Pola plasma proteomik sebagai biomarker

untuk kanker ovarium

Latar Belakang

Deteksi dini kanker ovarium masih menjadi tantangan. Tujuan dari penelitian ini adalah

untuk mengidentifikasi dan membedakan biomarker baru protein plasma pada pasien kanker

ovarium yang normal maupun ganas menggunakan metode SELDI Spektroskopi Massa.

SELDI spektroskopi massa merupakan variasi dari matriks yang dibantu laser yang desorpsi /

ionisasi (MALDI) menggunakan target yang dimodifikasi untuk mencapai afinitas biokimia

dengan senyawa analit.

Bahan dan Metode

Pasien dan spesimen

o Plasma (diambil sebelum operasi)

o Pasien yang memiliki kanker ovarium, pasien sehat dan pasien manula

Bahan

o WCX2

o SAX

o Cu Metal-binding protein chip

o SELDI MS

o Buffer posfat

Preparasi matriks dan kalibrasi SELDI

Kalibrasi seldi dilakukan setiap akan dianalisis. Matriks asam sinapinic disiapkan

baru pada saat akan digunakan secara berurutan pada 125 IL dari asetonitril dan 125

IL dari 1% asam trifluoroasetat kedalam aliquot dari matriks. Matriks sudah di vortex

dan disimpan dalam tempat gelap. Sebelum digunakan, matriks dimikrofugasi dengan

kecepatan 13.000rpm selama 1 menit. Untuk tujuan kalibrasi, bercak h4 chip yang

diisi 2 IL dari matriks yang berisi semua protein standar . termasuk campuran

sitokrom C(12.2 kD). Mioglobin (17,0 kD), dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat

(35,7 kD), albumin (66,4 kD), dan beta-galaktosidase (116,4 kD). Setelah

pengeringan udara, campuran dianalisis pada sistem SELDI menggunakan parameter

akuisisi massa yang tinggi dari 40 kD, berbagai massa optimum 3-20 kd, Intensitas

laser 210, sensitivitas 10, dan 50 mengumpulkan transien di seluruh permukaan

tempat. Alat telah terkalibrasi bila terlihat satu puncak dan dua puncak untuk setiap

kalibran.

Metode

Analisis berbagai Protein Chip

Perbedaan Tiga chip kimia yaitu kation (WCX2), anionic (SAX2), dan ikatan logam

Cu diuji untuk menentukan profil plasma yang terbaik dilihat dalam jumlah dan

resolusi puncak protein . Hal ini menunjukkan bahwa chip WCX2 dan SAX2

memberikan hasil terbaik .

Analisis WCX2 Chip

Delapan spot dari chip WCX2 dibilas dengan 50 mmol / L natrium asetat ( pH

4.0 ) sebanyak dua kali. Kemudian ditambahkan dapar natrium asetat kedalam

sampel plasma untuk membuat larutan dengan pengenceran 1:10 . Tiga

mikroliter plasma yang sudah diencerkan kemudian ditambahkan dengan chip

protein lalu diinkubasi selama 30 menit pada shaker. Setelah dibilas dengan

dapar natrium asetat sebanyak tiga kali ,kemudian dibilas dengan air mengalir.

0,5µL asam sinapinic jenuh(thoxy - 4 - hydroxycinnamic 3,5- dime) ditotolkan

kembali pada setiap spot lalu dibiarkan kering dengan diangin-anginkan.

Kemudian chip dianalisis dengan Ciphergen ProteinChip Reader, PBSII

( CiphergenBiosystems , Inc. ).

Analisis SAX2 Chip

Sampel plasma yang sudah di encerkan (1 : 10) dianalisis dengan chip SAX2

sesuai aturan pengerjaan (CiphergenBiosystems , Inc.). Secara singkat, setiap

spot harus diaktivasi dengan larutan dapar (1µL phosphate- buffered saline / 0,1

% Triton X - 100 , pH 7,5) pada suhu kamar selama 15 menit. Tiga mikroliter

sampel yang sudah diencerkan lalu ditambahkan kedalam chip SAX2 kemudian

diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Chip dibilas sebanyak dua kali

dengan larutan dapar dan sekali H2O untuk analisis KCKT lalu diangin-anginkan

hinga kering. Secara teratur chip dibilas dengan asam sinapinic jenuh (dengan 50

% asetonitrildan 0,5 % tri flasamuoroacetic). Chip kemudian dianalisis dengan

Ciphergen Protein Chip Reader, PBSII (CiphergenBiosystems , Inc.) .

Penilaian stabilitas sampel

Untuk mengevaluasi stabilitas plasma selama proses percobaan sebelum analisis

SELDI, percobaan skala pilot dilakukan di mana sampel melewati satu atau dua

siklus freeze-thaw dipengaruhi oleh durasi yang berbeda pada proses

penyimpanan pada suhu kamar atau di atases. Efekdari siklus freeze-thaw pada

puncak profil diuji dengan pembanding sampel yang sesuai (plus dan minus

freeze - thaw) pada waktu nol (t0). Pengaruh suhu penyimpanan diuji dengan

melihat perubahan intensitas puncak pada periode 2jam pada suhu dibawah 40C

atau suhu kamar setelah satu siklus freeze-thaw.

Bioinformatika dan biostatistik

Klasifikasi model dibuat dengan Software Biomarker Pattern (BPS,

CiphergenBiosystems, Inc.). Pengolahan data terdiri dari 65 sampel plasma (30

dari pasien dengan kanker ovarium dan 35 dari individu yang sehat). BPS

menggunakan informasi puncak yang dihasilkan oleh probandus untuk membuat

algoritma.Fungsi algoritma menetapkan masing-masing sampel didisribusikan

kedalam dua kelompok berdasarkan intensitas puncak tertentu atau splitter.

Sebagai contoh, jika intensitas puncak sampel lebih rendah dari atau sama

dengan ambang batas, sampel ini akan cenderung kesisi kiri. Jika tidak, sampel

akan cenderung kesisi kanan. Proses ini akan berlangsung sampai sampel

memasuki batas kelompok. Puncak dibawah berlabel CON (kontrol plasma) atau

puncak diatas berlabel T (plasma tumor). Spesifisitas dan sensitivitas masing-

masing dihitung dan diidentifikasi untuk mengetahui proporsi jumlah sampel non-

acancer dan cancer.

Result

Intensitas puncak yang dihasilkan dipindahkan ke BPS untuk melihat puncak yang

paling benar untuk mengklasifikasikan sampel. Dengan profil protein SAX2 Chip

menghasilkan tiga puncak dengan Mr dari 8.780,48, 11.537,7, dan 5.147,06, ternyata

menjadi penentu puncak terbaik. Pada node 1 (puncak 8.780,48) 25 kontrol dan 1 kanker

puncak intensitas yang dihasilkan lebih tinggi dari 18,986 yang diklasifikasikan ke dalam

terminal simpul 4. Sedangkan 39 sampel lainnya yang diklasifikasikan lebih lanjut pada

simpul 2 (puncak 11.537,7) dimana 8 kontrol dan 2 kanker dengan puncak intensitas yang

lebih rendah dari atau sama dengan 0,626 diklasifikasikan ke node terminal 1. 29 sampel

lainnya masuk simpul 3 (puncak 5.147,06) dimana 2 kontrol dengan puncak intensitas

lebih rendah dari atau sama dengan 0,251 diklasifikasikan ke terminal node 2. Sisa dari

27 sampel kanker yang diklasifikasikan ke node terminal 3. Secara keseluruhan dari 65

sampel, model yang benar diklasifikasikan semua 35 kontrol dan 27 dari 30 kanker

mencapai sensitivitas 90% dan spesifisitas 100%. Tiga puncak dengan Mr 11.522,6,

6.190,48, dan 5.295,5, ternyata menjadi yang terbaik untuk menentukan titik puncak dari

profil protein Chip WCX2. Di antara 56 sampel yang menggunakan spektrum SELDI-

TOF berhasil membedakan semua 29 kontrol dan 26 dari 27 jenis kanker dan mencapai

kepekaan dari 96,3% dan spesifisitas 100%.