potensi isolat bakteri selulolitik untuk …perpustakaan.fmipa.unpak.ac.id/file/skripsi...
TRANSCRIPT
POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK
PRODUKSI DEKOMPOSER
SKRIPSI
Disusun Oleh :
Dharma Sabaya
(062108015)
PROGAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PAKUAN
2012
POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK
PRODUKSI DEKOMPOSER
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Pakuan, Bogor
Disusun Oleh :
Dharma Sabaya
(062108015)
PROGAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PAKUAN
2012
DHARMA SABAYA. 062108015. 2012. Potensi Isolat Bakteri Selulolitik
Untuk Produksi Dekomposer. Dibawah bimbingan Dr. Tri Panji, MS
dan Ir. Suharyanto, M.Si
RINGKASAN
Bioetanol dapat diproduksi dari limbah lignoselulosa melalui pemecahan
limbah tersebut oleh enzim selulase menjadi gula sederhana yang dilanjutkan
dengan fermentasi. Teknologi bioetanol generasi kedua (G-II) ini mampu
meningkatkan nilai tambah limbah. Di samping itu, mikroba penghasil selulase
dapat dimanfaatkan untuk mempercepat proses pengomposan. Tujuan penelitian
ini adalah untuk memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk
mempercepat proses dekomposisi limbah lignoselulosa jerami padi.
Pada penelitian ini, isolat berasal dari jerami padi dan tanah bambu yang
diisolasi dan dimurnikan , serta kemampuan isolat dalam mendegradasi selulosa
diuji menggunakan medium Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Aktivitas enzim
dalam mendegradasi selulosa diuji dengan metode asam dinitrosalisilat (DNS).
Sebanyak 1,5kg jerami padi diinkubasi dengan 5% inokulan. Variasi isolat yang
diaplikasikan adalah isolat DDH92, isolat JP72, dan air steril sebagai kontrol,
dengan waktu inkubasi selama 10, 20, dan 30 hari. Analisi yang dilakukan
meliputi pengujian kadar selulosa dan rasio C/N pada waktu inkubasi 30 hari.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat bakteri selulolitik DDH92 dari
kelompok Actinomycetes ini mampu menghasilkan selulase dengan aktivitas
tertinggi sebesar 50,675x10-3
Unit/mL Pemanfaatan bakteri ini untuk untuk
mempercepat pengomposan jerami padi berhasil mempercepat penurunan C/N
rasio menjadi sebesar 19,38 selama 30 hari, lebih cepat dibandingkan hasil
penelitian sebelumnya yang membutuhkan waktu hingga 6 minggu.
Kata Kunci : Bakteri selulolitik, enzim selulase, bakteri actinomycetes, bioetanol
G-II, pengomposan limbah.
DHARMA SABAYA. 062108015. 2012. The Potential of isolates Cellulolytic
Microbes for the Production of Decomposers. Under the Direction of
Dr. Tri Panji, MS and Ir. Suharyanto, M.Si
SUMMARY
Bioethanol can be produced from lignocellulosic waste through waste
breakdown by cellulase enzymes into simple sugars followed by fermentation.
This second generation bioethanol technology (G-II) is able to increase the value-
added waste. In addition, cellulase-producing microbes can be used to speed up
the composting process. The purpose of this study was to obtain cellulolytic
bacterial isolates potential to accelerate the decomposition process of waste rice
straw lignocellulose.
In this study, isolates derived from rice straw and bamboo ground was
isolated and purified, and the capability of isolates to degade cellulose was tested
using the medium of Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Enzyme activity in
degading cellulose was tested with dinitrosalycilic acid (DNS). A total of 1.5 kg of
rice straw was incubated with 5% inoculant. Various isolates applied were isolate
DDH92, isolate JP72, and sterile water as a control with the incubation time of
10, 20, and 30 days. The analyses included levels of cellulose and C/N ratio in the
incubation time of 30 days.
The results showed that cellulolytic bacterial isolates DDH92 of
Actinomycetes goup was capable of producing highest cellulase activity of 50.675
x10-3
Units/mL Utilization of these bacteria to speed up the composting of rice
straw to successfully accelerate the decline in C/N ratio to be 19.38 for 30 days,
faster than the result of research before that takes up to 6 weeks.
Keywords : cellulolytic bacteria, cellulase enzymes, actinomycetes bacteria,
bioethanol G-II, composting waste.
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan
pertolongan-Nya, dalam menyelesaikan Skripsi dengan judul “Potensi Isolat
Bakteri Selulolitik Untuk Produksi Dekomposer”. Skripsi ini disusun berdasarkan
penelitian yang dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Jalan Taman Kencana No.1
Bogor Jawa Barat. Skripsi ini disusun sebagai kelengkapan salah satu syarat untuk
memperoleh gelar sarjana sains, Progam Studi Kimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor.
Penulis menyadari bahwa Skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu
penulis mengharapkan saran dan masukan untuk penyempurnaan Skripsi ini.
Akhirnya penulis berharap agar Skripsi ini bermanfaat bagi semua pihak.
Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Bapak Dr. Darmono Taniwiryono, M.Sc. selaku Kepala Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia.
2. Ibu Dr. Prasetyorini, MS selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Pakuan
Bogor.
3. Bapak Drs. Husain Nashrianto, M.Si selaku Ketua Jurusan Progam Studi
Kimia FMIPA Universitas Pakuan Bogor.
4. Ibu Ade Heri Mulyati, M.Si selaku Sekretaris Jurusan Progam Studi Kimia
FMIPA Universitas Pakuan Bogor.
5. Bapak Dr. Tri Panji, MS selaku Pembimbing I yang telah memberikan
saran dalam pembuatan makalah rencana tugas akhir ini.
6. Bapak Ir. Suharyanto, M.Si selaku Pembimbing II yang telah berkenan
membimbing dan memberikan saran dalam proses penelitian dan
pembuatan makalah rencana tugas akhir ini.
7. Kak Haryo, kak Deden, Bu Ida, Mbak Ning, Mbak Uchi, Mbak Wulan,
Mbak devi, Pak Ari, Pak Mustari, Pak Jumino, dan Pak Latief yang telah
membimbing saat berjalannya penelitian ini.
8. Orang tua tercinta yang selalu memberikan dukungan moril dan materiil.
9. Kakak-kakak dan adik tercinta yang telah memberikan dukungan.
ii
10. Teman-teman kimia 2008 yang telah berjuang bersama-sama (Novi,
Agung, Oskar, Zaenal, Amen, Deo, Shelvi, Dea, Tiar, Siska, Retno,
Anggun, Kania, Desi, Giya, dan Icha).
Bogor , November 2012
Dharma S
iii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................ i
DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL ................................................................................................. v
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... vii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1
1.2 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 2
1.3 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 2
1.4 Hipotesis ........................................................................................................ 2
TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 3
2.1 Jerami Padi .................................................................................................... 3
2.2 Lignoselulosa ................................................................................................ 4
2.2.1 Selulosa .................................................................................................. 4
2.2.2 Hemiselulosa .......................................................................................... 5
2.2.3 Lignin ..................................................................................................... 6
2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa ............................................................ 7
2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos ........................................ 7
2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua ....................................... 9
2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik) ..................... 10
2.5 Enzim Selulase ............................................................................................ 10
2.6 Spektrofotometer ......................................................................................... 12
METODE KERJA .............................................................................................. 15
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 15
3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 15
iv
3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa .......................................................... 15
3.4 Pemurnian Kultur ........................................................................................ 16
3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa ................................................................ 16
3.6 Aktivitas Enzim Selulase ............................................................................ 17
3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi ................................................................... 17
3.8 Analisis Kadar Selulosa .............................................................................. 18
3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh ................................................. 18
3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik ................................................................ 19
3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen) ............................................................. 19
HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 21
4.1 Isolasi Bakteri.............................................................................................. 21
4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif .................................................................... 22
4.3 Analisis Kompos Jerami Padi ..................................................................... 23
4.3.1 Bobot .................................................................................................... 23
4.3.2 Tinggi ................................................................................................... 24
4.3.3 Kadar Selulosa ..................................................................................... 24
4.3.4 Kadar Lignin ........................................................................................ 25
4.4 Aktivitas enzim selulase .............................................................................. 26
4.5 Rasio C/N .................................................................................................... 27
KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 29
5.1 Kesimpulan ................................................................................................. 29
5.2 Saran ............................................................................................................ 29
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 30
v
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Kandungan Lignoselulosa Pada Limbah Pertanian ................................ 4
Tabel 2. Jenis-Jenis Enzim Selulase...................................................................... 11
Tabel 3. Morfologi Koloni .................................................................................... 21
Tabel 4. Hasil Uji Penurunan Bobot Jerami Padi Setelah Inkubasi Selama
30 hari ..................................................................................................... 23
Tabel 5. Rasio C/N Dengan Variasi Inokulan ....................................................... 28
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Jerami Padi .......................................................................................... 3
Gambar 2. Struktur Selulosa ................................................................................. 5
Gambar 3. Mikrofibril Selulosa ............................................................................ 5
Gambar 4. Produk Nilai Tambah Dari Bahan Lignoselulosa ............................... 7
Gambar 5. Proses Pembuatan Bioetanol di IOGEN Corporation ......................... 9
Gambar 6. Skema Mekanisme Degadasi Selulosa Oleh Enzim Selulase ............. 12
Gambar 7. Penurunan Tinggi Penumpukan Jearmi Padi ...................................... 24
Gambar 8. Penurunan Kadar Selulosa Selama 30 Hari......................................... 25
Gambar 9. Penurunan Kadar Lignin Selama 30 Hari ........................................... 26
Gambar 10. Aktivitas Enzim Selulase Umur 30 Hari ........................................... 27
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian ..................................................................... 34
Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat ............................................... 35
Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 goresan .............................. 36
Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan NA miring ..................................... 37
Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa ....................................................... 38
Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase ........................... 39
Lampiran 7. Tabel Rasio HC ................................................................................ 40
Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi ...................................... 41
Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa ................................................. 42
Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin .................................................. 43
Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas Enzim Selulase ............................... 44
Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik ............................................ 45
Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (Nitrogen) ....................................... 46
Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi ...................... 47
Lampiran 15. Gambar Hasil Penelitian ................................................................. 48
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dalam bidang perkebunan
dan pertanian meningkatkan produk yang menyebabkan tingginya hasil limbah
seperti jerami padi. Jerami padi belum dinilai sebagai produk yang memiliki nilai
ekonomis. Pada sistem usaha tani yang intensif, jerami sering dianggap sebagai
sisa tanaman yang mengganggu pengolahan tanah dan penanaman padi. Oleh
karena itu, 75-80% petani membakar jerami di tempat. Tujuan utama petani
membakar jerami adalah untuk menyingkirkan jerami dari petakan sawah dengan
cara yang praktis. Perhitungan untung rugi atas tindakan pembakaran jerami
belum dipertimbangkan. Pembakaran jerami dapat meningkatkan suhu udara
dipermukaan tanah mencapai 700oC, sehingga dapat memusnahkan mikroba yang
berguna dalam proses biologis. Jerami padi memiliki komponen utama
lignoselulosa sehingga sukar didegadasi.
Lignoselulosa adalah bahan organik di alam yang berlimpah dan terdiri
dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Ketiganya
membentuk suatu ikatan kimia yang kompleks yang menjadi bahan dasar dinding
sel tumbuhan. Selulosa merupakan polimer linier dari D-glukosa yang terikat pada
ikatan 1,4 glikosidik dan sangat erat berasosiasi dengan hemiselulosa dan lignin.
Hemiselulosa merupakan salah satu penyusun dinding sel tumbuhan yang terdiri
dari kumpulan beberapa unit gula/heteropolisakarida dan dikelompokkan
berdasarkan residu gula utama sebagai penyusunnya seperti xilan, mannan,
galactan dan glucan (Fengel dan Wegener, 1995). Hemiselulosa mempunyai berat
molekul rendah dibandingkan dengan selulosa dan terdiri dari D-xilosa, D-
mannosa, D-galaktosa, D-glukosa, L-arabinosa, 4-0-metil glukoronat, D-
galakturonat dan asam D-glukoronat (Perez et al., 2002). Lignin merupakan
polimer aromatik yang berasosiasi dengan polisakarida pada dinding sel sekunder
tanaman. Pada umumnya, lignin mengandung tiga jenis alkohol aromatik yaitu
coniferyl, sinapyl dan p-coumaryl (Howard et al., 2003). .
2
Sejalan dengan perkembangan bioteknologi dan kekayaan Indonesia akan
sumber daya hayati, pemanfaatan mikroba dalam proses biokonversi limbah
lignoselulosa dapat dilakukan guna mendapatkan nilai tambah menjadi produk
lain seperti pupuk dan bioetanol. Proses hidrolisis selulosa dilakukan dengan
bantuan bakteri selulolitik secara enzimatik. Proses hidrolisis ini lebih disukai
karena ramah lingkungan walaupun laju hidrolisisnya rendah.
Tanah merupakan habitat yang didominasi oleh mikroorganisme seperti
bakteri, fungi, alga dan protozoa. Kualitas dan kuantitas mikroba tersebut
mempengaruhi kesuburan tanah karena beberapa mikroba berperan sebagai
dekomposer.
Penelitian mengenai potensi bakteri selulolitik sangat penting dilakukan,
karena mikroba penghasil enzim selulase menawarkan potensi yang besar di
bidang penanganan limbah selulosa.
1.2 Tujuan Penelitian
Memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk mempercepat proses
dekomposisi limbah lignoselulosa dari jerami padi.
1.3 Manfaat Penelitian
Mendapatkan isolat bakteri selulolitik yang potensial untuk produksi
dekomposer. Diharapkan dekomposer yang diperoleh dapat diaplikasikan untuk
hidrolisis selulosa menjadi glukosa dan etanol serta mempercepat pengomposan
jerami padi.
1.4 Hipotesis
Isolat bakteri selulolitik terpilih mampu mempercepat proses dekomposisi
jerami padi.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan dalam bidang pertanian dan perkebunan di Indonesia
menimbulkan peningkatan residu tanaman. Residu tanaman ini sebagian besar
menghasilkan produk sampingan yang mengandung lignoselulosa. Produk
samping tanaman seperti jerami padi, serasah kacang tanah, serasah jagung dan
sabut kelapa sangat berperan sebagai sumber hara dan dijadikan sebagai bahan
organik dan berpotensi sebagai salah satu sumber energi melalui proses konversi,
baik proses fisika, kimia maupun biologis.
2.1 Jerami Padi
Jerami padi adalah bagian vegetatif dari tanaman padi (batang, daun,
tangkai malai), pada waktu tanaman padi dipanen, jerami adalah bagian tanaman
yang tidak diambil. Jerami merupakan golongan kayu lunak yang mempunyai
komponen utama lignoselulosa. Selulosa adalah serat polisakarida yang berwarna
putih yang merupakan hasil dari fotosintesis tumbuh - tumbuhan. Jumlah
kandungan selulosa dalam jerami antara 35 - 40 %.
Gambar 1. Jerami Padi
4
Tabel 1. Kandungan lignoselulosa pada limbah pertanian (Howard et al., 2003)
Bahan lignoselulosa Selulosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%)
Tangkai kayu keras 40-55 24-40 18-25
Tangkai kayu lunak 45-55 25-35 25-35
Kertas 85-99 0 0-15
Jerami gandum 30 50 15
Jerami padi 32,1 24 18
Buangan sampah 60 20 20
Daun 15-20 80-85 0
Bagas segar 33,4 30 18,9
Rumput 25-40 25-50 10-30
2.2 Lignoselulosa
Lignoselulosa merupakan komponen utama tanaman yang
menggambarkan jumlah sumber bahan organik yang dapat diperbaharui.
Lignoselulosa terdiri dari selulosa, hemiselulosa, lignin dan beberapa bahan
ekstraktif lain. Semua komponen lignoselulosa terdapat pada dinding sel tanaman.
2.2.1 Selulosa
Selulosa adalah polisakarida yang mempunyai fungsi sebagai unsur
struktural pada dinding sel tumbuhan tingkat tinggi. Selulosa berbentuk serabut,
liat, tidak larut di dalam air, dan ditemukan terutama pada bagian berkayu pada
tumbuhan sekitar 40-45%. Selulosa merupakan bahan kimia organik yang
memiliki berat molekul tinggi dan polimer yang tidak bercabang yang terdiri dari
100-14.000 monosakarida atau lebih (Lehninger, 1982). Ikatan β(1→4) glikosida
yang berbentuk linier dan mempunyai kecenderungan kuat membentuk ikatan
hidrogen intra dan intermolekul (Lehninger, 1982).
5
Gambar 2. Struktur selulosa ( Lehninger, 1982).
Molekul selulosa tersusun dalam bentuk fibril. Pada kayu, fibril-fibril
membentuk struktur kristal dibungkus oleh lignin. Lignin berperan sebagai
pelindung selulosa dari serangan enzim pemecah selulosa (Judoamidjojo, 1989).
Kumpulan fibril disebut mikrofibril, sedangkan kumpulan mikrofibril membentuk
makrofibril. Bagian mikrofibril yang mengandung banyak ikatan hidrogen bersifat
sangat kuat, tidak dapat ditembus oleh air dan disebut bagian kristalin. Bagian
mikrofibril yang sedikit atau sama sekali tidak mengandung ikatan hidrogen
disebut bagian amorf (Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).
Gambar 3. Mikrofibril selulosa ( Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).
2.2.2 Hemiselulosa
Hemiselulosa adalah molekul bercabang yang hanya memiliki 150-200
monomer (Mulcahy, 1996). Hemiselulosa adalah polimer yang mirip dengan
selulosa. Backbone (rangka utama) dari hemiselulosa adalah terbentuk dari ikatan
β 1,4-D-pyranosyl dari unit penyususnnya.. Hemiselulosa mempunyai banyak
cabang, secara umum dapat dikatakan bahwa hemiseluloasa merupakan polimer
noncrystalline heteropolysaccharides. Komponen yang menyusun hemiselulosa
adalah gula pentosa ( D-xylose, L-arabinose ), gula heksosa ( D-galactose, L
6
galactose, D-mannose, Lrhamnose,\ L-fucose ) dan asam uronik (Lglucomonic
acid ) (Glazer dan Nikaido, 2007).
Hemiselulosa adalah polimer polisakarida yang komplek, komposisi dan
frekuensinya tergantung kepada jenis jaringan tanaman, jenis spesies dan tahapan
pertumbuhan pada tanaman. Hemiselulosa tidak hanya ditemukan berupa xylan,
namun juga ditemukan dalam jumlah yang banyak berupa glucomannans,
galactomannans, arabinogalactans dan senyawa yang lain (Mulcahy, 1996).
2.2.3 Lignin
Lignin merupakan fraksi non karbohidrat yang bersifat kompleks dan sulit
dikarakterisaasi. Pada dasarnya lignin merupakan polimer aromatik heterogen
dengan sistem jaringan yang bercabang serta tidak memiliki bentuk yang tetap
(Mc Donald dan Franklin, 1969 dalam Enny, 2008).
Pada saat dilakukan perlakuan dengan menggunakan suhu di atas 200°C,
maka lignin akan mengalami degadasi menjadi senyawa partikel dengan ukuran
yang kecil dan terlepasnya ikatan dengan selulosa (Tanahashi et al., 1983 dalam
Palonen, 2004).
Untuk mempermudah dalam mendegadasi lignin maka diperlukan
delignifikasi. Delignifikasi adalah suatu proses dalam menghilangkan lignin yang
dilakukan dengan menggunakan bahan kimia (Ahmed et al., 2001) sehingga
terputusnya ikatan ester dalam makro molekul lignin. Telah ditemukan
mikroorganisme yang dapat mendegadasi lignin dengan cepat dan telah disadari
bahwa menggunakan bahan kimia dalam proses penghilangan lignin akan
mengakibatkan limbah yang sangat berbahaya bagi lingkungan (Glazer dan
Nikaido, 2007).
Lignin tersusun oleh unit yang disebut dengan lignol, yang terdiri dari aryl
propanol yang tersusun pada senyawa aromatik dan tiga karbon rantai karbon.
Lignol secara struktural sangat berhubungan dengan asam amino phenylalanine
dan tyrosin.
7
2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa
Gambar 4. Produk nilai tambah dari bahan lignoselulosa (Mtui, 2009)
2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos
Pupuk adalah zat atau unsur yang ditambahkan ke dalam tanah dengan
maksud untuk menyuburkan tanah. Secara umum pupuk terbagi atas pupuk
organik (pupuk kandang, pupuk kompos, pupuk hayati) dan pupuk anorganik
(pupuk kimia, bahan sintetis). Pupuk organik menjadi salah satu alternatif untuk
mengurangi penggunaan pupuk anorganik yang saat ini banyak digunakan petani.
Pupuk organik dapat menyediakan semua unsur hara yang dibutuhkan oleh
tanaman oleh karena itu bersifat multiguna. Pupuk yang bersifat ramah
lingkungan ini dapat memperbaiki sifat fisika, biologi dan kimia tanah serta dapat
meningkatkan kehidupan mikroba tanah yang merupakan sumber hara bagi
tanaman.
Beberapa jenis mikroba yang berperan dalam proses penyuburan tanah
antara lain mikroba pendegadasi selulosa, Azospirilum, Lactobacillus,
Acetobacter, mikroba pelarut fosfat, mikroba penambat nitrogen, mikroba
penghasil hormon pertumbuhan, mikroba penghasil metabolit sekunder dan
mikroba yang mampu melakukan biotransformasi logam berat sehingga dapat
menurunkan toksisitas pada lahan. Selain itu, jenis mikroba lain dari golongan
8
Actinomycetes juga berperan dalam proses pembuatan pupuk organik (Abdulla,
2007).
Bahan lignoselulosa sangat potensial untuk bahan dasar pembuatan pupuk
organik, disamping untuk bahan bakar, makanan ternak dan bahan pembuatan
kertas (Singhania, 2009). Penggunaan limbah selulosa untuk produksi pupuk
organik bertujuan untuk memberikan nitrogen dan berperan sebagai penggembur
tanah (Malik et al., 2001).
Kompos, adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai
penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek
menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari
bakteri, kapang, aktinomisetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah
lignoselulosa (Mtui, 2009). Pada proses pembuatannya, pH, suhu, struktur bahan
yang digunakan akan menentukan populasi mikroba. Kompos yang banyak
digunakan adalah kompos jerami padi.
Bahan lignoselulosa dapat digunakan sebagai sumber C bagi organisma
lignoselulolitik. Disamping unsur hara yang tersedia, organisma dapat
menghasilkan C sederhana dalam proses metabolisma yang dapat digunakan
sebagai bahan baku pupuk organik (Widiastuti et al., 2009). Kandungan hara
kompos jerami padi terdiri dari ratio C/N 18,88, C organik (%) 35,11, N (%) 1,86,
P2O5 (%) 0,21, K2O (%) 5,35, kadar air (%) 55. (Isroi, 2010). Pemanfaatan jerami
padi sebagai pupuk organik diantaranya memiliki kandungan C organik yang
tinggi, kandungan bahan organik tanah dapat dinaikkan dan kesuburan tanah dapat
dikembalikan dengan pemakaian kompos jerami padi secara konsisten.
Parameter standar mutu pupuk organik menurut Menteri Pertanian
No.06/Permentan/SR.130/2/2011, terdiri dari C organik, C/N ratio, bahan ikutan
(plastik, kaca, kerikil), kadar air, kadar logam berat (As, Hg, Pb, Cd), pH, kadar
total (N, P2O5, K2O), mikroba patogen (E. coli, Salmonella), mikroba fungsional,
ukuran butiran dan unsur mikro (Fe, Mn, Cu, Zn, B, Co, Mo). Persyaratan teknis
mutu pupuk organik meliputi ganula/pelet, cair/pasta dan remah/curah. C organik
dan C/N ratio merupakan parameter utama pupuk organik. C organik terdiri atas
ganula/ pelet baik yang murni maupun yang diperkaya mikroba sebesar > 12%,
cair/ pasta sebesar ≥ 4% dan remah/ curah baik yang murni maupun yang
9
diperkaya mikroba sebesar ≥ 12%. C/N ratio murni dan yang diperkaya mikroba
baik ganula/pelet maupun remah/curah masing masing sebesar 15-25%.
2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua
Gambar 5. Proses pembuatan bioetanol di IOGEN Corporation.
Iogen Corporation merupakan perusahaan yang berasal dari kanada yang
memproduksi bioetanol generasi kedua. Bahan yang digunakan untuk pembuatan
bioetanol adalah limbah lignoselulosa \ serat. sebelum tahap hidrolisis enzimatis,
dilakukan tahap pretrearment, yaitu meningkatkan luas permukaan dan
aksesbilitas dari serat tanaman untuk enzim dengan proses ledakan uap.
Tahap hidrolisis enzimatis merupakan tahap konversi tinggi selulosa
menjadi glukosa. Tahap separation merupakan tahap penggunaan lignin untuk
menghasilkan tenaga untuk menjalankan fasilitas dan C5 dan C6 gula sederhana
difermentasikan menjadi etanol. Hasil fermentasi etanol kira-kira menghasilkan
etanol 3% sehingga perlu didestilasi.
Etanol dari selulosa mengurangi gas rumah kaca dibandingkan dengan
bahan bakar fosil seperti bensin serta mengurangi ketergantungan bahan bakar
fosil.
Fibre
Pretreatment
Enzymatic
hidrolysis Separation
Fermentation
Distilation
Bioethanol G2
Power generation
Electricity
10
2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik)
Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang dapat mendegadasi selulosa.
Beberapa bakteri pendegadasi selulosa adalah bakteri mesofilik dan termofilik
aerobik (Cellumonas sp, celvibrio sp, Microbispora bispora, Thermomonospora
sp), bakteri mesofilik dan termofilik anaerobik (Acentivibrio cellulolyticus,
Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus albus,
Ruminococcus flavefaciens dan Clostridium termocellum). Bakteri pendegadasi
selulosa termofil dapat menghasilkan enzim selulase yang relatif stabil (tahan
pada kondisi asam atau basa dan pada suhu tinggi hingga 90°C) (Bhat dan Bhat,
1997).
Bakteri selulolitik sering diisolasi dari tanah yang mengandung seresah
daun. Hal ini disebabkan karena tanah mengandung bahan organik yang relatif
kaya dan terdapat seresah daun dengan kandungan polisakarida yang relatif
komplek. Kondisi tersebut menyebabkan tanah dan seresah daun menjadi habitat
yang baik untuk berbagai mikroorganisme (William dan Govind, 2003).
Pada penelitian yang dilakukan oleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwa
jumlah bakteri yang berhasil diisolasi pada tanah hutan lebih banyak
dibandingkan dengan yang berhasil diisolasi pada lahan pertanian. Dari total
bakteri yang berhasil diisolasi juga diketahui bahwa jumlah total isolat bakteri
pendegadasi selulosa lebih banyak dibandingkan dengan yang diisolasi dari lahan
pertanian. Hal ini terjadi karena terdapat perbedaan material organik yang terdapat
pada hutan dan lahan pertanian. Hutan memiliki keanekaragaman material organik
yang lebih tinggi dibandingkan dengan lahan pertanian.
2.5 Enzim Selulase
Selulase adalah nama bagi semua enzim yang memutuskan ikatan
glikosidik beta-1,4 di dalam selulosa, selobiosa, dan turunan selulosa lainnya. Di
alam, enzim selulase ditemukan di berbagai ekosistem, terutama ditemukan pada
proses dekomposisi serasah daun, hingga keadaan anaerobik pada rumenansia
(Denman et al., 1996).
Sistem enzim selulosa sangat penting karena berperan dalam mengubah
selulosa menjadi gula sederhana. Enzim selulase merupakan system enzim yang
11
terdiri dari enzim Endoglukanase, Eksoglukanase, dan β- glukosidase (tabel 2).
Enzim selulase adalah enzim yang dapat mengkatalisis dan menghidrolisis ikatan
β 1-4 glukosidik pada selulosa (ikatan yang paling banyak di selulosa) (Bhat,
2000). Enzim endoglukanase (EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis enzim yaitu 1,4-
D-glucan-4-glucanohydrolases (Bhat dan Bhat, 1997).
Endoglucanases atau yang sering disebut dengan CM-cellulases
(carboxymethylcellulose) atau Cx enzim, menghidrolisis secara acak ikatan pada
serat selulosa (Wood, 1985). Hal ini mengakibatkan rantai polisakarida yang telah
terpotong (oligosakarida) mempunyai panjang rantai yang berbeda-beda (Bhat,
2000). Hasil dari hidrolisis serat selulosa adalah glukosa, cellobiose, cellotriose,
dan oligosakarida yang lebih tinggi (Wood, 1985).
Cellobiohydrolyase yang sering disebut dengan eksoglukanase adalah
enzim pendegadasi selulosa yang ditemukan pada mayoritas fungi yang dapat
mendegadasi selulosa (Wood, 1985). eksoglukanase dapat menghidrolisis
mikrokristalline namun tidak dapat menghidrolisis carboxymethylcellulose (Kim
dan Kim, 1995). Enzim eksoglukanase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4- D-glucan
glucanohydrolases (lebih dikenal dengan cellodextrinases) dan 1,4-D-glucan
cellobiohydrolases (cellobiohydrolases). Enzim eksoglukanase adalah enzim yang
aktif pada sisi crystalline selulosa (Mattinen, 1998).
Tabel 2. Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997)
Jenis enzim Kode EC Sinonim Mekanisme reaksi
Endo-(1-4)-β-
Dselulase
EC
3.2.1.4
Endoselulase atau
endoglukanase
-G-G-G-G
↑ ↑
Memutuskan ikatan secara acak
Ekso-(1-4)-
β-Dselulase
EC
3.2.1.91
Selobiohidrolase atau
eksoselulase
G-G-G-G
↑
Melepaskan selobiosa baik yang reducing atau
nonreducing end
Ekso-(1-4)-
β-Dselulase
EC
3.2.1.74
Eksoglukanase
atau
glukohidrolase
G-G-G-G
↑
Melepaskan glukosa dari non-reducing end
β-glukosidase
EC
3.2.1.21
Selobiose G-G, G-G-G
↑ ↑
Melepaskan glukosa dari selobiosa atau rantai
cellooligosakarida pendek
12
β-glucoside glucohydrolases lebih dikenal sebagai β-glukosidase. β-
glukosidase adalah enzim yang digunakan untuk menghidrolisis cellobiose dan
pada beberapa kasus dapat menghidrolisis cello-oligosakarida menjadi glukosa.
Enzim endogluconases dan β- glukosidase dapat menghidrolisis selulosa menjadi
glukosa. β-glukosidase dibutuhkan untuk menghidrolisis inhibitor cellobiose
(Wood, 1985).
Laju hidrolisis enzim selulase ditentukan oleh struktur enzim dan struktur
substrat (Mandels, 1985), dimana struktur Kristal dari selulosa relatif lebih sulit
dihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf (Coughlan, 1985). Mekanisme
skematis kerja enzim selulase seperti pada Gambar 6.
Gambar 6. Skema mekanisme degadasi selulasa oleh enzim selulase (Beguin dan
Aubert, 1994)
2.6 Spektrofotometer
Spektrofotometer absorbansi adalah sebuah instrumen untuk mengukur
absorbs cahaya dalam panjang gelombang tertentu oleh suatu atom atau molekul.
13
Untuk daerah ultraviolet sampai cahaya tampak, nilai panjang gelombang berkisar
antara 160-780 nm. Kemampuan suatu senyawa mampu menyerap radiasi sinar
UV-VIS yaitu adanya spesi pengabsorbsi yang disebut dengan kromofor.
Kromofor merupakan gugus fungsional yang dapat menyerap radiasi UV-VIS.
Aplikasi dari spektrofotometri UV-VIS, yaitu analisis kuantitatif senyawa
organik dan anorganik, untuk analisis kualitatif tidak terlalu berguna karena
spektrum yang dihasilkan cenderung mempunyai pita yang melebar sehingga
informasi yang didapat sangat sedikit. Dalam analisis kuantitatif dilakukan pada
panjang gelombang maksimum yaitu panjang gelombang yang menberikan
absorbs terbesar (dapat ditentukan dari spektrum absorbsinya). Pada λmaks respon
sinyal (absorbans) berada dalam kondisi maksimum sehingga akan memiliki
sensitivitas yang baik dan limit deteksi yang rendah serta mereduksi kesalahan
dalam pengukuran (Skoog et al., 2004).
Instrumentasi spektrofotometer secara sederhana terdiri dari sumber
cahaya, monokromator, yang berfungsi sebagai penyeleksi cahaya dengan panjang
gelombang (energi) tertentu, kompartemen sampel, detektor, dan pengukur
intensitas cahaya (Skoog et al., 2004). Berikut penjelasan empat bagian penting
dari spektrofotometer, yaitu:
a. Sumber Cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer haruslah memiliki pancaran radiasi
yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk
daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar
dengan kawat terbuat dari wolfarm (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar dengan biasa dengan daerah panjang gelombang (λ) berkisar antara
350-2200 nm. Paling lazim adalah lampu tabung tidak bermuatan (discas)
hidrogen (atau deuterium) 175 ke 375 atau 400 nm. Lampu hidrogen atau lampu
deuterium digunakan untuk sumber pada daerah ultraviolet.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya
polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang berbeda (terdispersi). Ada dua macam monokromator, yaitu
14
prisma dan gating (kisi difraksi). Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang
gelombang tertentu yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit
yang disebut slit. Ketelitian dari monokromatis dipengaruhi juga oleh lebar celah
(slith width) yang dipakai.
c. Kuvet
Kuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat
contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Kuvet biasanya terbuat dari kwarsa,
kaca, plastik dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5
cm. Pada pengukuran di daerah ultraviolet dipakai kuvet kwarsa atau plexiglass,
sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV.
Semua macam kuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak
(visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi
sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk
jarum penunjuk atau angka digital. Detektor yang biasa digunakan untuk
Spektrofotometer UV-VIS adalah detektor photo tube, Barrier Layer Cell, dan
Photo Multiplier Tube.
Spektrofotometer UV-VIS termasuk dalam spektroskopi absorbs. Prinsip
dasarnya ialah penyerapan (absorbs) gelombang elektromagnetik yang dilewatkan
pada sampel. Gelombang elektromagnetik yang digunakan pada daerah panjang
gelombang 160-780 nm. Absorbansi yang diperoleh dari sampel setelah diukur,
digunakan untuk membandingkan intensitas sinar yang dilalui menuju sampel (I)
dengan intensitas sinar sebelum dilewatkan ke sampel (I0). Transmitan diperoleh
dari rasio I/I0 dan absorban diperoleh dari nilai transmitan (Skoog et al., 2004).
Jenis spektrofotometer berdasarkan sistem optiknya terdapat 2 jenis, yaitu
spektrofotometer single beam (berkas tunggal) dan spektrofotometer double beam
(berkas ganda). Spektrofotometer single beam pada spektrofotometer ini hanya
terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui kuvet. Blanko, larutan standar,
dan contoh diperiksa secara bergantian.
15
BAB III
METODE KERJA
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses, Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor Jawa Barat. Waktu
penelitian adalah dari bulan Mei 2012 sampai dengan Oktober 2012.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven,
refluks, desikator, penangas air, shaker incubator, vortex, neraca analitik digital,
ayakan 50 mesh, laminar, spektrofotometer UV-VIS, hotplate, perangkat destilasi
Markham, pH-meter, kertas saring, botol selai, cawan petri, mikropipet,
thermometer, loop inokulan, bunsen, indicator universal, kapas, alumunium foil,
kaca arloji, gelas piala 1 L, labu takar 100 mL, corong, batang pengaduk, spatula,
pipet tetes, buret, pipet volumetrik, erlenmeyer, kuvet, labu semprot dan tisu.
Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini harus selalu
dalam keadaan steril. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jerami
padi yang diperoleh dari sawah Dramaga dan tanah dari rhizosfer bambu Kota
Bogor. Bahan yang digunakan dalam isolasi bakteri pendegadasi selulosa
diantaranya Media Cellulose Congo Red Agar (CCRA), Media Nutrient Agar
(NA) dan Media Nutrient Broth (NB), H2SO4 pekat, NaOH, H3BO3, Na2B4O7,
K2Cr2O7, indikator Conway, indikator selenium, sedang bahan kimia untuk
analisis komponen kimiawi terdiri DNS (Dinitri Salicylic Acid), fenol, Kalium
Natrium Tartrat.
3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa
Untuk mengisolasi bakteri pendegadasi selulosa digunakan medium
CCRA (Hendricks et al., 1995). Medium CCRA dibuat dengan dengan komposisi
16
K2HPO4 sebanyak 0,5 g, MgSO4 0,25 g, congo red 0,5 g, gelatin 2 g, CMC 1,88
g, 100 mL filtrat serbuk jerami padi dan 900 mL akuades steril. Bahan-bahan
tersebut dicampurkan kecuali agar dan gelatin. Keasaman medium adalah pH 7,0,
agar dan gelatin kemudian dilarutkan dalam medium dengan pemanasan
menggunakan hot plate. Medium kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu
121°C dengan tekanan 1,5 atm, didinginkan lalu dituangkan ke cawan Petri steril
dan disimpan pada suhu 4°C. Pengenceran bertingkat dilakukan untuk
memudahkan isolasi dengan cara sebanyak 10 g sampel dimasukkan ke dalam
botol selai yang berisi 90 mL akuades steril lalu dimasukkan ke dalam shaker
inkubator dengan kecepatan 200 rpm selama 3 jam (pengenceran tingkat 10-1
).
Selanjutnya dilakukan pengenceran secara bertingkat hingga 10-9
.
Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan cara meratakan 0,1 mL larutan
dari tingkat pengenceran 10-6
sampai 10-9
pada permukaan medium padat (CCRA)
spatula (Lampiran 2). Metode isolasi bakteri yang digunakan pada penelitian ini
adalah Spread Plate Methode. Koloni bakteri selulolitik yang tumbuh akan
menimbulkan zona bening di sekitarnya. Zona bening yang terbentuk
menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut menghasilkan enzim yang
mendegadasi selulosa yang ada disekitarnya.
3.4 Pemurnian Kultur
Setiap koloni terpisah yang memunculkan zona bening dimurnikan dengan
metode kuadran pada medium CCRA (Lampiran 3). Koloni bakteri yang
dimurnikan adalah koloni tunggal yang berada di ujung goresan kuadran. Dari
Isolat yang didapat diberi nama dan di kulturkan kembali pada medium CCRA
dan medium NA miring sebagai kultur stok (lampiran 4).
3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa
Uji kapasitas hidrolisis (HC) merupakan pengujian yang dilakukan untuk
mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam laju degadasi selulosa di lingkungan
sekitarnya. rasio HC adalah rasio antara diameter zona bening dengan diameter
koloni yang menghasilkan zona bening (Lu et al., 2005). Medium CCRA padat
17
digunakan pada pengujian ini. Biakan dari isolat murni diambil dengan
menggunakan jarum ose kemudian disentuhkan bagian ujung jarum yang
mengandung biakan pada bagian tengah medium CCRA. Biakan diinkubasikan di
dalam inkubator pada suhu 37º C. Pengukuran zona bening dan diameter koloni
dilakukan setiap hari selama 5 hari. Maka akan terlihat laju degradasi dengan
persamaan reaksi A 𝒌 B. k = −
𝜹𝑨
𝜹𝒕 = +
𝜹𝑩
𝜹𝒕
3.6 Aktivitas Enzim Selulase
Aktivitas enzim selulase dihitung berdasarkan metode DNS (Dinitro
Salicylic Acid). Sampel tiap-tiap perlakuan yang dikomposkan diambil masing-
masing sebanyak 10 g dan ditambahkan 30 mL buffer phosphat kemudian
diblender sampai halus dan disaring. Filtat diambil lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm, kemudian larutan jernih (supernatan) diambil sebanyak 1
mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 mL substrat CMC
1% diinkubasi selama 30 menit pada suhu 500C. Larutan tersebut kemudian
ditambahkan dengan 3 mL pereaksi DNS, dikocok hingga homogen menggunakan
vortex, dan ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit, lalu ditambahkan 1
mL KNa-Tartrat 40% dinginkan sampai suhu ruang. Larutan yang telah
didinginkan tadi diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS
pada panjang gelombang 570 nm. Untuk pengukuran blanko, supernatan sebanyak
1 mL ditambahkan dengan 1 mL buffer phosphat pH 7. Kurva standar dibuat
dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan kisaran 100-500 mg/L.
Penghitungan aktivitas enzim selulase dilakukan dengan rumus berikut,
Aktivitas enzim unit/mL = Kadar glukosa x factor pengenceran
BM glukosa x waktu inkubasi
3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi
Jerami kering ditimbang sebanyak 1,5 kg, kemudian direndam dalam
ember selama 1 malam. Lalu ditiriskan selama 2 jam, kemudian dimasukkan ke
dalam keranjang plastik dan ditambahkan inokulan 5% yang berasal dari isolat
JP72, DDH92, dan kontrol, kemudian diaduk rata. Proses inkubasi dilakukan
18
selama 30 hari dan juga dicek kelembabannya agar tetap terjaga. Proses
pengomposan ini dapat dilihat pada lampiran 5.
3.8 Analisis Kadar Selulosa
Metode untuk mengukur kandungan selulosa dan lignin berdasarkan
metode Chesson yang dikemukakan oleh Datta (1981). Sebanyak satu g sampel
kering (berat a) ditambahkan 150 mL H2O atau alkoholbenzene dan direfluk pada
suhu 100°C dengan water bath selama 1 jam. Hasilnya disaring, residu dicuci
dengan air panas 300 mL. Residu kemudian dikeringkan dengan oven sampai
beratnya konstan dan kemudian ditimbang (berat b). Residu kemudian
ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N, dan direfluk dengan water bath selama 1 jam
pada suhu 100°C. Hasilnya disaring dan dicuci sampai netral (300 mL) kemudian
residunya dikeringkan hingga beratnya konstan. Berat ditimbang (berat c). Residu
kering ditambahkan 100 mL H2SO4 72% dan direndam pada suhu kamar selama 4
jam kemudian ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N dan direfluk pada suhu 100oC
dengan water bath selama 1 jam pada pendingin balik. Residu disaring dan dicuci
dengan H2O sampai netral (400 mL). Residu kemudian dipanaskan dengan oven
dengan suhu 105oC sampai beratnya konstant dan ditimbang (berat d).
Selanjutnya residu diabukan dan ditimbang (berat e). Perhitungan kadar selulosa
dan kadar lignin menggunakan rumus berikut ini:
Kadar selulosa = (c-d)/a x 100%
Kadar lignin = (d-e)/a x 100%
3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh
Contoh diambil dari jerami padi yang sudah diinkubasi dengan
pengambilan pada hari ke-30. Diambil beberapa bagian dari jerami padi lalu
dikeringkan. Setelah kering, contoh diblender dan diayak menggunakan saringan
berukuran 50 mesh, akan dihasilkan serbuk contoh. Serbuk ini kemudian
ditentukan kadar karbon (C) dan nitrogen (N).
19
3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik
Kadar C-organik ditentukan dengan metode Walkley dan Black. Timbang
0,010-0,050 g contoh, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL.
tambahkan 5 mL K2Cr2O7 2N, lalu dikocok. Tambahkan 7 mL H2SO4 pekat,
dikocok lalu diamkan selama 30 menit. Encerkan, biarkan dingin dan ditepatkan.
Keesokan harinya diukur absorbansi larutan jernih dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 561 nm. Sebagai pembanding dibuat standar 0 dan 150 ppm
C, dengan memipet 0 dan 3 mL larutan standar 5.000 ppm C ke dalam labu ukur
100 mL dengan perlakuan yang sama dengan contoh. Kadar C dihitung dengan
persamaan berikut:
Kadar C-organik(%)= ppm kurva x mL ekstrak1.000 mL-1
x 100 contoh-1
x fk
= ppm kurva x 100 1.000-1
x 100 10-1
x fk
= ppm kurva x 10 10-1
x fk
Keterangan: Larutan standar : 12,510 g glukosa dalam 1L.
100 : faktor konversi ke %
Fk : faktor koreksi kadar air = 100/(100-%kadar air)
Reaksi :
2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 3 C → 2 Cr2(SO4)3 + 3 CO2 + 2 K2SO4 + 8 H2O
3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen)
Kadar N ditentukan dengan menggunakan metode kjeldahl. Sebanyak 0,2g
serbuk contoh ditimbang lalu dimasukkan ke labu kjehdahl 100 mL, ditambahkan
serbuk selenium sebanyak 1 g sebagai katalis dan 5 mL H2SO4 pekat, kemudian
didestruksi hingga didapatkan larutan jernih. Hasil destruksi dimasukkan ke alat
destilasi Markham, dibilas dengan air, ditambah 30 mL NaOH 30% kemudian
didestilasi. Hasil destilasi ditampung dengan 20 mL asam borat (H3BO3) 1% dan
empat tetes indikator Conway (merah). Setelah destilat berwarna hijau kemudian
destilasi dilanjutkan selama 10 menit. Destilat kemudian dititar dengan H2SO4
0,05 N hingga didapat titik akhir titrasi, larutan berwarna merah muda. Kadar
Nitrogen dihitung dengan persamaan:
Kadar N = 𝑽𝒄−𝑽𝒃 𝒙 𝑵 𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖
𝒎𝒈 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 x 100 %
20
Keterangan: Vc : Titran H2SO4 0,05N contoh (mL)
Vb: Titran H2SO4 0,05N blanko (mL)
Standarisasi H2SO4
Sebanyak 10 mL dinatriun tetraborat (Na2B4O7) 0,05 N dimasukkan ke
dalam Erlenmeyer 250 mL, ditambahkan dua tetes indikator merah metil (larutan
menjadi berwarna kuning), kemudian dititar dengan H2SO4 yang akan
distandarisasi hingga didapat titik akhir merah muda.
Reaksi yang terjadi :
N-organik + H2SO4 pekat → CO2+H2O+(NH4)2SO4(N-anorganik) (Destruksi)
(NH4)2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O (Destilasi)
NH3 + H3BO3 + Conway → NH4H2BO3 (hijau) (Destilasi)
NH4H2BO3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H3BO4 (Titrasi)
21
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri
Pada penelitian ini berhasil diisolasi 4 isolat bakteri yang berpotensi
sebagai bakteri pendegadasi selulosa yang berasal dari jerami padi di daerah
sawah Dramaga dan 1 isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu di daerah
kota Bogor. Keempat isolat yang berasal dari jerami padi diberi kode dengan
nama JP71, JP72. JP91, dan JP92. Huruf JP pada kode isolat adalah kependekan
dari jerami padi dan satu isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu diberi
kode dengan nama DDH92. Tabel 3 menunjukkan karakter koloni tersebut.
Karakter isolat DDH92 berbeda dengan keempat isolat yang berasal dari
jerami padi. Koloni dari isolat DDH92 menunjukkan adanya miselium. Koloni
Actinomycetes muncul perlahan ,menunjukkan konsistensi berbubuk dan melekat
erat pada permukaan media. Pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan
adanya miselium ramping bersel satu yang bercabang membentuk spora aseksual
untuk perkembangbiakannya (Nonomura dan Ohara, 1971). Rentang pH yang
paling cocok untuk perkembangbiakan Actinomycetes adalah antara 6,5-8,0.
Tanah yang tergenang air tidak cocok untuk pertumbuhan Actinomycetes,
sedangkan tanah gurun yang kering atau setengah kering dapat mempertahankan
populasi dalam jumlah cukup besar, karena adanya spora (Nonomura dan Ohara,
1971).
Table 3. Morfologi koloni bakteri
No Kode Isolat Bentuk Pinggiran Warna miselium
1 JP71 Bulat Utuh Merah -
2 JP72 Bulat Utuh Merah -
3 JP91 Bulat Utuh Merah -
4 JP92 Bulat Utuh Merah -
5 DDH92 Bulat Utuh Merah +
22
4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif
Uji degadasi adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui seberapa besar
kemampuan isolat bakteri untuk mendegadasi selulosa. Uji HC dilakukan dengan
menggunakan medium padat Congo Red Agar (CCRA) yang mengandung 2
macam material selulotik yaitu Carboxymethylcellulose (CMC) dan filtrat dari
serbuk jerami padi. Ratio HC menunjukkan kemampuan isolat bakteri yang
diperoleh dalam mendegadasi selulosa yang diindikasikan dengan terbentuknya
zona bening. Ratio HC adalah perbandingan antara diameter zona bening dengan
diameter koloni. (Sudiana et al., 2002).
Uji degadasi dengan menggunakan metode zona bening adalah uji semi
karena data hanya berupa perbandingan antara diameter zona bening dan dengan
diameter koloni. Kesulitan metode ini adalah apabila bentuk koloni atau zona
bening yang dihasilkan tidak benar-benar berbentuk bulat, atau bahkan tidak bulat
sama sekali. Zona bening yang terbentuk terkait dengan kelarutan dari enzim
selulase. Semakin tinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka akan semakin besar
zona bening yang terbentuk. Diameter zona bening umumnya berukuran lebih
besar dibandingkan dengan diameter koloni, karena enzim selulase disekresikan
ke lingkungan sekitarnya oleh bakteri pendegadasi selulosa. Bakteri tidak dapat
memasukkan molekul selulosa, karena ukuran selulosa lebih besar daripada
ukuran sel bakteri. ( Zverlova et al., 2003)
Luas zona bening tergantung pada konsentrasi CMC dan agar yang
digunakan. Semakin banyak CMC dan agar yang digunakan semakin tinggi
kepadatan medium. Semakin tinggi konsentrasi agar, semakin kecil pori medium
sehingga enzim selulase yang disekresikan lebih sulit melewati pori tersebut dan
mengakibatkan terhambatnya proses degadasi. Demikian pula sebaliknya. Namun
penggunaan agar pada medium yang digunakan juga tidak boleh terlalu sedikit,
penggunaan agar dibawah 0,8% menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankin and
Anagnostakis, 1997), medium menjadi terlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi
dan inokulasi. Pada awal penelitian ini agar yang semula digunakan adalah 0,5 %,
namun karena medium yang dihasilkan terlalu lunak maka agar ditingkatkan
menjadi 1,5%.
23
Berdasarkan ratio HC pada hari ke-5 masa inkubasi, isolat JP 72 adalah
yang mempunyai kemampuan tertinggi dalam mendegadasi CMC dan filtrat
serbuk jerami padi sebesar 6,67 yang kemudian diikuti oleh isolat JP71 sebesar
4,5, JP91 sebesar 4,5, JP92 sebesar 3,09 dan DDH92 sebesar 1,25 (Lampiran 7).
Sedangkan untuk isolat DDH92 ratio HC lebih kecil dibandingkan isolat yang
lain, akan tetapi zona beningnya dapat terlihat dengan jelas. Hal ini disebabkan
oleh pembentukan koloni yang perlahan.
4.3 Analisis Kompos Jerami Padi
Analisis kompos jerami padi dilakukan untuk menentukan penurunan rata-
rata bobot, tinggi tumpukan, kadar selulosa, dan kadar lignin dari jerami padi.
Hidrolisis selulosa jerami padi menggunakan 2 isolat saja yaitu isolat JP72 yang
berasal dari jerami padi dan isolat DDH92 yang berasal dari rhizosfer tanah
bambu, dilihat dari rasio HC terbesar dan perbedaan sampel. Proses inkubasi
selama 30 hari dilakukan secara non steril karena pengaplikasian ini secara
aerobik dan prosesnya lebih mudah dibandingkan jika harus steril. Sehingga
menggunakan kontrol sebagai pembanding isolat yang diinkubasikan dan kontrol
juga mengalami penurunan dalam analisis karena masih terdapat mikroba alami
pada jerami padi.
4.3.1 Bobot Jerami Padi
Analisis hasil inkubasi jerami padi selama 30 hari, didapatkan bahwa
isolat DDH92 lebih banyak menurunkan bobot jerami padi sebesar 26,67%. Isolat
JP72 sebesar 20% dan kontrol sebesar 13,33%. Hal ini membuktikan bahwa
semakin menurun bobot jerami padi yang diinkubasi maka semakin menurun
kadar C-0rganik pada jerami padi, maka isolat DDH92 lebih baik dalam
mendegadasi jerami padi.
Tabel 4. Hasil uji penurunan bobot jerami padi setelah inkubasi selama 30 hari
No Kode Isolat Rata-rata penurunan berat kering (%)
1 JP72 20,00
2 DDH92 26,67
3 Kontrol 13,33
24
4.3.2 Tinggi Tumpukan Jerami Padi
Proses inkubasi jerami padi menggunakan keranjang yang berukuran
panjang 37 cm, lebar 32,5 cm dan tinggi 18,5 cm. Proses inkubasi ini akan
menurunkan tinggi dari jerami padi karena glukosa yang terbentuk sebagian akan
dijadikan sebagai sumber makanan bakteri. Glukosa diubah menjadi CO2 dan H2O
yang nantinya CO2 akan terbang ke udara karena bersifat gas. Pada penelitian ini,
isolat DDH92 mampu menurunkan tinggi menjadi 6 cm, isolat JP72 menjadi 7cm
dan kontrol menjadi 8 cm.
Gambar 7. Penurunan tinggi Tumpukan jerami padi
4.3.3 Kadar Selulosa
Jerami padi adalah limbah selulosa yang merupakan unsur pokok pada
tanaman dan merupakan komponen yang dihidrolisis menjadi glukosa sehingga
perlu untuk mengetahui penurunan kadar selulosa selama inkubasi. Penurunan
kadar selulosa setelah inkubasi selama 30 hari secara non steril tertinggi adalah
pengomposan oleh isolat DDH92 menjadi 8,047%. Sedangkan isolat JP72 selama
30 hari menjadi 10,704% dan kontrol mengalami penurunan menjadi 11,119%.
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30
Tin
ggi t
um
pu
kan
(cm
)
Waktu Inkubasi (hari)
Kontrol
JP72
DDH92
25
Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 mampu menghidrolisis jerami padi
lebih cepat dibandingkan dengan isolat JP72.
Gambar 8. Penurunan kadar selulosa selama 30hari.
4.3.4 Kadar Lignin
Fungsi utama lignin adalah memperkuat struktur tanaman dalam menahan
terhadap serangan mikroba dan tekanan oksidasi (Hendriks dan Zeeman, 2009).
Sehingga perlu adanya penghilangan lignin agar dalam mendegadasi selulosa
tidak terhalangi oleh senyawa ini. Pada penelitian ini. Isolat DDH92 mampu
menurunkan kadar lignin menjadi 7,56% yang semula kadarnya adalah 14,4%.
Hal ini menunjukkan bahwa isolat DDH92 mampu mendegadasi lignin sebesar
47,5%.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 5 10 15 20 25 30
Kad
ar S
elu
losa
(%
)
Waktu Inkubasi (hari)
Kontrol
JP72
DDH92
26
Gambar 9. Penurunan kadar lignin selama 30 hari.
4.4 Aktivitas enzim selulase umur 30 hari
Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau
kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim
selulase didefinisikan sebagai jumalah enzim yang menghasilkan satu mikromol
gula reduksi (glukosa) setiap menit (Lehninger, 1982).
Penelitian ini aktivitas enzim selulase pada isolat DDH92 cukup besar
yaitu sebesar 50,675x10-3
U/mL sedangkan isolat JP72 sebesar 26,9x10-3
U/mL.
Pada uji rasio HC, isolat JP72 lebih besar dibandingkan dengan isolat DDH92
yaitu 6,67:1,25. Tetapi pembentukan zona bening pada isolat JP72 tidak terlalu
jelas seperti isolat DDH92. Hal ini membuktikan bahwa enzim selulase dari isolat
DDH72 mampu mendegadasi substrat dalam bentuk amorf dan kristalin. Sehingga
aktivitas enzim dari isolat DDH92 lebih besar dibandingkan dengan isolat JP72.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25 30
Kad
ar L
ign
in (
%)
Waktu Inkubasi (hari)
Kontrol
JP72
DDH92
27
Gambar 10. Aktivitas enzim selulase umur 30 hari.
Pada penelitian yang dilakukan oleh LIPI, menyatakan bahwa isolat
Actynonomycetes dari genus streptomyces yang berasal dari Taman Nasional
Bukit Duabelas Jambi memiliki aktivitas selulase sebesar 13,4 x 10-3
U/mL. Isolat
DDH92 sangat potensial untuk bahan dekomposer karena laju hidrolisisnya
sangat berpotensi untuk mendekomposisi jerami padi.
4.5 Rasio C/N
Kompos adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai
penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek
menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari
bakteri, kapang, Actinomycetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah
lignoselulosa (Mtui, 2009).
Dalam permentan No.06/Permentan/SR.130/2/2011, tentang pupuk
organik pembenah tanh, dikemukakan bahwa rasio C/N dari bahan organik <20.
Definisi tersebut menunjukkan bahwa pupuk organik lebih ditujukan kepada
kandungan C-organik, nilai C-organik itulah yang menjadi pembeda pupuk
organik dengan pupuk anorganik.
Dalam penelitian, isolat DDH92 mampu menurunkan rasio C/N menjadi
19,38 selama 30 hari. Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 dapat dijadikan
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Kontrol JP72 DDH92
Laju
Hid
rolis
i (U
nit
/mL)
Kode Isolat
28
sebagai bahan dekomposer karena mampu menurukan rasio C/N di bawah 20
sesuai dengan peraturan pemerintah.
Tabel 5. Rasio C/N jerami padi yang diberi decomposer selama 30 hari inkubasi
nonsteril.
Kode Isolat Kadar C (%) Kadar N (%) Rasio C/N
Kontrol 86,938 1,682 51,687
JP72 59,479 1,647 36.113
DDH92 33,258 1,716 19,381
Dari data tabel diketahui bahwa rasio C/n dari Kontrol dan isolate JP72 masih di
atas 20, padahal kadar selulosa dari ketiga perlakuan ini hamper sama.
Dikarenakan mikroba pada Kontrol dan JP72 baru memotong ikatan hingga ke
tahap oligosakarida dan disakarida belum mencapai glukosa yang nantinya
dijadikan sumber makanan bagi mikroba yang akan menghasilkan CO2 yang akan
terbang ke udara, sehingga kadar C-organik dalam kontrol dan JP72 masih tinggi.
29
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Isolat DDH92 yang merupakan golongan dari Actinomycetes berpotensi
sebagai agensia dekomposer jerami padi. Isolat ini memiliki aktivitas enzim
selulase yang tinggi, yaitu sebesar 50,675x10-3
U/mL, sehingga baik untuk proses
hidrolisis enzimatis lignoselulosa menjadi glukosa sebagai bahan baku fermentasi
bioetanol.
Nilai tambah dari isolat DDH72 adalah untuk pengomposan jerami padi
karena mampu menurunkan rasio C/N menjadi sebesar 19,38 selama 30 hari
sesuai dengan standar kriteria kompos yang bagus yaitu rasio C/N 20. Kompos
jerami padi yang dihasilkan bertekstur lunak dan berwarna kehitaman mirip
humus.
5.2 Saran
Penelitian selanjutnya disarankan untuk mengidentifikasi spesies mikroba
selulolitik pada penelitian ini. Aplikasi isolat mikroba ini pada media CCRA
hendaknya dilakukan optimasi pertumbuhan mikroba lebih dahulu. Pengomposan
limbah lignoselulosa tidak hanya untuk jerami padi tapi diharapkan untuk bahan
lignoselulosa lain yang memiliki kadar C-organik yang tinggi.
30
DAFTAR PUSTAKA
Abdulla, H.M. 2007. Enhancement of rice straw composting by lignocellulolytic
actinomycete strains. Int. J. of Agiculture & Biology. Vol. 9(1), 106-109.
Ahmed, Z., H. Banu, M.M, Rahman, F. Akhter & M.S. Haque. 2001. Microbial
activity on the degradation of lignocellulosic polysaccharides. Journal of
biological sciences. 1(10):993- 997.
Beguin, P. & J.P. Aubert. 1994. The Biological degradation of cellulose. FEMS
Microbiology Reviews, 13: 25-58.
Bhat, M.K. & S. Bhat. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potensial
industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583.
Bhat, M. K. 2000. Cellulose and releted enzymes ln biotechnology. Biotecnology
Advanteces, 18: 355-358.
Coughlan, M. P. 1985. The properties of fungal and bacterial cellulases with
comment on their production and application. Biotechnology Genetic
Engineering. Review, 3: 39-109.
Datta, A., A. Betterman, & T.K. Kirk. 1981. Identification of spesific manganese
peroxidase among lignolitic enzym secreted by Phanerochaete
chrysosporium during wood decay, Appl. Environ. Microbiol. 57 : 1453 –
1460.
Denman, S., G. Xue, & B. Patel. 1996. Characterisation of Neocallomastix
patriciarum cellulose cDNA (CelA) homologus to Tricoderma reesei
cellobiohydrolase II. Applied. Environ. Microbiol, 62:1889- 1896.
Enny, H.L. 2008. Optimasi proses hidrolisis kimiawi dan enzimatis tandan kosong
kelapa sawit menjadi glukosa untuk produksi etanol. Thesis. PAU
Bioteknologi IPB, Bogor.
Fengel, D., & G. Wegener. 1995. Kayu : Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi.
Diterjemahkan oleh Hardjono Sastrohamidjoyo. Cetakan I, Gajah Mada
University Press, Yogyakarta. Hal. 124-154.
Glazer, A. N., & H. Nikaido. 2007. Microbial biotechnology: Fundamentals of
Applied Microbiology, second edition. Cambridge : USA
31
Hankin, L., & S.L. Anagnostakis. 1997. Solid media containing
carboxymethylcellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms.
Journal of General Microbiology. 98:109- 115.
Hatami, S., H.A. Alikhani, H. Besharati, N. Salehrastin, M. Afrousheh, & Y.Z.
Jahromi. 2008. Investigation on aerobic cellulolytic bacteria in some of
north forest and farming soils. American-Eurasian J. Agic. & Environ. Sci.
3 (5): 713-716.
Hendricks, C.W., J.D. Doyle & B. Hugley. 1995. A new solid media for
enumerating cellulose-utilizing Bacteria in soil. Environmental Research
Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency,1 and Mantech
Environmental Technology, inc.,2 corvallis: Oregon.
Hendriks, A.T.W.M., & G. Zeeman. 2009. Pretreatments to enhance the
digestibility of lignocellulose biomass. Biores Technol. 100, 10-18.
Howard R.L., E. Abotsi, E.L.J. van Rensburg & S. Howard. 2003. Lignocellulose
biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African J.
Biotechnol. 2(12):602-619.
Isroi. 2010. Pemanfaatan jerami padi sebagai pupuk organik in situ untuk
mengurangi penggunaan pupuk kimia dan subsidi pupuk.
http://isroi.wordpress.com/2010/02/12/4905/.
Judoamidjojo R.M Said EG & L. Hartoto. 1989. Biokonversi. PAU Bioteknologi
IPB, Bogor.
Kim, C. H., & D. S. Kim. 1995. Purification and specificity of a specific endo-β-
D-glucanase (Avicelase II) resembling exocellobiohydrolase from Bacillus
circulans. Enzyme and Microbial Technology, 17: 248-254.
Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Lu, W.J., H. Wang, S. Yang, Z. Wang, & Y. Nie. 2005. Isolation and
characterization of mesophilic cellulose-degading bacteria from flower
stalks- vegetable waste co-composting system. J.Gen.Appl.Microbiol. 51:
353- 360.
Malik, F.R., S. Ahmed, & Y.M. Rizki. 2001. Utilization of lignocellulosic waste
for the preparation of nitrogenous biofertilizer. Pakistan J. Biological
Sciences 4(10), 1217-1220.
32
Mandels, M. 1985. Aplication of cellulases. Biochem Society Trans., 13:414-16..
Mattinen, M.L. 1998. Structural and functional studies of fungal cellulose binding
domain by NMR spectroscopy. Academic Dissertation. University of
Helsinki, Finland.
Mtui, Y.S. 2009. Recent advances in pretreatment of lignocellulosic wastes and
production of value added products. African J. of Biotechnology Vol. 8(8),
1398-1415.
Mulcahy. 1996. An investigation of cellulose Binding Domain in non-celululose
binding domains in non-cellulolytic enzymes. Final Year Project University
of Limerick.
Nonomura, H., & Y. Ohara. 1971. Distribution of soil actinomycetes. VIII. Geen
spore Goup of Microtetraspora, Its Preferential Isolation and Taxonomic
Characteristics. 49: 1-7.
Palonen, H. 2004. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses.
Disertation. University of Technology.Helsinki Finland.
Perez, J., J.M. Dorado, T. Rubia, & J. Martinez. 2002. Biodegadation and
biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview.
Int. Microbiol. 5, 53-63.
Singhania. 2009. Cellulolytic enzymes. Biotechnology for Ago-Industrial
Residues Utilization. Chapter 20, 371-381.
Skoog D.A., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of
Analytical Chemistry 8th
Ed. UK : Thomson Brooks.
Sudiana, I. M., A. Kanti, M. Rahmansyah, S. Widawati, Suliasih, R. W. Rahayu &
H. Imanuddin. 2002. Populasi dan karakterisasi bakteri selulotik yang
diisolasi berbegai ketinggian lokasi di taman nasional gunung Halimun.
Laporan Teknik Proyek Inventarisasi dan Karakterisasi Sumberdaya
Hayati, Puslit biologi-LIPI, Indonesia.
Widyastuti, H., Siswanto, & Suharyanto. 2007. Optimasi pertumbuhan dan
aktivitas enzim lignolitik Omphalina sp dan Pleurotus ostreatus pada
fermentasi padat. Menara Perkebunan, 75(2): 93-105.
William, R. & N.S. Govind. 2003. Identification of carbohydrate degading
bacteria in sub-tropical regions. Rev. Biol. Trop., 51, Supl. 4: 205-210.
33
Wood, T. M. 1985. Properties of cellulolytic enzyme systems. Biochem Society
Trans, 13: 407-10.
Zverlova, V. V., W. Holl, & H. Schwarz. 2003. Enzymes for digestion of
cellulose and other polysaccharides in the gut of longhorn beetle larvae,
Rhagium inquisitor L. (Col., Cerambycidae). International Biodeterioration
& Biodegadation. 51:175–179.
34
Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian
Kapasitas Hidrolisis (Diukur
setiap hari selama 5 hari)
Sampel Tanah dan jerami
Isolasi
Pemurnian
Metode CCRA Kualitatif
Metode Kuadran
NA /CCRA (agar miring) penyimpanan
n
Aktivitas Enzim Selulase
Metode DNS
Hidrolisis selulosa
Selama 30 hari
Metode Kuadran
NA /CCRA (agar miring)
Rasio C/N
Hari ke-30
Uji Kadar Selulosa
Metode Chesson
35
Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat
1000 mL
Buffer Salin 0,85 %
90
90 mL x 1 buah
9 mL x 1 buah
99 mL x 4 buah
Autoclaf
1210C 15
menit 1,5 atm
+ sampel 10 gr
Shaker
inkubator
3 jam
90
99
99
ml
ml 99
99
9
ml
1 mL
1 mL
1 mL 1 mL
1 mL
0,1 mL
36
Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 Goresan
Diambil 1 Ose
Digoreskan berurutan dimulai
dari I sampai IV
Dengan diputar setiap goresan.
Pengerjaan dilakukan secara
aseptis dan loop inokulan
dibakar setiap mulai menggores.
Koloni yang terpisah diujung
goresan disebut kultur murni.
IV I
III II
37
Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan Na Miring
Dihomogenkan
1000 mL
aquadest +
nutrient agar 15
gr/L
Dimasukkan 5 mL Na ke
dalam tabung ulir
Disterilkan
Dimiringkan
38
Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa
Jerami 1,5 kg dianalisis
kadar selulosa
Dicacah Direndam selama
1 malam
Ditiriskan selama
2 jam
Disimpan dalam keranjang
plastik A, B, C
Dicampurkan
inokulan 5% dan
diaduk rata
Diinkubasi selama
30 hari
Dijaga kelembabannya
dengan disemprotkan
dengan air
A → Air Steril
B → Jerami
C → Bambu
39
Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase
Pengambilan enzim → 10 g sampel yang dikomposkan + 30 mL buffer phosphate
pH 7,0 diblender dan sentrifugasi 10.000rpm, supernatan di ambil.
Sample blanko baku glukosa
1mL supernatan 1mL supernatan 1mL A + 1mL B
+ 1mL substrat + 1mL A
+ 3 mL larutan C + 3 mL larutan C
+ 1 mL larutan D + 1 mL larutan D
Ukur ABS λ= 570 nm Ukur ABS λ= 570 nm
Ket :
Larutan A : Larutan buffer phosphat
1,779 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 100 ml H2O
Larutan B : Larutan stok glukosa 0,1 M (dalam larutan A)
Larutan C : Larutan DNS 1% → DNS 10 gr, fenol 2 gr, NaSO4 0,5 gr, NaOH
10 gr dalam 1 L H2O
Larutan D : K Na tartrat 40%
Larutan Substrat : CMC 1% ( 1 gr dalam 100 mL larutan A)
Inkubasi 30menit 500C
Dididihkan 5-15 menit
Didinginkan
40
Lampiran 7. Tabel Rasio HC
Kode
Isolat
JP71 JP72 JP91 JP92 DDH92
Waktu
(Hari)
DZB
(cm)
DK
(cm)
HC DZB
(cm)
DK
(cm)
HC DZB
(cm)
DK
(cm)
HC DZB
(cm)
DK
(cm)
HC DZB
(cm)
DK
(cm)
HC
1 2,7 1 2,7 2,0 0,5 4,0 2,5 0,9 2,8 1,0 0,5 2,0 0,10 0,05 2,00
2 4,0 1 4,0 3,0 0,5 6,0 3,2 0,9 3,5 2,0 0,5 4,0 0,15 0,05 3,00
3 4,2 1 4,2 3,5 0,6 5,8 4,0 0,9 4,4 2,7 0,7 3,8 0,20 0,10 2,00
4 4,4 1 4,4 3,8 0,6 6,3 4,1 0,9 4,5 3,0 0,9 3,3 0,30 0,20 1,50
5 4,5 1 4,5 4,0 0,6 6,6 4,5 1,0 4,5 3,4 1,1 3,1 0,50 0,40 1,25
Keterangan : DZB = Diameter Zona bening
DK = Diameter Koloni
HC = Hidrolysis Capacity
41
Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi
% penurunan bobot kontrol = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%
% penurunan bobot kontrol = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠 − 𝟏,𝟑 𝐤𝐠
𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%
% penurunan bobot kontrol = 13,33 %
% penurunan bobot JP72 = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%
% penurunan bobot JP72 = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟐 𝐤𝐠
𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%
% penurunan bobot JP72 = 20 %
% penurunan bobot DDH92 = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%
% penurunan bobot DDH92 = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟏 𝐤𝐠
𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%
% penurunan bobot DDH92 = 26,67 %
42
Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa
Kadar a = 1,000 g
Kadar b = 0,736 g
Kadar c = 0,711 g
Kadar d = 0,299 g
Kadar e = 0,137 g
% selulosa = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒄−𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 x 100 %
% selulosa = 𝟎,𝟕𝟏𝟏 –𝟎,𝟐𝟗𝟗
𝟏,𝟎𝟎𝟎 x 100 %
% selulosa = 𝟒𝟏, 𝟐 %
Hari ke- Kadar Selulosa Kontrol
(%)
Kadar Selulosa
JP72 (%)
Kadar Selulosa
DDH92 (%)
0 39,400 39,400 39,400
10 34,340 32,213 22,413
20 15,305 10,746 8,613
30 11,119 10,704 8,047
43
Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin
Kadar a = 1,000 g
Kadar b = 0,736 g
Kadar c = 0,711 g
Kadar d = 0,299 g
Kadar e = 0,137 g
% Lignin = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅 − 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒆
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 x 100 %
% Lignin = 𝟎,𝟐𝟗𝟗 –𝟎,𝟏𝟑𝟕
𝟏,𝟎𝟎𝟎 x 100 %
% Lignin = 𝟏𝟔, 𝟐 %
Hari ke- Kadar Lignin Kontrol
(%)
Kadar Lignin
JP72 (%)
Kadar Lignin
DDH92 (%)
0 14,400 14,400 14,400
10 10,940 10,467 10,647
20 8,885 8,792 8,112
30 7,913 7,624 7,560
44
Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas enzim selulase
Aktivitas selulase ( U/mL ) = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒇𝒂𝒌𝒕𝒐𝒓 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏
𝑩𝑴 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒘𝒂𝒌𝒕𝒖 𝒊𝒏𝒌𝒖𝒃𝒂𝒔𝒊 (𝒎𝒆𝒏𝒊𝒕)
Aktivitas selulase ( U/mL ) = 𝟐𝟗𝟑,𝟎𝟐 𝒙 𝟏
𝟏𝟖𝟎 𝒙 𝟑𝟎
Aktivitas selulase ( U/mL ) = 54,43
No Kode islolat Absorbansi Konsentrasi (ppm) Aktivitas enzim
(U/mL)
1 Kontrol 1 0,091 105,39 25,07 x 10-3
2 Kontrol 2 0,092 105,39 25,07 x 10-3
3 JP72 1 0,142 144,36 26,72 x 10-3
4 JP72 2 0.145 146,32 27,09 x 10-3
5 DDH92 1 0,336 293,02 54,43 x 10-3
6 DDH92 2 0,284 253,40 46,92 x 10-3
Gambar kurva standar Glukosa
y = 0.002x - 0.009R² = 0.990
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 100 200 300 400 500
abso
rban
si
ppm
Kurva Standar Glukosa
Linear (Kurva Standar Glukosa)
45
Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik
% C-organik Kontrol = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%
% C-organik Kontrol = 𝟖𝟓,𝟐 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟖
𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%
% C-organik Kontrol = 86,938 %
% C-organik JP72 = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%
% C-organik JP72 = 𝟓𝟕,𝟏 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟔
𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%
% C-organik JP72 = 59,479 %
% C-organik DDH92 = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%
% C-organik DDH92 = 𝟑𝟏,𝟓𝟗𝟔 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟓
𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%
% C-organik DDH92 = 33,258 %
Gambar Kurva Standar C-organik
y = 601.2x - 0.677R² = 0.999
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300
abso
rban
si
ppm
Konsentrasi (ppm)
Linear (Konsentrasi (ppm))
46
Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (nitrogen)
% kadar N Kontrol = 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍−𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒙 𝑵 𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝑨𝒓 𝑵
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 x 100 %
% kadar N Kontrol = 𝟐𝟒,𝟗𝒎𝑳 –𝟐𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟎,𝟎𝟒𝟗𝑵 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖
𝟐𝟎𝟎𝒎𝒈 x 100 %
% kadar N Kontrol = 𝟏, 𝟔𝟖𝟐 %
% kadar N JP72 = 𝟏, 𝟔𝟒𝟕 %
% kadar N DDH92 = 𝟏, 𝟕𝟏𝟔 %
47
Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi
Rasio C/N DDH92 = 𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑪
𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑵
Rasio C/N DDH92 = 𝟑𝟑,𝟐𝟓𝟖
𝟏,𝟕𝟏𝟔
Rasio C/N DDH92 = 19,381
Kode Isolat Kadar C (%) Kadar N (%) Rasio C/N
Kontrol 86,938 1,682 51,687
JP72 59,479 1,647 36.113
DDH92 33,258 1,716 19,381
48
Lampiran 15. Gambar hasil Penelitian
Gambar kontrol dan bakteri selulolitik berasal dari jermi padi
Gambar medim cair isolat DDH92 Gambar isolat DDH92 pada media CCRA
Gambar kompos jerami padi dari kiri, control, JP72, dan DDH92.
49
Gambar isolat DDH92
Gambar jerami padi sebelum perlakuan
Gambar jerami sesudah perlakuan selama 30 hari dengan inokulum isolat DDH92