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ESCUELA PROFESIONAL: INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ALUMNOS :
ALTAMIRANO OLANO, JHOANA
CARRASCO CARRANZA, CARLOS
MIJAHUANCA CAJUSOL, YUDY
MORI INGA, RAQUEL
QUESQUEN SOLIS, ROBERTO
VIDAURRE TEJADA, ÉDGAR
DOCENTE : ING. VILLA CAJAVILCA, HÉCTOR LORENZO.
CURSO : ANALISIS DE LOS ALIMENTOS
PRACTICA N°4
“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA
BRUTA POR EL MÉTODO SEMI-
MICROKEJLDAHL EN LECHE”
PRACTICA N°4
“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA BRUTA POR EL MÉTODO SEMI-MICROKEJLDAHL”
I. INTRODUCCIÓN
El método Micro Kjeldahl ahora abarca la leche de otras especies, así como los
productos lácteos que son objeto de comercio internacional y están regulados por
las normas del Codex. La norma estándar ISO 8968-1:2014 (IDF 20-1:2014)
confirma el papel crucial del método Kjeldahl en la armonización del comercio, y
aumenta las garantías de protección de los consumidores.
El método micro Kjeldahl juega un papel fundamental en el comercio nacional e
internacional, por ejemplo, en el cálculo de los pagos justos de la leche a los
productores de leche, el control de procesos de fabricación y el control
reglamentario.
"Esta norma trata sobre la determinación de uno de los principales componentes
de la leche y los productos lácteos, de hecho, el componente que representa más
del 50% del valor de mercado de la leche", dijo el Dr. Harrie van den Bijgaart,
presidente del comité técnico de la ISO sobre la leche y los productos lácteos.
Esto, combinado con el hecho de que sólo se han llevado a cabo estudios de
colaboración internacional con el método para la leche entera de vaca líquida
hasta el momento, ilustra la necesidad de validar el método para productos
distintos de la leche entera de vaca.
El método Kjeldahl podrá ser aplicado a un amplio rango de productos:
"Los expertos de las FDI y de la ISO han modificado y validado científicamente,
con éxito, el método para poderlo aplicar a una amplia gama de productos
lácteos", dijo el Dr. Jaap Evers, presidente de IDF Methods Standards Steering
Group. Además de la leche entera de vaca, el método puede ahora ser aplicado a
la leche de vaca con un contenido reducido de grasa, el queso, la leche en polvo y
los productos lácteos en polvo, incluyendo los preparados para lactantes a base
de leche, el concentrado de proteína de leche, el concentrado de proteína de
suero de leche, la caseína.
II. OBJETIVOS
Determinar el % de acidez de la leche
Desarrollar el procedimiento del análisis de proteínas con el método de
micro Kjeldahl.
Determinar el % de proteína que posee la leche evaporada gloria.
Realizar cálculos con los resultados respectivamente del proceso realizado.
III. MARCO TEÓRICO
1. MÉTODO MICRO KJELDAHL
ANTECEDENTES
Para la determinación de proteínas en
muestras de alimentos se cuenta con una
gran variedad de métodos, basados en
diferentes principios. Existen aquellos en
los que se cuantifica el nitrógeno de las
muestras y por medio de factores de
conversión se conoce el contenido de
proteína. Tal es el caso del análisis
elemental, en el que se produce una
descomposición de la muestra en sus
elementos químicos principales; a este
grupo pertenece el método de Micro-Kjeldahl, uno de los métodos más
aceptados para la determinación de proteína en los alimentos. El contenido
de nitrógeno puede convertirse fácilmente a proteína utilizando un factor de
conversión.
En este método, el nitrógeno proteico se convierte a (NH4)2SO4 por medio
de una digestión con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores, el
digerido se neutraliza con NaOH concentrado, el amonio formado se destila
y se recibe en una solución de H3, para posteriormente cuantificar el
nitrógeno presente en la muestra a través de una titulación. Para el cálculo
de la proteína en la muestra se utilizan factores de conversión de nitrógeno
a proteína. El método micro-Kjeldahl es una adaptación del método de
Kjeldahl enfocado al uso de menores cantidades de reactivos y solventes.
HISTORIA
Desde 1883 en que John Kjeldahl presentó sus trabajos, su método ha
ganado una gran aceptación y se aplica en una amplia variedad de trabajos
para los análisis de alimentos, bebidas, piensos, grano, carnes, aguas
residuales, suelos para cultivos y otros.
Hoy por hoy es el método más usado para el análisis de proteínas y se
efectúa mediante la determinación de nitrógeno orgánico. Esto es así
porque los diferentes tipos de proteínas coinciden todas ellas en una
proporción similar de dicho nitrógeno orgánico. En la mayoría de los casos
de utiliza el factor de cálculo siguiente:
En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de
los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de
catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte en sulfato de amonio
mediante la digestión. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se
destila. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones
de borato así formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el
nitrógeno contenido en la muestra.
En general, el método Micro-Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar
mediante equipos no muy sofisticados y puede ser realizado por técnicos
poco experimentados.
RECONOCIMIENTO
Contenido de proteínas = Contenido de nitrógeno orgánico x 6.25
El método Micro-Kjeldahl ha sido reconocido oficialmente por un gran
número de entidades oficiales y asociaciones como por ejemplo: la AOAC
Internacional, EPA, AACC, AOCS, ISO, USDA y otras.
PROCEDIMIENTO
El método consta de tres etapas: DIGESTIÓN – DESTILACIÓN –
TITULACIÓN.
En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que
contienen las muestras orgánicas utilizando una solución de ácido
concentrado. Esto se obtiene haciendo hervir la muestra en una
concentración de ácido sulfúrico. El resultado es una solución de sulfato de
amonio.
En la etapa de DESTILACIÓN se
libera amoniaco, el cual es retenido
en una solución con una cantidad
conocida de ácido bórico.
Inicialmente se realiza una
destilación con vapor por el método
de arrastre de vapor de agua,
mediante la cual acelera la obtención
del destilado.
Al final, se utiliza la TITULACIÓN
para valorar finalmente la cantidad de
amonio presente en la muestra
destilada.
PROCESO DE DIGESTIÓN
Una serie de condiciones interrelacionadas en el proceso de digestión
determinan la velocidad de la reacción y de la descomposición de nitrógeno
en sulfato de amonio, como son la cantidad de calor transferida, la cantidad
de sales para elevar la temperatura de ebullición del ácido, el catalizador
empleado y el tiempo de la digestión. El ajuste de cualquiera de estos
parámetros tiene influencia sobre el resto. Hay estudios que determinan los
parámetros para obtener las condiciones óptimas dependiendo de la matriz
de las muestras. Por ejemplo, la cantidad de ácido necesario varía
dependiendo de la grasa que contiene la muestra. A más grasa, más ácido
se requiere. También varía con el tiempo de la digestión. A mayor tiempo,
más ácido perdido por evaporación.
El tiempo de digestión debe determinarse dependiendo de la cantidad de
recuperación mediante la utilización de muestras de matriz conocida.
La adición de sales es útil para elevar la temperatura de ebullición del
H2SO4. Dependiendo del tipo de sales empleadas, la temperatura puede
pasar de ser de 330ºC estando el ácido sulfúrico sólo, a una de 400ºC, con
lo que se acelera el ritmo de la descomposición y se acorta el tiempo de la
digestión de forma considerable.
Para realizar la digestión, suele utilizarse un bloque calefactor construido
en aluminio, rodeado de una gruesa capa de aislante térmico y montado en
una estructura de acero inoxidable. Hay distintos tamaños de bloque para
6, 12 y 20 muestras. El elemento calefactor es una resistencia eléctrica de
alta potencia la cual se controla desde un equipo electrónico que incorpora
un microprocesador el cual permite al usuario elegir y memorizar varios
programas de trabajo con rampas y tiempos totalmente programables.
Dicha capacidad de programación consigue optimizar las digestiones de
acuerdo con el material empleado.
Reacción:
PROCESO DE DESTILACIÓN
El producto de la digestión suele ser diluido con agua libre
de amoniaco para minimizar los efectos de las mezclas que
contienen altas proporciones acido/sales.
La mayor parte del NH3 es destilado y atrapado en la
solución ácida durante los primeros 5 a 10 minutos de
ebullición, pero dependiendo del volumen de la mezcla de la
digestión y del método seguido entre 20 y 140ml de
condensado puede ser recogido para obtener una completa
recolección del nitrógeno. A veces se requiere alargar la destilación, lo cual
produce mayor cantidad de agua pero esto no hace variar los resultados a la hora
de hacer la valoración.
La velocidad de la destilación varía con la capacidad de enfriamiento del
condensador y con la capacidad de generar calor del calefactor. El sistema de
calentar por arrastre de vapor de agua acelera la obtención del destilado.
Utilizando una solución receptora a base de ácido bórico no se necesita dosificar
con precisión, ya que la titulación mide exactamente la cantidad de amoniaco
neutralizando a 1:1 el complejo formado por el amoniaco y el ácido bórico. De
hecho, se puede añadir bastante bórico con el fin de asegurar la completa
absorción del amoníaco. La solución receptora debe permanecer a 45ºC para
evitar la pérdida de amoniaco.
Reacción:
PROCESO DE TITULACION
El análisis volumétrico es un método utilizado
para la determinación de cantidades de
sustancias que componen una muestra,
mediante una operación llamada titulación. La
reacción puede ser ácido-base, oxidación-
reducción o formación de complejos. Es de
gran importancia reconocer los diferentes
reactivos ya que de esta manera seremos
capaces de reconocer las diferentes
sustancias que se producen.
El destilado se titula con Ácido clorhídrico al 0.05 N y con el indicador verde de
bromocresol hasta el viraje a rojo grosella. La titulación es el método por el cual se
determina una cantidad desconocida de una sustancia particular, mediante la
adición de un reactivo estándar que reacciona con ella en proporción definida y
conocida.
Como consecuencia, conociendo la proporción en que reaccionan las sustancias y
teniendo determinada la cantidad de una sustancia (el reactivo titulado) necesaria
para reaccionar en esta proporción, se puede calcular fácilmente la cantidad
desconocida de sustancia presente en el frasco de reacción.
En una titulación, el punto en que la cantidad de reactivo titulado adicionado es
exactamente suficiente para que se combine en una proporción estequiométrica, o
empíricamente reproducible con la sustancia que se determina, se llama punto de
equivalencia.
Las titulaciones se realizan casi siempre con soluciones o disoluciones, sin
embargo también es fácil realizarlas con sustancias en los estados gaseosos,
sólido y de fusión, si se dispone de equipo adecuado.
Reacción:
CÁLCULOS
Al hacer los cálculos hay que tener en cuenta la solución receptora y los factores
de dilución utilizados en proceso de destilación. Se pueden tomar referencias en
los métodos de referencia publicados.
• Realizar el cálculo:
mg N = N x V x 14
Dónde:
N = Normalidad del ácido de valoración
V = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.
• Para pasar ha contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la
naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto)
• Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.
% Proteínas = P2/P0 x 100 x F
Dónde:
P2: Nitrógeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor proteínico.(6.25 por defecto)
*Instrumentación recomendada por organismos internacionales:
1- EL EQUIPO MÁS RECOMENDADO PARA EL PROCESO DE DIGESTIÓN ES: LA UNIDAD DE DIGESTIÓN “BLOC-DIGEST”
Características:
Menor manipulación de las muestras.
Calentamiento uniforme del bloque de aluminio.
Rango de temperatura de 45 a 450 ºC.
Memoria para 20 programas de 4 pasos.
Tiempo máximo por paso: 600 minutos.
Indicación acústica de fin de programa de digestión.
Alarma de rotura del sensor de temperatura.
Control independiente de temperatura.
Se incluye en la unidad de digestión un CD con el Software. El software, facilita la
edición de programas de digestión y permite realizar un seguimiento y registro de
la temperatura del digestor.
2- LOS EQUIPOS MÁS RECOMENDADOS PARA EL PROCESO DE DESTILACIÓN ES: EL DESTILADOR MICRO- KJELDAHL “PRONITRO M” Y “PRONITRO S”
El Pronitro M es un Kjeldahl con un grado de automatización que proporciona
una operación sencilla y segura. Adecuado para un laboratorio con un volumen
de muestras pequeño o medio.
Características:
Unidad de destilación por arrastre de vapor.
Generador de vapor compacto con termostato de seguridad de sobre
temperatura y presostato de protección contra sobrepresión.
Puerta de seguridad para impedir la destilación con la puerta abierta.
Detección de presencia del tubo de digestión/destilación. Este dispositivo
impide la dosificación de NaOH si no hay tubo.
Adaptador universal para tubos de digestión/destilación MACRO (Ø 42 mm)
y MICRO (Ø 26 mm).
Los depósitos de H2O y NaOH se alojan en el interior del equipo, lo que
ahorra espacio en el laboratorio.
Bastidor de acero inoxidable y frontal de plástico ABS.
Kit de adaptación a valorador automático.
Especificaciones:
Rango de medición: de 0,2 a 200 mg de Nitrógeno micro-Kjeldahl.
Tiempo de destilación programable.
Recuperación de Nitrógeno: > 99,5%.
Velocidad de destilación: de 35 a 40 ml/minuto.
Duración típica de una destilación: de 7 a 10 minutos.
Consumo de agua de refrigeración: de 80 a 100 litros/h.
Consumo de agua del generador de vapor: 2,5 litros/h.
Capacidad del depósito de agua para el generador de vapor: 6 litros.
Capacidad del depósito de NaOH: 2 litros.
IV. MATERIALES
A. Muestra
LECHE EVAPORADA GLORIA:
Es un lácteo que se ofrece enlatado y que
soporta grandes periodos de almacenamiento
debido a los procesos de deshidratación
realizados a la leche cruda, a los que se les ha
quitado cerca de un 60% del agua existente en
la leche.
Su aspecto concentrado difiere de la leche
condensada, aunque también se las denomina
indistintamente por su similitud esencial, si bien esta última posee
agregado de azúcar con el objeto de inhibir el crecimiento
bacteriano, mientras que la leche evaporada no contiene azúcar.
B. EQUIPOS
SOPORTE UNIVERSAL:
Es una pieza del equipamiento de laboratorio
donde se sujetan las pinzas de laboratorio,
mediante dobles nueces. Sirve para sujetar tubos
de ensayo, buretas, embudos de filtración, criba de
decantación o embudos de decantación, etc.
También se emplea para montar aparatos de
destilación y otros equipos similares más
complejos.
Está conformado por una base o pie rectangular, el cual permite
soportar una varilla cilíndrica que permite sujetar diferentes
materiales con ayuda de dobles nueces y pinzas.
BURETA:
Las buretas son recipientes de forma
alargada, graduadas, tubulares de diámetro
interno uniforme, dependiendo del volumen,
de décimas de mililitro o menos. Su uso
principal se da entre su uso volumétrico,
debido a la necesidad de medir con precisión
volúmenes de masa y de líquido invariables.
MATRAZ DE 250 ML:
El matraz de Erlenmeyer es uno de los frascos
de vidrio más ampliamente utilizados en
laboratorios de Química.
Se utiliza para el armado de aparatos de
destilación o para hacer reaccionar sustancias
que necesitan un largo calentamiento.
También sirve para contener líquidos que
deben ser conservados durante mucho
tiempo.
UN VASO DE PRECIPITADO:
Es un recipiente cilíndrico de vidrio borosilicado
fino que se utiliza muy comúnmente en el
laboratorio, sobre todo, para preparar o calentar
sustancias y traspasar líquidos. Son cilíndricos
con un fondo plano; se les encuentra de varias capacidades, desde
1 ml hasta de varios litros.
PIPETA:
La pipeta es un instrumento volumétrico de
laboratorio que permite medir la alícuota de
un líquido con bastante precisión. Suelen ser
de vidrio.
Está formada por un tubo transparente que
termina en una de sus puntas de forma
cónica, y tiene una graduación (una serie de
marcas grabadas) con la que se indican
distintos volúmenes.
C. REACTIVOS:
FENOLFTALEINA:
Es un indicador de pH que en disoluciones
ácidas permanece incoloro, pero en
presencia de disoluciones básicas toma un
color rosado con un punto de viraje entre
pH=8,2 (incoloro) a pH=10 (magenta o
rosado).
Sin embargo en pH extremos (muy ácidos o
básicos) presenta otros virajes de coloración;
en la cual la fenolftaleína en disoluciones
fuertemente básicas se torna incolora,
mientras que en disoluciones fuertemente
ácidas se torna naranja.
FORMOL:
El formol se obtiene por oxidación catalítica
del alcohol metílico. A temperatura normal es
un gas incoloro de olor penetrante. Son sus
disoluciones acuosas las que se conocen
como formol, que es un líquido incoloro de
olor penetrante y sofocante. El formaldehído
se disuelve en agua (400 L de gas / L de
agua a 20 ºC).
El formaldehído es uno de los compuestos
orgánicos básicos más utilizados por la
industria química, dado su gran poder
antiséptico, desinfectante y conservante.
ÁCIDO SULFÚRICO:
Es un compuesto químico extremadamente
corrosivo cuya fórmula es H2SO4.
Generalmente se obtiene a partir de dióxido
de azufre, por oxidación con óxidos de
nitrógeno en disolución acuosa.
Normalmente después se llevan a cabo
procesos para conseguir una mayor
concentración del ácido.
La molécula presenta una estructura
piramidal, con el átomo de azufre en el centro
y los cuatro átomos de oxígeno en los
vértices. Los dos átomos de hidrógeno están unidos a los átomos
de oxígeno no unidos por enlace doble al azufre
HIDRÓXIDO DE SODIO:
Es una disolución acuosa del gas cloruro de
hidrógeno (HCl). Es muy corrosivo y ácido.
Se emplea comúnmente como reactivo
químico y se trata de un ácido fuerte que se
disocia completamente en disolución
acuosa.
Una disolución concentrada de ácido
clorhídrico tiene un pH inferior a 1; una
disolución de HCl 0,1 M da un pH de 1 (Con
40 mL es suficiente para matar a un ser
humano, en un litro de agua. Al disminuir el
pH provoca la muerte de todo el
microbioma gastrointestinal, además de la
destrucción de los tejidos gastrointestinales).
V. PROCEDIMIENTO
1) “DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN LECHE CON EL MÉTODO DE
KJELDAHL”
Colocamos 20 ml de leche en una probeta,
seguidamente vaciamos la leche en dos
matraces de Erlenmeyer de 250ml de capacidad.
Se pone agua destilada en la bureta para desinfectarla,
seguidamente se le pone a la bureta ácido clorhídrico.
Después en un matraz de 250 ml de
capacidad con muestra de leche se añade 3
gotas de fenolftaleína y vamos a empezar a titular.
Una vez que ha virado a un color ligeramente rosado ya se puede
ver el gasto de ácido clorhídrico que fue de 11.6 ml.
Primero vamos a determinar la acidez de la leche y poder saber su
acidez, aplicamos la fórmula establecida.
Seguidamente vamos a determinar el porcentaje de proteínas en la
leche donde agregamos en el matraz de 250 ml, 4ml de formol
neutro.
% ACIDEZ=0.090 x0.1 x11.620
x100
%ACIDEZ=0.522
Después hemos vuelto a titular porque volvió a su color normal,
una vez que ha virado obtenemos un gasto de 3.8 ml de ácido
clorhídrico.
Luego calculamos el porcentaje de proteínas según el método, que
es método de microKjeldahl usando los siguientes valores.
VI. CONCLUSIONES
Determinamos el % de acidez de la leche evaporada gloria que es de un
0.522%
Desarrollamos todo el procedimiento del análisis de proteínas con el
método de micro Kjeldahl donde logramos aprender a seguir cada uno de
sus pasos para llegar a nuestro objetivo de determinar las proteínas.
%PROTEINA=3.8 X 0.1909 X5
%PROTEINA=3.6271
Realizamos todos cálculos necesarios para poder encontrar el % de
proteína con los valores que obtuvimos del gasto al titular y al emplear la
formula correspondiente.
Determinamos el % de proteína que posee la leche evaporada gloria que
es de un valor de 3.6271% y lo demás de la leche está compuesto por
otros elementos que dan una buena vitalidad al ser humano.
VII. BIBLIOGRAFÍA
AOAC International: “Official Methods of Analysis”. 17ªed. Gaithersburg,
USA, 2000.
Adrian, J.; Potus, J.; Poiffait, A.; Dauvillier, P.: “Análisis nutricional de los
alimentos”, Ed. Acribia, 2000, pág. 41-43.
Nielsen, S.: “Food Analysis”, Ed. Kluwer Academic/Plenum Publ, 2003, pág.
131- 142.
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16338/Determinaci%C3%B3n
%20de%20proteinas.pdf?sequence=1