat sedikit demi sedikit secara perlahan sambil diaduk dengan

pengaduk magnetik sampai ammonium sulfat larut dalam enzim. Enzim yang

mengendap selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada 4oC

selama 20 menit. Selanjutnya endapan enzim dilarutkan dalam buffer fosfat sitrat

pH 7 hingga tepat larut, kemudian dilakukan dialisis menggunakan tabung

selofan.

3.3.7.2 Dialisis

Dialisis dilakukan dengan cara memasukkan fraksi enzim yang memiliki

aktivitas optimum ke dalam tabung selofan yang salah satu ujungnya telah

disimpul. Setelah setengah dari volume tabung terisi, maka ujung yang lain diikat.

Tabung selofan yang telah terisi larutan enzim pektinase direndam dalam larutan

0,025 M buffer Tris-HCl pH 7,5 sambil diaduk perlahan dengan pengaduk

magnetik dan setiap 2 jam dilakukan penggantian buffer. Dialisis dilakukan



Nur Rohishoh

36

sampai fraksi enzim bebas ammonium sulfat. Proses dialisis selesai apabila fraksi

enzim telah bebas dari ammonium sulfat yang ditandai dengan tidak terbentuknya

endapan putih ketika larutan buffer ditetesi larutan BaCl2 atau tidak terbentuknya

endapan coklat ketika larutan buffer ditetesi pereaksi Nessler. Setelah proses

dialisis selesai, larutan enzim dikeluarkan dari tabung selofan dan diukur

volumennya. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dan dilanjutkan dengan tahap

pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion.

3.3.7.3 Pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion

Kromatografi penukar anion dilakukan dengan memasukkan kapas

secukupnya ke dalam kolom. Sebanyak 1-2 ml matriks DEAE-Toyopearl 650 M

dalam etanol dituangkan ke dalam kolom. Selanjutnya ke dalam matriks

ditambahkan 10 ml larutan buffer Tris HCl pH 7. Sebanyak 2 ml enzim pektinase

hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom. Fraksi enzim dipisahkan dengan

mengalirkan eluen NaCl [0-1] M dalam buffer Tris HCl 7 dibuat bergradien dari

konsentrasi rendah ke tinggi dalam kolom. Selanjutnya masing-masing fraksi

diukur kadar protein dan aktivitasnya.

3.3.8 Analisis SDS-PAGE

Penentuan berat molekul enzim pektinase dilakukan dengan analisis SDS-

PAGE berdasarkan prosedur Laemmli (1970). Gel yang digunakan terdiri dari

12% separating gel dan 5% stacking gel. Ke dalam tabung Eppendorf

dimasukkan sampel (enzim 20 µL dan buffer sampel 5 µL). Campuran tersebut

dipanaskan dalam penangas air mendidih selam 5 menit. Kemudian sampel

dimasukkan ke dalam sumur stacking gel bersama-sama dengan marker protein.



Nur Rohishoh

37

Selanjutnya piranti elektroforesis Biorad dipasang, dan 800 µL buffer

elektroforesis pH 8,3 dituangkan ke dalam bejana elektroforesis. Proses

elektroforesis berlangsung lebih kurang selama 2 jam pada tegangan 80 volt.

Setelah proses elektroforesis selesai, gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan

jarak migrasi bromofenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Penampakan

pita protein dilakukan dengan merendam gel elektroforesis dalam larutan staining

yang mengandung Coomassie Blue 0,1 % selama 30 menit sambil digoyang

konstan pada mesin penggoyang. Selanjutnya untuk mengetahui posisi enzim

pektinase target dilakukan destaining yang mengandung 10% asam asetat glasial

dan 10% metanol Proses ini dilakukan sampai diperoleh pita-pita protein

berwarna biru dengan latar belakang jernih.



Nur Rohishoh

38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Produksi Enzim Pektinase dari Pseudomonas stutzeri

Bakteri Pseudomonas stutzeri yang telah telah berhasil diisolasi dari

perairan tambak di Gresik, diremajakan kembali pada media padat yang

mengandung substrat pektin. Penggunaan substrat bertujuan agar dapat

menginduksi bakteri untuk menghasilkan enzim pektinase. Bakteri yang tumbuh

merupakan bakteri yang memanfaatkan pektin sebagai sumber karbon dengan

cara mendegradasi pektin menjadi monomer-monomer asam galakturonat

(Masithah, 2008). Tujuan peremajaan ini adalah untuk menumbuhkan kembali

bakteri pada media yang baru dengan kebutuhan nutrisi yang cukup. Setelah

diperoleh beberapa isolat tunggal, dilakukan seleksi isolat bakteri yang memiliki

aktivitas pektinolitik tertinggi yang dapat dideteksi dengan adanya bidang halo

yang paling besar di sekitar koloni bakteri. Bidang halo akan tampak berwarna

bening setelah proses pewarnaan menggunakan Congo red, sedangkan media

pektin akan berwarna merah kecoklatan.

Gambar 4.1 Isolat bakteri penghasil enzim pektinase

P-1

P-2

P-3

P-4

38



Nur Rohishoh

39

Di antara keempat isolat bakteri pektinolitik pada Gambar 4.1, isolat

bakteri dengan kode P-3 memiliki diameter bidang halo terbesar yang

menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut memiliki aktivitas pektinolitik

tertinggi (Masithah, 2008). Isolat dengan bidang halo terbesar (P-3) diinokulasi

dalam media dengan penggoyangan menggunakan shaker 150 rpm pada suhu

kamar selama 12 jam. Biakan inokulum dipindahkan ke dalam media produksi

dan diinkubasi selama 12 jam dengan penggoyangan 150 rpm yang bertujuan agar

proses aerasi merata di seluruh bagian media cair sehingga bakteri dapat tumbuh

dengan baik. Enzim pektinase yang diproduksi terdapat pada bagian supernatan

hasil sentrifugasi karena enzim pektinase merupakan enzim ekstraseluler (Alkorta

et al., 1998).

(a) (b)

Gambar 4.2 Hasil isolasi enzim pektinase, sebelum disentrifugasi (a) dan sesudah disentrifugasi (b)

4.2 Uji Aktivitas Enzim Pektinase

Enzim pektinase diuji aktivitas poligalakturonasenya pada substrat asam

poligalakturonat (pektin teresterifikasi) menggunakan metode DNS. Substrat

asam poligalakturonat didegradasi oleh poligalakturonase menjadi monomer-

Supernatan(crude enzyme)

endapan



Nur Rohishoh

40

monomer asam galakturonat secara hidrolisis (Alkorta et al., 1998). Asam

galakturonat merupakan gula pereduksi yang dapat mereduksi asam 3,5-

dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat (Zheng et al.,2000). Secara

kualitatif, reaksi reduksi ini dapat dilihat dari perubahan warna campuran enzim

pektinase, substrat asam poligalakturonat, dan reagen DNS yang berwarna kuning

tua menjadi coklat tua. Reaksi yang terjadi sebagai berikut:

asam 3,5-dinitrosalisilat asam 3-amino-5-nitrosalisilat (kuning) (coklat)

Gambar 4.3 Reaksi reduksi asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat

Pada pengukuran uji aktivitas enzim digunakan kontrol yang berfungsi

sebagai pembanding banyaknya produk yang dihasilkan. Adapun komposisi

kontrol sama dengan sampel enzim, perbedaannya terletak pada urutan

penambahan komposisi dan proses inkubasi. Perlakuan pada sampel dimulai dari

penambahan enzim dan substrat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu

40oC yang bertujuan agar enzim bereaksi dengan substrat secara optimal,

selanjutnya ditambah dengan reagen DNS. Sedangkan pada kontrol, urutan

penambahan komposisinya dimulai dari enzim kemudian reagen DNS dan

terakhir substrat tanpa inkubasi. Hal ini bertujuan agar enzim tidak bereaksi

dengan substrat. Substrat yang digunakan yaitu asam poligalakturonat yang

gula pereduksiasam galakturonat

COOH

OH

NO2O2N

COOH

OH

NH2O2N



Nur Rohishoh

41

merupakan substrat spesifik untuk aktivitas poligalakturonase. Pada pembuatan

substrat asam poligalakturonat ditambahkan larutan EDTA 1 mM yang bertujuan

untuk menghambat aktivitas enzim pektat liase dan pektin liase (Yadav et al.,

2008).

Uji aktivitas enzim dengan metode DNS yaitu dengan menginkubasi

enzim yang telah ditambahkan dengan substrat selama 30 menit pada suhu 40 oC.

Selama proses ini terjadi degradsi pektin oleh poligalakturonase menjadi

monomer-monomer asam galakturonat yang merupakan salah satu jenis gula

pereduksi. Setelah penambahan reagen DNS, dilakukan pemanasan dalam air

mendidih yang bertujuan untuk mematikan enzim dan menyempurnakan reaksi

antara gula pereduksi asam galakturonat dengan reagen DNS. Banyaknya gula

pereduksi yang terbentuk diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang 546,5 nm. Satu unit aktivitas enzim pektinolitik didefinisikan

sebagai jumlah enzim yang memproduksi 1 µmol produk asam galakturonat per

satuan waktu untuk setiap ml enzim pada kondisi percobaan (Zheng et al., 2000).

Aktivitas yang terukur pada ekstrak kasar enzim sebesar 0,15513 U/ml.

4.3 Uji Kadar Protein

Penentuan kadar protein pada penelitian ini menggunakan metode

Bradford. Pemilihan metode ini dikarenakan pengerjaannya yang sangat

sederhana, cepat, sensitif, dan cukup akurat. Penentuan kadar protein ini

digunakan untuk menghitung aktivitas spesifik dari suatu protein enzim.



Nur Rohishoh

42

Beberapa reagen yang harus dipersiapkan adalah reagen Bradford dan

standar Bovine Serum Albumin (BSA). Reagen Bradford ini terdiri dari 50 mg

Coomassie brilliant blue G-250 yang dilarutkan dalam 25 ml etanol 96%,

kemudian ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% dan diencerkan dengan akuades

sampai volume 500 ml (Bollag and Edelstein, 1991). Prosedur yang dilakukan

yaitu menambahkan sampel enzim dengan reagen Bradford. Setelah

dihomogenkan dengan vortex, diukur absorbansinya dengan spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 595 nm. Pada penelitian ini, reagen Bradford

dibuat dengan menambahkan asam fosfat yang bertujuan untuk memberikan

respon yang lebih konsisten dengan protein lain dan merupakan reagen yang

stabil (Scope, 1993). Kadar protein untuk ekstrak kasar enzim pektinase

(poligalakturonase) yaitu 2,54132 mg/ml, sehingga diperoleh aktivitas spesifik

ekstrak kasar enzim pektinase (poligalakturonase) sebesar 0.06104 U/mg.

4.4 Hasil Pemurnian Enzim Pektinase

4.4.1 Hasil pengendapan enzim pektinase dengan ammonium sulfat

Enzim pektinase yang dihasilkan berupa ekstrak kasar yang merupakan

campuran dari berbagai macam protein lainnya sehingga perlu dilakukan

pemurnian untuk mendapatkan enzim yang lebih murni. Prosedur awal pemurnian

yaitu dengan mengendapkan enzim pektinase menggunakan ammonium sulfat

berdasarkan tabel Scopes (1993).

Prinsip pengendapan dengan ammonium sulfat adalah salting out. Ion-ion

dari garam ammonium sulfat sangat mempengaruhi kelarutan protein. Pada



Nur Rohishoh

43

konsentrasi rendah ion-ion garam mengeilingi molekul protein enzim dan

mencegah bersatunya molekul protein enzim sehingga protein berada dalam

keadaan larut (salting in). Pada penambahan ammonium sulfat dengan

konsentrasi tinggi, molekul air akan tertarik ke ion-ion garam sehingga molekul

air yang berinteraksi dengan protein akan berkurang. Keadaan ini mengakibatkan

terjadinya interaksi hidrofobik di antara sesama molekul protein enzim yang dapat

menurunkan kelarutan protein sehingga protein mengendap (Scopes, 1993).

Penambahan ammonium sulfat dalam ekstrak kasar enzim pektinase

dilakukan sedikit demi sedikit disertai pengadukan dengan magnetic stirrer untuk

mempercepat kelarutan ammonium sulfat dan menghomogenkan ammonium

sulfat ke seluruh bagian ekstrak kasar enzim. Proses pengadukan secara perlahan-

lahan untuk menghindari terbentuknya buih, karena pembentukan buih ini

merupakan indikasi enzim terdenaturasi (Suhartono, 1992).

Ammonium sulfat yang ditambahkan dalam ekstrak kasar enzim antara

40-100%. Hasil penelitian Masithah (2008) menyebutkan enzim pektinase

mengendap pada kejenuhan ammonium sulfat 70%. Enzim yang telah diendapkan

memiliki aktivitas pektinolitik (aktivitas spesifik) lebih besar dibandingkan

dengan ekstrak kasarnya. Hasil optimasi pengendapan enzim pektinase dengan

ammonium sulfat disajikan pada Gambar 4.4.



Nur Rohishoh

44

Gambar 4.4 Optimasi pengendapan ekstrak kasar enzim pektinase dengan ammonium sulfat

Berdasarkan hasil penelitian, enzim pektinase memiliki aktivitas optimum

pada pengendapan dengan 70% ammonium sulfat. Selanjutnya aktivitas enzim

menurun karena enzim telah jenuh dengan ammonium sulfat. Enzim pektinase

hasil pengendapan dengan amonium sulfat optimum memiliki aktivitas total

sebesar 0.09204 U/ml. Besarnya kadar protein setelah pengendapan enzim ini

sebesar 0,50964 mg/ml, sehingga diperoleh aktivitas spesifik enzim pektinase

dengan jenis poligalakturonase sebesar 0,18059 U/mg.

4.4.2 Hasil dialisis enzim pektinase

Tahap dialisis bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa garam ammonium

sulfat dari enzim agar tidak menggangu aktivitas enzim . Enzim pektinase yang

telah diendapkan dengan ammonium sulfat didialisis dalam buffer tris HCl 0,025

M pH 7,5 menggunakan tabung selofan (± 12 kD). Untuk menghindari

kontaminasi dari bahan kimia, tabung selofan terlebih dahulu direbus selama 10

menit dalam larutan yang mengandung 10 mM NaHCO3 dan 1 mM EDTA lalu

dicuci dan direbus kembali dengan akuades selama 10 menit sebanyak 2 kali.



Nur Rohishoh

45

Untuk penyimpanan, tabung selofan direndam dalam larutan EDTA dan disimpan

dalam suasana dingin (Harris dan Angal, 1993).

Pada proses dialisis, molekul berukuran lebih kecil seperti garam ataupun

ion pengganggu lainnya akan melewati pori-pori tabung selofan sampai

konsentarsi di dalam dan di luar tabung mencapai nilai yang sama dan larutan

buffer masuk ke dalam tabung menggantikan molekul kecil yang keluar (Boyer,

1993), sedangkan molekul-molekul protein yang berukuran lebih besar tertahan di

dalam tabung selofan.

Proses dialisis enzim pektinase berlangsung selama kurang lebih 10 jam di

mana setiap 2 jam sekali buffer tris HCl diganti agar tidak terjadi penumpukan

ammonium sulfat dalam buffer. Dialisis dihentikan setelah tidak ada lagi

ammonium sulfat yang keluar dari tabung selofan. Hal ini dapat diidentifikasi

dengan menambahkan beberapa tetes pereaksi Nessler pada buffer dialisis, jika

sudah tidak terbentuk endapan coklat maka proses dialisis telah selesai.

Identifikasi ammonium sulfat pada proses dialisis ini tidak menggunakan BaCl2

karena ion fosfat dari buffer fosfat sitrat yang digunkanan untuk melarutkan

enzim pektinase akan membentuk endapan putih Ba3(PO3)2. Begitu pula dengan

ion sulfat dari amonium sulfat akan membentuk endapan putih BaSO4, sehingga

reagen BaCl2 ini kurang spesifik jika digunakan untuk mengidentifikasi adanya

amonium sulfat dalam buffer selama proses dialisis.

Setelah proses dialisis, diharapkan aktivitas spesifik dari enzim pektinase

mengalami peningkatan. Berdasarkan hasil uji, diperoleh aktivitas total enzim



Nur Rohishoh

46

0,07794 U/ml, kadar protein 0,25482 mg/ml, dan aktivitas spesifik enzim

pektinase dengan jenis poligalakturonase sebesar 0,30585 U/mg.

4.4.3 Hasil pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion

Tahap pemurnian enzim pektinase selanjutnya menggunakan metode

kromatografi penukar anion. Kromatografi penukar anion digunakan untuk

memisahkan protein berdasarkan muatannya (Stryer, 2002). Seperangkat alat

kromatografi penukar ion terdiri dari kolom plastik transparan berukuran 5 ml

yang dirangkai dengan selang yang menghubungkan eluen dengan kolom. Eluen

yang digunakan adalah NaCl dalam buffer tris HCl pH 7 bergradien 0-1 M dan

matriks yang digunakan adalah DEAE-Toyopearl 650 M dalam etanol.

Preparasi kolom kromatografi penukar ion dilakukan dengan menyumbat

ujung kolom dengan kapas untuk mencegah kebocoran matriks. Matriks DEAE-

Toyopearl 650 M yang telah berada dalam kolom dikondisikan dengan

mengalirkan 5 ml buffer tris HCl pH 7, karena pada pH 7 merupakan kondisi

optimal dari enzim pektinase khususnya poligalakturonase (Pathak et al., 2000).

Enzim pektinase dalam kolom penukar ion dielusi dengan NaCl dalam buffer tris

HCl pH 7 yang dialirkan secara bergradien dari konsentrasi rendah ke tinggi.

Perbandingan volume NaCl dan buffer tris HCl yang digunakan yaitu 1:1 (Yadav

et al., 2008). NaCl 1 M dialirkan ke dalam buffer tris HCl disertai dengan

pengadukan menggunakan magnetic stirrer yang bertujuan untuk

menghomogenkan aliran gradien eluen.

Protein enzim pektinase memiliki muatan negatif, karena pH enzim

pektinase lebih besar daripada titik isoelektriknya (pI) (Pathak et al., 2000).



Nur Rohishoh

47

Enzim pektinase yang bermuatan negatif akan diselimuti oleh komponen buffer

tris HCl yang bermuatan positif (H+), sedangkan matriks DEAE yang bermuatan

positif akan diselimuti oleh komponen dari buffer yang bermuatan negatif (Cl-).

Interaksi antara enzim dan matriks DEAE akan terjadi di mana ion Cl- akan segera

digantikan posisinya oleh enzim. Ion Cl- selanjutnya akan bergabung kembali

dengan Htris+ menjadi Tris Cl yang tidak bermuatan. Peningkatan konsentrasi

Tris Cl akhirnya dapat mengusir kedudukan enzim, sehingga enzim akan terelusi

keluar kolom dengan fraksi yang berbeda-beda (Scopes, 1993). Peningkatan

konsentrasi ion dalam penelitian ini dilakukan dengan gradien NaCl 0-1 M.

Enzim pektinase yang telah dielusi, ditampung dalam botol untuk setiap 1

ml fraksi enzim yang dikeluarkan dari kolom. Fraksi enzim yang diperoleh

sebanyak 22 botol dengan hasil uji sebagai berikut :

Gambar 4.5 Profil elusi enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion

Hasil kromatografi penukar anion menunjukkan adanya 3 aktivitas enzim

pektinase. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 4.4, terdapat 3 puncak aktivitas

enzim pektinase pada fraksi fraksi ke-9, ke-14 dan ke-18. Fraksi ke-9 dan ke-14



Nur Rohishoh

48

menunjukkan aktivitas spesifik yang lebih kecil, masing-masing yaitu (0,19212

U/mg) dan (0,39517 U/mg). Hal ini dapat diartikan aktivitas enzim pektinase pada

fraksi ke-14 tidak hanya tidak hanya poligalakturonase melainkan juga enzim

pektinase jenis lainnya seperti pektin liase dan pektat liase. Sedangkan pada fraksi

ke-18 menunjukkan aktivitas spesifik yang paling tinggi (4,74208 U/mg), yang

dapat diartikan bahwa sebagian besar enzim yang bekerja pada fraksi ke-18

adalah poligalakturonase. Kemurnian poligalakturonase pada fraksi ke-18 dapat

dideteksi melalui analisis SDS-PAGE.

Berdasarkan hasil serangkaian pemurnian enzim pektinase, dapat

diinformasikan lebih lanjut melalui suatu tabel pemurnian sebagai berikut :

Tabel 4.1 Pemurnian enzim pektinase (poligalakturonase)

Tahap Pemurnian

Volume (ml)

Aktivitas Total (Unit)

Protein Total (mg)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Hasil(%)

Kemurnian

Ekstrak kasar 500 0,15513 2,54132 0,06104 100 1

Pengendapan (NH4)2SO4 70%

50 0,09204 0,50964 0,18059 59,3 2,9

Dialisis 30 0,07794 0,25482 0.30585 50,2 5,0

Kromatografi penukar anion

5 0,06532 0,01377 4,74208 42,1 77,7

Pada Tabel 4.1 diinformasikan bahwa selisih tertinggi protein yang hilang

pada setiap tahap pemurnian ditunjukkan pada saat dilakukan pengendapan enzim

dengan amonium sulfat, yaitu sekitar 40,7%. Sedangkan pada tahap dialisis dan

kromatografi penukar anion, protein yang hilang sekitar 9,1% dan 8,1%.

Banyaknya protein yang hilang setelah dilakukan pengendapan enzim dengan

amonium sulfat, dikhawatirkan masih banyak protein target yang tidak



Nur Rohishoh

49

terendapkan karena tujuan dari pengendapan enzim ini yaitu memekatkan enzim

dan memisahkanya dari molekul air (Scopes, 1993). Hal ini menunjukkan bahwa

pengendapan enzim dengan amonium sulfat yang dilakukan pada satu titik

kejenuhan yang dalam penelitian ini hanya dilakukan pada kejenuhan 70% belum

memberikan hasil yang maksimal, sehingga perlu dilakukan fraksinasi enzim

pektinase dengan amonium sulfat pada range kejenuhan tertentu untuk

mendapatkan hasil pengendapan enzim dengan persentase yang lebih besar.

Berdasarkan hasil pemurnian enzim dengan kromatografi penukar anion,

diperoleh tingkat kemurnian enzim yang cukup tinggi yaitu 77,7 kali lebih murni

dibandingkan dengan ekstrak kasarnya, sedangkan hasil pemurnian yang

diperoleh sebesar 42,1%. Hasil pemurnian ini menunjukkan protein enzim

pektinase telah terpisah dengan baik dari beberapa protein maupun kontaminan

lainnya, walaupun kadar protein yang diperoleh cukup rendah dan masih

dimungkinkan terdapat kontaminan yang belum terpisah dari protein enzim

pektinase.

4.5 Hasil Analisis SDS-PAGE

Hasil pemurnian enzim pektinase dapat dikonfirmasi melalui analisis

SDS-PAGE untuk mengetahui seberapa murni enzim pektinase yang diperoleh

berdasarkan data kualitatif yang ditunjukkan oleh hasil SDS-PAGE. Selain itu,

hasil SDS-PAGE juga dapat digunakan untuk menentukan berat molekul dari

protein enzim pektinase.



Nur Rohishoh

50

Pada pembuatan gel SDS-PAGE baik stacking gel 5% maupun separating

gel 12%, ditambahkan ammonium persulfat yang berfungsi sebagai inisiator

polimerisasi dan TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylen-ethylendiamine) yang

berfungsi sebagai katalis untuk mempercepat pembentukan radikal SO4 (Janson,

1998). Sedangkan perlakuan terhadap sampel yaitu dengan menambahkan sampel

buffer disertai dengan pemanasan untuk proses denaturasi. Sampel buffer

mengandung beta-merkaptoetanol yang berperan untuk merusak struktur tiga

dimensi protein dengan cara memecah ikatan disulfida yang tereduksi menjadi

gugus sulfhidril. Adanya gliserol dalam buffer sampel berfungsi untuk

meningkatkan berat jenis larutan sampel sehingga dapat masuk dengan mudah

ketika diinjeksikan ke dalam sumur gel. Buffer sampel juga mengandung pewarna

bromophenol blue yang berfungsi untuk membantu memonitor jalannya

elektroforesis (Wilson dan Walker, 2000)

Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu pemisahan protein berdasarkan ukuran

molekulnya. SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan deterjen ionik yang terdiri

dari gugus hidrofobik yang kuat (suatu lipid) dan gugus yang sangat hidrofilik

(gugus sulfat). Ujung hidrofobik SDS akan berinteraksi dengan asam amino

hidrofobik suatu protein dan merusak struktur tersier protein menjadi linear

sehingga pemisahan protein terjadi karena perbedaan berat molekul. Ujung

hidrofilik SDS (gugus sulfat) yang bermuatan negatif akan mengelilingi protein

dan membentuk komplek yang mengandung muatan negatif sehingga dapat

dipisahkan dalam gel poliakrilamid dengan adanya aliran listrik (Boyer, 1993).



Nur Rohishoh

51

Pergerakan protein dalam medan listrik hanya didasarkan pada ukuran

molekul protein. Protein yang berukuran kecil akan bergerak lebih cepat

dibandingkan dengan protein yang berukuran lebih besar. Massa molekul relatif

(Mr) protein dapat diukur menggunakan protein standar (marker protein) yang

yang telah diketahui Mr-nya dengan cara membandingkan nilai mobilitas relatif

(Rf). Rf protein merupakan perbandingan jarak antara titik awal ke pita protein

dengan jarak titik awal ke titik akhir elektroforesis (Wilson dan Walker, 2000).

Marker protein yang digunakan yaitu LMW standard yang dapat mendeteksi berat

molekul suatu protein antara 14,4-97,0 kDa.

Gambar 4.6 Hasil analisis SDS-PAGE; marker protein (M), ekstrak kasar enzim (CE), pengendapan dengan ammonium sulfat (AS), dialisis (D), dan fraksi ke-18 kromatografi penukar anion

Berdasarkan hasil SDS-PAGE, sumur 1 merupakan marker protein yang

sudah diketahui berat molekulnya sekitar 20,1-97,0 kDa. Pada sumur 2

merupakan ekstrak kasar enzim pektinase yang diisolasi dari bakteri

Pseudomonas stutzeri., terlihat banyak pita-pita protein yang belum terpisah

97,0 kDa

66,0 kDa

45,0 kDa

30,0 kDa

20,1 kDa

M

2 pita protein

21 3 4 5CE AS D F-18



Nur Rohishoh

52

dengan jelas (smear). Hal ini mengindikasikan dalam ekstrak kasar pektinase

masih terdapat berbagai macam protein kontaminan. Sumur 3 merupakan hasil

pengendapan enzim dengan ammonium sulfat 70% yang dilanjutkan dengan hasil

dialisis pada sumur 4. Pada sumur 2 pita protein terlihat tidak jelas sedangkan

pada sumur 3 terdapat sekitar 4 pita protein dari hasil dialisis. Hasil pemurnian

dengan kolom penukar anion pada fraksi ke-18 pada sumur 5 memperlihatkan dua

buah pita protein yang saling berdekatan dengan berat molekul relatif (Mr)

masing-masing pita sekitar 44,95 kDa dan 46,73 kDa. Dua pita protein yang

diperoleh ini diduga sebagai pita-pita protein dari enzim pektinase

(poligalakturonase) karena jaraknya yang sangat berdekatan, sehingga dapat

diartikan enzim pektinase (poligalakturonase) merupakan isozim, yaitu enzim

yang mengkatalisisi reaksi metabolisme yang sama tetapi mempunyai sifat,

ukuran dan bentuk molekul yang beragam (polimorfik) dalam suatu organisme

atau spesies (Micales and Bonde, 1995).

Berat molekul relatif (Mr) enzim pektinase khususnya poligalakturonase

berada pada kisaran 38-79 kDa (Tari et al., 2008), sehingga Mr dari kedua pita

protein hasil analisis SDS-PAGE (44,95 kDa dan 46,73 kDa) sesuai dengan

literatur dan merupakan Mr enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri

Pseudomonas stutzeri.



Nur Rohishoh

53

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :

1. Tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri

Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan serangkaian tahap pemurnian sebesar

77,7 kali lebih murni dibandingkan ekstrak kasarnya.

2. Berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari Pseudomonas stutzeri

yaitu sekitar 44,95 kDa dan 46,73 kDa.

5.2 Saran

Penelitian selanjutnya perlu dilakukan fraksinasi enzim dengan

ammonium sulfat pada range kejenuhan tertentu untuk mendapatkan hasil

pengendapan enzim yang maksimal. Tahap pemurnian enzim dapat dilanjutkan

menggunakan kromatografi kolom lainnya (kromatografi filtrasi gel, kromatografi

afinitas, kromatografi interaksi hidrofobik). Selain itu, perlu juga dilakukan

analisis zimogram untuk mendapatkan hasil pemisahan protein enzim yang yang

lebih baik.

53



Nur Rohishoh

54

DAFTAR PUSTAKA

Alkorta, I., Garbisu, C., Llama, M.J., and Serra, J.L., 1998, Industrial Application of Pektin Enzymes: A Review, Process Biochemistry, 33: 21-28.

Boyer, RF., 1993, Modern Experimental Biochemistry, Jilid 2, The Benjamin/Cummings PCI, California.

Bollag, D.M. and Edelstein, S.J., 1991, Protein Methods, Willey-liss, New York.

Builder, E., 1993, Hydrophobic Interaction Chromatography : Principles and Methods, Amersham Bioscience, San Fransisco.

Davis, L., Kuehl, M., and Battey, M., 1994, Basic Methods: Molecular Biology, Jilid 2, Appletn & Lange, Norwola.

Debing, J., Peijun, L., Stagnitti, F., Xianzhe, X., and Li, L., 2006, Pectinase Production by Solid Fermentation from Aspergillus niger by a New Prescription Experiment, Ecotoxicology and Environmental Safety, 64: 244-250.

Fawole, O.B. and Odunfa, S.A., 2003, Some Factors Affecting Production of Pectic Enzymes by Aspergillus niger, International Biodeterioration & Biodegradation, 52: 223-227.

Harris, E.L.V., 1989, Concentration of The Extract, di dalam Harris E.L.V., Angal S, Editor Protein Purufication Methods, A Pratical Approach, IRL PC, Oxford.

Harris, E.L.V. and Angal, S, 1993, Protein Purification Methods, A Pratical Approach, IRL Press, Oxford.

Herlina, M.S., 2010, Isolasi Bakteri Indigen Sebagai Pendegradasi Bahan Organik Pada Pembenihan Ikan Lele Dumbo Sistem Resirkulasi Tertutup, Skripsi, Fakultas Perikanan Dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya.

Jacob, N., Poorna, C.A., and Prema, P., 2008, Purification and Partial Characterization of Polygalacturonase from Streptomyces lydicus, Bioresource Technology, 99: 6697-6701.

Janson, J.C., L.Ryden, 2008, Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and Application, Second Edition, John Wiley and Sons, Inc : Canada.

54



Nur Rohishoh

55

Kobayashi, T., Hatada, Y., Suzumatsu, A., Saeki, K., Hakamada, Y., and Ito, S., 2000, Highly Alkaline Pectat Lyase Pel-4A from Alkaliphilic Bacillus sp. Strain P-4-N: Its Catalytic Properties and Deduced Amino Acid Sequence, Extremophiles, 4: 377-383.

Lehninger, A. L., 1993, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid 1, terjemahan Maggy Thenawijaya, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Laemmli, U.K., 1970, Cleavage of Structural Proteins during The Assembly of The Head of Bacteriophage T4, Nature, London 227 : 680-685.

Masithah, E.D., 2008, Potensi Bakteri Pektinolitik Sebagai Kandidat Pengendali Blooming Microcystis aeruginosa, Disertasi, Program Pascasarjana, Universitas Airlangga, Surabaya.

Mayans, O., Scott, M., Connerton, I., Gravesen, T., Benen, J., Visser, J., pickersgill, R., and Jenkins, J.,1997, Two Crystal Structures of Pektin Lyase A from Aspergillus Reveal a pH Driven Conformational Change and Striking Divergence in the Substrate-binding Clefts of Pektin and Pectate Lyases, Research Article, 5 (5): 677-689.

Micales, J.A. and Bonde, M.R., 1995, Isozymes: Methods and Applications, di dalam: Singh RP, Singh US, Editors Molecular Methods in Plant Pathology, CRC Press-Lewis Publishers, Boca Raton.

Nussinovitch, 1997, Hydrocolloid Aplications Gum Technology in The Food and Other Industries, Blackie Academic and Profesional, London.

O’Farrel, P.A., 1998, Hydrophobic Interaction Chromatography, di dalam Repley R. and Walker JM., Molecular Biomethods Handbook, Humana Pr, Totowa.

Ortega, N., de Diego, S., Perez-Mateos, M., and Busto, M.D., 2004, Kinetic Properties and Thermal Behaviour of Polygalacturonase Used in Fruit Juice Clarification, Food Chemistry, Burgos 88: 209-217.

Ottoway, J.H., Apps, D.K., 1984, Biochemistry, Edisi ke-4, ELBS, Cambridge.

Pathak, N., Mishra, S., and Sanwal, G.G., 2000, Purification and Characterization of Polygalacturonase from Banana Fruit, Phytochemistry, 54 : 147-152.

Pelczar, M.J. dan Chan, E.C.S., 2007, Dasar-dasar Mikrobiologi, Jilid I, Penerjemah Hadiutomo, R.S., Imas, T., Tjitrosomo, S.S., dan Angka, S.L., UI-Press, Jakarta.



Nur Rohishoh

56

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Purwani, N.N., 2006, Pemurnian Parsial Enzim Xilanase Asal Isolat Sumber Air Panas Pacet, Jawa Timur, Skripsi, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Quiroga, E.N., Sgariglia, M.A.., Molina, C.F., Sampietro, D.A., Soberon, J.R., and Vattuone. M.A., 2009, Purification and Characterization of an Exo-polygalacturonase from Pycnoporus sanguineus, Mycological Research, 113: 1404-1410.

Rahardja, S.B., 2010, Efektifitas Bakteri Pseudomonas Sebagai Pengurai Bahan Organik (Protein, Karbohidrat, Lemak) pada Media Air Limbah Pembenihan Ikan Lele Dumbo (Clarias sp.) Sistem Sirkulasi Tertutup, Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya.

Rani, H.C., 2009, Pemisahan Dan Pemurnian Kompleks Enzim Selulase Dari Bakteri Acidothermus cellulolitycus, Skripsi, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Scopes, R.K., 1993, Protein Purification Principle and Practice, Edisi Ke-3, Springer Verlag, New York.

Shen, Z., Reese, J.C., and Reeck, G.R., 1996, Purification and Characterization of Polygalacturonase from the Rice Weevil, Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae), Insect Biochemistry Molecular Biology, 26(5): 427-433.

Stanbury, P.F. and Whitaker, A., 1995, Principles of Fermentation Technology,Edisi Ke-2, Elsevier Science, Ltd., Oxford.

Stryer, L., Tymoczko, J.L., and Berg, J.M. 2002, Biochemisty, Fifth Edition, W.H. Freeman, New York.

Suhartono, M.T., 1992, Enzim dan Bioteknologi, PAU IPB, Bogor.

Tari, C., Dogan, N., and Gogus, N., 2008, Biochemical and Thermal Characterization of Crude Exo-polygalacturonase Produced by Aspergillus sojae, Food Chemistry, 111: 824-829.

Van Niel, C.B., and Allen, B.M., 1995, A Note on Pseudomonas stutzeri, Journal of Bacteriology, 64 : 413-422.

Wilson, K., and Walker, J., 2000, Principles and Techniques of Practical Biochemistry 5th Edition, Cambridge University Press, Cambridge.



Nur Rohishoh

57

Winarno, F.G., Fardias, S., 1990, Biofermentasi dan Biosintesa Protein, Edisi X, Penerbit Angkasa, Bandung.

Zheng, Z., and Shetty, K., 2000, Solid State Production of Polygalacturonase by Lentinus edodes Using Fruit Processing Wastes, Process Biochemistry, 35 : 825-830.

Yadav, S., Pramod, K.Y., Dinesh, Y., and Kapil, D.S., 2008, Purification and Characterization of An Alkaline Pectin Lyase from Aspergillus flavus, Process Biochemistry, 43 : (547-552).



Nur Rohishoh

LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan reagen

Larutan buffer fosfat sitrat

Larutan stok A asam sitrat 0,1 M dibuat dengan cara menimbang 1,921 gram

asam sitrat lalu dilarutkan dengan akuades dan diencerkan dalam labu ukur 100

mL hingga tanda batas. Larutan stok B Na2HPO4.7H2O 0,2 M dibuat dengan cara

menimbang 5,365 gram lalu dilarutkan dengan akuades dan diencerkan dalam

labu ukur 100 mL hingga tanda batas. Sebanyak X ml larutan A ditambah Y ml

larutan B kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume 100 ml.

X Y pH24,3 25,7 517,9 32,1 66,5 43,6 7

Larutan asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS)

Ditimbang dengan teliti 1 gram NaOH dilarutkan dengan 60 ml akuades,

ditambahkan 18,2 gram garam Rochelle, 1 gram asam dinitrosalisilat

(ditambahkan pelan-pelan sambil diaduk dengan magnetic stirrer), 0,2 gram fenol

dan 0,05 gram natrium sulfit. Lalu dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu

ukur 100 ml, diencerkan sampai tanda batas dan dikocok sampai homogen.

Larutan NaCl 1 M

Ditimbang sebanyak 5,85 gram NaCl kemudian dilarutkan dengan sedikit

akuades, kemudian dituang secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 ml, dan

diencerkan dengan akuades hingga tanda batas serta dikocok sampai homogen.



Nur Rohishoh

produksi dan pemurnian enzim pektinase …repository.unair.ac.id/25746/1/rohishoh, nur.pdf ·...

Documents