PENGGUNAAN EKSTRAKSI FASA PADAT UNTUKANALISIS TETRASIKLIN DALAM CONTOH UDANG

Evita Boes, Julia Kantasubrata dan A.T. Karossi

Pusat Penelitian dan Pengembangan Kimia Terapan - LlPI

Jalan Cisitu - Sangkuriang, Bandung 40135

INTISARIUdang beku Indonesia banyak diekspor ke Jepang dan Amerika

Serikat, akan tetapi produk ini seringkali ditolak karena mengandungcemaran derivat tetrasikiin. Analisa kualitatif yang dilakukan terhadapcontoh udang yang akan diekspor menggunakan HPLC menunjukkanadanya cemaran oksitetrasiklin dan tetrasiklin. Analisis kuanutatifcemaran tersebut mengalami gangguan karena terdapat beberapa puncakyang berasal dari bahan matriks, yang terelusi berdekatan dengan puncaksenyawa yang akan dianalisa. Dalam penelitian ini telah dicoba peng-gunaan ekstraksi [asa padat (Solid Phase Extraction, disingkat SPE)untuk menghllangkan puncak senyawa yang berasal dari bahan matnks,sehingga analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan lebih teliti. Per-lakuan pendahuluan contoh menggunakan SPE, selain dapat memisahkansenyawa yang akan dianalisa dari ketidakmurnian yang terdapat dalambahan matriks, juga dapat mengkonsentrasikan kandungan derivattetrastklin dalam ekstrak contoh yang akan dianalisis. Perolehan kembalidari proses elusi kolom SPE cukup baik (±90%) dan kapasitas kolom SPE- Octadecyl 1 ml berkisar dart 2,4-7,9 1l8; 3,5-11,8 1l8; 3,4-11,2 Il8 dan17,3-57,5 Il8 berturut-turut untuk oksitetrasiklin, tetrasiklin, demeklosiklindan dosisiklin.

ABSTRACTA great quantity of Indonesian frozen prawns were exported to Japan

and America. Unfortunately these products have often been rejected dueto their content of tetracycline derivative residues. Qualitative analysis offrozen prawn samples being exported by means of HPLC, indicated thatthey are contaminated by oxytetracycline and tetracycline residues. Aproblem of quantitative analysis of such residues could be due to severalpeaks of the matrix being eluted closely to the peaks of the tetracyclinederivatives. An experiment was carried out to eliminate the peaks of thematrix origin using SPE (Solid Phase Extraction) in order to quantify thederivatives more accurately. Application of SPE in the samplepretreatment is useful not only for separating the solute being analyzedfrom the matrixs, but also for concentrating the tetracycline derivativesof the extract. The recovery of SPE column elution process was about 90%and the SPE octadecyl (1 ml) column capacity for oxytetracycline,tetracycline, demeclocycline and doxycycline i.e. 2.4-7.9 f'8; 3.5-11.8 fig;3.4-11.21l8 and 17.3-57.51l8 respectively.

PENDAHULUAN

Direktorat Jendral Perikanan menghimbau para petanitambak udang untuk tidak menggunakan antibiotik pad akegiatan produksi udang, mulai dari pembibitan, budidayatambak, dan pembuatan. pakan. Penggunaan antibiotik yangberupa derivat tetrasiklin dikhawatirkan akan menimbulkan

74

pencemaran terhadap 'udang yang dihasilkan, karena anti-biotik berkadar tinggi dapat merusak jaringan sel otak (6).Himbauan tersebut dilontarkan sehubungan dengan terjadi-nya penolakan udang beku ekspor dari Indonesia keJepang, karena temyata mengandung tetrasiklin. Udangyang ditolak tersebut berasal dari Sumatera Utara yangpada tanggal 4 Desember 1991 ditemukan mengandungresidu tetrasiklin dengan kadar 3,4 ppm. Akibatnya setiapekspor udang ke Jepang dikenakan pemeriksaan dan peng-.ujian laboratorium oleh pihak Jepang. Untuk itu diperlukaasuatu metode analisa pengujian antibiotik dalam udangkarena memang belum tercantum dalam metoda standarpengujian nasional untuk produk perikanan (7,8). Dikenbeberapa macam antibiotik tetras'iklin diantaranya mi-nosiklin, oksitetrasiklin, tetrasiklin, k1ortetrasiklin, de-meklosiklin, dan dosisiklin. Derivat-derivat ini sering di-gunakan sebagai antibiotik untuk temak (1,2).

Dari hasil penelitian terdahulu telah didapat kondis;pemisahan derivat tetrasiklin menggunakan kromatograficairan tekanan tinggi (HPLC). Kondisi ini diaplikasikuntuk memantau adanya residu tetrasiklin didalam udang,Sebelum ekstrak contoh udang diinjeksikan kedalam kolomHPLC, terlebih dahulu dilakukan proses ekstraksi untumenarik tetrasiklin yang terikat, menggunakan campurametanol dan bufer Mcllvaine. Pada kromatogram contoh,dihasilkan banyak puncak yang berasal dari bahan matriksdan keluamya puncak-puncak tersebut berdekatan denganpuncak senyawa yang dianalisis.

Masalah lain yang timbul adalah persyaratan kandungantetrasiklin didalam udang ada dalam orde ppb. Agar tetra-siklin dalam contoh dapat terdeteksi, maka sebelumdiinjeksikan ke dalam kolom HPLC, kandungan tetrasiklindalam contoh perlu dipekatkan terlebih dahulu. Untumengurangi gangguan matriks dan untuk mengkonsentrasi-kan senyawa yang dianalisa dilakukan preparasi contomenggunakan Ekstraksi Fase Padat (Solid Phase Ex-traction, disingkat SPE). SPE adalah salah satu teknikpreparasi contoh yang didasarkan pada mekanisme pe-misahan kromatografi cairan. Didalam kromatografi cairan,keIarutan dan interaksi gugus fungsi dari contoh, fasa diamdan peIarut akan menyebabkan terjadinya pemisahan. PactaSPE interaksi tersebut tergambarkan dalam proses ekstra

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 199:j

dan elusi pada sebuah kolom mini. Pada proses ekstraksi,komponen yang mempunyai kepolaran relatif sarna denganrasa diam akan terikat pada fasa diam, sedangkan kom-

lain atau bahan matriks dengan kepolaran berbedaeluar bersama filtrat atau dengan kata lain tidakoleh fasa diam. Akan tetapi, komponen pengganggumempunyai kepolaran hampir sarna dengan rasa diam.ikut terikat pada kolom mini, namun pada saat elusi,

en yang spesifik hanya dapat mengelusi komponen yangdianalisis dan diharapkan komponen pengganggu akantetap tinggal pada kolom mini (4). Didalam penelitian iniSPE yang digunakan berupa kolom mini dari SPE fasaterikat Octadecyl (CIS) BAKER-10.

Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari peng-gunaan kolom SPE untuk mengurangi gangguan-gangguanmatriks dan pemekatan senyawa yang dianalisa denganmencari pelarut untuk mengelusi senyawa yang terikatpada kolom SPE.

PERCOBAANPerala tan yang digunakan berupa satu unit peralatan

HPLC yang terdiri dari Pompa BECKMAN 110B, detektorUV BECKMAN M163, kolom analitik u-Bondapak CISdan Integrator SPECTRA PHYSICS 4290 serta satu unitperalatan HPLC SHIMADZU LC 6A dengan detektorPhotodiode Array SPD M6A, Komputer IBM dan Printer P5300. Peralatan lain yang digunakan untuk preparasi contohadalah satu unit sistem BAKER-lO SPE yang terdiri dariwadah BAKER-10 EXTRACTION SYSTEM, rak tabungkoIeksi contoh, tabung 2 ml untuk koleksi contoh, penam-pung dan kolom 1 ml Octadecyl BAKER-lO SPE.

Bahan kimia yang digunakan adalah standar mumiminosiklin-HCI (MC), tetrasiklin-HCI (TC), oksiietrasiklin-HCI (OTC), demeklosiklin-HCI (DMC) dan dosisiklin-HCI(DC) dari SIGMA. Metanol, asetonitril, asam oksalat,asam sitra!~ asam fosfat dan disodium hidrogen fosfatadalah produksi EMER<;K.

Bufer McIlvaine pH 4,5 dibuat dengan melarutkan21,014 gr asam sitrat dan 35,598 gr disodium hidrogenfosfat masing-masing dalam 1 Lair suling. Kemudiandicampurkan 538 ml larutan asam sitrat dan 462 mldisodium hidrogen fosfat dan campuran siap digunakanpada proses ekstraksi (9).

Pemisahan berbagai standar derivat tetrasiklin dilaku-kan dengan teknik HPLC. Larutan larutan standar ini dibuatdengan melarutkan masing-masing 1 mg MC/ml; 2,5 mgOTC/ml; 3,06 mg TC/ml; 5 mg DMC/ml dan 2,5 mgDC/ml dalam metanol. Masing-masing standar sebanyak100 ul, 50 ul, 50 ul, 50 fAl dan 175 fAl berturut-turut untukMC, OTC, TC, DMC dan DC, diencerkan menjadi 1 m!.Campuran larutan standar ini diinjeksikan ke kolom HPLCuntuk mengetahui waktu retensi (1.) masing-masing derivattetrasiklin, menggunakan campuran metanol : asetonitril :

JKTI VOL. 3 - NO.2, Desember, 1993

0,01 M asam oksalat dengan perbandingan (1:1,5:7) se-bagai eluen. Untuk proses ekstraksi, contoh udang yangakan dianalisis dipotong dan dihancurkan dengan meng-gunakan blender, kemudian ditimbang kira-kira 10 gr.Contoh ini dimasukkan kedalam erlemeyer dan ditambah-kan 5 ml metanol, dikocok sebentar dan ditambahkan 45 mllarutan bufer McIlvaine. Campuran ini kemudian dikocokselama 1 jam dengan kecepatan 2500 rpm, lalu disaringmenggunakan kertas saring Whatman No 40 dan filtratnyadiinjeksikan ke kolom HPLC. Apabila dari kromatogrampemisahan yang dihasilkan, didapat puncak senyawa yangmempunyait, yang sarna dengan 1,. dari salah satu standarderivat tetrasiklin, maka dilakukan konfmnasi puncakmenggunakan detektor diode array. Spektrum serapan darisenyawa yang diduga ditumpangsuhkan pada spektrumserapan standar, untuk melihat apakah puncak dengan 1.

yang sarna berasal dari senyawa yang sarna.Preparasi contoh menggunakan kolom SPE dilakukan

sebagai berikut :

1.. Untuk terlebih dahulu mengaktifkan kolom SPE yangdigunakan, kedalam kolom dialirkan metanol meng-gunakan bantuan pompa vakum. Apabila metanol sudahmelewati fasa diam, pompa vakum dihentikan dankolom dibilas dengan air suling, dan bufer McIlvaine.Pompa vakum dimatikan sebelum semua bufer me-lewati fasa diam.

2. Sejumlah tertentu larutan contoh udang di pipetkemudian dimasukkan kedalam kolom dan pompavakum dijalankan kembali. Senyawa yang dianalisisakan terikat pada kolom. Kecepatan alir larutan contohdiatur kira-kira 5ml/menit.

3. Kolom SPE kemudian dicuci dengan air suling danpada proses pencucian hanya dapat melarutkan senyawJlpengganggu. Dengan bantuan pompa vakum kolomdikeringkan selama 1-5 menit.

4. Senyawa tetrasiklin yang terikat pada fasa diam dielusimenggunakan campuran pelarut yang ditentukan jenis-nya melalui percobaan kecil dengan menambahkansejumlah tertentu standar derivat tetrasiklin kedalamcontoh udang. Apabila setelah melewati prosedur butir1,2, dan 3 contoh buatan dielusi dengan 1 ml metanol,temyata diperoleh persen-perolehan kembali yang kecil.Nilai persen-perolehan kembali dapat ditingkatkanapabila sebagai larutan pengelusi digunakan campuranmetanol dan asetonitril (1:1). Untuk mengetahui terlebihdahulu kapasitas dari kolom ekstraksi dilakukan per-cobaan dengan cara membuat larutan standar dengankonsentrasi yang bervariasi dalam pelarut yang sarna.dengan pelarut untuk contoh udang. Terhadap larutanstandar ini dilakukan tahapan pengerjaan butir 1, 2, 3dan 4 diatas dan temyata kolom ekstraksi denganvolume 1 ml mempunyai kapasitas muat tertentu.

75

Apabila kedalam kolom dilewatkan senyawa dengankonsentrasinya yang lebih tinggi dari kapasitas muatnyamaka senyawa tersebut akan lolos.

HASIL DAN DISKUSIPemisahan derivat standar tetrasiklin berupa MC, TC,

OTC, DMC dan DC dan bentuk kromatogram telahdilaporkan sebelurnnya (3) sebagaimana tergambar dibawah ini.

OTC

MCTC DMC

DC

o lS 20S 10WAKTU (MENIT)

Gambar 1. Pemisahan 6 derivat standar tetrasiklin Kolom: f.lBondapak C18, detektor: UV. Eluen: metanol-asetonitril-0,01 M asam oksalat (1:1,5:7). Kecepatanaliran 1 ml/menit dan kecepatan kertas 0,5 cm/mnt.

Pada Gambar 2 ekstraksi residu tetrasiklin dalam contohudang yang diduga mengandung residu senyawa tetrasiklinlangsung diinjeksikan kedalam kolom HPLC

A B

o 8 12

WAKTU (MENIT)o , e 12

WAKTU (MENIT)16

Gambar 2. Kromatogram pemisahan dari contoh udang. Kolom: f.lBondapak C18, detektor: Diode Array. Eluen:metanol-asetonitril-O,Ol M asam oksalat (1:1,5:7).Kecepatan aliran 1 ml/rnenit dan kecepatan kertas 0,5crn/rnnt. A = eontoh sebelum pengenceran; B = contohsesudah pengeneeran.

Pada kromatogram 2A terdapat beberapa puncak danberdasarkan waktu retensi diduga puncak 1 = MC, 2 = OTCdan 3 = TC. Puncak 1 keluar bersamaan dengan puncakyang sangat besar Yilng kemungkinan berasal dari pengotor

76

dalam bahan matriks. Dengan faktor pengencerandidapat puncak 1 yang relatif Iebih jeIas (Gambar 2B). Pgambar 2B diperoleh puncak 1,2 dan 3 yang mempunyaisama atau hampir sama dengan 1. standar MC, OTCTC Untuk mengkonfirrnasikan puncak-puncak tersdigunakan detektor diode array. Apabila spektrum serapuncak yang diduga ditumpangsuhkan pada spektruessera pan standar terlihat adanya perbedaan, seperti tampada Gambar 3.

.~3r--------------------'HONOSIKlIN

'"~.032m<r~.021<.011

o~~--~~--~~--~~230 250 270 290

PANJANG GELOMBANG (nm)

2S

~30 250 270 290

PANJANG GELOMBANG (nm)

.027, --,

TETRASIKlIN

.022

'"~.016<r~.011m<.005

O~~--~~--~~--~~230 250 270 290

PANJANG GELOMBANG (nm)

Garnbar 3. Spektrum sera pan standar Me, OTC, TC dan spek-trum serapan puncak 1,2 dan 3.

16

Dari Gambar 3 terlihat panjang gelombang maksimumstandar MC, OTC dan TC berturut-turut 264, 271 dan 271nm, sedangkan panjang gelombang maksimum senyawayang diduga MC (puncak 1), OTC (puncak 2) dan TC(puncak 3) berturut-turut adalah 262, 272 dan 276 run.

Besar kemungkinan perbedaan panjang gelombang mak-simum dari setiap puncak, disertai dengan bentuk spektrumyang juga berbeda, disebabkan karena puncak 1, 2 dan 3terelusi bersamaan dengan puncak lain yang berasal daribahan matriks. Terdapatnya senyawa pengganggu semacamitu dapat dikurangi dengan suatu periakuan pendahuluanpada contoh udang. Untuk itu digunakan SPE yang dapatmengeiiminasi senyawa-senyawa pengganggu (4).

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

~--------~-~~

Untuk melihat kemampuan dari SPE, mula-mula dibuatkromatogram yang diperoleh dari contoh udang yang tidakdilewatkan ke dalam kolom SPE (Gambar 4), dalam hal iniekstrak Iangsung diinjeksikan kedalam kolom HPLC.

30 25 1520WAKTU (MEN!T)

Gambar 4. Kromatogram dari contoh udang yang tidak dilewat-kan ke dalam kolom SPE. Kolom: I.l. Bondapak C18,detektor: UV. Eluen: metanol-asetonitril-O,Ol M asamoksalat (1:1,5:7). Kecepatan aliran 1 ml/menit dankecepatan kertas 0,5 cm/mnt.

Kromatogram yang diperoleh memberikan banyakpuncak pengganggu. Apabila sebelum diinjeksikan contohudang tersebut dilewatkan terlebih dahulu pada SPE, makadapat dihasilkan kromatogram dengan garis dasar yangreIatif mendatar (Gambar 5), yang berarti contoh tidak lagimengandung senyawa pengganggu yang berasal dari bahanmatriks.

20 16 12WAKTU (MEN!T)

8 4

Garnbar 5. Kromatogram dari contoh udang yang mengalarniperlakuan pendahuluan menggunakan kolom SPE.Kolorn: fA. Bondapak CIS, Detektor: UV. Eluen:metanol-asetonitril-O.Ol m asam oksalat (1:1,5:7).Kecepatan aliran: 1 ml/rnnt dan kecepatan kertas 0,5cm/mnt.

Untuk melihat pentingnya tahapan pemekatan, dilaku-kan percobaan terhadap contoh sebagai berikut : kedalamsejumlah tertentu contoh udang ( ± 10 gr) ditambahkanstandar GTC, TC, DMC dan DC masing-masing sebesar3,97; 5,88; 5,61 dan 28,76 ~. Jumlah standar yang

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

ditambahkan disesuaikan dengan perkiraan jumlah pen-cemar derivat tetrasiklin yang umumnya terdapat dalamudang, dan hasil kromatogramnya dapat dilihat padaGambar6.

o 30 . 25 20 15 10 5 oWAKTU (MEN!T)

Gambar 6. Kromatogram contoh udang yang ditatnbah standar.Kolom: I.l. Bondapak CiS, Detektor: UV. Eluen:metanol-asetonitril-O.OlM asam oksalat (1:1,5:7).Kecepatan aliran: 1 ml/menit kecepatan kertas 0,5cm/mnt.

Seharusnya pada kromatogram, puncak GTC, TC, DMCdan DC terlihat pada tempat-tempat seperti yang di-tunjukkan oleh anak panah. Temyata pada cara penambah-an standar ini analisis kualitatif dan kuantitatif tidak dapatdilakukan karena puncaknya tidak begitu jelas. Selain daripada itu, terlihat juga banyaknya puncak-puncak senyawapengganggu yang terelusi sebelum puncak GTC dan salahsatu t, puncak pengganggu berdekatan dengan t, standarMC. Apabila contoh yang sama dengan contoh padaGambar 6 dilewatkan terlebih dahulu pada SPE sebelumdiinjeksikan ke dalam kolom analitik, maka puncak-punoakGTC, TC, DMC dan DC dapat terdeteksi (Gambar 7).

o

DC TC OTC

o25 20 15WAKTU (MEN!T)

Gambar 7. Krornatogram contoh udang yang ditambah standar,dan dilewatkan ke kolom SPE. Kolom: I.l. BondapakC18, Detektor: UV. Eluen: metanol-asetonitril-O.OlMasarn oksalat (1:1,5:7). Kecepatan aliran: Irnl/menitdan kecepatan kertas 0,5 cm/mnt.

77

Apabila dibandingkan dengan Gambar 6 bagian mukakromatogram pada Gambar 7 (daerah puncak senyawasenyawa pengganggu) menjadi relatif bersih. Dengandemikian terlihat jelas bahwa kolom SPE selain dapatmenghilangkan puncak-puncak senyawa pengganggu, jugadapat memekatkan kandungan residu dalam contoh,

Pada penggunaan kolom SPE, larutan pengelusi yangbaik dicari untuk dapat mengelusi komponen yang akandianalisa dari ikatannya dengan fasa diam pada kolomtersebut. Metanol pemah digunakan sebagai larutan penge-lusi (1), akan tetapi pada percobaan disini apabila diguna-kan larutan pengelusi metanol didapatkan nilai perolehankembali yang rendah (± 30%). Karena metanol tidak cukupkuat untuk mengelusi senyawa tetrasiklin yang terikat padakolom SPE. Apabila kita bekerja pada kromatografi fasaterbalik maka pelarut 'yang relatif lebih kuat adalah pelarutyang bersifat relatif tidak polar (5). Berdasarkan pedomanini dicoba menggunakan larutan pengelusi metanol :asetonitril (1:1), dan ternyata dapat memberikan perolehan-kembali yang baik (± 90%). Data-data perolehan-kembalidari proses elusi kolom SPE dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel I, Perolehan kembali dari proses elusi pada kolom SPE.

Larutan pengelusi Perolehan kembali %)OTC TC DMC DC

Metanol 37,9 38,6 42,4 38,3Metanol : asetonitril 97,8 92,9 89,7 91,7

(1 : 1)

Untuk mengetahui kapasitas dari kolom SPE, dicobamengelusi standar derivat tetrasiklin dengan konsentrasiyang bervariasi. Sebelum dilewatkan pada kolom SPE,larutan standar diinjeksikan ke kolom HPLC, dan luaspuncak kromatogram yang diperoleh digunakan sebagaipembanding, untuk menghitung perolehan-kembali setelahmasing-masing larutan standar dilewatkan ke dalam kolomSPE. Kandungan standar sebelum dan sesudah dilewatkankedalam kolom SPE dapat dilihat pada Tabel 2. Apabilajumlah yang dilewatkan melebihi kapasitas kolom, makasebagian senyawa yang lewat ke dalam kolom SPE akanlolos bersama filtrat, yang menunjukkan bahwa senyawatidak diikat oleh kolom. Hal ini dapat ditandai denganrendahnya nilai perolehan kembali « 75 %). Sebagaipatokan perolehan kembali yang baik adalah 85-90 %.

Tabel2. Kapasitas kolom SPE- Octadecyll ml

DerivatTetrasikl Sebelum

SPEOTC 2,38 2,12

3,97 3,887,93 7,41

11,90 7,41TC 3,53 3,15

5,88 5,4611,76 10,5017,64 10,50

DMC 3,37 3,255,61 5,03

11,22 10,8316,83 11,92

DC 17,28 16,7828,77 26,3757,53 52,7486,'30 63,49

78

KESIMPULANDari hasil-hasil percobaan yang diperoleh dapat

simpulkan bahwa penggunaan SPE untuk analisis residtetrasiklin dalam udang dapat mengurangi gangguapuncak-puncak senyawa yang berasal dari bahan matriks,dan dapat memekatkan senyawa yang akan dianalisissehingga jumlah renik residu akan dapat terdeteksi. Di-samping itu kolom SPE-Octadecyl 1ml yang digunamempunyai keterbatasan kapasitas pengikatan, sehingga.apabila akan digunakan untuk kandungan residu yangrelatif besar, kemungkinan dapat menggunakan kolom SPEyang mempunyai volume lebih besar yaitu kolom SPE-Octadecyl 3 atau 6 ml.

UCAPAN TERlMA KASIHMakalah ini telah disampaikan pada Seminar Nasional

X Perhimpunan Biokimia Indonesia, .Ujung Pandang 3 -Juli 1993 dengan fasilitas yang diberikan oleh PuslitbangKimia Terapan - LIPI, Bandung.

PUSTAKA

1. Y.lkai, H.Oka, N.Kawamura and M.Yamada, Sys-tematic Simultaneous Analysis of Residual Tetra-cyclines in Animal Tissues Using Thin Layer and HighPerformance Liquid Chromatography. J. of Chro-matogr.404: 313-323 (1988).

2. H.Oka, Y.lkai, N.Kawamura, K.Ono and M.Yamada. ASimple Method for Residual Tetracyclines Analysis inHoney Using A Tandem Cartridge Clean-Up System. J.of Chromatogr.389: 417-426 (1987).

3. E.Boes, J.Kantasubrata dan A.T.Karossi. Tekni'Analisa Tetrasiklin dengan HPLC Dan PenggunaannyaDalam Monitoring Proses Fermentasi. Warta kimiaAnalitik. No:9 hal. 10-12 (Juli 1991).

4. Baker-lO SPETM Applications Guide VoLlI, LifeScience Edition, 96-121 (1982).

5. N. Hadden, F. Baumann, F. MacDonald, M. Munk, RSuvenson, D. Gere, F. Zamaroni and R. Majors. Basicliquid Chromatography. 1971 pp 5.25 - 5.29

6. Udang Indonesia tidak terbukti mengandung antibiotik.Surat Kabar Pikiran Rakyat 18 Maret 1991.

7. Dirjen Perikanan: Jangan gunakan antibiotik dalampembudidayaan udang. Surat Kabar Kompas 23 Maret1992.

8. Lagi Udang Indonesia Tercemar Tetrasiklin, SuraKabar Kompas 5 Juni 1992.

9. Buffer Substances, Risalat MERCK, 22/11 23/137715/584R, hal. 12.

JKTI VOL. 3 - No.2, Des ember, 1