1

Perkembangan biomolekuler

Penemuan rangkaian DNA sebagai dasar dari

gen

Sebelumnya, dunia kedokteran tidak mengetahui

persis wujud gen yang sebenarnya

Seseorang dengan kelainan tertentu hanya

dimengerti sebabnya sebagai bawaan dari nenek

moyangnya, tanpa diketahui bagaimana

penjelasan rasional dan ilmiah. Apalagi

kemungkinan mencari jalan keluarnya.

2

Teknologi DNA

revolusi dalam bioteknologi

manipulasi organisme /

komponen organisme untuk

menghasilkan produk yang bermanfaat

3

PCR

Polymerase Chain Reaction: disusun 1983

oleh Kary Mullis Hadiah Nobel 1993

Reaksi Rantai Polimerase

Suatu teknik untuk memperbanyak

segmen DNA tertentu

Setiap fragmen DNA dpt diperkuat

(diamplifikasi/disalin bbrp kali ) dengan cepat

tanpa menggunakan sel 4

PCR

DNA diinkubasi tabung reaksi DNA polimerase, suatu pasokan nukleotida & potongan pendek DNA untai tunggal sintetik (primer sintesis DNA)

DNA polimerase membutuhkan primer

polimerase ini dapat menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang telah ada sebelumnya

5

PCR

Secara otomatis PCR dpt membuat

miliaran salinan segmen DNA target dlm

beberapa jam

Lebih cepat drpd pengklonan sepotong

DNA yg butuh berhari-hari dg membuat

plasmid rekombinan & membiarkannya

bereplikasi di dlm bakteri

6

PCR

Penguatan (amplifikasi) sampel DNA kecil

bermiliar kali beberapa keperluan

Penyidikjarian DNA dlm percobaan

pembunuhan

7

Dalam kasus-kasus kejahatan pembunuhan, pemerkosaan, teror pengeboman,

untuk memastikan benar tidaknya tersangka sebagai pelaku.

Jika tersangka masih hidup pengujian dilakukan dengan membandingkan DNA tersangka dengan DNA objek yang tertinggal di tempat kejadian, misalnya rambut atau sperma.

Jika tersangka mati dan tubuhnya hancur, maka DNA dari bagian-bagian tubuh tersangka dicocokkan pola restriksinya dengan DNA kedua orang tuanya atau saudara-saudaranya yang masih hidup.

8

Manfaat

Prosedur PCR

DNA dipanasi sec singkat utk memisahkan untainya

Didinginkan utk membiarkan primer berikatan dg ujung2 urutan target melalui ikatan hidrogen, satu primer pada setiap untai

9

Prosedur PCR

DNA polimerase menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer, dg menggunakan untai DNA yg lebih panjang sbg cetakannya

Dlm wkt + 5 menit urutan DNA target yg panjangnya mencapai 100 pasangan basa telah digandakan

Larutan ini kemudian dipanaskan lagi, memulai siklus pemisahan untai yg lain, pengikatan primer & sintesis DNA

10

Reproduced from http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html

Because both strands are copied during PCR, there is an exponential

increase of the number of copies of the gene.

e.g. if there is only one copy of the wanted gene before the cycling starts,

after one cycle, there will be 2 copies, after two cycles, there will be 4 copies,

three cycles will result in 8 copies and so on.

11

PCR Reaction Tubes

http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/509-pcr-pictures/74-pcr-reaction-tubes.html

PCR Machine Thermal Cycler

12

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif

13

PCR

Digunakan u/ memperkuat DNA dr berbagai

sumber:

DNA dr sedikit darah, jaringan, / air mani yg ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal

DNA dr sel embrionik tunggal u/ diagnosis kelainan genetik sblm kelahiran

DNA gen virus dr sel yg diinfeksi o/ virus yg sulit terdeteksi spt HIV

14

The HIV PCR test

salah satu alat diagnostik paling akurat

mendeteksi keberadaan virus immunodeficiency dalam darah manusia, lebih dikenal sebagai HIV.

Salah satu prosedur screening

dapat digunakan untuk deteksi dini.

Bahkan, tes ini berhasil dapat menunjukkan virus dalam waktu tiga minggu setelah infeksi terjadi.

http://www.wisegeek.com/what-is-a-hiv-pcr-test.htm

15

http://www.google.co.id/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electrophores

is_apparatus.JPG/288px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG&imgrefurl=http://hdtv2008.blogspot.com/2008/06/gel-

electrophoresis-

1.html&h=368&w=288&sz=20&tbnid=QjuyI6M1cwcJ::&tbnh=122&tbnw=95&prev=/images%3Fq%3Delectrophoresis%2B

pictures&hl=en&usg=__nUHyJ5-XZaVlUcVRahSwaZaFV7o=&sa=X&oi=image_result&resnum=3&ct=image&cd=1

16

Elektroforesis Gel

Memisahkan makromolekul-as nukleat atau prot- berdasarkan ukuran, muatan listrik & sifat2 fisis lainnya

U/ molekul DNA linear, pemisahan yg dilakukan terutama tergantung pd ukurannya

Memisahkan campuran molekul DNA mjd pita2 yg msg2 tdd molekul DNA dg pj yg sama

17

Elektroforesis

•Proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik.

•Kecepatan molekul yang bergerak pada medan

listrik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran.

•Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat

dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,

ataupun dilakukan kuantifikasi dengan

densitometer.

18

Elektroforesis

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

19

Elektroforesis

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut.

Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.

20

http://www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.jpg 21

Manfaat elektroforesis

Diagnosis kelainan genetik

Diagnosis thalassemia dibuat berdasarkan

anamnesis mengenai gejala klinis, riwayat

keluarga/pola herediter, pemeriksaan fisik dan

pemeriksaan laboratorium.

Pemeriksaan laboratorium yang diperlukan adalah

untuk analisa hemoglobin yaitu hematologi rutin,

hapusan darah tepi, dan elektroforesis.

pemeriksaan Hb elektroforesis

Elektroforesis hemoglobin

mengidentifikasi hemoglobin abnormal

dan mengukur kadar hemoglobin normal

Hull.D & Johnston,D.I 2008.Dasar dasar pediatri ed.3

Southern Blotting

Suatu metode untuk memindahkan

fragmen-fragmen DNA yang telah

didenaturasi dan yang telah dipisahkan

dengan eletrophoresis, dari gel ke suatu

lembar penyerap

Mendeteksi & menganalisis urutan DNA

tertentu

Membandingkan DNA dr individu / spesies

yg berbeda 24

Southern Blotting: Gel Transfer

Legend: Detection of specific DNA fragments by gel-transfer hybridization (Southern blotting). (A) The mixture of double-stranded DNA fragments generated by restriction nuclease treatment of DNA is separated according to length by electrophoresis. (B) A sheet of either nitrocellulose paper or nylon paper is laid over the gel, and the separated DNA fragments are transferred to the sheet by blotting. The gel is supported on a layer of sponge in a bath of alkali solution, and the buffer is sucked through the gel and the nitrocellulose paper by paper towels stacked on top of the nitrocellulose. As the buffer is sucked through, it denatures the DNA and transfers the single-stranded fragments from the gel to the surface of the nitrocellulose sheet, where they adhere firmly. This transfer is necessary to keep the DNA firmly in place while the hybridization procedure (D) is carrried out. (C) The nitrocellulose sheet is carefully peeled off the gel. (D) The sheet containing the bound single-stranded DNA fragments is placed in a sealed plastic bag together with buffer containing a radioactively labeled DNA probe specific for the required DNA sequence. The sheet is exposed for a prolonged period to the probe under conditions favoring hybridization. (E) The sheet is removed from the bag and washed thoroughly, so that only probe molecules that have hybridized to the DNA on the paper remain attached. After autoradiography, the DNA that has hybridized to the labeled probe will show up as bands on the autoradiograph. An adaptation of this technique to detect specific sequences in RNA is called Northern blotting. In this case mRNA molecules are electrophoresed through the gel and the probe is usually a single-stranded DNA molecule.

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/southBlotg.html 25

Southern, Northern, Westerns Blotting

Southern,

Northern, Westerns

Ekstrak DNA

dr sel

Ekstrak RNA dr

sel

Ekstrak Protein

dr sel

26

DNA microarray

Merupakan suatu teknik untuk

menentukan gen-gen mana yang aktif dan

gen-gen mana yang ter-represi/tidak aktif

pada keadaan fisiologis tertentu

27

28