PENGARUH FAKTOR FISIKOKIMIA TERHADAP PEMBENTUKAN PIGMEN OLEH BAKTERI LAUT

MESOPHILOBACTER SP.

ENDANG S. SRIMARIANA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2000

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Pengaruh Faktor Fisikokimia terhadap Pembentukan Pigmen oleh Bakteri Laut Mesophilobacter sp. adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing Dr. Ir. Linawati Hardjito, M.Sc; Dr. Ir. Anwar Bey Pane, DEA; dan Dr. Ir. Sukarno, M.Sc. dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Desember 2000

Endang S. Srimariana Nrp. 97388

ABSTRACT

ENDANG S. SRIMARIANA. The effect of physicochemical factors on the pigment formation by a marine bacteria, Mesophilobacter sp. Supervised by LINAWATI HARDJITO, ANWAR BEY PANE, and SUKARNO.

It has been conducted an observations on the effect of environmental

factors especially physicochemical factors on the growth and pigment formation by a marine bacteria Mesophilobacter sp. The objectives of this research were to study the effect of : 1) cultivation temperature (25oC, 30oC and 35oC); 2) pH of growth medium (5, 7, and 9); 3) salinity of growth medium (0 ppt, 10 ppt, 20 ppt, 30 ppt and 40 ppt), 4) carbon sources (glucose, acetate, citrate, and maltose), and 5) nitrogen sources (peptone, yeast extract, sodium nitrate, and ammonium sulfate) on the growth of bacteria and the pigment formation. Bacteria were cultivated in 500 ml flasks with a working volume of 250 ml in marine broth and incubated on a shaker incubator with the agitation speed of 120 rpm for seven days. Variables that were observed during the cultivation process involved bacterial growth (cell concentration), pigment concentration, and pH. Observations were carried out up to 168 hours. The cell and pigment concentrations were monitored spectrophotometrically. The results indicated that Mesophilobacter sp. grew well and formed the highest concentration of pigment (P) at temperature 30oC, with value of P 0.12 + 0.003 (λ 463 nm). At pH experiment the highest average P was obtained from medium with pH 9 was 0.14 + 0.006 (λ 463 nm) and significantly different from pH 7 (p <0.5). At salinity experiment, the highest average P obtained from the growth medium with 10 ppt salinity is 3.54 + 0.11 in λ 368 nm. At carbon source experiment, the highest average of P were obtained from maltose, with value 12.13 + 1.33 (λ 232 nm) and 15.86 + 0.52 (λ 258 nm), while in λ 312 nm, λ 368 nm and λ 656 nm that obtained from glucose were 11.59 + 0.28, 7.22 + 0.44 and 1.50 + 0.05. At nitrogen source experiment, the result showed that Mesophilobacter sp. grew rapidly in the medium with yeast extract. The pigment has a maximum absorbance at five wavelengths, namely λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm, and 658 nm. The average concentration of cells and pigment, showed that yeast extract is the best nitrogen source in cell growth and pigment formation (p <0.05). The highest average P is 12.49 + 0.22 (λ 232 nm); 12.86 + 0.21 (λ 258 nm); 11.09 + 0.56 (λ 312 nm) ; 11.88 + 0.97 (λ 368 nm) and 1.29 + 0.04 (λ

656 nm).

Keywords: physicochemical factors, Mesophilobacter sp., cells concentration, pigment concentration, spectrophotometrically.

RINGKASAN

ENDANG S. SRIMARIANA. Pengaruh Faktor FisikoKimia terhadap Pembentukan Pigmen oleh Bakteri Laut Mesophilobacter sp. Dibimbing oleh LINAWATI HARDJITO, ANWAR BEY PANE, dan SUKARNO.

Kondisi lingkungan baik kondisi fisika maupun kimia (nutrien) merupakan faktor penting yang menentukan produktifitas mikroorganisme. Kedua kondisi tersebut merupakan faktor eksternal yang dapat dikendalikan untuk keberhasilan suatu proses yang memanfaatkan organisme (bioproses). Penelitian ini bertujuan untuk : 1) menentukan suhu kultivasi, 2) menentukan pH kultivasi, 3) menentukan intensitas cahaya, 4) menentukan salinitas, 5) menentukan sumber karbon, 6) menentukan sumber nitrogen yang sesuai baik untuk pertumbuhan maupun untuk sintesa biopigmen dari bakteri laut Mesophilobacter sp. yang diisolasi dari terumbu karang.

Dalam penelitian ini kultivasi dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml dengan volume kerja 250 ml pada inkubator goyang dengan kecepatan 121 rpm. Suhu kultivasi yang digunakan adalah 25oC, 30oC dan 35oC; pH medium pertumbuhan yang dicoba adalah 5, 7, dan 9; intensitas cahaya yang dicoba adalah 2350Wm-2 (kondisi tanpa penambahan cahaya), 4710Wm-2, dan 12500Wm-2; salinitas medium pertumbuhan yang dicoba adalah 0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil dan 40 permil; sumber karbon yang diuji adalah glukosa, asetat, sitrat, dan maltosa; dan sumber nitrogen yang diuji adalah pepton, ekstrak khamir, sodium nitrat, dan ammonium sulfat. Variabel yang diamati selama proses kultivasi meliputi pertumbuhan bakteri (konsentrasi sel), konsentrasi pigmen, dan pH. Selain itu dihitung juga laju spesifik pertumbuhan sel (µ), laju spesifik pembentukan pigmen (qp

Percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan perlakuan yang sesuai dengan setiap faktor fisika dan kimia yang hendak dipelajari. Pengaruh suhu, pH, cahaya, salinitas, sumber karbon dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dianalisis dengan Analisis Sidik Ragam (Anova). Jika terdapat perbedaan akibat adanya perlakuan terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen, maka pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) (Koopmans, 1987).

) dan rendemen biomassa (sel). Pengamatan dilakukan sampai kultur berumur 168 jam.

Pada percobaan suhu; laju spesifik pertumbuhan sel (µ) dan laju spesifik pembentukan pigmen (qp) tertinggi yang diolah selama bakteri berada pada fase logaritmik, diperoleh dari medium yang diinkubasi pada suhu 30oC dengan nilai µ sebesar 0,24 jam-1 dan qp 0,02 jam-1 berturut-turut. Rata-rata konsentrasi pigmen (P) tertinggi diperoleh dari inkubasi suhu 25oC dan 30oC, yaitu sebesar 0,12 + 0,02 dan 0,12 + 0,003 (λ 463 nm). Diperoleh hasil bahwa suhu yang baik dalam pembentukan pigmen adalah 30oC. Suhu 30o

Pada percobaan pH; µ dan q

C digunakan sebagai suhu kultivasi dalam percobaan berikutnya.

p tertinggi diperoleh dari medium pertumbuhan dengan pH 9, dengan nilai µ sebesar 0,42 jam-1 dan qp sebesar 0,04 jam-1 berturut-turut. Pada medium pertumbuhan dengan pH 5 tidak terjadi pembentukan pigmen

walaupun konsentrasi sel tertinggi diperoleh pada pH ini. Rata-rata P tertinggi diperoleh dari medium dengan pH 9 yaitu sebesar 0,14 + 0,006 (λ 463 nm) dan berbeda nyata dengan pH 7 (p<0,5). pH optimum dalam pembentukan pigmen adalah 9, kemudian pH 9 digunakan sebagai pH medium pertumbuhan dalam percobaan berikutnya.

Pada percobaan intensitas cahaya; µ dari medium yang disertai penambahan cahaya 12500 Wm-2 adalah yang tertinggi dengan nilai µ 0,46 jam-1, akan tetapi qp tanpa penambahan cahaya memiliki nilai tertinggi yaitu sebesar 0,04 jam-1. Rata-rata P hasil kultivasi tanpa penambahan cahaya (suhu 30oC) adalah yang tertinggi dengan P sebesar 0,14 + 0,006 (λ 463 nm). Hasil analisis sidik ragam terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen pada fase stasioner terlihat bahwa perlakuan cahaya berpengaruh nyata (p<0,05). Pengujian dilanjutkan dengan uji BNT, dengan hasil uji bahwa : suhu 30oC tanpa penambahan cahaya memberikan hasil terbaik dan berbeda nyata (p<0,05) dalam pertumbuhan Mesophilobacter sp. dan pembentukan pigmen dibanding dengan perlakuan penambahan cahaya 4700Wm-2 dan 12500 Wm-2

Pada percobaan salinitas; µ tertinggi adalah 0,38 jam.

-1 yang diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 0 permil, 10 permil dan 20 permil, sedangkan qp tertinggi diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 10 permil, yaitu sebesar 1,68 jam-1

Pada percobaan sumber karbon, µ terbesar diperoleh dari media yang menggunakan sumber karbon asetat dengan nilai µ 0,36. Pigmen yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki absorban maksimum pada lima panjang gelombang, yaitu λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm, dan 658 nm. Pada λ 232 nm dan 258 nm, rata-rata P tertinggi diperoleh dari sumber karbon maltosa, yaitu sebesar (12,13 + 1,33) dan (15,86 + 0,52), sedangkan pada λ 312 nm, 368 nm dan 656 nm diperoleh dari glukosa dengan rata-rata (11,59 + 0,28), (7,22 + 0,44) dan (1,50 + 0,05).

. Rata-rata P tertinggi diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 10 permil yaitu 3,54 + 0,11 pada λ 368 nm. Dari hasil percobaan ini, disimpulkan bahwa salinitas terbaik adalah 10 permil.

Pada percobaan sumber nitrogen; µ dan qp tertinggi dari Mesophilobacter sp. diperoleh dari media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir dengan nilai µ 0,24 jam-1 dan nilai qp pada λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm dan 656 nm secara berturut-turut adalah 1,55 jam-1; 1,59 jam-1; 1,38 jam-1; 1,48 jam-1 dan 0,16 jam-1. Dari hasil ini terlihat bahwa Mesophilobacter sp. tumbuh dengan cepat pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir. Sumber nitrogen yang dapat menghasilkan pigmen pada penelitian ini adalah pepton dan ekstrak khamir, yang mempunyai absorban maksimum pada lima panjang gelombang, yaitu λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm, dan 658 nm. Diperoleh hasil bahwa ekstrak khamir merupakan sumber nitrogen yang terbaik dalam pembentukan pigmen (p<0,05). Rata-rata konsentrasi P tertinggi adalah 12,49 + 0,22 (ODλ 232 nm); 12,86 + 0,21 (λ 258 nm); 11,09 + 0,56 (λ 312 nm); 11,88 + 0,97 (λ 368 nm); dan 1,29 +

0,04 (λ 656 nm).

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2000 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan

karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.

b. pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PENGARUH FAKTOR FISIKOKIMIA TERHADAP PEMBENTUKAN PIGMEN OLEH BAKTERI LAUT

MESOPHILOBACTER SP.

ENDANG S. SRIMARIANA

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Studi Teknologi Kelautan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2000

Judul Tesis : Pengaruh Faktor Fisikokimia terhadap Pembentukan Pigmen oleh Bakteri Laut Mesophilobacter sp.

Nama Mahasiswa : Endang S. Srimariana Nomor Pokok : 97388 Program Studi : Teknologi Kelautan

Disetujui

Komisi Pembimbing

Ketua Dr. Ir. Linawati Hardjito, M.Sc.

Dr. Ir. Anwar Bey Pane, DEA Anggota Anggota

Dr. Ir. Sukarno, M.Sc.

Diketahui Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Teknologi Kelautan

Prof. Dr. Ir. John Haluan, M.Sc.

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

Tanggal Ujian : 27 Juli 2000 Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan pada Allah Bapa atas anugrahNya

sehingga tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Tesis dengan judul Pengaruh

Faktor FisikoKimia terhadap Pembentukan Pigmen oleh Bakteri Laut

Mesophilobacter sp. disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Pada kesempatan ini, dengan penuh ketulusan hati penulis menyampaikan

penghargaan dan terima kasih yang besar kepada Dr. Ir. Linawati Harjito, M. Sc.

selaku ketua komisi pembimbing yang juga mendanai penelitian ini dengan

menyediakan segala fasilitas yang dibutuhkan sehingga penelitian ini dapat

dilaksanakan. Dr. Ir. Anwar Bey Pane, DEA dan Dr. Ir. Sukarno masing-masing

selaku anggota komisi pembimbing, terima kasih atas pengarahan dan bimbingan

yang diberikan sejak penyusunan proposal hingga tesis ini dapat diselesaikan.

Dekan Fakultas Perikanan dan Rektor Universitas Pattimura Ambon yang telah

memberikan ijin untuk menempuh pendidikan pada Program Pascasarjana di

Institut Pertanian Bogor. Ketua Program Studi Teknologi Kelautan (TKL), serta

seluruh Staf Pengajar S2

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu

penulis mengharapkan masukan-masukan demi penyempurnaan tesis ini.

Akhirnya, semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi yang memerlukannya.

PS TKL Program Pascasarjanan IPB, atas pelayanan,

fasilitas dan kesempatan yang diberikan. Suami dan anak-anak tercinta serta mami

papi yang saya hormati serta seluruh keluarga yang telah memberikan doa,

dorongan, pengorbanan dan semangat dengan penuh kesetiaan dan pengertian

untuk dapat melanjutkan studi sampai selesai.

Bogor, Desember 2000

Endang S. Srimariana

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 12 Oktober 1961 di Airmadidi (Minahasa)

sebagai anak pertama dari enam bersaudara, dari keluarga bapak Bondan Bandono

dan ibu Fintje Wudan Waroh.

Pendidikan Sekolah Dasar ditempuh di SDK. St. Angela, Surabaya dari

tahun 1968 dan lulus pada tahun 1973. Pada tahun 1974 penulis menempuh

pendidikan di SMPK. Stella Maris, Surabaya dan lulus pada tahun 1976,

kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri II, Surabaya dan lulus pada

tahun 1980.

Pada tahun akademik 1980/1981, penulis diterima sebagai mahasiswa

Institut Pertanian Bogor, Bogor melalui Proyek Perintis II dan diterima pada

Fakultas Perikanan IPB pada tahun akademik 1981/1982, pada program studi

Pemanfaatan Sumberdaya Perikanan. Lulus sebagai Sarjana Perikanan pada tahun

1985.

Pada tahun 1986, penulis diangkat sebagai staf pengajar pada Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya hingga tahun 1994,

kemudian pindah pada Fakultas Perikanan Universitas Pattimura, Ambon pada

Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan dari tahun 1994 hingga sekarang.

Penulis memperoleh kesempatan mengikuti pendidikan Program Pra

Pascasarjana, IPB pada tahun akademik 1996/1997 dan lulus pada tahun 1997

dengan beasiswa dari URGE-DIKTI. Selanjutnya pada tahun itu juga penulis

kembali memperoleh kesempatan mengikuti pendidikan Program Pascasarjana

pada Program Studi Teknologi Kelautan, IPB dengan beasiswa dari BPPS-DIKTI

dan ujian untuk mendapatkan gelar Magister Sains dilakukan pada tanggal 27 Juli

2000.

x

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xiv

1. PENDAHULUAN .............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................ 1 1.2 Tujuan Penelitian ........................................................................ 3 1.3 Manfaat Penelitian ...................................................................... 4 1.4 Permasalahan .............................................................................. 4 1.5 Hipotesis Penelitian .................................................................... 4

2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5 2.1 Bakteri ......................................................................................... 5 2.2 Bakteri laut penghasil pigmen .................................................... 6

2.2.1 Bakteri fototrof yang mengandung bakterioklorofil ......... 6 2.2.2 Bakteri gram negatif, aerobik, berbentuk batang dan

kokus ................................................................................. 9 2.2.3 Bakteri gram negatif, fakultatif an aerobik, berbentuk

batang ................................................................................ 10 2.2.4 Bakteri gram negatif, an aerobik, berbentuk batang dan

kokus ................................................................................. 10 2.3 Pertumbuhan bakteri ................................................................... 10

2.3.1 Siklus pertumbuhan .......................................................... 11 2.3.2 Pengaruh faktor-faktor lingkungan pada pertumbuhan .... 13 2.3.3 Pengukuran kuantitatif pertumbuhan bakteri .................... 17

2.4 Pewarna alami ............................................................................. 18 2.4.1 Pewarna makanan ............................................................. 21

3. METODOLOGI PENELITIAN ....................................................... 23 3.1 Bahan dan alat ............................................................................. 23

3.1.1 Bahan ................................................................................ 23 3.1.2 Alat .................................................................................... 24

3.2 Metode penelitian ........................................................................ 24 3.2.1 Penelitian tahap pertama : Identifikais bakteri ................... 25 3.2.2 Penelitian tahap kedua ...................................................... 27 3.2.3 Penelitian tahap ketiga ....................................................... 31 3.2.4 Pengamatan ....................................................................... 34 3.2.5 Rancangan percobaan ....................................................... 35 3.2.6 Analisis data ...................................................................... 35

3.2.7 Tempat dan waktu penelitian ............................................ 35

xi

4. PENGARUH FAKTOR FISIKOKIMIA TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI DAN ATAU PEMBENTUKAN PIGMEN ............................................................................................ 36

4.1 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen ........................................................................................ 36

4.2 Pengaruh pH terhadap pembentukan pigmen ............................. 39 4.3 Pengaruh cahaya terhadap pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen ................................................................. 42 4.4 Pengaruh salinitas terhadap pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen ................................................................. 46 4.5 Pengaruh sumber karbon terhadap pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen ................................................................. 49 4.6 Pengaruh sumber nitrogen terhadap pertumbuhan bakteri dan ...

pembentukan pigmen ................................................................. 54 5. KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 58 5.1 Kesimpulan ................................................................................. 58 5.2 Saran ........................................................................................... 59 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 60 LAMPIRAN ........................................................................................... 64

xii

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Perbedaan sifat bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif ......... 5 2. Metode untuk mengukur pertumbuhan bakteri .................................. 18 3. Pigmen pada tumbuhan dan alga ........................................................ 20 4. Pigmen pada vertebrata ....................................................................... 20 5. Komposisi ekstrak khamir ................................................................... 24 6. Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber karbon ................................................................................................... 32 7. Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber nitrogen ................................................................................................ 34 8. Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth pada pH 7, suhu kultivasi berbeda. .......... 38 9. Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth pada pH percobaan 5, 7, dan 9; suhu kultivasi 30oC ...................................................................................... 42 10. Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth dengan pH 9, suhu kultivasi 30oC serta perlakuan cahaya. ................................................................................. 45 11. Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth dengan pH 9 dan salinitas yang berbeda; serta suhu kultivasi 30oC. .................................................................... 48 12. Nilai hasil pengukuran variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. pada pH 9, sumber karbon yang berbeda, sumber nitrogen ekstrak khamir dan dikultivasi pada suhu 30oC dalam labu kocok. ................ 51 13. Nilai hasil pengukuran beberapa parameter dari kultivasi Mesophilobacter sp. pada pH 9, sumber nitrogen yang berbeda, sumber karbon glukosa dan dikultivasi pada suhu 30oC dalam labu kocok ................................................................................................... 56 14. Karakterisasi bakteri yang diisolasi dari air laut dan karakterisasi dari

Mesophilobacter sp. ............................................................................ 65

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Susunan membran intrasitoplasma yang ditemukan pada bakteri fotosintesis (Austin, 1988) .................................................................. 8 2. Kurva pertumbuhan bakteri (Schlegel dan Schmidt, 1994) ............... 12 3. Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu kultivasi 25oC, 30oC, dan 35oC dengan pH 7 ........................................................................................ 36 4. Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada media pertumbuhan dengan pH 5, 7, dan 9 suhu 30oC ............................................................................................ 40 5 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu 30oC, pH 9 yang disertai dengan perlakuan cahaya ................................................................................. 43 6. Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada auhu 30 oC, pH 9 yang disertai dengan perlakuan salinitas .............................................................................. 47 7. Kurva pertumbuhan sel oleh Mesophilobacter sp. pada suhu 30 °C, pH 9, salinitas 10 permil dalam medium pertumbuhan dengan berbagai sumber karbon ...................................................................... 50 8. Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu 30 oC, pH 9, salinitas 10 permil dalam medium pertumbuhan dengan berbagai sumber karbon .................... 53 9. Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada pada suhu 30 °C, PH 9, salinitas 10 permil Dalam medium pertumbuhan dengan berbagai sumber nitrogen ........ 55

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Hasil identifikasi bakteri ...................................................................... 65 2. Konsentrasi sel dan pigmen pada masing-masing perlakuan faktor fisika

dengan OD 540 nm .............................................................................. 66 3. Contoh perhitungan laju pertumbuhan spesifik ................................... 68

4. Perhitungan analisis statistika dengan menggunakan Rancangan Acak

Lengkap.. .............................................................................................. 69 5. Konsentrasi sel dan pigmen pada perlakuan sumber karbon ............ 83

6. Konsentrasi sel dan pigmen pada perlakuan sumber nitrogen .......... 84 7. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ........................................ 85

8. Perubahan warna pada media pertumbuhan selama kultivasi ............. 86

9. Perubahan pH medium selama kultivasi ............................................ 88

10. Medium pertumbuhan yang mengandung glukosa yang telah beubah

warna menjadi merah .......................................................................... 89

1

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Indonesia adalah negara tropis yang dikelilingi oleh perairan dengan luas

lebih dari 60% wilayah teritorialnya. Indonesia memiliki sumberdaya hayati laut

dengan keragaman yang tinggi. Di antara sumberdaya hayati laut yang besar itu,

organisme yang dimanfaatkan sebagian besar adalah ikan, udang, kerang-

kerangan, dan rumput laut. Sumberdaya hayati lain yang juga mempunyai potensi

yang besar untuk dikembangkan adalah mikroorganisme laut, namun belum

banyak mendapat perhatian terutama di Indonesia.

Mikroorganisme laut yang meliputi bakteri, fitoplankton, mikroalga dan

lain-lain merupakan sumber bahan aktif dan bahan kimia yang sangat potensial.

Dari biota laut tersebut dapat dihasilkan berbagai bahan alami yang bermanfaat

antara lain untuk industri farmasi (seperti anti-tumor/anti-cancer, antibiotik, anti-

inflammatory), bidang pertanian (fungisida dan pestisida), industri kosmetik dan

makanan (pigmen dan polisakarida) (Zilinkas dan Lundin, 1993; Fenical dan

Jensen, 1993). Selanjutnya dari biota laut juga dapat dihasilkan protein serta

bahan diet sebagai sumber makanan sehat (asam lemak tak jenuh omega-3,

vitamin, asam amino, berbagai jenis gula rendah kalori) dan lain-lain.

Perkembangan bioteknologi dewasa ini memungkinkan pemanfaatan

mikroorganisme untuk menghasilkan produk-produk tersebut di atas.

Dalam industri pangan (makanan dan minuman) atau non pangan (obat-

obatan, kosmetika, dan farmasi), pigmen merupakan bagian terpenting yang tidak

bisa diabaikan. Selain ikut menentukan penerimaan produk oleh konsumen,

pigmen juga berperan sebagai salah satu indikator mutu pangan dan non pangan.

Karena pentingnya zat pewarna tersebut, maka berbagai upaya dilakukan untuk

membuat produk pangan dan non pangan dengan warna yang menarik.

Penambahan zat pewarna ke dalam produk pangan maupun non pangan baik

pewarna alami maupun sintetik merupakan hal yang tidak dapat dihindari.

Sejalan dengan berkembangnya industri di Indonesia maka penggunaan

pewarna sintetik juga semakin meningkat. Penggunaan pewarna sintetik ini perlu

diwaspadai karena banyak diantaranya yang menimbulkan bahaya terhadap

2

kesehatan manusia (Jenie et al., 1994) seperti azorubin dan tartrazin yang terbukti

menyebabkan alergi (Fabre et al., 1993) dan bersifat karsinogenik (Blanc et al.,

1994). Berbeda dengan pewarna sintetik, pewarna alami tidak mengandung bahan

yang berbahaya bagi konsumen (Winarno, 1992). Dengan adanya kenyataan ini

maka penggunaan pewarna alami yang aman bagai kesehatan perlu ditingkatkan.

Biopigmen atau zat pewarna alami merupakan bahan yang penting dalam

industri baik pangan maupun non-pangan. Permintaan dan penggunaan zat

pewarna alami akan terus meningkat sejalan dengan meningkatnya kesadaran

masyarakat tentang arti keamanan dan kesehatan bagi kehidupan dan lingkungan.

Kebutuhan tersebut telah mendorong dilakukannya penelitian ke arah penemuan

dan atau produksi zat warna alami.

Bakteri diketahui dapat memproduksi pewarna alami yang menyerupai

pewarna alami yang terdapat di tanaman (Hendry, 1992). Bacillus megaterium

merupakan bakteri penghasil pigmen merah (Mitchell et al., 1986);

Flavobacterium dehydrogenans (Djafar, 1987 in Fardiaz dan Rini, 1994),

Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus (Urakami dan Yoshida,

1993), Rhodopseudomonas spheroides (Goodwin et al., 1955) merupakan bakteri

penghasil pigmen karotenoid; Streptomyces sp. MAFF 10-06015 menghasilkan

pigmen biru (Yanagimoto et al., 1988); Actinomycetes menghasilkan pigmen

violet kehitaman dan pigmen kuning (Tanabe et al., 1995). Urakami dan Yoshida

(1993) menyatakan bahwa khlorofil merupakan pigmen yang sangat berguna pada

industri makanan.

Pewarna alami (biopigmen) dapat diproduksi melalui kultur

mikroorganisme (Evans dan Wang, 1984; Nelis dan Leenheer, 1991; Lin dan

Demain, 1993) serta kultur sel dan jaringan tanaman (Taya et al., 1992; Hanagata

et al., 1993; Taya et al., 1994) atau ekstraksi langsung dari tanaman atau bagian

tanaman. Dibandingkan dengan ekstraksi langsung dari tanaman atau bagian

tanaman maka produksi biopigmen dengan kultur mikroorganisme dan kultur sel

atau jaringan tanaman lebih baik karena faktor lingkungan yang mempengaruhi

produksi biopigmen dapat dikendalikan dengan baik.

Produksi pigmen dari bakteri laut, berkaitan erat dengan kondisi lingkungan

tempat bakteri tersebut hidup dan berkembang. Bila kondisi lingkungan baik

3

kondisi fisik maupun kondisi kimiawi sesuai, maka pertumbuhan bakteri juga juga

akan baik dan cepat yang ditandai dengan meningkatnya jumlah sel dalam media

pertumbuhan.

Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri laut

Gram-negatif yang diisolasi dari terumbu karang di Florida, Amerika Serikat.

Penelitian ini merupakan kerja sama antara Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan

Lautan dengan Center of Marine Biotechnology, University of Maryland.

Identifikasi awal telah dilakukan, bakteri tersebut termasuk bakteri Gram negatif,

katalase positif, mereduksi nitrat menjadi nitrit dan dapat menghasilkan pigmen.

Untuk sementara bakteri tersebut diduga termasuk dalam genus Mesophilobacter

sp. dan akan dilakukan identifikasi lanjut untuk memastikan golongan bakteri

tersebut.

1.2 Tujuan penelitian

Tujuan penelitian ini adalah mengetahui pengaruh faktor fisika dan kimia

yang meliputi suhu, pH, cahaya, salinitas, sumber karbon dan sumber nitrogen

terhadap pertumbuhan sel bakteri laut Mesophilobacter sp. dan pembentukan

pigmennya, yang dapat dirinci sebagai berikut :

(1) Menentukan suhu kultivasi (25°C, 30°C dan 35°C) yang sesuai baik untuk

pertumbuhan maupun untuk sintesa biopigmen.

(1) Menentukan pH kultivasi (5, 7 dan 9) yang sesuai untuk sintesa biopigmen.

(2) Menentukan intensitas cahaya (2350 Wm-2 : kondisi tanpa penambahan

cahaya, 4710 Wm-2, dan 12500 Wm-2

(3) Menentukan salinitas (0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil dan 40

permil) yang sesuai baik untuk pertumbuhan maupun untuk sintesa

biopigmen.

) yang sesuai baik untuk pertumbuhan

maupun untuk sintesa biopigmen.

(4) Menentukan sumber karbon (glukosa, maltosa, asam asetat dan asam sitrat)

yang sesuai baik untuk pertumbuhan maupun untuk sintesa biopigmen.

(5) Menentukan sumber nitrogen (pepton, ekstrak khamir, natrium nitrat dan

amonium sulfat) yang sesuai baik untuk pertumbuhan maupun untuk sintesa

biopigmen.

4

1.3 Manfaat penelitian

Manfaat penelitian ini adalah sebagai sumber informasi baik bagi peneliti

maupun bagi industri dalam memproduksi pigmen dari bakteri laut baik yang

berkaitan dengan pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.

Selanjutnya hasil penelitian ini diharapkan mampu memicu perkembangan

industrialisasi di Indonesia khususnya industri yang berlandaskan bioproses.

Biopigmen yang dihasilkan diharapkan dapat dimanfaatkan oleh industri di bidang

makanan dan minuman, farmasi, kosmetika dan lainnya.

1.4 Permasalahan

Permasalahan dalam penelitian ini adalah belum diketahuinya faktor

lingkungan baik faktor fisika maupun kimia yang meliputi suhu, pH, cahaya,

salinitas, sumber karbon dan sumber nitrogen yang berpengaruh pada

pertumbuhan bakteri dan ataupun pada pembentukan pigmen.

1.5 Hipotesis penelitian

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:

(1) Suhu media pertumbuhan berpengaruh dalam pertumbuhan bakteri laut dan

pembentukan pigmen.

(2) pH media pertumbuhan berpengaruh dalam pembentukan pigmen oleh

bakteri laut.

(3) Cahaya media pertumbuhan berpengaruh dalam pertumbuhan bakteri laut dan

pembentukan pigmen.

(4) Salinitas media pertumbuhan berpengaruh dalam pertumbuhan bakteri laut

dan pembentukan pigmen.

(5) Sumber karbon media pertumbuhan berpengaruh dalam pertumbuhan bakteri

laut dan pembentukan pigmen.

(6) Sumber nitrogen media pertumbuhan berpengaruh dalam pertumbuhan

bakteri laut dan pembentukan pigmen.

5

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri

Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, uniseluler, dan tidak mengandung

struktur yang dibatasi membran di dalam sitoplasmanya. Dinding sel bakteri

merupakan struktur yang unik secara biokimia. Dinding sel pada beberapa bakteri

mengandung murein, yang juga dikenal sebagai peptidoglikan atau mucopeptida.

Lapisan peptidoglikan ini tidak ditemukan pada organisme eukariotik (Atlas,

1984).

Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga kelompok utama, yaitu

bentuk kokus (bulat), bentuk basil (silinder atau batang), dan bentuk spiral (batang

melengkung atau melingkar-lingkar). Berdasarkan struktur dan dinding sel,

bakteri dibedakan menjadi bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif.

Perbedaan sifat bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif disajikan pada

Tabel 1 (Tortora et al., 1989).

Tabel 1 Perbedaan sifat bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif

Ciri-ciri Gram-positif Gram-negatif

Struktur dinding sel :

Tebal (15 – 80 nm) Berlapis tunggal (mono)

Tipis (10 – 15 nm) Berlapis 3 (multi)

Komponen dinding sel : - Kandungan lipid dan

lipoprotein - Peptidoglikan

- Kandungan lipopolisakarida (LPS) - Asam tekoat - Toksin yang dihasilkan

Rendah Komponen utama (90% dari dinding sel) Tebal (multilayer)

Tidak ada Kebanyakan ada, terutama eksotoksin

Tinggi Jumlah sedikit (10% dari dinding sel) Tipis (single layer)

Tinggi Tidak ada, terutama indotoksin

Ketahanan terhadap pengeringan

Tinggi Rendah

Ketahanan terhadap gangguan fisik

Tinggi Rendah

Sumber : Tortora et al., 1989

6

2.2 Bakteri laut penghasil pigmen

Austin (1988) mengatakan bahwa sebagian besar bakteri yang terdapat pada

perairan laut terdiri dari bakteri Gram-negatif, sedangkan bakteri Gram-positif

sebagian besar terdapat pada sedimen. Pada umumnya, kebanyakan dari bakteri-

bakteri ini merupakan penghasil pigmen terutama pigmen kuning, oranye, atau

merah pada media padat.

2.2.1 Bakteri fototrof yang mengandung bakteriokhlorofil

Dikatakan pula kalau bakteri gram-negatif fototrof umumnya terdapat pada

permukaan perairan. Bakteri yang mengandung bakteriokhlorofil yang ditemukan

pada perairan laut, diwakili oleh lima famili, yaitu Chlorobiaceae (green sulphur

bacteria), Chromatiaceae (purple sulphur bacteria), Ectothiorhodospiraceae

(purple sulphur bacteria), Rhodospirillaceae (purple non-sulphur bacteria), dan

Thiocapsaceae (purple sulphur bacteria).

Selanjutnya Austin menyebutkan bahwa Famili Chlorobiaceae, yang

terdapat pada perairan laut adalah Chlorobium dan Prosthecochloris. Chlorobium

adalah bakteri an-aerob yang tidak dapat bergerak, berbentuk batang lurus atau

melengkung dengan vakuola yang tidak mengandung gas, mengandung pigmen

bakteriokhlorofil c, d, atau e, dan karotenoid, chlorobactene dan isorenieratene.

Pigmen-pigmen ini menyebabkan massa sel berwarna dari kuning – hijau – coklat,

yang terkandung pada vesikel yang terdapat di bawah dan melekat pada membran

sitoplasma (Gambar 1). Chlorobium yang terisolasi dari perairan laut adalah C.

limicola dan C. vibrioforme. Genus kedua adalah Prosthecochloris, yang

berbentuk bulat dan mengandung pigmen bakteriokhlorofil c atau e bersama-sama

dengan karotenoid, chlorobactene dan isorenieratene yang terdapat pada vesikel.

Prosthecochloris yang terisolasi dari lumpur pantai dan estuari adalah P. aestuarii

dan P. phaeoasteroidea.

Sedangkan Famili Chromatiaceae yang terdapat pada perairan laut adalah

Chromatium, Thiocystis dan Thiospirillum. Chromatium merupakan bakteri an-

aerob, tidak mempunyai vakuola, berbentuk batang dan menghasilkan lendir,

dapat bergerak dengan flagella polar. Memerlukan hidrogen sulfida untuk

fotosintesis, sedangkan sulfur yang dihasilkan disimpan pada sel intraseluler.

Massa sel berwarna purple atau coklat. Thiocystis merupakan bakteri yang

7

berbentuk bulat dengan diameter kira-kira 3,0 µm, mengandung okenone dan atau

rhodopinal sebagai karotenoid yang memberikan warna purple – violet – merah

pada massa sel. Thiocystis yang ditemukan pada perairan dan lumpur pantai yang

mengandung hidrogen sulfida adalah T. gelatinosa dan T. violacea. Thiospirillum

jenense berbentuk spiral, mengandung likopene dan rhodopin sebagai karotenoid,

dan menyebabkan massa sel berwarna oranye – coklat.

Genus Ectothiorhodospira merupakan bakteri an-aerob yang berbentuk

spiral, sel tidak mempunyai vakuola, yang jika dapat bergerak karena memiliki

flagella polar. Bakteriokhlorofil a atau b terdapat pada stacked membrane

(Gambar 1), dan massa sel berwarna hijau atau merah. Hidrogen sulfida dioksidasi

selama fotosintesis dan melepaskan sulfur yang kemudian disimpan pada bagian

luar sel. Yang ditemukan pada perairan pantai adalah E. halochloris, E. halophila

dan E. mobilis (Truper dan Imhoff, 1981 in Austin, 1988).

Famili Rhodospirillaceae meliputi Rhodocyclus, Rhodomicrobium,

Rhodopseudomonas dan Rhodospirillum. Dari genus Rhodocyclus, contohnya

adalah R. purpureus, merupakan bakteri mikro-aerofilik, tidak bergerak,

merupakan sel dengan pigmen purple – violet. Karotenoid meliputi rhodopin dan

rhodopinal. Pigmen fotosintesis terdapat pada membran intrasitoplasma, tersusun

seperti tabung (Gambar 1) (Truper dan Pfennig, 1981 in Austin, 1988).

Rhodomicrobium, meliputi R. vannielii, merupakan bakteri Gram-negatif yang an-

aerob, mampu melakukan metabolisme oksidasi pada kondisi mikro-aerofilik dan

aerobik. Organisme ini memiliki sebuah sistem membran lamellar (Gambar 1),

mengandung bakteriokhlorofil a, karotenoid grup I dan β-karoten (Moore, 1981 in

Austin, 1988). Rhodopseudomonas mempunyai dua spesies yang telah diisolasi

dari air laut, yaitu R. marina (Imhoff, 1983 in Austin, 1988) dan R. sulfidophila

(Hansen dan Veldkamp, 1973 in Austin, 1988). Bakteri ini dikenal sebagai purple

non-sulphur bacteria, toleran terhadap konsentrasi sulfida yang rendah yang tidak

dioksidasi menjadi sulfat, tetapi dioksidasi menjadi thiosulfat dan sulfur. Bakteri

berbentuk batang pendek, bergerak dengan flagella polar. Pigmen fotosintesis,

yaitu bakteriokhlorofil a dan karotenoid dari spirilloxanthine, yang terdapat pada

membran intrasitoplasma, tersusun seperti stacks (Gambar 1) dan terletak sejajar

dengan membran sitoplasma. Rhodospirillum, merupakan obligat halofilik,

8

contohnya adalah spesies R. salexigens, bakteri Gram-negatif, berbentuk spiral

atau melengkung yang bergerak dengan flagella bipolar. Pigmen utama adalah

bakteriokhlorofil a dan spirilloxanthine yang terdapat pada membran

intrasitoplasma, tersusun sejajar dengan membran sitoplasma (Drews, 1981 in

Austin, 1988).

Dari genus Thiocapsa, yang ditemukan pada lumpur estuarin dan lumpur

pantai adalah T. pfennigii dan T. roseopersicina. Sel bakteri berbentuk bulat

dengan diameter 1,2 – 3,0 µm, tidak mempunyai vakuola, tidak bergerak, pigmen

sel terdiri dari orange – coklat – pink – merah. Karotenoid merupakan

spirilloxanthine dan tetrahydrospirilloxanthine. Bersama dengan bakteriokhlorofil

a dan b, pigmen terdapat pada membran intrasitoplasma yang berbentuk vesicular

atau tube (Gambar 1) (Austin, 1988).

Keterangan :

1 = tubes, ditemukan pada Rhodocyclus, Rhodopseudomonas dan Rhodospirillum; 2 = bundled tubes seperti yang ditemukan pada Thiocapsa; 3 = stacks, ditemukan pada Ectothiorhodospira dan Rhodospirillum; 4 = membran seperti pada Rhodomicrobium dan Rhodopseudomonas; 5 = vesicle, yang umum pada Chromatium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Thiocapsa dan Thiospirillum. Gambar 1 Susunan membran intrasitoplasma yang ditemukan pada bakteri

fotosintesis (Austin, 1988).

Dua genera yang lain, yaitu Chloroherpeton dan Erythrobacter.

Chloroherpeton, yang hanya satu spesies, yaitu C. thalassium, merupakan bakteri

9

Gram-negatif, berbentuk batang panjang, merupakan organisme green sulphur,

gliding dan obligat fototrof, mempunyai pigmen bakteriokhlorofil c dan sedikit

bakteriokhlorofil a bersama γ - karoten, memerlukan CO2

dan sulfida untuk

tumbuh. Sulfur disimpan di luar sel (Gibson et al., 1984 in Austin, 1988).

Erythrobacter, dengan spesies E. longus, tidak tumbuh secara fototrofik. Tetapi

selnya mengandung bakteriokhlorofil a, berbentuk batang oval, bergerak dengan

flagella sub-polar, aerobik, memerlukan biotin, memproduksi katalase, oksidase

dan fosfatase, menguraikan gelatin, menggunakan atau memanfaatkan glukosa,

asetat, butirat, glutamat dan piruvat sebagai sumber karbon (Shiba dan Simidu,

1982 in Austin, 1988).

2.2.2 Bakteri Gram-negatif, aerobik, berbentuk batang dan kokus

Organisme halofilik, yang memerlukan 15% NaCl, merupakan famili

Halobacteriaceae, dan terdapat pada lingkungan lautan adalah Halobacterium dan

Halococcus. Halobacterium yang terisolasi dari laut adalah H. denitrificans, H.

mediterranei, H. pharmaconis, H. saccharovorum, H. salinarium, H. sodomense

dan H. volcanii. Halobacterium merupakan bakteri Gram-negatif berbentuk

batang, dapat bergerak atau tidak, memiliki metabolisme respiratory, dan

memproduksi katalase dan oksidase. Bakteri ini menghasilkan koloni berwarna

pink, merah, atau oranye. Pertumbuhan terbaik pada NaCl 20 - 26 %. Ciri-ciri

yang sama juga dilaporkan pada Halococcus, yang terisolasi dari laut dan

diklasifikasikan sebagai H. morrhuae merupakan bakteri yang menghasilkan

pigmen pink, merah atau oranye, Gram-negatif tidak bergerak, berbentuk kokus

dan memproduksi katalase dan oksidase. Pembelahan sel dengan septasi.

Metabolisme dengan respiratory (Larsen, 1984 in Austin, 1988).

Alteromonas, merupakan bakteri Gram-negatif berbentuk batang yang

bergerak dengan flagellum tunggal yang polar. Bakteri ini melakukan

metabolisme secara respiratif, serta ditemukan pada perairan pantai dan lautan

terbuka. A. rubra membentuk pigmen warna merah, A. aurantia menghasilkan

pigmen warna oranye, A. citrea menghasilkan pigmen warna kuning lemon dan A.

luteoviolacea berwarna violet (Baumann et al., 1984a in Austin, 1988).

10

Genera Chromobacterium dan Janthinobacterium merupakan bakteri

aerobik berpigmen purple, berbentuk batang, Gram-negatif, dan bergerak dengan

flagellum tunggal yang polar. Janthinobacterium lividum terdapat dalam jumlah

yang rendah pada perairan pantai (Austin, 1988).

2.2.3 Bakteri Gram-negatif, fakultatif an-aerobik, berbentuk batang

Serratia rubidea berpigmen merah, Gram-negatif, berbentuk batang, yang

menghasilkan katalase tetapi tidak oksidase, bergerak dengan flagella peritrichous

(Grimont dan Grimont, 1984).

Vibrio merupakan genus bakteri yang banyak ditemukan pada perairan

pantai dan estuarin. Berbentuk batang, menghasilkan katalase dan oksidase,

fermentatif, bergerak dengan flagella polar. V. fischeri merupakan bakteri yang

memancarkan cahaya, berpigmen oranye kekuningan. V. gazogenes menghasilkan

koloni dengan warna merah, Vibrio nigripulchritudo menghasilkan koloni dengan

pigmen biru kehitaman (Austin, 1988).

2.2.4 Bakteri Gram-negatif, an-aerobik, berbentuk batang dan kokus

Menurut Austin, 1988 dari famili Desulfurococcaceae, yang ditemukan di

laut dan menghasilkan pigmen adalah Desulfuromonas. Contoh bakteri ini adalah

D. acetoxidans, dengan ciri-ciri antara lain berbentuk batang, bergerak dengan

flagellum tunggal yang polar, membentuk koloni yang mengandung pigmen

peach – pink.

2.3 Pertumbuhan bakteri

Pada umumnya pertumbuhan didefinisikan sebagai peningkatan secara

teratur pada semua komponen-komponen kimiawi sel dan struktur sel. Kecepatan

pertumbuhan untuk sistem uniseluler didefinisikan sebagai peningkatan jumlah sel

atau massa sel per satuan waktu. Setiap terjadi pembelahan sel disebut dengan

satu generasi, waktu yang diperlukan untuk pembelahan disebut waktu generasi.

Waktu generasi bervariasi antara mikroorganisme : biasanya bakteri memerlukan

satu sampai tiga jam untuk membelah diri tetapi ada juga yang hanya memerlukan

10 – 20 menit sedangkan mikroba yang lain memerlukan waktu 24 jam atau

lebih (Middelbeek et al., 1992 a).

11

Bakteri dapat tumbuh pada sistem tertutup, yang dikenal sebagai batch

culture atau pada sistem terbuka, dimana proses berlangsung secara kontinu. Pada

sistem terbuka, pertumbuhan dikontrol dengan menambahkan nutrien segar dan

membuang medium sisa dan sel-sel dari wadah pertumbuhan.

2.3.1 Siklus pertumbuhan

Pertumbuhan suatu populasi bakteri pada sistem tertutup hanya terwakili

pada tahap atau fase eksponensial (Gambar 2). Pertumbuhan bakteri dapat

dinyatakan secara grafik dengan menggunakan data hasil pengukuran populasi

bakteri yang hidup dalam kultur media cair pada selang waktu yang tetap.

Pertumbuhan bakteri terdiri dari beberapa fase (tahap) yaitu : (1) tahap ancang-

ancang (lag phase), (2) tahap eksponensial (logaritmic phase), (3) tahap

stasioner (stationair phase) dan (4) tahap kematian (death phase) (Middelbeek et

al., 1992 a

Pada lag phase, tidak ada peningkatan jumlah sel atau turbiditas karena

bakteri sedang beradaptasi dengan lingkungan yang baru. Hal ini dapat

disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah adanya kemungkinan

medium tidak optimal untuk organisme sehingga organisme perlu mensintesa

enzym agar mampu menggunakan substrat sebagai sumber energi atau untuk

sintesis material sel. Selama fase ini massa sel dapat berubah tanpa adanya suatu

perubahan jumlah sel (Sa’id, 1987).

).

Schlegel dan Schmidt (1994) menjelaskan bahwa, tahap ancang-ancang

mencakup interval waktu antara saat penanaman dan saat tercapainya kecepatan

pembelahan maksimum. Lamanya tahap ancang-ancang tergantung dari

konsentrasi awal, umur, bahan yang ditanam dan sifat medium pertumbuhan.

Dikatakannya pula bahwa tahap pertumbuhan eksponensial atau logaritmik

ditandai oleh kecepatan pembelahan maksimum yang konstan. Kecepatan

pembelahan pada fase logaritmik bersifat spesifik untuk tiap jenis bakteri dan

tergantung pada kondisi lingkungan, misalnya suhu dan komposisi medium kultur

(Middelbeek et al., 1992a). Karena kecepatan pembelahan diri relatif konstan pada

tahap logaritmik, maka dapat digunakan untuk mempelajari pengaruh faktor-

faktor lingkungan (pH, potensial redoks, suhu, aerasi, dan sebagainya) terhadap

12

pertumbuhan dan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menggunakan

berbagai substrat.

Y

(3)

(2) (4)

(1)

X

Keterangan : X Waktu inkubasi Y Jumlah sel bakteri (1) Tahap ancang-ancang (2) Tahap eksponensial (3) Tahap stasioner

(4) Tahap menuju kematian

Gambar 2 Kurva pertumbuhan bakteri (Schlegel dan Schmidt, 1994).

Secara matematis, pertumbuhan eksponensial dapat didekati dengan dua

cara. Pendekatan pertama dengan menentukan jumlah awal sel. Perubahan jumlah

sel karena pembelahan atau pertumbuhan, diekspresikan dengan persamaan

(Middelbeek et al., 1992a

Nt = No . 2

) :

Log Nt = log No + n log 2

n

n/t = (log Nt – log No) / t log 2

dimana : Nt = jumlah sel setelah waktu tertentu No = jumlah awal sel N = banyaknya pembelahan

n/t = banyaknya pembelahan per satuan waktu yang disebut juga dengan konstanta kecepatan pertumbuhan (k)

Pendekatan lain adalah dengan menggambarkan kecepatan pertumbuhan

populasi sebagai suatu reaksi autokatalitik. Kecepatan reaksi katalis tergantung

pada banyaknya katalis. Pada kasus ini, biomassa merupakan katalis yang

sebenarnya, dan kecepatan produksi biomassa tergantung pada banyaknya

13

biomassa pada waktu tertentu. Pertumbuhan eksponensial dapat dihitung dengan

menggunakan persamaan (Middelbeek et al., 1992 a

Banyaknya biomassa pada satuan waktu tertentu : Xt = Xo . e

) : dx/dt = µ.X

Kecepatan pertumbuhan spesifik adalah : µ = (ln Xt – ln Xo) / t

µt

dimana : dx/dt = kecepatan pertumbuhan µ = kecepatan pertumbuhan spesifik X = banyaknya biomassa

Tahap stasioner dimulai ketika sel-sel sudah tidak tumbuh lagi. Kecepatan

pertumbuhan tergantung dari kadar substrat. Menurunnya kecepatan pertumbuhan

sudah terjadi ketika kadar substrat berkurang sebelum substrat habis terpakai.

Penurunan kecepatan pertumbuhan juga disebabkan oleh kepadatan populasi yang

tinggi, tekanan parsial oksigen yang rendah dan timbunan produk metabolisme

yang bersifat toksik (mengintroduksi tahap stasioner). Pada tahap stasioner bahan-

bahan simpanan masih dapat digunakan, sebagian ribosom dapat diuraikan dan

masih ada pembentukan enzim. Selama energi yang dibutuhkan untuk

mempertahankan sel-sel masih dapat diperoleh dengan respirasi bahan simpanan

dan protein, bakteri masih mampu mempertahankan hidupnya untuk masa yang

cukup panjang. Masa bakteri yang dicapai pada tahap stasioner dinamakan hasil

atau keuntungan.

Tahap kematian dan sebab-sebab kematian sel bakteri dalam larutan biak

normal belum banyak diteliti. Pada tahap ini terjadi penimbunan asam misalnya

pada bakteri Escherichia coli dan Lactobacillus sp. Jumlah sel hidup dapat

berkurang secara eksponensial. Ada kemungkinan sel-sel diuraikan kembali oleh

enzim yang dihasilkan sendiri oleh sel (autolisis).

2.3.2 Pengaruh faktor lingkungan pada pertumbuhan

Ada beberapa faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri

yaitu faktor-faktor fisika dan faktor-faktor kimia. Faktor-faktor fisika yang

mempengaruhi pertumbuhan bakteri antara lain yaitu suhu, ketersediaan air, pH,

tekanan hidrostatik dan cahaya (Middelbeek dan Drijver – de Haas, 1992). Faktor-

faktor kimia sebagai sumber nutrisi yang juga mempengaruhi pertumbuhan yaitu

makro nutrien (C, O, N, H, P dan S), mikro nutrien atau trace element (Mn, Zn,

14

Co, Mo, Ni, Cu, dan Cl) dan faktor-faktor pertumbuhan (Middelbeek et al.,

1992b

Faktor Fisiko Kimiawi

).

(1) Suhu

Pengaruh suhu pada kecepatan pertumbuhan bakteri sebagian

menggambarkan pengaruh suhu pada kecepatan reaksi-reaksi (bio)kimia.

Berdasarkan toleransi suhu pertumbuhan, bakteri dapat diklasifikasikan menjadi

tiga kelompok : Psikrofil, yaitu bakteri yang dapat tumbuh pada suhu yang

rendah, pada perairan Arctic dan Antarctic (di bawah 0oC), perairan laut dengan

suhu 1oC sampai 5oC. Suhu optimum bagi pertumbuhan bakteri psikrofil adalah

15oC atau lebih rendah dan suhu minimum 0oC. Bakteri fakultatif psikrofil atau

psikrotrop yaitu bakteri yang mempunyai suhu optimum pertumbuhan pada 25oC

sampai 30oC dan suhu maksimum pertumbuhan pada 35oC. Mesofil, yaitu bakteri

yang hidup pada manusia dan hewan berdarah panas, pada daratan dan perairan di

daerah beriklim sedang dan tropis. Kisaran suhu bagi bakteri mesofil adalah 20oC

dan 40oC, dengan suhu optimum untuk pertumbuhan adalah 37oC. Thermofil,

yaitu bakteri yang pertumbuhannya optimum pada suhu 50oC sampai 70o

(2) pH

C

(Middelbeek dan Drijver-de Haas, 1992).

Semua mikroorganisme mempunyai kisaran pH tertentu dimana mereka

dapat tumbuh dan biasanya pada kisaran itu merupakan pH optimum dimana

mereka tumbuh dengan sangat baik. Pada umumnya bakteri tumbuh baik pada

kisaran pH 6,5 - 7,5.

Nilai pH air laut berkisar antara 7,5 dan 8,5 (Austin, 1988). Pada bakteri

yang dibiakkan di laboratorium, pH medium merupakan salah satu faktor penting

yang mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan produk. Selain itu, pH

medium juga sangat dipengaruhi oleh hasil metabolisme dari bakteri, oleh sebab

itu pH medium mempunyai kecenderungan berubah.

Pada proses fermentasi, bakteri menghasilkan asam organik (asam laktat,

asam asetat dan lain-lain) dan amonia yang dilepaskan ke medium saat asam

amino terfermentasi, sehingga pH medium mempunyai kecenderungan berubah.

Bila amonia adalah sumber nitrogen, maka pH cenderung menurun. Amonia pada

15

larutan (di bawah pH 9) berbentuk NH4+; mikroorganisme kemudian

menggabungkannya dengan sel sebagai R-NH3+, dimana R adalah suatu gugus

karbon. Pada saat proses fermentasi berlangsung, sebuah ion H+ tertinggal di

dalam medium. Bila nitrat adalah sumber nitrogen, maka ion-ion nitrogen diambil

dari medium untuk mereduksi NO3 menjadi R-NH3+

(3) Cahaya

, dan pH cenderung naik.

Untuk mempertahankan pH medium, dapat ditambahkan asam chlorida atau

natrium hidroksida.

Persyaratan cahaya hanya penting untuk pertumbuhan mikroorganisme

fotosintetik. Untuk mendapatkan pertumbuhan mikroorganisme fototropik dari

jenis yang berbeda, harus menggunakan cahaya dengan panjang gelombang yang

tepat. Eukariot dan alga biru hijau mengabsorbsi cahaya pada spektrum merah

terakhir sedangkan bakteri fotosintetik pada spektrum infra merah (Middelbeek et

al., 1992b

Cahaya dapat menyebabkan kerusakan pada sel bakteri dan dapat juga

menyebabkan kematian. Banyak dari mikroorganisme mempunyai komponen-

komponen sel yang sensitif terhadap cahaya. Komponen-komponen sel yang

menyerap cahaya yaitu sitokhrom, flavin dan khlorofil menjadi aktif ketika

menyerap cahaya dan menghasilkan energi yang lebih tinggi. Mereka kemudian

dapat mengembalikan energi tersebut seperti semula melalui pemancaran cahaya

(fluorescens) atau mentransfer energi ke komponen sel yang lain. Transfer energi

dapat menguntungkan organisme (fotosintesis) tetapi dapat juga merusak

organisme. Pada kasus yang terakhir, ada dua mekanisme yang menimbulkan

pengaruh berbahaya, salah satunya adalah molekuler oksigen. Kerusakan karena

oksigen bebas disebabkan oleh pembentukan radikal bebas (O

).

2-

(4) Unsur-unsur nutrisi

) yang sangat

reaktif dan destruktif (Middelbeek dan Drijver – de Haas, 1992).

Bakteri seperti organisme lain agar dapat tumbuh memerlukan nutrisi

esensial tertentu dari medium tempat hidup. Nutrisi esensial dibagi dalam dua

kelompok, yaitu nutrien yang diperlukan sebagai suplai energi untuk tumbuh dan

nutrien yang diperlukan sebagai suplai elemen-elemen kimia yang diperlukan

untuk biosintesis. Dari berbagai bentuk energi yang tersedia, bakteri dapat

16

menggunakan energi kimia dan cahaya untuk tumbuh (Sokatch, 1973). Nutrien

yang diperlukan dalam jumlah yang cukup besar dan yang merupakan bagian

terbesar dari berat kering dalam sel, disebut dengan makro nutrien. Yang termasuk

dalam makro nutrien adalah C (50 %), O (20 %), N (14 %), H (8 %), P (3 %), dan

S (1 %) serta K, Na, Ca, Mg dan Fe (Middelbeek et al., 1992b

Elemen-elemen yang disebut sebagai mikronutrien atau disebut juga trace

element adalah Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu dan Cl. Biasanya trace element

diperlukan sebagai kofaktor enzim atau sebagai aktivator.

).

Kelompok nutrien yang merupakan bahan-bahan organik yang tidak dapat

disintesis oleh sel bakteri disebut faktor-faktor pertumbuhan, oleh sebab itu

medium pertumbuhan harus mengandung kelompok nutrien ini. Berdasarkan

struktur kimiawi dan fungsi metaboliknya, faktor pertumbuhan dibagi dalam tiga

kelompok (Middelbeek et al., 1992b

Berdasarkan kebutuhan nutrisinya baik sebagai sumber energi maupun

sebagai sumber karbon, organisme diklasifikasikan oleh Middelbeek et al. (1992

), yaitu : asam amino, sebagai unsur pokok

protein; purin dan pirimidin, sebagai unsur pokok asam nukleat; dan vitamin,

merupakan senyawa organik yang diperlukan sebagai kofaktor oleh enzim. Asam

amino, purin dan pirimidin diperlukan dalam jumlah yang cukup besar, karena

merupakan unsur pembentuk untuk sintesis biopolimer. Vitamin diperlukan dalam

jumlah yang kecil karena merupakan kofaktor bagi enzim.

b

- Fototrof, bila cahaya merupakan sumber utama energi.

)

sebagai berikut :

- Kemotrof, bila bahan kimiawi merupakan sumber utama energi.

- Autotrof, bila bahan anorganik merupakan sumber utama karbon.

- Heterotrof, bila bahan organik merupakan sumber utama karbon.

Dengan mengkombinasikan kelompok organisme tersebut di atas, dapat

dibentuk empat kelompok organisme yang lain, yaitu :

- Fotoautotrof, yaitu organisme yang menggunakan cahaya sebagai

sumber energi dan CO2

- Fotoheterotrof, yaitu organisme yang menggunakan cahaya sebagai

sumber energi dan senyawa organik sebagai sumber karbon.

sebagai sumber karbon.

17

- Kemoautotrof, yaitu organisme yang menggunakan bahan kimiawi

sebagai sumber energi dan CO2

- Kemoheterotrof, yaitu organisme yang menggunakan bahan kimiawi

sebagai sumber energi dan bahan organik sebagai sumber karbon.

sebagai sumber karbon.

Berdasarkan kebutuhan oksigen, bakteri dapat dibedakan atas bakteri aerob,

yaitu bakteri yang membutuhkan oksigen untuk hidup dan bakteri an-aerob, yaitu

bakteri yang tidak mampu menggunakan oksigen. Bakteri aerob dapat dibagi

dalam tiga kelompok yaitu bakteri aerob obligat, fakultatif, dan mikroaerofilik.

Bakteri aerob obligat memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya, tetapi tidak

dapat tumbuh bila konsentrasi oksigen melebihi konsentrasi oksigen atmosfir (>

20%). Bakteri aerob fakultatif tidak memerlukan oksigen tetapi dapat tumbuh

dengan baik bila oksigen tersedia. Bakteri aerob mikroaerofilik memerlukan

oksigen tetapi dengan konsentrasi yang lebih rendah dari konsentrasi oksigen

atmosfir (2 – 10 % v/v). Bakteri an-aerob dapat dibagi dalam dua kelompok yaitu

bakteri an-aerob obligat dan bakteri an-aerob aerotoleran. Pada bakteri an-aerob

obligat, adanya oksigen dalam media pertumbuhannya merupakan racun dan

berbahaya bagi bakteri tersebut. Bakteri an-aerob aerotoleran yaitu bakteri yang

tidak dapat menggunakan oksigen untuk pertumbuhannya tetapi dapat

mentoleransi adanya oksigen (Tortora et al., 1989; Middelbeek et al., 1992).

2.3.3 Pengukuran kuantitatif pertumbuhan bakteri

Pengukuran kuantitatif pertumbuhan bertujuan untuk mengetahui berbagai

respon pertumbuhan mikroorganisme dalam berbagai media atau pada kondisi

yang berbeda-beda sehingga dapat digunakan dalam menilai daya dukung suatu

medium tertentu untuk menunjang pertumbuhan (Pelczar dan Chan, 1986).

Beberapa teknik untuk mengukur pertumbuhan mikroorganisme disajikan pada

Tabel 2.

Pertumbuhan populasi sel disertai juga dengan peningkatan total massa sel.

Pengukuran massa sel dapat dilakukan secara langsung atau tidak langsung

(Jenkins, 1992). Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengukur massa sel

secara langsung adalah dengan menentukan berat kering sel. Pengukuran berat

kering massa sel meliputi tiga tahap, yaitu : pemisahan organisme dari medium,

pencucian sel dan pengeringan biomassa. Organisme dapat dipisahkan dari

18

medium dengan filtrasi atau dengan sentrifugasi. Pencucian biomassa harus

dilakukan sedemikian rupa agar tidak terjadi lisis pada organisme karena pecah

akibat osmosis. Pengeringan biomassa biasanya dilakukan pada suhu 80oC selama

24 jam atau 110o

BK (g/l) = -

x 10

C selama 8 jam (Jenkins, 1992). Berat Kering (BK) sel diperoleh

dengan cara sebagai berikut :

3

Pengukuran massa sel secara tidak langsung didasarkan pada kenyataan

bahwa sel bakteri memencarkan kembali cahaya yang membentur sel. Teknik

pengukuran ini merupakan teknik yang lebih cepat dan sensitif. Jumlah cahaya

yang tersebar adalah sebanding dengan konsentrasi sel yang ada. Banyaknya

cahaya yang menyebar dapat diukur dengan menggunakan spektrofotometer.

Dalam hal ini cahaya yang terukur sebanding dengan konsentrasi sel bakteri pada

tingkat absorbans yang rendah. Absorbans (A) didefinisikan sebagai logaritma

dari perbandingan antara intensitas cahaya yang melewati suspensi (Io) dengan

cahaya yang dipencarkan oleh suspensi (I), atau A = log(Io/I) (Jenkins, 1992).

l

Tabel 2 Metode untuk mengukur pertumbuhan bakteri

Metode Beberapa penetapan

Hitungan mikroskopik Perhitungan bakteri dalam susu dan vaksin

Hitungan cawan Perhitungan bakteri dalam susu, air, makanan, tanah, biakan dan sebagainya

Membran atau filter molekuler Sama seperti hitungan cawan

Pengukuran kekeruhan Uji mikrobiologis, pendugaan hasil panen sel, biakan, atau suspensi berair

Penentuan nitrogen Pengukuran panen sel dari suspensi biakan kental untuk digunakan pada penelitian mengenai metabolisme

Penentuan berat kering Sama seperti penentuan nitrogen

Pengukuran aktivitas biokimia Uji mikrobiologis

Sumber : Pelczar dan Chan, 1986

2.4 Pewarna alami

Pewarna alami dalam sistem biologi didefinisikan sebagai pewarna yang

terbentuk dan terakumulasi dalam atau dikeluarkan dari sel hidup (Hendry, 1992).

Pewarna yang terdapat pada sistem biologi dapat diklasifikasikan berdasarkan

19

jenis dari organisme (hewan, tumbuhan atau bakteri) penghasil pewarna tersebut.

Sehubungan dengan pewarna makanan, bakteri, fungi sel tunggal dan fungi

sederhana bersama-sama dengan alga sel tunggal dan juga zooplankton sederhana

dapat menjadi sumber pewarna baru karena potensinya untuk dieksploitasi dengan

teknik kultur. Pigmen dari organisme yang lebih tinggi seperti hewan, tumbuhan

dan fungi, lebih kecil kemungkinan untuk dieksploitasi karena struktur pigmennya

yang kompleks dengan jaringan sel yang kuat atau karena pigmen dari organisme

yang lebih tinggi hanya terbentuk pada saat-saat kritis dari perkembangan

organisme dalam suatu siklus hidup yang kompleks. Sebagai contoh, pigmen yang

berfungsi sebagai bahan perangsang dalam reproduksi seksual yang terbentuk

hanya setelah aspek-aspek lain dari siklus hidup selesai.

Klasifikasi pigmen pada sistem biologi menurut Hendry (1992) adalah

sebagai berikut :

(1) Tumbuh-tumbuhan termasuk alga

Pigmen dari tumbuhan merupakan penyumbang terbesar pewarna alami,

namun kisaran atau variasi pigmen yang terdapat pada tumbuhan adalah kecil.

Pewarna dominan yang berasal dari tumbuhan darat adalah khlorofil (2 jenis),

karotenoid (4 – 5 jenis) dari flavonoid (3 jenis). Dari lautan, terdapat 4 jenis

khlorofil yang umum, 6 atau 7 karotenoid dan 2 bentuk phycobilin. Kontribusi

pigmen lainnya dari tumbuhan, termasuk betalain, melanin, anthraquinon,

naphthaquinon, karoten yang tidak umum, xanthofil dan beberapa flavonoid yang

relatif tidak signifikan bila dilihat secara global. Pigmen-pigmen yang terdapat

pada tumbuhan termasuk alga disajikan pada Tabel 3.

(2) Hewan vertebrata

Pada hewan vertebrata, kelas-kelas yang menghasilkan pewarna adalah

burung, amphibi, ikan bertulang dan beberapa reptil. Pigmen tersebut disajikan

pada Tabel 4.

(3) Hewan invertebrata

Distribusi pigmen pada hewan lebih rendah lebih besar daripada vertebrata

dan merupakan saingan tumbuhan lebih tinggi dalam variasi.

20

Tabel 3 Pigmen pada tumbuhan dan alga

Pigmen Contoh Terdapat pada

Khlorofil a b c, d

Semua organisme eukariot yang berfotosintesis Semua tumbuhan darat, beberapa alga Alga coklat dan lainnya

Phycobilin Phycocyanin Phycoerythrin

Alga biru –hijau dan lainnya Alga merah dan lainnya

Karotenoid Lutein β-caroten Violaxanthin Neoxanthin Fucoxanthin

Xanthofil lebih melimpah, umumnya pada organisme fotosintetik Karoten lebih melimpah, umumnya pada organisme fotosintetik Umum pada tumbuhan lebih tinggi Umum pada tumbuhan lebih tinggi Alga coklat dan lainnya

Anthocyanidin Cyanidin Pelargonidin Delphinidin

Yang paling umum anthicyanidin, tersebar luas pada tumbuhan lebih tinggi Umum pada tumbuhan lebih tinggi Umum pada tumbuhan lebih tinggi

Betalain Betacyanin Tersebar luas tetapi terbatas pada satu ordo timbuhan

Sumber : Hendry, 1992

Tabel 4 Pigmen pada vertebrata

Kelas Pigmen

Mamalia Terutama melanin Burung (termasuk telurnya) Melamin

Karotenoid Tetrapyrrole

Reptil dan Amfibi dan ikan bertulang

Melanin Karotenoid Pterin Riboflavin

Ikan bertulang rawan Melanin Sumber : Hendry, 1992

(4) Fungi

Fungi, terutama fungi sel tunggal yang lebih sederhana dapat diambil untuk

kultur skala besar, mempunyai potensi yang sangat besar sebagai sumber pigmen

alami.

(5) Bakteri

Pada umumnya bakteri mengandung banyak pigmen yang sama atau identik

dengan pigmen dari organisme yang lebih kompleks terutama tumbuhan. Klorofil

dari bakteri berbeda dengan klorofil tumbuhan dalam reduksi satu ikatan rangkap.

21

Karotenoid dari bakteri mempunyai ciri tersendiri yang berbeda tetapi secara

struktural dan biosintetik berhubungan erat dengan karotenoid dari tumbuhan dan

hewan. Kebanyakan bakteri baik fotosintetik maupun non-fotosintetik juga

mengandung β- dan γ-karoten.

2.4.1 Pewarna makanan

Pada umumnya pewarna makanan dapat dibagi dalam tiga kategori utama

(Bauernfeind, 1981), yaitu :

(a) Pewarna organik alami yang berasal dari tumbuhan atau hewan, diekstrak dari

alam atau senyawa-senyawa identik yang dihasilkan melalui sintesis kimiawi.

(b) Pewarna inorganik yang diambil dari alam atau dihasilkan secara sintetis.

(c) Pewarna buatan, yaitu senyawa-senyawa sintetis yang tidak berasal dari alam

atau tidak terdapat pada makanan yang dikonsumsi.

Secara kimiawi menurut Bauernfeind (1981) pewarna makanan alami dapat

dibagi menjadi beberapa grup, yaitu :

(a) Derivat isoprenoid (warna-warna karotenoid)

(b) Derivat tetrapyrrol (warna-warna klorofil dan heme)

(c) Derivat benzopiran (anthosianin dan flavonoid)

(d) Senyawa betalain (warna betanin dan yang berhubungan)

(e) Flavin (seperti riboflavin)

(f) Pigmen inorganik

Alasan ditambahkannya pewarna pada makanan menurut Henry (1992)

antara lain adalah untuk memperkuat warna pada makanan, memastikan

keseragaman warna makanan, memulihkan warna awal makanan yang berubah

karena pengaruh pengolahan, dan untuk memberi warna pada makanan tertentu

yang sebenarnya tidak berwarna.

Pewarna alami untuk makanan merupakan kelompok pewarna yang berbeda-

beda karakteristik solubilitas dan stabilitasnya. Oleh sebab itu setiap pewarna

tersedia dalam beberapa bentuk aplikasi yang berbeda, yang diformulasikan agar

pewarna sesuai dengan sistem makanan tertentu. Suatu bentuk aplikasi produk

pewarna adalah suatu formula yang memungkinkan bahan tambahan pangan

dengan mudah dan efisien tercampur dalam produk-produk makanan. Beberapa

faktor yang berhubungan dengan bentuk aplikasi yang harus dipertimbangkan

22

oleh ahli teknologi pangan adalah solubilitas, bentuk fisik, pH, kualitas

mikrobiologis dan bahan-bahan lain (Henry, 1992).

Karakteristik pewarna makanan yang baik menurut Bauernfeind (1981)

adalah sebagai berikut :

(1) Tidak toksik dan tidak bersifat karsinogenik pada berbagai level; tidak

mengandung bahan-bahan yang toksik.

(2) Kemampuan larut (solubilitas) dan kemampuan menyebar yang baik agar

dapat menyatu dengan produk-produk makanan dengan dasar air dan lemak.

(3) Tidak memberikan rasa atau bau yang berbeda terhadap produk-produk

makanan.

(4) Harus stabil terhadap cahaya, terhadap kisaran pH yang luas terutama pH 2 -

8, pada suhu panas, dan selama penyimpanan dan perlakuan sebelum

dikonsumsi.

(5) Tidak bereaksi dengan trace element atau dengan oxidizing atau bahan-

bahan pereduksi.

(6) Harus seragam pada tiap bagian dan dapat dimonitor baik dalam bentuk

konsentrat maupun dalam makanan dengan teknik analitis.

(7) Tersedia luas dan relatif ekonomis untuk digunakan pada makanan.

(8) Disetujui dan sesuai dengan spesifikasi pemerintah dan lebih baik bila

mempunyai status yang disetujui secara internasional.

23

3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Bahan dan alat 3.1.1 Bahan

1). Mikroorganisme

Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri laut

Gram-negatif yang diisolasi dari terumbu karang di Florida, Amerika Serikat yang

disediakan oleh Center of Marine Biotechnology, University of Maryland.

2). Media Pertumbuhan

Media yang digunakan terdiri dari media padat dan cair. Media padat

berfungsi untuk memelihara stok bakteri, yang dimodifikasi dari komponen

nutrien agar (Tortora et al., 1986). Media ini mengandung ekstrak khamir (2 g/l),

pepton (5 g/l), NaCl (20 g/l), agar (20 g/l). Komposisi ekstrak khamir dapat

dilihat pada Tabel 5. Media cair berfungsi sebagai media pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen. Media cair terdiri dari ekstrak khamir (2 g/l), pepton (5 g/l),

NaCl (20 g/l) dan trace element (5 ml/l). Komposisi trace element adalah

Na2EDTA (4,36 mg/l), FeCl36H2O (3,15 mg/l), CuSO45H2O (0,01 mg/l),

ZnSO47H2O (0,02 mg/l), CoCl26H2O (0,01 mg/l), MnCl24H2O (0,18 mg/l), dan

Na2MoO42H2O (0,006 mg/l). Untuk mempelajari pengaruh karbon dan nitrogen

dalam pertumbuhan dan pembentukan pigmen dari bakteri laut, maka digunakan

juga media cair yang terdiri dari sumber karbon dan sumber nitrogen. Sumber

karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah glukosa, asetat, sitrat,dan

maltosa. Sumber nitrogen yang digunakan adalah pepton, ekstrak khamir,

(NH4)2SO4, dan NaNO3

. Selain sumber karbon dan nitrogen, di dalam medium

cair juga ditambahkan NaCl dan trace element. Bahan kimia lainnya adalah

alkohol, HCl, NaOH dan metanol.

24

Tabel 5 Komposisi ekstrak khamir

Komponen mg/g Vitamin µg/g Total nitrogen Amino nitrogen Khlorida (NaCl) Berat Kering Phosphat (P2O5Karbohidrat

)

Sodium Pottasium Kalsium Besi Magnesium Tembaga Seng Mangan Kobalt

75 – 108 34 – 48 0,7 – 13 300 38 82 56 30 0,1 0,05 2 0,05 0,05 0,005 0,005

Thiamin Riboflavin Asam nukleat Asam pantotenat Piridoksin Biotin Inositol Kolin

10 20 400 50 25 1 1500 1500

Sumber : Bridson and Brecker (1970) in Sikyta (1983)

3). Penentuan Gram pada Identifikasi Bakteri

Bahan yang digunakan untuk identifikasi gram bakteri laut adalah : kristal

violet, larutan lugol, etanol 95%, aseton, safranin dan aquades.

3.1.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, cawan

petri, labu erlenmeyer, batang pengaduk, pipet, penjepit, lup inokulasi, vortex

mixer, inkubator, timbangan analitik, autoklaf, gelas ukur, sentrifus, clean bench,

inkubator goyang, spektrofotometer, refrigerator, kertas pH, tissue dan aluminium

foil.

3.2 Metode penelitian

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama penelitian adalah

identifikasi bakteri. Tahap kedua adalah penelitian yang bertujuan untuk mencari

suhu, pH, cahaya dan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan

pembentukan pigmen. Tahap ketiga adalah penelitian yang bertujuan untuk

mengetahui pengaruh sumber karbon dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan

sel bakteri dan pembentukan pigmen.

25

Selain itu, sebelum penelitian dimulai dilakukan pembuatan media untuk

stok bakteri dan penyegaran bakteri yang digunakan dalam proses fermentasi,

dengan langkah-langkah sebagai berikut :

(a) Pembuatan media padat

Pembuatan media dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml dengan volume

medium 250 ml. Komposisi media padat terdiri dari pepton 5 g, ekstrak khamir 2

g, NaCl 20 g, dan agar 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades, pH

medium diatur pada 7. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

(b) Penyegaran bakteri

C selama

15 menit. Setelah itu media dituang ke dalam cawan petri, masing-masing

sebanyak 20 ml secara aseptik. Setelah media dingin dan padat, siap digunakan

untuk penyegaran bakteri.

Bakteri digoreskan pada media padat secara aseptik. Setelah itu bakteri

diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 30o

C selama 24 jam.

3.2.1 Penelitian tahap petama: Identifikasi bakteri

Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan morfologi dan ciri-ciri fisiologi

bakteri.

1). Morfologi

(1). Pewarnaan Gram

Bakteri dioles di atas gelas obyek sebanyak satu lup dan diratakan dengan

aquades secukupnya hingga ukuran 1 x 1 cm, kemudian difiksasi di atas api

hingga kering. Tetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit.

Dicuci dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit. Bilas dengan aquades,

kemudian dibilas lagi dengan campuran etanol 95% sebanyak 80 ml dan aseton 20

ml, selama 1 menit. Dibilas kembali dengan aquades, kemudian diwarnai dengan

safranin selama 1 menit. Selanjutnya dibilas dengan aquades dan dikeringkan.

Preparat siap diamati dengan mikroskop; bila berwarna violet gelap berarti

termasuk dalam bakteri Gram-positif, bila berwarna oranye maka termasuk dalam

bakteri Gram-negatif.

26

(2). Pemeriksaan mikroskop

Preparat yang sudah disiapkan pada pewarnaan Gram selanjutnya diperiksa

di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi. Dengan

pengamatan mikroskopik dapat diketahui bentuk sel bakteri bulat (kokus) atau

batang (basili).

(3). Pergerakan bakteri

Medium yang digunakan dalam uji pergerakan bakteri adalah medium

motilitas. Secara aseptis dengan menggunakan loop, suspense bakteri ditusukkan

ke dalam medium motilitas yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Selanjutnya

diinkubasikan pada suhu 35 o

C selama 48 jam. Bila pertumbuhan bakteri

menyebar, maka bakteri tersebut bergerak (motil), dan bila pertumbuhan bakteri

tidak menyebar hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak.

2) Ciri-ciri Fisiologi

(1). Uji Katalase

Secara aseptis diambil satu lup pertumbuhan bakteri dan dipindahkan pada

gelas obyek. Kemudian ditetesi dengan satu tetes larutan 30% H2O2

. Adanya

enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil oksigen

yang terlihat seperti busa sabun.

(2). Uji Oksidase

Kultur bakteri ditumbuhkan pada medium Trypticase Soy Agar (TSA),

kemudian koloni yang terbentuk ditetesi dengan pereaksi untuk uji oksidase yaitu

p-aminodimetilanilin oksalat 1% sekitar dua sampai tiga tetes. Uji positif ditandai

dengan perubahan koloni menjadi merah muda, kemudian merah tua, dan

akhirnya hitam.

(3). Uji Indol

Medium yang digunakan adalah medium Tryptone Broth. Bakteri yang diuji

diionokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Trypton Broth, dan diinkubasi

pada suhu 37 oC selama 48 jam. Setelah inkubasi, masing-masing tabung

27

ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovaks. Terbentuknya cincin warna merah pada

permukaan medium menunjukkan uji Indol positif.

(4). Uji H2

Medium yang digunakan pada uji H

S

2S adalah medium Sulfit Agar. Bakteri

yang akan diuji diinokulasi dengan cara menusuk loop pada medium tegak Sulfit

Agar yang sudah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 35oC selama 48 jam.

Terbentuknya warna hitam menunjukkan uji H2

S positif.

(5). Uji Reduksi Nitrat

Bakteri diinokulasi ke dalam Nitrat Broth kemudian diinkubasi pada suhu

35o

C selama 24 jam hingga 48 jam. Kemudian tambahkan larutan α Naftilamin

dan larutan asam sulfanilat masing-masing sebanyak 1 ml. Hasil uji positif bila

terbentuk warna merah. Hasil uji negatif, bila tidak terjadi perubahan warna dan

pengujian dilanjutkan dengan menambahkan serbuk Zink. Bila tidak terjadi

perubahan warna maka hasil pengujian positif,nitrat direduksi menjadi nitrit. Bila

terjadi perubahan warna menjadi merah maka hasil pengujian negatif, maka

bakteri tidak mereduksi nitrat.

(6). Uji Fermentasi Karbohidrat

Medium yang digunakan pada pengujian ini adalah Glukosa Broth, Laktosa

Broth, Fruktosa Broth, dan Sukrosa Broth. Masing-masing medium dimasukkan

ke dalam tabung reaksi dengan menambahkan Brom Creso Purple (BCP) dan

tabung Durham.

Bakteri yang akan diuji secara aseptis diinokilasikan pada masing-masing

medium yang telah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 30o

C selama 48 jam.

Uji fermentasi positif ditandai dengan terbentuknya asam yaitu terjadi perubahan

warna menjadi kuning, dan bila bakteri tersebut memproduksi gas akan ditandai

dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham (Fardiaz, 1992).

3.2.2 Penelitian tahap kedua

Penelitian tahap kedua adalah penetapan suhu, pH, cahaya dan salinitas

optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.

28

1) Penetapan suhu optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen

Suhu air laut berkisar antara 25oC sampai 32oC dengan kisaran kurang dari

2oC (Austin, 1988). Pada penelitian ini digunakan suhu inkubasi yang sesuai

dengan suhu air laut yaitu 25oC, 30oC dan 35o

C.

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair yang digunakan terdiri dari pepton 5 g, ekstrak

khamir 2 g, trace element 5 ml, dan NaCl 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1

liter aquades, kemudian dituang ke dalam 3 labu erlenmeyer 500 ml masing-

masing sebanyak 250 ml. pH awal medium diatur pada 7. Setelah itu medium

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

C selama 15 menit.

(2). Percobaan suhu bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen.

a. Proses produksi pigmen

Proses produksi pigmen dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml yang telah

diisi 250 ml medium cair. Bakteri yang telah disegarkan dalam medium padat,

diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian bakteri

diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa

pengaturan aerasi. Suhu inkubasi untuk percobaan diatur pada 25oC, 30oC dan

35o

b. Isolasi pigmen

C. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi

berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.

Sampel yang menghasilkan pigmen kemudian disentrifus pada kecepatan

3000 rpm selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen

ekstraseluler. Biomassa yang diperoleh diekstrak dengan metanol untuk

mendapatkan pigmen (intraseluser) dengan cara mensentrifus pigmen pada

kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen yang dihasilkan. Selanjutnya

dengan menggunakan spektrofotometer, dilakukan scanning untuk mengetahui

serapan maksimum bagi pigmen intraseluler maupun pigmen ekstraseluler.

29

Konsentrasi pigmen kemudian diukur pada panjang gelombang sesuai dengan

hasil scanning yang diperoleh.

2) Penetapan pH optimum bagi pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen

Nilai pH air laut berkisar antara 7,5 dan 8,5 (Austin, 1988). Nilai pH yang

dicoba pada percobaan ini adalah 5, 7, dan 9. Nilai pH 5 juga dicoba pada

penelitian ini untuk mempelajari adanya kemungkinan bakteri laut yang

digunakan mengeluarkan metabolit sekunder pada pH yang ekstrim.

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk

penentuan suhu optimum, tetapi medium diatur pada pH 5, 7 dan 9. Setelah itu

medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

C selama 15 menit. Setelah

proses sterilisasi, pH medium cair kembali diperiksa. Apabila nilai pH berubah,

nilai pH dikembalikan sesuai dengan pH semula dengan menambahkan NaOH

atau HCl steril.

(2). Percobaan pH optimum bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen

a. Proses produksi pigmen

Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup

dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator

goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang

digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan sel bakteri dan

pembentukan pigmen yang optimum pada percobaan (1). Selama inkubasi

dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12,

15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.

b. Isolasi pigmen

Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu optimum.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu

optimum.

30

3) Penetapan cahaya optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan pembentukan pigmen

Intensitas cahaya yang digunakan pada penelitian ini adalah 2350 Wm-2

(kondisi lab tanpa penambahan cahaya dari lampu), 4700 Wm-2, dan 12500 Wm-2

.

Intensitas cahaya diperoleh dengan cara mengatur jarak letak sampel pada

inkubator goyang dengan lampu Philips 10 Watt dan 40 Watt.

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk

penentuan suhu dan pH optimum. pH medium diatur sesuai dengan pH yang

memberikan pertumbuhan yang terbaik dari percobaan (2). Setelah itu medium

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

C selama 15 menit.

(2). Percobaan cahaya bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen

a. Proses produksi pigmen

Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup

dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator

goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang

digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Intensitas

cahaya yang digunakan 2350 Wm-2, 4700 Wm-2, dan 12500 Wm-2

b. Isolasi pigmen

. Selama

inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6,

9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.

Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu dan pH optimum.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu

optimum.

4). Penetapan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan

pembentukan pigmen

Salinitas air laut berkisar antara 32 permil dan 38 permil, sedangkan pada

perairan pantai lebih rendah yaitu antara 10 permil dan 32 permil. Salinitas air laut

tertinggi pada Laut Merah yaitu 44 permil. Berdasarkan kisaran tersebut, salinitas

31

yang digunakan pada penelitian ini adalah 0 permil, 10 permil, 20 permil, 30

permil, dan 40 permil.

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk

penentuan suhu dan pH optimum, salinitas diatur pada 0 permil, 10 permil, 20

permil, 30 permil, dan 40 permil, sedangkan pH diatur sesuai dengan pH yang

01+memberikan pertumbuhan yang terbaik dari percobaan (2). Setelah itu

medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

C selama 15 menit.

(2). Percobaan salinitas bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen

a. Proses produksi pigmen

Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup

dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator

goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang

digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Intensitas

cahaya yang digunakan adalah intensitas cahaya yang menghasilkan pertumbuhan

sel dan pembentukan pigmen yang optimum berdasarkan hasil percobaan (3).

Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur

0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.

b. Isolasi pigmen

Sama dengan isolasi pigmen seperti sebelumnya.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu

optimum.

3.2.3 Penelitian tahap ketiga

Penelitian tahap ketiga adalah penetapan jenis sumber karbon dan sumber

nitrogen yang optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.

1). Penetapan sumber karbon optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan

pembentukan pigmen

Sumber karbon yang digunakan dalam percobaan adalah glukosa, asetat,

sitrat dan maltosa.

32

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair untuk percobaan yang menggunakan sumber karbon

glukosa, asetat, sitrat dan maltosa disajikan pada Tabel 6. Medium untuk masing-

masing percobaan setelah ditimbang dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 500

ml dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 250 ml, kemudian pH medium diatur

hingga mencapai pH optimum pada percobaan tahap pertama dengan

menambahkan NaOH atau HCl. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf

pada suhu 121o

C selama 15 menit. pH medium yang telah steril diperiksa

kembali, apabila pH medium berubah dilakukan penambahan NaOH atau HCl

sampai pH medium pH optimum.

Tabel 6 Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber karbon

Sumber Karbon Komposisi Medium Satuan Media Kompleks (Kontrol)

Pepton 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5 NaCl konsentrasi optimum

g/l g/l g/l g/l

Glukosa Glukosa 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5 NaCl konsentrasi optimum

g/l g/l ml/l g/l

Asetat Asetat 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5 NaCl konsentrasi optimum

g/l g/l ml/l g/l

Sitrat Sitrat 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5 NaCl konsentrasi optimum

g/l g/l ml/l g/l

Maltosa Maltosa 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5 NaCl konsentrasi optimum

g/l g/l ml/l g/l

(2). Percobaan sumber karbon bagi pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen

a. Proses produksi pigmen

Proses produksi pigmen dilakukan dalam erlenmeyer 500 ml yang telah

berisi 250 ml medium cair yang telah disiapkan pada persiapan (a). Bakteri yang

telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke

dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan

33

kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah

suhu optimum pada penelitian tahap pertama. Selama inkubasi dilakukan

pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24,

30, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam.

b. Isolasi pigmen

Sama dengan isolasi pigmen pada penelitian tahap pertama.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu

optimum.

2). Penetapan sumber nitrogen optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan

pembentukan pigmen

Sumber nitrogen yang digunakan dalam percobaan adalah pepton, ekstrak

khamir, NaNO3, dan (NH4)2SO4

.

(1). Persiapan medium cair

Komposisi medium cair untuk percobaan yang menggunakan sumber

nitrogen pepton, ekstrak khamir, NaNO3, dan (NH4)2SO4 disajikan pada Tabel 7.

Sumber Karbon yang digunakan dalam percobaan ini adalah sumber karbon yang

memberi hasil optimum dalam pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen pada

percobaan pertama. Selain itu digunakan juga NaCl yang memberikan hasil yang

optimum dalam pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dari percobaan tahap

pertama serta trace element. Medium untuk masing-masing percobaan setelah

ditimbang dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 500 ml dan dilarutkan dengan

aquades sebanyak 250 ml, kemudian pH medium diatur hingga mencapai pH

optimum pada percobaan tahap pertama dengan menambahkan NaOH atau HCl.

Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o

C selama 15 menit.

pH medium yang telah steril diperiksa kembali, apabila pH medium berubah

dilakukan penambahan NaOH atau HCl sampai pH medium pH optimum.

(2). Percobaan sumber nitrogen bagi pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen

a. Proses produksi pigmen

34

Proses produksi pigmen dilakukan dalam erlenmeyer 500 ml yang telah

berisi 250 ml medium cair yang telah disiapkan pada persiapan (a). Bakteri yang

telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke

dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan

kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah

suhu optimum pada penelitian tahap pertama. Selama inkubasi dilakukan

pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24,

30, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam.

b. Isolasi pigmen

Sama dengan isolasi pigmen pada penelitian tahap pertama.

c. Pengukuran konsentrasi pigmen

Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu

optimum.

Tabel 7 Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber nitrogen

Sumber Nitrogen Komposisi Medium Satuan Pepton Pepton 5

Sumber Karbon optimum 5 Trace Element 5 NaCl konsentrasi maksimum

g/l g/l ml/l g/l

Ekstrak Khamir Ekstrak Khamir 5 Sumber Karbon optimum 5 Trace Element 5 NaCl konsentrasi maksimum

g/l g/l ml/l g/l

NaNO NaNO3 3Sumber Karbon optimum 5

5

Trace Element 5 NaCl konsentrasi maksimum

g/l g/l ml/l g/l

(NH4)2SO (NH4 4)2SO4Sumber Karbon optimum 5

5

Trace Element 5 NaCl konsentrasi maksimum

g/l g/l ml/l g/l

3.2.4 Pengamatan

Pengamatan yang dilakukan pada setiap pengambilan contoh adalah :

1. Konsentrasi sel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

540 nm dan berat kering sel.

2. Konsentrasi pigmen diukur dengan spektrofotometer.

3. Perubahan pH diukur dengan kertas pH.

35

4. Laju spesifik pertumbuhan sel (µ), laju spesifik pembentukan pigmen (qp

).

3.2.5 Rancangan percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(Koopmans, 1987).

3.2.6 Analisis data

Pengaruh suhu, pH, cahaya dan salinitas, sumber karbon dan sumber nitrogen

terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dianalisis dengan Analisis

Ragam. Jika terdapat perbedaan akibat perlakuan suhu (25oC, 30oC dan 35oC),

pH (5, 7 dan 9), cahaya (2350 Wm-2, 4700 Wm-2 dan 12500 Wm-2) dan salinitas

(0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil dan 40 permil), sumber karbon (media

kompleks, glukosa, asetat, sitrat dan maltosa) dan sumber nitrogen (pepton,

ekstrak khamir, (NH4)2SO4 dan NaNO3

) terhadap pertumbuhan sel dan

pembentukan pigmen, maka pengujian dilanjutkan dengan menggunakan metode

BNT (Koopmans, 1987).

3.2.7 Tempat dan waktu penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Kimia

dan Biokimia Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan IPB.

Kegiatan penelitian dilakukan mulai dari bulan Oktober 1998 sampai

dengan bulan Oktober 1999.

36

4. PENGARUH FAKTOR FISIKOKIMIA TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI DAN ATAU PEMBENTUKAN

PIGMEN

4.1 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen

Hasil identifikasi dari sampel bakteri yang diuji diduga kuat adalah

Mesophilobacter sp. (Lampiran 1). Hasil pengukuran konsentrasi sel bakteri dan

pigmen dengan menggunakan media marine broth (ekstrak khamir, pepton, NaCl

dan trace element) pada suhu 25oC, 30oC dan 35oC dengan pH 7 dapat dilihat

pada Lampiran 2. Kurva pertumbuhan sel bakteri dan pigmen pada suhu 25oC,

30oC dan 35oC disajikan pada Gambar 3. Dari Gambar 3 dapat dilihat bahwa

pertumbuhan sel bakteri pada percobaan ini mengalami beberapa fase seperti yang

dinyatakan oleh Middlebeek et al. (1992a

), yaitu fase adaptasi, fase logaritmik,

fase stasioner dan akhirnya mengalami fase kematian.

Keterangan : s: sel bakteri

p: pigmen

Gambar 3 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu kultivasi 25oC, 30oC, dan 35o

C dengan pH 7.

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

22,2

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

Sel

(OD

540

nm

) dan

Kon

sent

rasi

Pig

men

(OD

463

nm

)

Waktu Kultivasi (jam)

25oC, pH 7s 30oC, pH 7s 35oC, pH 7s

25oC, pH 7p 30oC, pH 7p 35oC, pH 7p

37

Bakteri yang diikultivasi pada suhu 30oC dan 35oC segera menunjukkan

peningkatan sel (pertumbuhan) pada masa inkubasi 3 jam, sedangkan bakteri yang

dikultivasi pada suhu 25oC mengalami peningkatan sel setelah 9 jam inkubasi. Hal

ini menunjukkan bahwa medium pertumbuhan pada pH 7 dengan suhu 30oC dan

35oC merupakan lingkungan yang sesuai bagi Mesophilobacter sp. untuk

bertumbuh dan memperbanyak sel.

Masa adaptasi yang panjang dapat merugikan suatu proses produksi,

terutama produk yang merupakan hasil metabolit sekunder seperti pigmen.

Pigmen merupakan hasil metabolit sekunder yang pada umumnya dihasilkan atau

dibentuk setelah fase logaritmik berakhir (Sa’id, 1987). Namun ada juga beberapa

dari metabolit sekunder yang dibentuk bersamaan dengan fase logaritmik. Variasi

terbentuknya metabolit sekunder ini menurut Bu’Lock et al., 1975 in Vining,

1986 dipengaruhi juga oleh nutrien yang digunakan dalam medium pertumbuhan,

terutama dalam kultur tertutup. Pigmen yang dihasilkan pada percobaan ini adalah

pigmen warna orange yang mempunyai absorban maksimum pada λ 463 nm.

Secara deskriptif, berdasarkan hasil pengamatan kecepatan bakteri

memasuki setiap fase pertumbuhan terlihat bahwa 30oC merupakan suhu inkubasi

yang paling baik dibanding dengan suhu 25oC dan 35oC. Pada suhu 30oC dan

35oC, sel bakteri segera tumbuh dan memperbanyak sel hingga memasuki fase

stasioner masing-masing setelah 24 jam dan 48 jam. Pada suhu 25oC bakteri

memerlukan masa adaptasi yang panjang sebelum tumbuh, yaitu 9 jam. Setelah itu

baru memasuki fase logaritmik hingga 30 jam inkubasi. Fase stasioner dimasuki

setelah 48 jam inkubasi.

Laju pertumbuhan sel spesifik (µ) yang diperoleh selama bakteri berada

pada fase logaritmik, pada suhu 25oC, 30oC dan 35oC secara berturut-turut adalah

0,19; 0,24 dan 0,06 jam-1. Nilai µ merupakan slope dari persamaan garis regresi

linier dari data konsentrasi sel (ln OD 540 nm) pada fase pertumbuhan

eksponensial (Blanch dan Clark, 1994). Berdasarkan nilai µ sel dapat disimpulkan

bahwa bakteri yang diinkubasi pada suhu 30oC mempunyai laju pertumbuhan sel

spesifik (µ) yang lebih tinggi dibanding dengan suhu 25oC dan 35o

Laju pembentukan pigmen spesifik (qp) pada suhu 25

C. oC, 30oC dan 35oC

secara berturut-turut adalah 0,01; 0,02 dan 0,003 jam-1. Nilai qp adalah merupakan

38 perbandingan antara konsentrasi pigmen dengan konsentrasi sel dan dikali dengan

laju spesifik pertumbuhan sel (Blanch dan Clark, 1994). Berdasarkan nilai qp

dapat disimpulkan juga bahwa bakteri yang diinkubasi pada suhu 30oC

mempunyai laju pertumbuhan pigmen spesifik (qp) yang lebih tinggi dibanding

dengan suhu 25oC dan 35oC. Contoh perhitungan µ dan qp disajikan pada

Lampiran 3.

Rata-rata konsentrasi sel dan pigmen serta nilai µ dan qp hasil percobaan ini

disajikan secara ringkas pada Tabel 8. Dari Tabel 8 dapat dilihat bahwa rata-rata

konsentrasi sel tertinggi adalah hasil inkubasi pada suhu 25oC sebesar

3,51 + 0,55 (g/l). Rata-rata konsentrasi pigmen yang diperoleh dari hasil

pengukuran OD 463 nm adalah sama untuk suhu 25oC dan 30oC yaitu 0,12. Akan

tetapi nilai µ dan qp terbesar adalah pada suhu 30oC, yaitu sebesar 0,24 dan

0,02 jam-1

T (

.

Tabel 8 Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp.

dalam media marine broth pada pH 7, suhu kultivasi berbeda

oµ

(jamC) -1qp

(jam) -1X

(OD 540 nm ) ) BK (g/l)

P intraseluler (OD 463 nm)

25 30 35

0,19 0,24 0,06

0,01 0,02 0,003

1,61 + 0,32 a 1,37 + 0,11 a 1,55 + 0,20

3,51 + 0,55 2,83 + 0,16 3,17 + 0,34 a

0,12 + 0,02 a 0,12 + 0,003 a 0,08 + 0,002 b

Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b) yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata. T, suhu inkubasi; µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering biomassa; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner.

Hasil di atas menunjukkan bahwa suhu medium pertumbuhan merupakan

faktor yang penting dalam pembentukan pigmen. Dari hasil analisis dengan

menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dapat disimpulkan bakteri

Mesophilobacter sp. dapat tumbuh dengan baik dan tidak berbeda nyata pada

ketiga suhu yang dicobakan pada selang kepercayaan 95%. Analisis konsentrasi

pigmen yang dihasilkan pada ketiga suhu percobaan dengan RAL, terbukti bahwa

pigmen yang dihasilkan pada suhu kultivasi 30oC adalah sama dan tidak berbeda

39 nyata pada selang kepercayaan 95% dengan suhu 25oC. Hasil perhitungan

statistika disajikan pada Lampiran 4.

Fang dan Cheng (1993) dalam penelitiannya mendapati bahwa suhu yang

optimum dalam pertumbuhan massa sel Phaffia rhodozyma adalah 15°C – 20°C,

tetapi suhu optimum dalam pembentukan pigmen astaxanthin adalah 15oC.

Sementara itu Lin (1973) in Lin dan Demain (1991), serta Lin dan Demain (1991)

mendapati bahwa pertumbuhan yang optimum untuk Monascus sp. adalah suhu

37°C, dilain pihak Yoshimura et al. (1975) menyatakan bahwa Monascus sp. dari

strain yang lain lebih menyukai suhu yang lebih rendah, yaitu 25°C. Johnson dan

Lewis (1979), melaporkan bahwa suhu optimum bagi pertumbuhan dan

pembentukan pigmen dari P. rhodozyma adalah antara 20oC sampai 22oC.

Pada ketiga suhu inkubasi terlihat bahwa pigmen terbentuk bersamaan

dengan pertumbuhan sel, walaupun dengan konsentrasi yang rendah yaitu 0,016

pada OD 463 nm. Kondisi ini memperjelas bahwa pigmen yang dihasilkan oleh

Mesophilobacter sp. pada medium pertumbuhan ini merupakan produk dari

metabolit sekunder yang pembentukannya berasosiasi dengan pertumbuhannya

(growth associated).

Berdasarkan hasil analisis yang telah dilakukan dengan menggunakan RAL

ternyata pigmen yang dihasilkan pada suhu kultivasi 30oC adalah sama dan tidak

berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% dengan suhu 25oC, akan tetapi nilai

laju pertumbuhan spesifik terhadap pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan

pigmen pada suhu 30o C lebih tinggi dibanding suhu 25oC. Suhu 30oC kemudian

dijadikan sebagai suhu yang optimum dan digunakan sebagai suhu kultivasi dalam

percobaan berikutnya.

4.2 Pengaruh pH terhadap pembentukan pigmen

pH medium diduga merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi

pembentukan produk seperti pigmen. Semua bakteri laut mempunyai kisaran pH

tertentu untuk tumbuh dengan baik. Kebanyakan lingkungan perairan memiliki

pH pada kisaran antara 5 dan 9 dan umumnya pH optimum mikroorganisme

berada pada kisaran ini (Middelbeek dan de Haas, 1992).

40

Konsentrasi sel dan pigmen yang diperoleh dari medium pertumbuhan yang

terdiri dari ekstrak khamir, pepton, NaCl dan trace element; pH percobaan 5, 7

dan 9; dan diinkubasi pada suhu 30o

Gambar 4 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada media pertumbuhan dengan pH 5, 7 dan 9 suhu 30

C dapat dilihat pada Lampiran 2. Gambar 4

memperlihatkan bahwa pada medium pertumbuhan dengan pH 5 memerlukan

masa adaptasi yang panjang yaitu 48 jam. Penyebab utama hal ini terutama adalah

karena bakteri Mesophilobacter sp. diisolasi dari terumbu karang laut yang

mempunyai kisaran pH 7,5 – 8,5 (Austin, 1988). Meskipun memerlukan adaptasi

yang lebih lama, namun bakteri menunjukkan peningkatan jumlah konsentrasi sel

yang lebih tinggi yaitu dari konsentrasi 0,05 pada jam pengamatan 48 menjadi 3,0

pada jam pengamatan 96. Pengamatan pertumbuhan sel bakteri pada pH 7 dan 9

menunjukkan bahwa jumlah konsentrasi sel pada pH 7 dan 9 tersebut berturut-

turut mencapai maksimum pada 1,5 dan 1,74. Bakteri yang diinokulasi pada

medium pertumbuhan dengan pH 7 dan 9 tidak mengalami fase adaptasi tetapi

segera memasuki fase logaritmik. Terlihat bakteri segera menunjukkan

peningkatan konsentrasi yang cepat hingga 24 jam masa inkubasi. Setelah itu pada

kedua kondisi pH, bakteri memasuki fase stasioner hingga akhir pengamatan.

oC.

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

22,22,42,62,8

33,2

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

sel

(OD

540

nm

) dan

Kon

sent

rasi

Pig

men

(OD

463

nm

)

Waktu Kultivasi (jam)

30oC, pH 5s 30oC, pH 7s 30oC, pH 9s

30oC, pH 7p 30oC, pH 9p

41

Selama pengamatan terlihat bahwa Mesophbilobacter sp. yang diinokulasi

pada pH 5 tidak menghasilkan pigmen. Tetapi terjadi perubahan pada medium

pertumbuhan menjadi sangat kental dan membentuk gel-gel. Perubahan

kekentalan ini akibat usaha dari Mesophbilobacter sp. untuk beradaptasi dengan

lingkungan yang ekstrim baginya agar dapat tetap hidup dan tumbuh dengan cara

mengeluarkan lapisan lendir (Volk dan Wheeler, 1984). Dari perubahan medium

serta beberapa percobaan di laboratorium, dapat disimpulkan bahwa

Mesophbilobacter sp. yang dikultivasi pada pH 5 menghasilkan polisakarida

dalam jumlah yang cukup tinggi. Kesimpulan tersebut ditunjang oleh Sutherland

(1990) juga mengatakan bahwa pada medium cair, kultur yang menghasilkan

polisakarida akan menjadi sangat kental, bahkan kadang-kadang memadat seperti

gel.

Laju spesifik pertumbuhan sel (µ) bakteri yang diinokulasi pada pH 9

mempunyai nilai yang lebih tinggi dibanding dengan perlakuan lainnya; nilainya

mencapai 0,42 jam-1. Laju spesifik pembentukan pigmen (qp) tertinggi juga

didapatkan dari medium dengan pH 9, dengan nilai sebesar 0,17 jam-1

Hasil di atas menunjukkan bahwa pH medium pertumbuhan merupakan

faktor yang penting dalam pembentukan pigmen. Analisis konsentrasi pigmen

pada fase stasioner dengan RAL memperlihatkan bahwa pigmen yang dihasilkan

pada pH 9 lebih tinggi dibanding dengan pH 7 dan berbeda nyata pada selang

kepercayaan 95%. Juga dapat disimpulkan konsentrasi sel pada pH 5 lebih tinggi

dibanding dengan pH 7 dan 9 serta berbeda nyata pada selang kepercayaan 95%.

Hasil perhitungan statistika disajikan pada Lampiran 4. Jadi walaupun konsentrasi

sel tertinggi diperoleh dari medium dengan pH 5, tetapi konsentrasi pigmen

tertinggi diperoleh dari medium dengan pH 9. Belum diperoleh bandingan

. Dapat

dilihat bahwa qp yang terbesar adalah dari pH 9. Contoh perhitungan µ dan qp

disajikan pada Lampiran 3.

Rata-rata konsentrasi sel dan pigmen serta nilai µ dan qp hasil percobaan ini

disajikan secara ringkas pada Tabel 9. Dari Tabel 9 dapat dilihat bahwa rata-rata

konsentrasi sel tertinggi adalah pada pH 5 sebesar 4,84 + 0,96 (g/l). Rata-rata

konsentrasi pigmen tertinggi yang diperoleh dari hasil pengukuran OD 463 nm

adalah pH 9 yaitu 0,14 + 0,006.

42 literatur bakteri laut lainnya untuk penelitian pigmen dan pertumbuhannya. Tetapi

Johnson dan Lewis (1979) menemukan pH optimum bagi mikroorganisme lainnya

yaitu kapang Phaffia rhodozyma adalah berbeda, dimana mikroorganisme tersebut

memproduksi sel maksimum dan kecepatan pertumbuhannya tertinggi terdapat

pada pH 4,5.

Tabel 9 Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp.

dalam media marine broth pada pH percobaan 5, 7, dan 9; suhu kultivasi 30o

pH

C µ

(jam-1qp

(jam) -1X

(OD 540 nm) ) BK (g/l)

P intraseluler (OD 463 nm)

5 7 9

0,15 0,24 0,42

- 0,02 0,04

2,38 + 0,56 a 1,13 + 0,06 b 1,48 + 0,12

4,84 + 0,96 2,68 + 0,11 3,24 + 0,31 b

- 0,10 + 0,004 a 0,14 + 0,006 b

Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b) yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata. µ, laju spesifik pertumbuhan sel, qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering biomassa; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner; - , tidak menghasilkan pigmen.

Dari Gambar 4 pada percobaan pH dapat dilihat bahwa pigmen terbentuk

bersamaan dengan pertumbuhan sel, sama dengan yang terjadi pada percobaan

suhu. Berdasarkan hasil analisis yang telah dilakukan baik secara deskriptif

maupun dengan menggunakan RAL dan nilai laju spesifik terhadap pertumbuhan

sel bakteri dan pembentukan pigmen diperoleh pH optimum bagi pembentukan

pigmen adalah pada pH 9. Kemudian suhu 30oC dan pH 9 dijadikan sebagai suhu

dan pH yang optimum dan digunakan dalam percobaan berikutnya.

4.3 Pengaruh cahaya terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan

pigmen

Hasil kultivasi bakteri Mesophilobacter sp. dalam media kompleks dengan

pH 9 dan suhu kultivasi 30o

Gambar 5 memperlihatkan secara deskriptif pertumbuhan Mesophilobacter

sp. yang dikultivasi dengan pemberian cahaya 4700 Wm

C yang disertai dengan perlakuan cahaya disajikan

pada Lampiran 1. Pertumbuhan bakteri ini dapat lebih jelas dilihat pada

Gambar 5.

-2 relatif sama dengan

yang dikultivasi tanpa pemberian cahaya 4700 Wm-2 (erlenmeyer tempat

43 pertumbuhan ditutup dengan aluminium foil). Waktu yang diperlukan untuk

memasuki setiap fase pertumbuhan juga relatif sama. Gambar 5 memperlihatkan

bahwa Mesophilobacter sp. tidak mengalami fase adaptasi, tetapi segera masuk

fase logaritmik setelah diinokulasikan ke dalam medium pertumbuhan hingga

15 jam masa inkubasi. Dari 15 jam hingga 24 jam inkubasi, Mesophilobacter sp.

berada pada fase pertumbuhan lambat. Kemudian bakteri memasuki fase

pertumbuhan stasioner hingga waktu pengamatan berakhir.

Keterangan : S: konsenrasi sel P: konsentrasi pigmen A: perlakuan cahaya 4700 Wm-2 B: perlakuan cahaya 12500 Wm-2 Gambar 5 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh

Mesophilobacter sp. pada suhu 30o

Mesophilobacter sp. yang dikultivasi dengan penambahan cahaya dengan

intensitas 12500 Wm

C, pH 9 yang disertai dengan perlakuan cahaya.

-2 maupun yang ditutup dengan aluminium foil, mempunyai

pola pertumbuhan yang relatif sama. Pada perlakuan ini, Mesophilobacter sp. juga

segera berada pada fase logaritmik hingga 18 jam masa inkubasi. Dari 18 jam

hingga 30 jam inkubasi bakteri ada dalam fase pertumbuhan lambat. Setelah itu

masuk pada fase pertumbuhan stasioner hingga pengamatan berakhir.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

Sel

dan

K

onse

ntra

si P

igm

en

Waktu Kultivasi (jam)

OD 540 nm,SA OD 463 nm,PA OD 258 nm,PA OD 232 nm,PAOD 540 nm,SB OD 463 nm,PB OD 258 nm,PB OD 232 nm,PB

44

Secara deskriptif, pertumbuhan Mesophilobacter sp. yang dikultivasi disertai

dengan penambahan cahaya 4700 Wm-2 dan 12500 Wm-2 terlihat bahwa

konsentrasi sel dari Mesophilobacter sp. yang disertai dengan penambahan cahaya

4700 Wm-2 lebih tinggi dibanding dengan hasil yang disertai dengan penambahan

cahaya 12500 Wm-2.

Laju spesifik pertumbuhan sel (µ) yang dihitung selama bakteri berada pada

fase logaritmik dapat dilihat bahwa µ Mesophilobacter sp. yang disertai

penambahan cahaya 4700Wm-2 dan 12500 Wm-2 berturut-turut adalah 0,44 dan

0,46 jam-1, sedangkan nilai µ Mesophilobacter sp. pada suhu 30oC tanpa

penambahan cahaya adalah 0,42 jam-1. Dapat dilihat bahwa nilai µ

Mesophilobacter sp. antara ketiga perlakuan tersebut tidak berbeda jauh,

walaupun perlakuan penambahan cahaya 12500 Wm-2 sedikit lebih tinggi

dibanding dengan penambahan cahaya 4700 Wm-2 dan tanpa disertai penambahan

cahaya (suhu 30oC).

Laju spesifik pembentukan pigmen (qp) dengan penambahan cahaya 4700

Wm-2 dan 12500 Wm-2 berturut-turut adalah 0,01 dan 0,009 jam-1, sedangkan nilai

qp pada suhu 30oC tanpa penambahan cahaya adalah 0,04 (Tabel 10). Terlihat

bahwa pada pertumbuhan Mesophilobacter sp. yang diberi penambahan cahaya

12500 Wm-2 mempunyai nilai µ yang lebih tinggi. Diduga peristiwa ini ada

hubungannya dengan terjadinya sedikit peningkatan suhu dengan adanya

penambahan cahaya, sehingga menyebabkan gerakan molekul yang relatif cepat

dan energi yang dihasilkan dari tabrakan antar molekul menjadikan reaksi berjalan

lebih cepat (Atlas, 1989). Akan tetapi nilai qp tertinggi adalah pada suhu 30o

Rata-rata konsentrasi sel dan pigmen serta nilai hasil percobaan selama fase

stasioner disajikan secara ringkas pada Tabel 10. Dari Tabel 10 dapat dilihat

bahwa rata-rata konsentrasi sel dan pigmen tertinggi adalah 3,24 + 0,31 (g/l) dan

0,14 + 0,006 yang merupakan hasil kultivasi pada suhu 30

C

tanpa penambahan cahaya. Contoh perhitungan µ dan qp disajikan pada

Lampiran 3.

oC. Jadi dapat

disimpulkan bahwa konsentrasi sel dan pigmen yang dihasilkan oleh

Mesophilobacter sp. tidak dipengaruhi oleh cahaya, karena tanpa penambahan

45 cahaya hasil pigmen yang terbentuk lebih tinggi dibanding dengan penambahan

cahaya.

Tabel 10 Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth dengan pH 9, suhu kultivasi 30o

Cahaya

C serta perlakuan cahaya

µ

(jam-1qp

(jam) -1X

(OD 540 nm) ) BK (g/l)

P intraseluler (OD 463 nm)

30oC 4700 Wm-2

4700 Wm-2* 12500 Wm-2

12500 Wm

0,42 0,44 0,44 0,46 0,46 -2*

0,04 0,02 0,01 0,02 0,009

1,49 + 0,12a 1,38 + 0,06cd 1,33 + 0,17d 1,20 + 0,05b 1,03 + 0,12

3,24 + 0,31 3,11 + 0,10 3,04 + 0,28 2,81 + 0,08 2,52 + 0,20 c

0,14 + 0,006a 0,06 + 0,009c 0,03 + 0,003e 0,04 + 0,008b 0,02 + 0,003d

Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b, c) yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata. µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering sel; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Hasil pengukuran konsentrasi pigmen selama kultivasi disajikan pada

Lampiran 5. Warna akhir pigmen yang dihasilkan pada penelitian ini adalah

orange yang mempunyai absorban maksimum pada tiga panjang gelombang yaitu

λ 232 nm, 258 nm dan 463 nm. Pembentukan pigmen dengan pemberian cahaya

4700 Wm-2 dan 12500 Wm-2 pada ketiga panjang gelombang ini lebih jelas

disajikan pada Gambar 5.

Hasil analisis sidik ragam terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan

pigmen pada fase stasioner terlihat bahwa perlakuan cahaya berpengaruh nyata

(p<0,05) (perhitungan disajikan pada Lampiran 10). Pengujian dilanjutkan dengan

uji BNT, dengan hasil bahwa suhu 30oC tanpa penambahan cahaya memberikan

hasil terbaik dan berbeda nyata (p<0,05) dalam pertumbuhan Mesophilobacter sp.

dan juga dalam pembentukan pigmennya dibanding dengan perlakuan

penambahan cahaya 4700 Wm-2 dan 12500 Wm-2. Secara keseluruhan dapat

disimpulkan bahwa hasil pertumbuhan sel pada suhu 30oC , pH 9 dan tanpa

disertai dengan penambahan cahaya lebih baik dibanding dengan perlakuan yang

lain.

46 4.4 Pengaruh salinitas terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan

pigmen

Hasil pengukuran konsentrasi sel bakteri Mesophilobacter sp. dalam media

kompleks yang disertai dengan perlakuan salinitas 0, 10, 20, 30 dan 40 permil; pH

medium 9 dan suhu inkubasi 30oC disajikan pada Lampiran 2. Pertumbuhan

Mesophilobacter sp. serta pembentukan pigmen dapat lebih jelas dilihat dalam

kurva pertumbuhan pada Gambar 6.

Secara deskriptif, dari Gambar 6 dapat dilihat bahwa Mesophilobacter sp.

yang diinokulasi dalam medium pertumbuhan dengan salinitas yang berbeda

memasuki setiap fase pertumbuhan pada waktu yang berbeda. Masa adaptasi yang

diperlukan Mesophilobacter sp. adalah 3 jam inkubasi (pada medium 0, 10, dan

20 permil), sedangkan pada medium 30 dan 40 permil memerlukan adaptasi

hingga 6 jam dan 9 jam. Mesophilobacter sp. berada pada fase logaritmik setelah

inkubasi 3 jam hingga 18 jam (0 dan 10 permil) dan 24 jam (20 permil), 6 jam

hingga 24 jam (30 permil) dan 9 jam hingga 24 jam (40 permil). Dari 18 jam

hingga 48 jam inkubasi Mesophilobacter sp. berada pada fase pertumbuhan

lambat (0 dan 10 permil) dan dari 24 jam hingga 48 jam inkubasi (20 permil),

sedangkan pada medium 30 permil dan 40 permil Mesophilobacter sp. tidak

mengalami fase pertumbuhan lambat. Fase stasioner dimulai dari 48 jam inkubasi

hingga akhir pengamatan baik pada 0, 10 dan 20 permil; pada 30 permil dari

24 jam hingga 120 jam inkubasi kemudian perlahan-lahan konsentrasi sel

menunjukkan penurunan sedangkan pada 40 permil dari 24 jam hingga 96 jam

inkubasi dan setelah itu konsentrasi sel berkurang hingga akhir pengamatan.

Laju spesifik pertumbuhan sel (µ) yang diolah selama bakteri

Mesophilobacter sp. berada pada fase logaritmik, pada salinitas 0, 10, 20, 30 dan

40 permil secara berturut-turut adalah 0,38; 0,38; 0,38; 0,36 dan 0,27 jam-1.

Berdasarkan nilai µ, dapat disimpulkan bahwa Mesophilobacter sp. yang

diinokulasikan pada medium pertumbuhan dengan salinitas 0, 10 , dan 20 permil

mempunyai laju spesifik pertumbuhan yang lebih besar dibanding dengan 30 dan

40 permil. Mesophilobacter sp. merupakan bakteri yang diisolasi dari laut. Austin

(1988) menyatakan bahwa kisaran salinitas air laut pada umumnya antara 10

sampai 30 permil. Berdasarkan nilai µ dan kemampuan Mesophilobacter sp. untuk

47 tumbuh dan berkembang pada salinitas uji dengan kisaran 0 sampai 40 permil,

dapat disimpulkan bahwa bakteri ini mempunyai toleransi hidup yang tinggi

terhadap kisaran salinitas yang panjang. Contoh perhitungan laju pertumbuhan

spesifik disajikan pada Lampiran 3.

Keterangan : A: Kurva Pertumbuhan Bakteri B: Kurva Pembentukan Pigmen

Gambar 6 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada auhu 30 oC, pH 9 yang disertai dengan perlakuan salinitas.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

Sel

(O

D 5

40 n

m)

Waktu Kultivasi (jam)

A 0 permil 10 permil 20 permil30 permil 40 permil

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

Pig

men

(OD

368

nm

)

Waktu Kultivasi (jam)

B0 permil 10 permil20 permil 30 permil40 permil

48

Laju spesifik pembentukan pigmen (qp) dari Mesophilobacter sp. yang

dikultivasi pada salinitas 0, 10, 20, 30, dan 40 permil secara berturut-turut 1,47;

1,68; 1,38; 1,18; dan 0,44 jam-1. Contoh perhitungan laju pembentukan pigmen

spesifik disajikan pada Lampiran 3. Dari hasil perhitungan tampak bahwa nilai qp

tertinggi adalah hasil dari salinitas 10 permil. Rata-rata konsentrasi sel dan

pigmen serta nilai µ dan qp hasil percobaan ini disajikan secara ringkas pada

Tabel 11. Dari Tabel 11 dapat dilihat bahwa rata-rata konsentrasi sel tertinggi

diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 30 permil 0,97 + 0,26 pada

OD 540 nm dengan rata-rata berat kering 2,29 + 0,59 (g/l). Rata-rata konsentrasi

pigmen tertinggi diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 10 permil

yaitu 3,54 + 0,11 pada OD 368 nm. Jadi walaupun rata-rata konsentrasi sel

tertinggi diperoleh dari medium pertumbuhan dengan salinitas 30 permil, akan

tetapi rata-rata konsentrasi pigmen tertinggi diperoleh dari medium dengan

salinitas 10 permil. Demikian juga dengan nilai µ tertinggi diperoleh dari medium

dengan salinitas 10, 20, dan 30 permil sedangkan qp tertinggi diperoleh dari

medium dengan salinitas 10 permil.

Tabel 11 Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp.

dalam media marine broth dengan pH 9 dan salinitas yang berbeda; serta suhu kultivasi 30oC

Salinitas (permil)

µ (jam-1)

qp (jam-1)

X (OD 540 nm)

BK (g/l)

P extraseluler (OD 368 nm)

0 10 20 30 40

0,38 0,38 0,38 0,36 0,27

1,47 1,68 1,38 1,18 0,44

0,64 + 0,24 a 0,80 + 0,33 a 0,96 + 0,37 a 0,97 + 0,26 a 0,66 + 0,25 a

1,83 + 0,42 2,12 + 0,58 1,67 + 0,34 2,29 + 0,59 1,63 + 0,43

2,47 + 0,13 a 3,54 + 0,11 a

3,48 + 0,37 a b 3,17 + 0,68 b 1,07 + 0,10 c

Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b, c) yang sama pada kolom yang sama, tidak

berbeda nyata. µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering sel; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Hasil analisis konsentrasi sel dari RAL yang dihitung pada fase stasioner,

terlihat bahwa perlakuan salinitas 0, 10, 20, 30 dan 40 permil mempunyai

pengaruh yang sama (tidak berbeda nyata) terhadap pertumbuhan

Mesophilobacter sp. pada fase stasioner (p>0,05).

49

Hasil pengujian analisis ragam dari konsentrasi pigmen yang dihitung pada

fase stasioner yang dilanjutkan dengan pengujian BNT terlihat bahwa pigmen

yang dihasilkan oleh Mesophilobacter sp. yang dikultivasi dalam medium dengan

salinitas 10 permil mempunyai pengaruh yang sama (tidak berbeda nyata) dengan

salinitas 20 dan 0 permil dalam pembentukan pigmen (p>0,05). Akan tetapi

karena pigmen yang diperoleh dari medium dengan salinitas 10 permil

memberikan rata-rata konsentrasi yang tertinggi dibanding dengan yang lain,

maka disimpulkan bahwa salinitas 10 permil adalah yang terbaik. 4.5 Pengaruh sumber karbon terhadap pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen

Sumber karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah media

kompleks, glukosa, asetat, sitrat dan maltosa. Salinitas yang digunakan adalah

10 permil, pH media 9 dan suhu inkubasi 30oC. Konsentrasi sel bakteri dapat

dilihat pada Lampiran 5. Kurva pertumbuhan sel bakteri dalam kelima media

disajikan pada Gambar 7. Karbon merupakan salah satu nutrien yang diperlukan

bakteri dalam jumlah yang cukup besar selain nitrogen dan lain-lain (Middelbeek

et al., 1992b). Dalam penelitian ini, penulis ingin mengetahui sumber karbon yang

mana dari sumber karbon yang dicobakan yang memberikan hasil yang optimum

dalam pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dari bakteri laut

Mesophilobacter sp.

Pada Gambar 7, secara deskriptif terlihat bahwa media kompleks terlihat

lebih tinggi konsentrasi selnya dibanding sumber karbon yang lain, sedangkan

antara glukosa, dan asetat mula-mula memberikan hasil yang relatif sama dalam

pertumbuhan sel, namun setelah 72 jam inkubasi terlihat terjadi peningkatan sel

bakteri yang dikultivasi dalam media dengan sumber karbon glukosa. Ketiga

sumber karbon tersebut, yaitu glukosa, media kompleks dan asetat memberikan

hasil yang relatif lebih baik dalam pertumbuhan sel dibanding sitrat dan maltosa.

Laju spesifik pertumbuhan sel (µ) Mesophilobacter sp. dalam media yang

menggunakan sumber karbon media kompleks, glukosa, asetat, sitrat dan maltosa

secara berturut-turut adalah 0,35; 0,25; 0,36; 0,13; dan 0,22 jam-1. Dari hasil ini

terlihat bahwa kecepatan Mesophilobacter sp. tumbuh dengan cepat adalah pada

50 media dengan sumber karbon asetat dan media kompleks, kemudian berturut-turut

diikuti oleh sumber karbon glukosa, maltosa dan sitrat. Contoh perhitungan laju

pertumbuhan spesifik disajikan pada Lampiran 3.

Gambar 7 Kurva pertumbuhan sel oleh Mesophilobacter sp. pada suhu 30 °C, pH

9, salinitas 10 permil dalam medium pertumbuhan dengan berbagai sumber karbon.

Pigmen yang dihasilkan pada penelitian ini adalah pigmen dengan warna

hijau yang berbeda pada setiap media dengan absorban maksimum pada lima

panjang gelombang, yaitu λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm, dan 658 nm. Pada

media kompleks warna pigmen adalah hijau kebiruan, pada glukosa berwarna

hijau tua, pada asetat berwarna biru toska, pada asam sitrat warna hijau melon

sedangkan pada maltosa berwarna hijau daun tua. Setelah kultivasi bakteri hingga

hari ke sembilan, pigmen yang dihasilkan berubah menjadi merah. Hasil

pengukuran dapat dilihat pada Lampiran 5.

Rata-rata konsentrasi sel dan pigmen selama fase stasioner hasil percobaan

ini disajikan secara ringkas pada Tabel 12. Dari Tabel 12 dapat dilihat bahwa rata-

rata konsentrasi sel tertinggi adalah dari medium dengan sumber karbon glukosa,

yaitu 1,21 + 0,08 yang diukur pada OD 540 nm dengan rata-rata berat kering

sebesar 2,55 + 0,13 (g/l). Rata-rata konsentrasi pigmen tertinggi adalah berbeda

pada setiap panjang gelombang. Pada panjang gelombang 232 nm, 258 nm,

51 312 nm, 368 nm dan 656 nm rata-rata konsentrasi pigmen tertinggi secara

berturut-turut diperoleh dari medium kompleks (18,40 + 1,59), maltosa (15,86 +

0,52), glukosa (11,59 + 0,28), glukosa (7,22 + 0,44) dan glukosa (1,50 + 0,05).

Tabel 12 Nilai hasil pengukuran variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. pada

pH 9, sumber karbon yang berbeda, sumber nitrogen ekstrak khamir dan dikultivasi pada suhu 30oC dalam labu kocok

Variabel yang diukur

Sumber Karbon Media

Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa

µ (jam-1) 0,35 0,25 0,36 0,13 0,22 X (OD 540 nm) 1,05 + 0,19 ab 1,21+ 0,08 a 0,91 + 0,23 b 0,60 + 0,09 c 0,65 + 0,08 c

BK (g/l) 2,37 + 0,34 2,55 + 0,13 2,07 + 0,52 1,30 + 0,14 1,40 + 0,17 Yx/s (g/g) 0,34 + 0,05 0,51 + 0,03 0,41 + 0,10 0,26 + 0,03 0,28 + 0,03 qp (jam-1) ;

P (OD 232 nm) 6,13;

18,40 + 1,59 a 2,45;

11,86 + 1,95 bc 4,02;

10,17 + 0,55 c 1,18;

5,46 + 0,06 d 4,11;

12,13 + 1,33 b qp (jam-1) ;

P (OD 258 nm) 4,84;

14,53 + 0,41 b 2,65;

12,83 + 0,31 c 4,13;

10,44 + 0,65 d 1,27;

5,88 + 0,06 e 5,37;

15,86 + 0,51 a qp (jam-1) ;

P (OD 312 nm) 2,09;

6,28 + 0,06 b 2,40;

11,59 + 0,28 a 2,50;

6,33 + 0,57 b 0,43;

1,99 + 0,13 c 2,34;

6,90 + 0,45 b qp (jam-1) ;

P (OD 368 nm) 0,92;

2,76 + 0,29 b 1,49;

7,22 + 0,44 a 0,80;

2,03 + 0,15 c 0,19;

0,86 + 0,02 d 0,96;

2,83 + 0,19 b qp (jam-1) ;

P (OD 656 nm) 0,37;

1,11 + 0,02 b 0,31;

1,50 + 0,05 a 0,38;

0,97 + 0,05 c 0,05;

0,24 + 0,01 e 0,26;

0,78 + 0,08 d

Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b, c, d, e) yang sama pada baris yang sama, tidak berbeda nyata; µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering sel; Yx/s, cell yield; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Hasil analisis statistika dengan RAL yang dilanjutkan dengan pengujian

BNT pada α = 0.05 terlihat bahwa sumber karbon yang digunakan dalam media

kompleks dan glukosa lebih baik pertumbuhan selnya dibanding sumber karbon

yang lain. Namun berdasarkan pertimbangan ekonomis (harga yang relatif lebih

murah) dan juga karena rata-rata konsentrasi sel pada glukosa lebih tinggi

daripada media kompleks maka dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa

glukosa memberikan hasil yang lebih baik dalam pertumbuhan sel. Hasil

perhitungan analisis statistika terdapat pada Lampiran 4.

Hasil analisis statistika pigmen dengan RAL yang dilanjutkan dengan

pengujian BNT pada α = 0.05 terlihat bahwa konsentrasi pigmen tertinggi pada

panjang gelombang 232 nm dan 258 nm diperoleh dari medium dengan sumber

karbon media kompleks dan maltosa. Pada panjang gelombang 312 nm, 368 nm

52 dan 656 nm diperoleh dari medium dengan sumber karbon glukosa. Perhitungan

analisis statistika terdapat pada Lampiran 4.

Fang dan Cheng (1993), dalam penelitiannya yang mempelajari pengaruh

berbagai sumber karbon terhadap pertumbuhan P. rhodozyma NCHU-FS301

menyatakan bahwa fruktosa lebih menunjang pertumbuhan sel dibanding sumber

karbon lain yang diuji, seperti glukosa, sukrosa, maltosa, fruktosa, laktosa,

molases, L-Arabinose, D-Raflinose, D-Cellobiose, D-Sorbitol dan xylose. Selain

fruktosa, dikatakan pula bahwa glukosa dan sukrosa juga menunjang dalam

pembentukan konsentrasi sel yang tinggi.

Pemanfaatan sumber-sumber karbon untuk pertumbuhan sel adalah spesifik

untuk setiap strain mikroorganisme. Hal ini terlihat dalam hasil yang diperoleh

Lin dan Demain (1991), yang mendapatkan bahwa glukosa dan oligo- serta

polisakaridanya adalah lebih baik untuk pertumbuhan sel Monascus sp. dibanding

sumber karbon yang lain, sedangkan hasil yang diperoleh dan Lin (1973) in Lin

dan Demain (1991) adalah galaktose dan ethanol. Akan tetapi Yoshimura et al.

(1975), menyatakan bahwa ethanol menunjang Monascus dalam pembentukan

pigmen dengan kecepatan produksi yang lebih besar daripada gula.

Fang dan Cheng (1993), mendapatkan bahwa pembentukan pigmen

astaxanthin tertinggi oleh P. rhodozyma NCHU-FS301 diperoleh dari medium

pertumbuhan dengan sumber karbon glukosa dan sukrosa, walaupun pertumbuhan

sel tertinggi diperoleh dari medium dengan sumber karbon fruktosa. Lin dan

Demain (1991) juga memperoleh hasil bahwa konsentrasi pigmen yang tinggi dari

Monascus sp. diperoleh dari sumber karbon glukosa dengan oligo- dan

polisakaridanya. Sementara Chen dan Johns (1994) yang mempelajari pengaruh

sumber karbon maltose dan glukosa dalam nitrogen ammonium dalam

pembentukan pigmen dari Monascus purpureus mendapati bahwa medium

pertumbuhan dari maltose menjadi merah dalam waktu 1.5 hari dengan hasil tiga

pigmen utama, yaitu monascorubramine, monascin dan monascorubrin;

sedangkan warna medium pertumbuhan dari glukose kurang merah dengan hasil

pigmen alkaflavin dan rubropunctatin yang tinggi. Didapatkan pula bahwa

produksi monascorubramine dari maltose tiga kali lebih tinggi dibanding dari

glukose.

53

Gambar 8 Kurva pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu 30 oC, pH 9, salinitas 10 permil dalam medium pertumbuhan dengan

berbagai sumber karbon dengan panjang gelombang yang berbeda.

54 4.6 Pengaruh sumber nitrogen terhadap pertumbuhan bakteri dan

pembentukan pigmen

Sumber nitrogen yang digunakan dalam penelitian ini adalah pepton, ekstrak

khamir, natrium nitrat dan ammonium sulfat. Sumber karbon yang digunakan

adalah glukosa. Salinitas yang digunakan adalah 10 permil, pH media 9 dan suhu

inkubasi 30 oC. Konsentrasi sel bakteri dan pigmen percobaan ini disajikan pada

Lampiran 6. Kurva pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen dalam

kelima media disajikan pada Gambar 9.

Pada Gambar 9 dapat dilihat bahwa pada natrium nitrat dan ammonium

sulfat, tidak terjadi pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen. Sumber nitrogen

yang sangat menunjang pertumbuhan bakteri dalam percobaan ini adalah ekstrak

khamir, karena ekstrak khamir merupakan nutrien kompleks yang mengandung

zat-zat yang diperlukan bakteri untuk pertumbuhan. Tiga faktor pertumbuhan

yang dibutuhkan oleh mikroorganisme adalah asam amino, purin dan pirimidin

serta vitamin (Middelbeek et al., 1992b), sedangkan ekstrak khamir merupakan

media yang terdiri atas campuran asam amino dan peptida, vitamin yang larut

dalam air, dan karbohidrat (Sikyta, 1983). Komposisi ekstrak khamir secara

lengkap dapat dilihat pada Tabel 5.

Fang dan Cheng (1993) juga mendapatkan bahwa ekstrak khamir

memberikan hasil yang tinggi dari massa sel P. rhodozyma NCHU-FS301,

sedangkan Lin dan Demain (1991) mendapati bahwa ammonium chlorida adalah

sumber nitrogen terbaik untuk pertumbuhan Monascus sp. dibanding ammonium

nitrat, glutamat dan potasium nitrat.

Laju spesifik pertumbuhan sel (µ) Mesophilobacter sp. dalam media yang

menggunakan sumber nitrogen pepton, ekstrak khamir, natrium nitrat, dan

ammonium sulfat berturut-turut adalah 0.16, 0.24, 0.18 dan 0.07 jam-1 (Tabel 13).

Dari hasil ini terlihat bahwa kecepatan Mesophilobacter sp. tumbuh dengan cepat

adalah pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir. Hasil perhitungan laju

pertumbuhan spesifik disajikan pada Lampiran 3.

55

Keterangan : A: Kurva pertumbuhan bakteri B: Kurva pembentukan pigmen Gambar 9 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh

Mesophilobacter sp. pada pada suhu 30 °C, PH 9, salinitas 10 permil dalam medium pertumbuhan dengan berbagai sumber nitrogen.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

sel

(OD

540

nm

)

Waktu Kultivasi (jam)

A Pepton Eks. khamirNaNO3 (NH4)2SO4

0

2

4

6

8

10

12

14

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168

Kon

sent

rasi

Pig

men

Waktu Kultivasi (jam)

BP232nm E232nm P258 nmE258nm P312nm E312nmP368nm E368nm P656nm

56

Sumber nitrogen mempunyai pengaruh yang besar baik dalam kualitas

maupun kuantitas pigmen dari Monascus (Shepherd, 1977 in Jûzlová et al., 1994).

Sumber nitrogen yang dapat menghasilkan pigmen pada penelitian ini adalah

pepton dan ekstrak khamir. Pigmen yang dihasilkan pada akhir kultivasi ekstrak

khamir adalah pigmen dengan warna hijau tua, sedangkan pada pepton berwarna

hijau melon. Keduanya mempunyai absorban maksimum pada lima panjang

gelombang, yaitu λ 232 nm, 258 nm, 312 nm, 368 nm, dan 658 nm. Setelah

pengamatan hingga dua minggu keduanya berubah warna menjadi merah. Hasil

pengukuran dapat dilihat pada Lampiran 6.

Laju spesifik pembentukan pigmen (qp) Mesophilobacter sp. dalam media

yang menggunakan sumber nitrogen pepton dan ekstrak khamir disajikan pada

Tabel 13. Dari hasil ini terlihat bahwa kecepatan Mesophilobacter sp. tumbuh

dengan cepat adalah pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir. Hasil

perhitungan laju pertumbuhan pigmen spesifik disajikan pada Lampiran 3.

Tabel 13 Nilai hasil pengukuran beberapa parameter dari kultivasi

Mesophilobacter sp. pada pH 9, sumber nitrogen yang berbeda, sumber karbon glukosa dan dikultivasi pada suhu 30oC dalam labu kocok

Sumber Nitrogen Pepton Ekstrak

Khamir (NaNO)3 (NH4)2SO4

µ (jam-1) 0,16 0,24 - 0,18 0,07 X (OD 540 nm) 0,33 + 0,008 b 1,93 + 0,08 a 0,26 + 0,008 c 0,04 + 0,004 c

BK (g/l) 0,80 + 0,04 4,08 + 0,28 0,009 + 0,004 0,30 + 0,007 Y x/s (g/g) 0,16 + 0,01 0,82 + 0,06 0,05 + 0,002 0,06 + 0,001

qp (jam-1) ; P (OD 232 nm)

1,48 ; 3,06 + 0,04 b

1,55 ; 12,49 + 0,22 a

- -

qp (jam-1) ; P (OD 258 nm)

1,53 ; 3,16 + 0,02 b

1,60 ; 12,86 + 0,21 a

- -

qp (jam-1) ; P (OD 312 nm)

0,6 7 ; 1,38 + 0,09 b

1,38 ; 11,09 + 0,56 a

- -

qp (jam-1) ; P (OD 368 nm)

0,60 ; 1,24 + 0,12 b

1,48 ; 11,88 + 0,97 a

- -

qp (jam-1) ; P (OD 656 nm)

0,07 ; 0,14 + 0,005 b

0,16 ; 1,29 + 0,04 a

- -

Keterangan : Nilai dengan superskrip yang sama pada baris yang sama, berbeda nyata µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; Yx/s, cell yield; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner

57

Dari Tabel 13 juga dapat dilihat bahwa rata-rata konsentrasi sel dan pigmen

tertinggi yang diukur selama bakteri berada pada fase stasioner diperoleh dari

medium dengan sumber nitrogen ekstrak khamir. Rata-rata konsentrasi sel

tertinggi adalah 1,93 + 0,08 (OD 540 nm), dengan rata-rata berat kering sebesar

4,08 + 0,28 (g/l); sedangkan rata-rata konsentrasi pigmen tertinggi adalah 12,49 +

0,22 (OD 232 nm); 12,86 + 0,21 (OD 258 nm); 11,09 + 0,56 (OD 312 nm); 11,88

+ 0,97 (OD 368 nm); dan 1,29 + 0,04 (OD 656 nm).

Hasil analisis statistika dengan RAL yang dilanjutkan dengan pengujian

BNT pada α = 0.05 terlihat bahwa ekstrak khamir adalah sumber nitrogen yang

terbaik baik dalam pertumbuhan sel maupun dalam pembentukan pigmen.

Perhitungan analisis statistika disajikan pada Lampiran 4.

Jadi dapat disimpulkan bahwa ekstrak khamir merupakan penunjang baik

dalam pertumbuhan sel maupun dalam pembentukan pigmen dari

Mesophilobacter sp. Sedangkan pada P. rhodozyma pepton merupakan penunjang

utama dalam pembentukan pigmen selain nutrien broth, beef extract dan casein

hydrolysate (Fang dan Cheng (1993). Pada Monascus sp. berdasarkan hasil yang

diperoleh oleh Lin dan Demain (1991), sumber nitrogen utama yang

menghasilkan pigmen dengan konsentrasi yang tinggi adalah monosodium

glutamat.

58

5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Mesophilobacter sp. mampu hidup dan tumbuh dengan baik pada suhu 25oC,

30oC dan 35oC, tetapi pembentukan pigmen terbaik adalah suhu 30oC. Pada suhu

30 o

Glukosa merupakan sumber karbon yang terbaik bagi pertumbuhan

Mesophilobacter sp. Pigmen yang dihasilkan adalah pigmen ekstraseluler dengan

warna hijau tua yang berubah menjadi merah setelah sembilan hari. Pada panjang

gelombang 232 nm sumber karbon yang memberikan rata-rata konsentrasi pigmen

tertinggi adalah media kompleks. Pada λ 258 nm, sumber karbon yang terbaik

dalam pembentukan pigmen adalah maltosa, sedangkan pada λ 312 nm, 368 nm

dan 658 nm adalah glukosa.

C, pH optimum dalam pembentukan pigmen adalah pH 9. Pigmen yang

diperoleh adalah pigmen intraseluler dengan warna oranye. Mesophilobacter sp.

juga mampu hidup dan tumbuh dengan baik pada kisaran salinitas dari 0 permil

sampai 40 permil, namun pembentukan pigmen terbaik terjadi pada salinitas

10 permil. Pigmen yang diperoleh adalah pigmen ekstraseluler dengan warna

merah.

Pada percobaan sumber nitrogen, ekstrak khamir merupakan penunjang utama

baik dalam pertumbuhan sel maupun dalam pembentukan pigmen. Warna akhir

pigmen yang dihasilkan pada akhir pengamatan dari ekstrak khamir adalah hijau

tua yang mempunyai absorban maksimum pada panjang gelombang 232 nm, 258

nm, 312 nm, 368 nm dan 658 nm.

59

5.2 Saran

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian ini, disarankan untuk

melakukan penelitian lanjut mengenai pigmen yang dihasilkan antara lain karakter

dari pigmen yang bersangkutan, yang meliputi stabilitas pigmen, toksisitas

pigmen dan stabilitas kimia pigmen.

60

DAFTAR PUSTAKA

Atlas RM. 1984. Microbiology. Fundamentals and applications. New York: Macmillan. 879 hal.

Austin B. 1988. Marine microbiology. Cambridge: Cambridge Univ Pr. 222 hal. Bauernfeind JC. 1981. Natural food colors. In: Bauernfeind JC, editor.

Carotenoids as Colorants and Vitamin a Precursors. Technological and nutritional applications. New York: Avi Publishing. hlm 1-45.

Bergey DH, Holt JG. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed

ke-9. Baltimore: Williams & Wilkins. hlm 87. Blanch HW, Clark DS. 1994. Biochemical Engineering. Marcel Dekker. 702 hlm. Blanc PJ et al. 1994. Pigment of Monascus. J Food Sci 59(4):862-865. Chen MH, Johns MR. 1994. Effect of carbon source on ethanol and pigment

production by Monascus purpureus. Enzyme Microb Technol 16:584-590. Evans PJ, Wang H. 1984. Pigment production from immobilized Monascus sp.

utilising polymeric resin adsorption. Appl Environ Microbiol 47:1323-1326. Fabre CE et al. 1993. Production and food applications of the red pigments of

Monascus ruber. J Food Sci 58(5):1099-1102. Fang TJ, Cheng YS. 1993. Improvement of astaxanthin production by Phaffia

rhodozyma through mutation and optimization of culture conditions. J Ferment Bioeng 75(6):466-469.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama. 307 hal. Fardiaz, S, Rini PS. 1994. Produksi pigmen Rhodotorula glutinis di dalam

medium limbah cair tapioka. Bul TIP. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. 5(2):9-14.

Fenical W, Jensen PR. 1993. Marine Microorganisms : a new biomedical

resource. In: Attaway DH, Zaborsky OR, editor. Marine Biotechnology. Vol ke-1. Pharmaceutical and Bioactive Natural Products. New York: Plenum Pr. hlm 419-457.

Goodwin TW, Land DG, Osman HG. 1955. Studies in carotenogenesis.

Carotenoid synthesis in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas spheroides. Biochem 59:491-496.

61 Grimont PAD, Grimont F. 1984. Genus VIII. Serratia bizio 1823, 288. In: Krieg

NR, editor. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Vol ke-1. Baltimore: Williams & Wilkins. hlm 477-484.

Hanagata N et al. 1993. Behavior of cell aggregate of Carthamus tinctorius L.

cultured cells and correlation with red pigment formation. J Biotechnol 30:259-269.

Hendry GAF. 1992. Natural Pigments in Biology. In: Hendry GAF, Houghton

JD, editor. Natural Food Colorants. New York: Avi Published. hlm 1-38. Henry BS. 1992. Natural Food Colours. In: Hendry GAF, Houghton JD, editor.

Natural Food Colorants. New York: Avi Published. hlm 39-78. Jenie BSL, Helianti, Fardiaz S. 1994. Pemanfaatan ampas tahu, onggok dan dedak

untuk produksi pigmen merah oleh Monascus purpureus. Bul TIP. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. 5(2):22-29.

Jenkins RO. 1992. The Estimation of Biomass. In: Cartledge TG, editor. In Vitro

Cultivation of Microorganisms. Oxford: Butterworth – Heinemann. hlm 53-77.

Johnson EA, Lewis MJ. 1979. Astaxanthin formation by the yeast Phaffia

rhodozyma. J Gen Microbiol 115:173-183. Juzlova P, Martinkova L, Lozinski J, Machek F. 1994. Ethanol as substrate for

pigment production by the fungus Monascus purpureus. Enzyme Microb Technol 16:997-1001.

Koopmans, LH. 1996. Pengantar ke Statistika Kontemporer. Buku Ke-2.

Bambang Sumantri, penerjemah. University of New Mexico. 327 hlm. Lin TF, Demain AL. 1991. Effect of nutrition of Monascus sp. on formation of

red pigments. Appl Microbiol and Biotechnol 36:70-75. Lin TF, Demain AL. 1993. Resting cell studies on formation of water-soluble red

pigments by Monascus sp. J Ind Microbiol 12:361-367. Lin TF, Demain AL. 1994. Leucine interference in the production of water-

soluble red Monascus pigments. Arch Microbiol 162:114-119. Middelbeek EJ, Drijver JS - de Haas. 1992. Environmental Factors Influencing

Growth. In: Cartledge TG, editor. In Vitro Cultivation of Microorganisms. Oxford: Butterworth - Heinemann. hlm 145-175.

62 Middelbeek EJ, Jenkins RO, Drijver JS - de Haas. 1992a. Growth in Batch

Culture. In: Cartledge TG, editor. In VitroCcultivation of Microorganisms. Oxford: Butterworth - Heinemann. hlm 79-106.

Middelbeek EJ, Jenkins RO, Drijver JS- de Haas. 1992b. Nutrition and Cultivation

of Microorganisms. In: Cartledge TG, editor. In Vitro Cultivation of Microorganisms. Oxford: Butterworth - Heinemann. hlm 21-51.

Mitchell C, Iyer S, Skommuski JF, Vary JC. 1986. Red pigment in Bacillus

megaterium spores. App Env Microbiol 52(1):64-67. Nelis HJ, De Leenheer AP. 1991. Microbial sources of carotenoid pigments used

in foods and feeds. J Appl Microbiol 70:181-191. Pelczar, Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: UI Pr. hlm 131-156. Sa’id EG. 1987. Bioindustri. Penerapan Teknologi Fermentasi. Jakarta: Penerbit

PT Mediyatama Sarana Perkasa. 317 hlm. Schlegel HG, Schmidt K. 1994. Mikrobiologi Umum. Baskoro T, penerjemah.

Yogyakarta: Gadjah Mada Univesity Pr 6:202-245. Sikyta B. 1983. Method of Industrial Microbiology. Ells Harwood. Sokatch, J.R. 1973. Bacterial Physiology and Metabolism. London: Academic Pr.

hlm: 3-9. Sutherland IW. 1990. Biotechnology of Microbial Exopolysaccharides.

Cambridge Studies in Biotechnology 9. Cambridge: Cambridge University Pr. 163 hlm.

Tanabe, Kuriyama M, Nonomura H. 1995. Production of C2 – symmetrical

phenazines by some Actinomycetes. J Ferment Bioeng 79(4):384-386. Taya M, Yakura K, Kino-oka M, Tone S. 1994. Influence of medium constituens

on enhancement of pigment production by batch culture of red beet hairy roots. J Ferment Bioeng 77:215-217.

Taya M, Mine K, Kino-oka M, Tone S, Ichi T. 1992. Production and release of

pigments by culture of transformed hairy root of red beet. J Ferment Bioeng 31:31-36.

Tortora GJ, Funke BR, Case CL. 1989. Microbiology. An Introduction. California:

The Benjamin/Cummings. 810 hlm.

63 Urakami T, Yoshida T. 1993. Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll a

by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus. J Ferment Bioeng 76(3):191-194.

Vining LC. 1986. Secondary Metabolism. In:. Rehm H-J, Reed-Weinheim G,

editor. Biotechnology. Volume 4: Microbial Products II. Deerfield Beach, FL. VCH. hlm 19-38.

Volk WA, Wheeler MF. 1984. Basic Microbiology. Ed ke-5. Harper and Row. Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan ke-6. Jakarta: PT Gramedia.

hlm 171-200. Yanagimoto M, Matsumoto K, Mori K. 1988. IM2. A New inducer of blue

pigment production in Streptomyces sp. MAFF 10 – 06015. J Ferment Technol 66(1):1-6.

Yoshimura M, Yamanaka S, Mitsugi K, Hirose Y. Production of Monascus

pigments in submerged shaken culture. Agr Biol Chem 39:1789-1795. Zilinkas RA, Lundin CG. 1993. Marine Biotechnology and Developing Countries.

World Bank Discussion Papers. Washington DC: The World Bank. 115 hlm.

65

Lampiran 1. Hasil identifikasi bakteri

Hasil identifikasi dari sampel bakteri yang diuji adalah sebagai berikut: bakteri Gram-

negatif yang berbentuk kokus, non motil, katalase positif, oksidase negatif, uji Indol positif,

tidak membentuk H2

Percobaan dari pertumbuhan bakteri diperoleh hasil bahwa suhu optimum bakteri adalah

30

S, nitrat direduksi menjadi nitrit, asam tetapi tidak menghasilkan gas dari

glukosa dan fruktosa.

o

C, dapat tumbuh pada kisaran pH 5 sampai pH 9, dapat tumbuh pada kisaran NaCl dari 0

sampai 40 permil.

Tabel 14. Karakterisasi bakteri yang diisolasi dari air laut dan karakterisasi dari Mesophilobacter sp.

Karakteristik Bakteri sampel Mesophilobacter sp.

1. Pewarnaan Gram 2. Bentuk 3. Motilitas 4. Uji Katalase 5. Uji Oksidase 6. Uji Indol 7. Uji H28. Uji Reduksi Nitrat

S

9. Uji Fermentasi Karbohidrat; Pembentukan gas dari: - Glukosa - Laktosa - Fruktosa - Sukrosa

10. Optimum temperature 11. pH medium pertumbuhan 12. NaCl medium pertumbuhan

Gram-negatif Kokus

Non motil Positif Negatif Positif Negatif Positif Positif

Negatif

- Negatif

- 30 o9,0

C

0 – 40 permil

Gram-negatif Kokus

Non motil Positif Negatif Positif Negatif Positif Positif

Negatif Positif Negatif Positif

33 – 37 o6,0 – 8,0

C

7 %

Hasil karakterisasi yang diperoleh dibandingkaan dengan karakterisasi dari Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology – 9 seperti yang tertera pada Tabel 14. Dari hasil tersebut,

dapat dilihat bahwa sampel bakteri memiliki beberapa karakter yang sama dengan karakter dari

Mesophilobacter sp. Oleh sebab itu, untuk sementara diduga kuat bahwa sampel bakteri tersebut

Mesophilobacter sp.

65

66

Lampiran 2 Konsentrasi sel dan pigmen pada masing-masing perlakuan faktor fisika dengan OD 540 nm

Jam Perlakuan Suhu Perlakuan pH 25o 30C, pH 7 o 35C, pH 7 o 30C, pH 7 o 30C, pH 5 o 30C, pH 7 oC, pH 9 Konsentrasi (OD = nm )

Konsentrasi (OD = nm )

Konsentrasi (OD = nm )

Konsentrasi (OD = nm )

Konsentrasi (OD = nm )

Konsentrasi (OD = nm )

sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen 540 463 540 463 540 463 540 540 463 540 463

0 0.060 0.060 0.040 0.050 0.060 0.045 3 0.110 0.016 0.170 0.016 0.180 0.017 0.050 - 0.170 0.016 0.210 0.024 6 0.082 0.016 0.250 0.017 0.240 0.017 0.042 - 0.250 0.017 0.560 0.042 9 0.080 0.016 0.290 0.028 0.260 0.020 0.050 - 0.290 0.028 0.700 0.067

12 0.230 0.028 0.600 0.039 0.340 0.022 0.050 - 0.600 0.039 0.950 0.071 15 - 18 0.470 0.036 1.000 0.078 0.470 0.020 0.050 - 1.000 0.044 1.150 0.094 24 0.750 0.045 1.470 0.100 0.560 0.019 0.050 - 1.470 0.100 1.620 0.110 30 1.050 0.090 1.500 0.108 0.880 0.022 0.050 - 1.500 0.102 1.740 0.125 48 1.860 0.090 1.480 0.120 1.500 0.035 0.050 - 1.350 0.098 1.740 0.130 72 1.860 0.094 1.480 0.122 1.750 0.080 1.500 - 1.170 0.106 1.620 0.129 96 1.770 0.113 1.400 0.127 1.750 0.078 3.000 - 1.140 0.108 1.560 0.130

120 1.560 0.130 1.360 0.124 1.650 0.075 2.550 - 1.050 0.104 1.440 0.138 144 1.560 0.131 1.300 0.125 1.350 0.080 2.580 - 1.080 0.100 1.470 0.142 168 1.020 0.123 1.200 0.120 1.300 0.078 2.250 1.200 0.103 1.300 0.139

67

Lampiran 2 (lanjutan)

Jam Perlakuan Cahaya (Wm-2) 4700 -4700 12500 -12500

Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen 540 232 258 463 540 232 258 463 540 232 258 463 540 232 258 463

0 0.030 0.030 0.030 0.030 3 0.160 0.563 0.307 0.050 0.160 0.343 0.203 0.005 0.160 0.378 0.198 0.010 0.160 0.322 0.201 0.008 6 0.420 0.537 0.302 0.015 0.420 0.319 0.250 0.011 0.480 0.439 0.230 0.022 0.480 0.354 0.233 0.014 9 0.800 0.295 0.285 0.023 0.800 0.373 0.275 0.021 0.760 0.481 0.322 0.029 0.760 0.396 0.263 0.018 12 1.100 0.355 0.373 0.029 1.100 0.304 0.411 0.023 0.800 0.489 0.346 0.033 0.800 0.497 0.353 0.021 15 1.500 0.366 0.402 0.036 1.420 0.376 0.440 0.025 0.920 0.571 0.434 0.036 0.940 0.501 0.389 0.017 18 1.540 0.633 0.507 0.038 1.580 0.593 0.471 0.026 1.000 0.551 0.407 0.034 1.000 0.497 0.387 0.013 24 1.680 0.568 0.492 0.037 1.740 0.581 0.506 0.028 1.080 0.514 0.384 0.028 1.080 0.504 0.357 0.013 30 1.680 0.587 0.475 0.041 1.680 0.681 0.532 0.029 1.200 0.529 0.392 0.035 1.200 0.558 0.381 0.015 48 1.470 0.663 0.496 0.045 1.620 0.661 0.514 0.028 1.290 0.575 0.385 0.031 1.200 0.591 0.407 0.020 72 1.400 0.638 0.492 0.048 1.420 0.744 0.538 0.031 1.200 0.592 0.376 0.056 1.110 0.528 0.364 0.019 96 1.380 0.631 0.446 0.052 1.330 0.762 0.542 0.034 1.170 0.605 0.380 0.041 1.080 0.539 0.369 0.021

120 1.360 0.650 0.481 0.059 1.230 0.757 0.554 0.034 1.170 0.554 0.363 0.045 0.960 0.541 0.368 0.025 144 1.320 0.571 0.494 0.067 1.200 0.525 0.406 0.032 1.200 0.624 0.396 0.040 0.940 0.540 0.369 0.026 168 1.320 0.580 0.498 0.065 1.200 0.564 0.424 0.036 1.180 0.618 0.386 0.039 0.900 0.539 0.368 0.024

Perlakuan Salinitas (permil) 0 10 20 30 40 Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) Konsentrasi (OD = nm ) sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen sel Pigmen 540 232 258 368 540 232 258 368 540 232 258 368 540 232 258 368 540 232 258 368

0 0.020 0.012 0.016 0.390 0.020 0.011 0.015 0.392 0.020 0.012 0.015 0.391 0.020 0.011 0.015 0.376 0.020 0.011 0.015 0.363 3 0.024 0.011 0.015 0.375 0.030 0.014 0.020 0.388 0.030 0.013 0.018 0.391 0.025 0.012 0.016 0.370 0.022 0.011 0.015 0.370 6 0.068 0.027 0.017 0.403 0.112 0.060 0.036 0.464 0.111 0.057 0.033 0.470 0.050 0.027 0.037 0.380 0.040 0.011 0.015 0.360 9 0.305 0.012 0.018 0.445 0.480 0.034 0.039 0.529 0.455 0.036 0.046 0.538 0.180 0.013 0.018 0.432 0.080 0.011 0.015 0.369

12 0.660 0.037 0.056 0.580 0.820 0.048 0.053 0.852 0.800 0.046 0.05 0.860 0.600 0.065 0.071 0.680 0.235 0.011 0.015 0.410 15 0.680 0.077 0.084 0.900 0.830 0.063 0.067 1.200 0.860 0.068 0.072 1.360 0.760 0.059 0.066 0.845 0.530 0.017 0.02 0.492 18 0.710 0.089 0.094 1.198 0.960 0.079 0.083 1.498 1.000 0.078 0.084 1.842 0.920 0.054 0.063 0.921 0.780 0.039 0.048 0.600 24 0.850 0.123 0.141 1.485 1.060 0.108 0.126 2.142 1.290 0.090 0.108 2.304 1.280 0.069 0.084 0.930 1.000 0.048 0.051 0.762 30 0.990 0.201 0.209 1.669 1.215 0.161 0.163 2.842 1.350 0.121 0.124 2.604 1.280 0.097 0.098 0.967 0.980 0.038 0.042 0.796 48 1.080 0.147 0.151 2.286 1.335 0.152 0.154 3.333 1.500 0.122 0.126 2.742 1.260 0.031 0.035 1.830 0.900 0.031 0.035 0.868 72 0.740 0.129 0.13 2.326 0.940 0.170 0.175 3.588 1.170 0.123 0.125 3.570 1.200 0.112 0.116 3.150 0.860 0.034 0.037 1.110 96 0.540 0.134 0.141 2.550 0.870 0.134 0.138 3.540 1.110 0.119 0.123 3.600 1.050 0.123 0.129 3.300 0.820 0.032 0.035 1.110 120 0.540 0.127 0.131 2.550 0.720 0.132 0.137 3.570 0.840 0.119 0.123 3.630 0.930 0.109 0.113 3.600 0.660 0.029 0.032 1.080 144 0.480 0.114 0.118 2.550 0.510 0.114 0.117 3.630 0.600 0.107 0.111 3.600 0.720 0.104 0.107 3.560 0.380 0.026 0.03 1.110 168 0.430 0.104 0.111 2.550 0.430 0.107 0.112 3.600 0.530 0.108 0.112 3.750 0.628 0.106 0.11 3.600 0.330 0.029 0.034 1.140

68

Lampiran 3 Contoh perhitungan laju pertumbuhan spesifik

Konsentrasi sel pada media dengan sumber nitrogen yang berbeda pada OD 540 nm (ln)

Jam Pepton Ekstrak Khamir NaNO (NH4)3 2SO4

Ln OD 540 nm Ln OD 540 nm Ln OD 540 nm Ln OD 540 nm 0 -4.6052 -2.9957 -4.6052 -4.6052 3 -4.6052 -2.1203 -4.6052 -4.6052 6 -2.9957 -1.3863 -4.6052 -4.6052 9 -2.4079 -0.8675 -4.6052 -4.6052 12 -1.7720 -0.5108 -5.5215 -4.2687 15 -1.4697 -0.1985 -5.5215 -4.2687 18 -1.5141 -0.1508 -6.2146 -3.9120 24 -1.4697 0.1133 -6.2146 -3.9120 30 -1.3471 0.2776 -6.2146 -3.9120 48 -1.2730 0.5188 -6.2146 -3.5066 72 -1.1087 0.5878 -6.2146 -3.4420 96 -1.0788 0.6931 -4.6052 -3.2702

120 -1.0788 0.6831 -4.6052 -3.5066 144 -1.1394 0.6729 -4.6052 -3.2189 168 -1.1087 0.6523 -4.4228 -3.4420 192 -0.9163 0.4447 -4.6052 -3.5066

Kultivasi bakteri Mesophilobacter sp. dalam medium pertumbuhan dengan

sumber nitrogen ekstrak khamir menunjukkan bahwa fase pertumbuhan eksponensial dimulai pada jam ke-0 sampai jam ke-9. Selama fase pertumbuhan eksponensial tersebut diperoleh data logaritmik normal seperti yang disajikan pada tabel di atas (daerah yang diarsir). Plot data tersebut dalam kurva pertumbuhan dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Dari hasil perhitungan dengan menggunakan metode regresi linier diperoleh persamaan garis yaitu: Y = 0,24 X – 2,91. Dari persamaan yang terdapat pada halaman 15, yaitu µ = (ln Xt – ln Xo) / t dapat diketahui bahwa nilai laju pertumbuhan spesifik Mesophilobacter sp. pada medium ekstrak khamir merupakan kemiringan garis dari persamaan garis kurva pertumbuhan selama fase eksponensial, yaitu 0,24 per jam.

y = 0,24x - 2,91R² = 0,99

-3,5

-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 3 6 9 12

Kon

sent

rasi

Sel

(ln

OD

540

nm

)

Waktu Kultivasi (jam)

Laju Pertumbuhan Spesifik Bakteri pada Medium Ekstrak Khamir

69

70

69

Lampiran 4 Perhitungan analisis statistika dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap I. Pengaruh faktor fisika terhadap pertumbuhan (konsentrasi) sel dan pembentukan

pigmen (1). Suhu Konsentrasi sel pada fase stasioner

Waktu Kultivasi (jam) 25o 30C, pH 7 o 35C, pH 7 o Total C, pH 7 48 72 96 120 144 168

1,86 1,86 1,77 1,56 1,56 1,02

1,48 1,48 1,40 1,36 1,30 1,20

1,50 1,75 1,75 1,65 1,35 1,30

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXSD

2

9,63 1,61 15,96 0,32

8,22 1,37 11,32 0,11

9,3 1,55 14,61 0,20

27,15

41,89

FK = = 40,95

JKP = - FK = 0,18 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 0,76 - FK = 0,94

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel 0.05 (2,15) Perlakuan Galat

2 15

0,18 0,76

0,09 0,05

1,8 3,68

Total 17 0,94

Fhit. < Ftabel : Perlakuan suhu (25 oC, 30 oC dan 35 o

(tidak berbeda nyata pada α = 0.05) C) mempunyai pengaruh yang sama terhadap pertumbuhan sel bakteri

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Jam 25 o 30 C, pH 7 o 35 C, pH 7 o Total C, pH 7

OD 463 nm OD 463 nm OD 463 nm

72 96 120 144 168

0,094 0,113 0,13 0,131 0,123

0,122 0,127 0,124 0,125 0,12

0,08 0,078 0,075 0,08 0,078

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXSD

2

0,59 0,12 0,07 0,56

0,62 0,12 0,08 0,06

0,39 0,08 0,03 0,12

1,60

0,18

FK = = 0.17

JKP = - FK = 0,006 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 0,0009 - FK = 0,007

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(2,12) Perlakuan Galat

2 12

0,006 0,0009

0,003 0,000082

37,47 3,89

Total 14 0,007

70

Lampiran 4 (Lanjutan) Fhitung > Ftabel : Perlakuan suhu (25oC, 30oC dan 35o

C) mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap pembentukan pigmen (berbeda nyata).

BNT = = 0,013 Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT)

35

oC 25

oC 30

o

0,08 0,12 0,12 C

35

oC - 25

oC

35

= 0,04 > BNT o

C - 30o

C

25

= 0,05 > BNT o

C - 30o

C

= 0,005 < BNT

Konsentrasi pigmen pada suhu 30oC lebih tinggi dibanding suhu 35oC, suhu 25oC menghasilkan pigmen yang lebih tinggi dibanding suhu 35oC, tetapi konsentrasi pigmen antara suhu 30oC dengan 25o

C tidak berbeda nyata.

(2). pH Konsentrasi sel pada fase stasioner

Waktu Kultivasi (jam) 30o 30C, pH 5 o 30C, pH 7 o Total C, pH 9 72 96 120 144 168

1,5 3,0 2,55 2,58 2,25

1,17 1,14 1,05 1,08 1,20

1,62 1,56 1,44 1,47 1,30

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXSD

2

11,88 2,38 29,47 0,56

5,64 1,13 6,38 0,06

7,39 1,48 10,98 0,12

24,91

46,83

FK = = 41,37

JKP = - FK = 4,14 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 1,32 - FK = 5,46

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(2,12) Perlakuan Galat

2 12

4,14 1,32

2,07 0,11

18,84 3,89

Total 14 5,46 Fhitung > Ftabel : Perlakuan pH (5, 7, 9) pada suhu 30o

C mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap pertumbuhan sel (berbeda nyata pada α = 0,05).

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,46

(30,7)(1) (30,9)(2) 1,13 1,48 2,38

(30,5)(3)

(3) - (1)

(2)

= 1,25 > BNT - (1)

(3)

= 0,35 < BNT - (2)

= 0,90 > BNT

Konsentrasi sel pada pH 5 lebih tinggi dibanding pH 7 dan 9, sedangkan pertumbuhan pada pH 7 dan 9 tidak berbeda nyata.

71

Lampiran 4 (Lanjutan)

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Waktu Kultivasi (jam) 30o 30C, pH 7 o Total C, pH 9 48 72 96 120 144 168

0,098 0,106 0,108 0,104 0,100 0,103

0,130 0,129 0,130 0,138 0,142 0,139

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXSD

2

0,62 0,10 0,06

0,004

0,81 0,14 0,11

0.006

1,43

0,17

FK = = 0,17

JKP = - FK = 2,67 x 10JKT = ΣX

-3 2 - FK = 3 X 10

JKG = JKT - JKP = 3,3 X 10-3

-4

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,10) Perlakuan Galat

1 10

2,67 x 103,3 x 10

-3 2,67 x 10-4 3,3 x 10

-3 80,91 -5

4,96

Total 11 3 x 10 -3 Fhit. > Ftabel

: Perlakuan pH (7 dan 9) mempunyai pengaruh yang berbeda nyata terhadap pertumbuhan pigmen.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT). BNT = = 7,39 x 10

-3

pH9 pH7 0,14 0,10

pH9 - pH7

= 0,04 > BNT

Perlakuan pH 9 menghasilkan pigmen dengan konsentrasi yang lebih tinggi daripada pH 7. (3). Cahaya Tabel Konsentrasi sel pada fase stasioner

Jam 4700 Wm 12500 Wm-2 Kondisi lab. (30

-2 o

Total C) + - + -

48 72 96 120 144 168

1,47 1,40 1,38 1,36 1,32 1,32

1,62 1,42 1,33 1,33 1,20 1,20

1,29 1,20 1,17 1,17 1,20 1,18

1,20 1,11 1,08 0,96 0,94 0,90

1,74 1,62 1,56 1,44 1,47 1,30

Total Konsentrasi (∑X) Rataan Konsentrasi ( )

∑X

8,25

2 1,38 11,36

8,00 1,33 10,80

7,21 1,20 8,67

6,19 1,03 6,45

9,13 1,52 14,01

38,78

FK = = 50,13

JKP = - FK = 0,82 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 0,35 - FK = 1,17

72

Lampiran 4 (Lanjutan)

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(4,25) Perlakuan Galat

4 25

0,82 0,35

0,21 0,01

14,71 2,76

Total 29 1,17 Fhitung > Ftabel

: Pemberian cahaya berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan sel.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT) BNT = = 0,14 30

oC +4700 -4700 +12500

-12500

-12500

+12500

0,49* 0,34* 0,30* 0,17*

-4700

0,32* 0,17* 0,13

+4700

0,19* 0,04

0,15*

Hasil pengujian BNT menunjukkan bahwa : Medium pertumbuhan yang dikultivasi pada suhu 30o

C adalah yang terbaik dalam pertumbuhan sel.

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Jam 4700 Wm 12500 Wm-2 Kondisi lab. (30

-2 o

Total C) + - + -

48 72 96 120 144 168

0,045 0,048 0,052 0,059 0,067 0,065

0,028 0,031 0,034 0,034 0,032 0,036

0,031 0,056 0,041 0,045 0,040 0,039

0,020 0,019 0,021 0,025 0,026 0,024

0,130 0,129 0,130 0,138 0,142 0,139

Total Konsentrasi (∑X) Rataan Konsentrasi ( )

∑X

0,34

2 0,06 0,02

0,20 0,03 0,006

0,25 0,04 0,01

0,14 0,02

0,003

0,81 0,14 0,11

1,73

FK = = 0,10

JKP = - FK = 0.05 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 0,0004 - FK = 0,05

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman dB Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(4,25) Perlakuan Galat

4 25

0,05 0,0004

0,012 1,6 X 10

750 -5

2,76

Total 29 0,05 Fhit. > Ftabel

: Pemberian cahaya berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan pigmen.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT). BNT = = 4,76 x 10

-3

30o

C +4700 +12500

-12500

-4700

-4700

0,112* 0,033* 0,019* 0,01*

+12500

0,102* 0,023* 0,009* 0,093* 0,014*

+4700

0,079*

Hasil pengujian BNT menunjukkan bahwa antara semua perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda, tetapi kondisi dengan suhu 30o

C memberikan hasil yang lebih baik dibanding perlakuan yang lain.

73

Lampiran 4 (Lanjutan) (4). Salinitas Konsentrasi sel pada fase stasioner

Waktu Kultivasi (jam) 0 permil 10 permil 20 permil 30 permil 40 permil Total 48 72 96 120 144 168

1,08 0,74 0,54 0,54 0,48 0,43

1,34 0,94 0,87 0,72 0,51 0,43

1,5 1,17 1,11 0,84 0,60 0,53

1,26 1,20 1,05 0,93 0,72 0,63

0,90 0,86 0,82 0,66 0,40 0,33

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXSD

2

3,81 0,64 2,71 0,24

4,81 0,80 4,40 0,33

5,75 0,96 6,20 0,37

5,79 0,97 5,91 0,26

3,97 0,66 2,93 0,25

24,13

FK = = 19,41

JKP = - FK = 0,59 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 2,15 - FK = 2,74

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(4,25) Perlakuan Galat

4 25

0,59 2,15

0,15 0,86

1,72 2,76

Total 29 2,74 Fhitung < Ftabel

: Perlakuan salinitas (0, 10, 20, 30, 40 permil) mempunyai pengaruh yang sama (tidak berbeda nyata) terhadap pertumbuhan sel.

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner

Waktu Kultivasi (jam) 0 permil 10 permil 20 permil 30 permil 40 permil Total

48 72 96 120 144 168

0,149 0,130 0,138 0,129 0,116 0,108

0,153 0,173 0,136 0,135 0,116 0,110

0,124 0,124 0,121 0,121 0,109 0,110

0,033 0,114 0,126 0,111 0,106 0,108

0,033 0,036 0,034 0,031 0,028 0,032

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣX

0,77

2 0,13 0,10

0,82 0,14 0,12

0,71 0,12 0,08

0,60 0,10 0,07

0,19 0,03 0,006

3,09

FK = = 0,32

JKP = - FK = 0,04 JKT = ΣX2

JKG = JKT - JKP = 0,01 - FK = 0,05

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(4,25) Perlakuan Galat

4 25

0,04 0,01

0,01 0,0004

27,6 2,76

Total 29 0,05 Fhitung > Ftabel

: Perlakuan salinitas (0, 10, 20, 30, dan 40 permil) mempunyai pengaruh yang berbeda (berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT). BNT = = 0,02

74

Lampiran 4 (Lanjutan) 10 0 20 30

40 0,11*

30

0,10* 0,09* 0,07*

20

0,04* 0,03* 0,019

0

0,019 0,01

0,009

Hasil pengujian BNT menunjukkan bahwa : Bakteri yang dikultivasi dalam medium dengan salinitas 10 permil memberikan hasil yang lebih baik dalam pembentukan pigmen (berbeda

nyata) dibanding dengan salinitas 40 dan 30 permil, tetapi mempunyai pengaruh yang sama (tidak berbeda nyata) dengan salinitas 20 dan 0 permil. 2). Pengaruh faktor kimia terhadap pertumbuhan (konsentrasi) sel dan pembentukan pigmen (1). Sumber Karbon Konsentrasi sel pada fase stasioner (λ 540 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose Total

48 72 96 120 144 168

1,3 1,28 1,2 1,02 0,9 0,84

1,14 1,2 1,26 1,29 1,2 1,08

1,2 1,18 1,1 0,9 0,74 0,64

0,66 0,66 0,64 0,66 0,6 0,45

0,8 0,78 0,66 0,62 0,59 0,58

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣX

6,54

2 1,09 7,32

7,17 1,20 8,60

5,76 0,96 5,81

3,67 0,61 2,28

4,03 0,67 2,75

27,17 26,76

FK = = 24,61

JKP = - FK = 1,57 JKT = (1,32 + 1,28 + … + 0,58) - FK = 2,16 JKG = JKT - JKP = 0,59 Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tab.(0.05(4,25))

Perlakuan Galat

4 25

1.57 0,59

0,39 0,02

16,73 2,76

Total 29 2,16 Fhitung > Ftab.(0.05 (4,25))

: tolak Ho

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan Uji Beda Nyata Terkecil (Uji BNT) BNT = = 0,18

sitrat(1) maltose(2) asetat(3) med.kompleks (4) glukosa(5) 0,61 0,67 0,96 1,09 1,20

(1) - (2) = 0,06 (2) - (4)

(1)

= 0,418 > BNT - (3) = 0,348 > BNT (2) - (5)

(1)

= 0,523 > BNT - (4) = 0,478 > BNT (3) - (4)

(1)

= 0,13 - (5) = 0,583 > BNT (3) - (5)

(2)

= 0,235 > BNT - (3) =0,288 > BNT (4) - (5)

= 0,105

Asetat, media kompleks dan glukosa berbeda nyata terhadap sitrat dan asetat (media dengan sumber karbon dari asetat, media kompleks dan glukosa memberikan hasil yang lebih baik dalam pertumbuhan daripada sitrat dan asetat).

75

Lampiran 4 (Lanjutan)

Media dengan sumber karbon dari glukosa lebih baik pertumbuhan selnya daripada asetat. Media dengan sumber karbon dari asetat

memberikan hasil pertumbuhan yang sama dengan media kompleks, demikian juga antara media kompleks dan glukosa.

KESIMPULAN : Antara sumber karbon media kompleks dan glukosa, walaupun secara statistik memberikan hasil pertumbuhan yang sama, tetapi rata-rata

pertumbuhan bakteri dalam media dengan glukosa lebih tinggi daripada media kompleks. Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 232 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose

Total OD 232 nm

OD 232 nm

OD 232 nm

OD 232 nm

OD 232 nm

72 96

120 144 168

20,6989 18,1686 18,6946 18,1482 16,2636

9,1311 14,6501 11,966 11,7672 11,7856

10,108 10,737 10,2528 10,4838 9,2868

5,4255 5,4082 5,437

5,5198 5,5258

12,6891 10,4178 11,0208 13,2822 13,2474

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

91,97 18,39

1701,89 5

59,3 11,86 718,55

5

50,87 10,17 518,73

5

27,32 5,46

149,25 5

60,66 12,13

742,91 5

290,12

3831,34

FK = 3366,69 JKP = 431,06 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 33,58 - FK = 464,65

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel 0.05 (4, 20)

Perlakuan Galat

4 20

431,06 33,58

107,77 1,68

64,18 2,87

Total 24 464,65

Fhitung > Ftabel

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT

: Penggunaan sumber karbon (media kompleks, glukosa, asetat, asam sitrat dan maltosa) memberikan hasil yang berbeda dalam pembentukan pigmen pada λ 232 nm.

BNT = = 1,71

sitrat(1) asetat(2) glukose(3) maltose(4) media kompleks(5) 5,46 10,17 11,86 12,13 18,39

(5) - (1) = 12,93 > BNT (4) - (2)

(4)

= 1,96 > BNT - (1) = 6,67 > BNT (3) - (2)

(3)

= 1,69 < BNT - (1) = 6,40 > BNT (5) - (3)

(2)

= 6,53 > BNT - (1) = 4,71 > BNT (4) - (3)

(5)

= 0,27 < BNT - (2) = 8,22 > BNT (5) - (4)

= 6,26 > BNT

Kesimpulan: Media kompleks merupakan media terbaik dalam pembentukan pigmen pada panjang gelombang 232 nm.

76

Lampiran 4 (Lanjutan) Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 258 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose

Total OD 258 nm

OD 258 nm

OD 258 nm

OD 258 nm

OD 258 nm

96 120 144 168

14,1678 14,605 14,2578 15,0618

13,28099 12,6004 12,6908 12,7492

11,0515 10,446 10,7226 9,5364

5,8244 5,8276 5,9356 5,9178

15,5726 16,1024 16,4526 15,3222

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

58,09 14,52 844,18

4

51,32 12,83

658,75 4

41,76 10,44 437,17

4

23,51 5,88

138,14 4

63,45 15,86

1007,25 4

238,13

3085,49

FK = 2268,15 JKP = 814,50 JKT = 817,34 JKG = 2,84 Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(4, 11)

Perlakuan Galat

4 11

814,50 2,84

203,62 0,26

789,27 3,36

Total 15 817,34

Fhitung > Ftabel

: Penggunaan sumber karbon (media kompleks, glukosa, asetat, asam sitrat dan maltosa) memberikan hasil yang berbeda dalam pembentukan pigmen pada λ258 nm.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,79

sitrat(1) asetat(2) glukose(3) media kompleks(4) maltose(5) 5,88 10,44 12,83 14,52 15,86 X(5) - X(1) = 9,99 > BNT X(4) - X(2)X

= 4,08 > BNT (4) - X(1) = 8,65 > BNT X(3) - X(2)

X = 2,39 > BNT

(3) - X(1) = 6,95 > BNT X(5) - X(3)

X = 3,03 > BNT

(2) - X(1) = 4,56 > BNT X(4) - X(3)X

= 1,69 > BNT (5) - X(2) = 5,42 > BNT X(5) - X(4)

= 1,34 > BNT

Kesimpulan : Pada λ 258 nm, pembentukan pigmen terbaik adalah sumber karbon maltosa. Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 312 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose

Total OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

120 144 168

6,22 6,29 6,33

11,36 11,53 11,89

6,68 6,65 5,68

1,84 2,10 2,03

6,93 7,34 6,44

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

18,84 6,28

118,36 3

34,78 11,60

403,34 3

19,00 6,33

120,99 3

5,97 1,99 11,92

3

20,71 6,90

143,39 3

99,31

798,01

FK = 657,44 JKP = 139,32

77

Lampiran 4 (Lanjutan) JKT = Total X2 - FK = 140,57 JKG = JKT - JKP = 1,25 Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel 0.05 (4, 10)

Perlakuan Galat

4 10

139,32 1,25

34,83 0,12

279,27 3,48

Total 14 140,57

Fhitung > Ftabel

: Penggunaan sumber karbon (kompleks, glukosa, asetat, asam sitrat dan maltosa) memberikan hasil yang berbeda dalam pembentukan pigmen pada λ 312 nm.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,64

sitrat(1) med.kompleks(2) asetat(3) maltose(4) glukosa(5) 1,99 6,28 6,33 6,90 11,59

(5) - (1) = 9,60 > BNT (4) - (2)

(4)

= 0,62 < BNT - (1) = 4,91 > BNT (3) - (2)

(3)

= 0,05 < BNT - (1) = 4,34 > BNT (5) - (3)

(2)

= 5,26 > BNT - (1) = 4,29 > BNT (4) - (3)

(5)

= 0,57 < BNT - (2) = 5,31 > BNT (5) - (4)

= 4,69 > BNT

Pada pembentukan pigmen dengan λ 312 nm, penggunaan sumber karbon dari glukosa memberikan hasil yang paling baik dibanding dengan maltosa, asetat, media kompleks dan sitrat. Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 368 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose

Total OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

OD 312 nm

120 144 168

2,5583 2,6438

3,09

6,7632 7,2548 7,6356

2,0813 2,1388 1,8612

0,8524 0,887 0,8437

2,6522 3,0350 2,8089

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

8,29 2,76 23,08

3

21,65 7,22

156,68 3

6,08 2,03 12,37

3

2,58 0,86 2,23

3

8,50 2,83 24,14

3

47,11

218,49

FK = 147,93 JKP = 69,89 JKT = Total X2 - FK = 70,56 JKG = JKT - JKP = 0,66 Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel 0.05 (4,10)

Perlakuan Galat

4 10

69,89 0,66

17,47 0,07

263,28 3,48

Total 14 70,56

Fhitung > Ftabel

: Penggunaan sumber karbon (media kompleks, glukose, asetat, asam sitrat dan maltose) memberikan hasil yang berbeda dalam pembentukan pigmen pada λ368 nm.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,47

78

Lampiran 4 (Lanjutan)

sitrat(1) asetat(2) media kompleks(3) maltose(4) glukosa(5) 0.86 2.03 2.76 2.83 7.22

(5) - (1) = 6,36 > BNT (4) - (2)

(4)

= 0,80 > BNT - (1) = 1,97 > BNT (3) - (2)

(3)

= 0,74 > BNT - (1) = 1,90 > BNT (5) - (3)

(2)

= 4,45 > BNT - (1) = 1,17 > BNT (4) - (3)

(5)

= 0,07 < BNT - (2) = 5,19 > BNT (5) - (4)

= 4,39 > BNT

Dalam pembentukan pigmen dengan λ 368nm, glukosa merupakan sumber karbon yang paling baik dibanding sumber karbon maltose, media kompleks asetat dan sitrat. Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 656 nm)

Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltose

Total OD 658 nm

OD 658 nm

OD 658 nm

OD 658 nm

OD 658 nm

120 144 168

1,1073 1,0865 1,1237

1,5276 1,4354 1,5228

1,0011 0,9920 0,9034

0,2294 0,2496 0,2386

0,7787 0,8543 0,7049

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

3,32 1,11 3,67

3

4,49 1,50 6,71

3

2,90 0,97 2,80

3

0,72 0,24 0,17

3

2,34 0,78 1,83

3

13,76

15,19

FK = 12,61 JKP = 2,55 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 0,02 - FK = 2,51

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel 0.05 (4,10)

Perlakuan Galat

4 10

2,55 0,02

0,64 0,002

274,24 3,48

Total 14 2,58

Fhitung > Ftabel

: Penggunaan sumber karbon (media kompleks, glukose, asetat, asam sitrat dan maltose) memberikan hasil yang berbeda dalam pembentukan pigmen pada λ656 nm.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,09

sitrat(1) maltose(2) asetat(3) media kompleks (4) glukosa(5)

0,24 0,78 0,97 1,11 1,50

(5) - (1) = 1,26 > BNT (4) - (2)

(4)

= 0,33 > BNT - (1) = 0,87 > BNT (3) - (2)

(3)

= 0,19 > BNT - (1) = 0,73 > BNT (5) - (3)

(2)

= 0,53 > BNT - (1) = 0,54 > BNT (4) - (3)

(5)

= 0,14 > BNT - (2) = 0,72 > BNT (5) - (4)

= 0,39 > BNT

Dalam pembentukan pigmen dengan λ 656 nm sumber karbon dari glukose memberikan hasil yang terbaik dibanding sumber karbon yang lain.

79

Lampiran 4 (Lanjutan)

(2). Sumber Nitrogen Konsentrasi sel pada fase stasioner (OD 540 nm)

Jam

Pepton Ekstrak Khamir NaNO (NH3 4)2SO

Total

4

OD 540 nm OD 540 nm OD

540 nm OD

540 nm

48 72 96 120 144 168

0,28 0,33 0,34 0,34 0,32 0,33

1,68 1,8 2

1,98 1,96 1,92

0,002 0,002 0,01 0,01 0,01

0,012

0,03 0,032 0,038 0,03 0,04

0,032

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

1,94 0,32 0,63

6

11,34 1,89

21,51 6

0,05 0,008 0,0005

6

0,20 0,03

0,007 6

13,53

22,15

FK = 7,63 JKP = 14,44 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 0,08 - FK = 14,52

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(3,20)

Perlakuan Galat

3 20

14,44 0,08

4,81 0,004

1189,74 3,1

Total 23 14,52

Fhitung > Ftabel : Penggunaan sumber nitrogen (pepton, ekstrak khamir, NaNO3 dan (NH4)2SO4

) memberikan hasil yang berbeda nyata dalam pertumbuhan sel pada λ 540 nm.

Pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji BNT BNT = = 0,08

X XNaNO3(1) X(NH4)2SO4(2) Xpepton(3)

0,008 eks.khamir(4)

0,03 0,32 1,89 X(4) - X(1) = 1,88 > BNT X(4) - X(2)X

= 1,86 > BNT (3) - X(1) = 0,32 > BNT X(3) - X(2)

X = 0,29 > BNT

(2) - X(1) = 0,03 < BNT X(4) - X(3)

= 1,57 > BNT

Dalam penggunaan nitrogen dalam pertumbuhan bakteri terlihat bahwa ekstrak khamir memberikan hasil yang terbaik dalam pertumbuhan bakteri dibanding pepton, NaNO3 dan (NH4)2SO4. Antara NaNO3 dan (NH4)2SO4

memberikan hasil yang tidak berbeda nyata.

80

Lampiran 4 (Lanjutan)

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 232 nm)

Jam Pepton Ekstrak Khamir

Total OD 232 nm OD 232 nm

72 96 120 144 168

3,04 3,04 3,04 3,05 3,12

12,12 12,52 12,6

12,68 12,52

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

15,29 3,06 46,77

5

62,44 12,49 779,94

5

77,73

826,70

FK = 604,20 JKP =222,31 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP =0,19 - FK =222,50

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,8)

Perlakuan Galat

1 8

222,31 0,19

222,31 0,02

9274,60

5,32

Total 9 222,50 Fhitung > Ftabel

Perlakuan sumber N ekstrak khamir memberikan hasil yang lebih baik dibanding pepton (berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen pada λ 232 nm.

:

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 258 nm)

Jam Pepton Ekstrak Khamir

Total OD 258 nm OD 258 nm

72 96

120 144 168

3,14 3,16 3,16 3,17 3,19

12,64 13

12,64 13

13,04

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

15,82 3,16

50,06 5

64,32 12,86

827,58 5

80,14

877,64

FK = 642,24 JKP = 235,23 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 0,17 - FK = 235,39

81

Lampiran 4 (Lanjutan)

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,8)

Perlakuan Galat

1 8

235,23 0,17

235,23 0.02

11092,90 5,32

Total 9 235,39

Fhitung > F tabel

Perlakuan sumber N ekstrak khamir memberikan hasil yang lebih baik dibanding pepton berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen pada λ 258 nm.

:

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 312 nm)

Jam Pepton Ekstrak Khamir

Total OD 312 nm OD 312 nm

72 96

120 144 168

1,34 1,32 1,34 1,35 1,53

10,56 10,6 11

11,4 11,88

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

6,88 1,38 9,50

5

55,44 11,09

615,97 5

62,32

625,47

FK = 388,38 JKP = 235,81 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 1,28 - FK = 237,09

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,8)

Perlakuan Galat

1 8

235,81 1,28

235,81 0,16

1474,49 5,32

Total 9 237,09

Fhitung > F tabel

Perlakuan sumber N ekstrak khamir memberikan hasil yang lebih baik dibanding pepton (berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen pada λ 312 nm.

:

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 368 nm)

Jam Pepton Ekstrak Khamir

Total OD 368 nm OD 368 nm

72 96

120 144 168

1,16 1,17 1,2 1,22 1,45

10,24 11,88 12,22 12,28 12,76

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

6,2 1,24 7,75

5

59,38 11,88

708,94 5

65,58

716,68

82

Lampiran 4 (Lanjutan) FK =430,07 JKP =282,81 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP =3,80 - FK =286,61

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,8)

Perlakuan Galat

1 8

282,81 3,80

282,81 0,47

595,88

5,32

Total 9 286,61 Fhitung > Ftabel

Perlakuan sumber N ekstrak khamir memberikan hasil yang lebih baik dibanding pepton (berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen pada λ 368 nm.

:

Konsentrasi pigmen pada fase stasioner (λ 656 nm)

Jam Pepton Ekstrak Khamir

Total OD 656 nm OD 656 nm

96 120 144 168

0,14 0,14 0,14 0,15

1,24 1,27 1,32 1,32

Total konsentrasi (ΣX) Rataan konsentrasi ( )

ΣXn

2

0,57 0,14 0,08

4

5,15 1,29 6,64

4

5,72

6,72

FK = 4,09 JKP = 2,62 JKT = Total X2

JKG = JKT - JKP = 0,005 - FK = 2,63

Tabel Analisis Ragam

Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Fhitung tabel0.05(1,6)

Perlakuan Galat

1 6

2,62 0,005

2,62 0,0008 3312,06 5,99

Total 7 2,63

Fhitung > Ftabel

Perlakuan sumber N ekstrak khamir memberikan hasil yang lebih baik dibanding pepton (berbeda nyata) terhadap pembentukan pigmen pada λ 656 nm.

:

83

Lampiran 5 Konsentrasi sel dan pigmen pada perlakuan sumber karbon

Jam Perlakuan sumber Karbon Konsentrasi sel (OD 540 nm) Konsentrasi pigmen (OD= 232nm)

Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa 0 0.030 0.075 0.020 0.020 0.100 3 0.030 0.075 0.020 0.020 0.100 6 0.035 0.080 0.020 0.020 0.100 9 0.090 0.100 0.046 0.020 0.100 12 0.280 0.280 0.200 0.020 0.100 2.999 3.056 2.835 2.171 3.066 15 0.640 0.450 0.470 0.020 0.410 3.823 3.047 2.843 2.200 3.080 18 0.820 0.680 0.600 0.040 0.610 5.706 3.024 2.866 2.281 3.093 24 1.120 0.800 0.820 0.100 0.800 5.600 3.054 2.877 2.844 3.234 30 1.240 1.100 1.000 0.200 0.820 5.900 3.130 5.898 3.659 6.983 48 1.300 1.140 1.200 0.660 0.800 13.216 3.182 9.626 5.454 10.975 72 1.280 1.200 1.180 0.660 0.780 20.699 9.131 10.108 5.426 12.689 96 1.200 1.260 1.100 0.640 0.660 18.169 14.650 10.737 5.408 10.418

120 1.020 1.290 0.900 0.660 0.620 18.695 11.966 10.253 5.437 11.021 144 0.900 1.200 0.740 0.600 0.590 18.148 11.767 10.484 5.520 13.282 168 0.840 1.080 0.640 0.450 0.580 16.264 11.786 9.287 5.526 13.247 Jam Konsentrasi pigmen (OD= 258nm) Konsentrasi pigmen (OD= 312nm)

Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa 12 3.200 3.272 3.077 2.938 3.255 2.127 2.509 1.354 0.800 2.966 15 3.398 3.247 3.087 3.010 3.277 2.159 2.527 1.388 0.845 3.025 18 5.021 3.231 3.105 3.044 3.318 2.162 2.555 1.590 1.011 3.108 24 6.039 3.228 3.179 3.101 3.755 2.434 2.797 1.758 1.218 3.221 30 8.668 3.326 5.517 4.066 8.039 3.662 2.668 2.673 1.483 4.422 48 13.121 3.383 10.236 5.815 15.959 6.051 2.601 4.215 1.903 6.315 72 15.199 8.826 9.418 5.820 16.604 5.981 6.721 5.422 1.859 6.785 96 14.168 13.281 11.052 5.824 15.573 6.388 8.220 6.807 1.864 6.534

120 14.605 12.600 10.446 5.828 16.102 6.218 11.356 6.677 1.843 6.931 144 14.258 12.691 10.723 5.936 16.453 6.295 11.528 6.646 2.100 7.342 168 15.062 12.749 9.536 5.918 15.322 6.330 11.894 5.678 2.029 6.439

Jam Konsentrasi pigmen (OD= 368nm) Konsentrasi pigmen (OD= 656nm) Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa

12 0.886 1.212 0.513 0.272 1.229 0.150 0.152 0.094 0.059 0.145 15 0.939 1.180 0.543 0.280 1.322 0.163 0.151 0.107 0.060 0.145 18 0.944 1.157 0.599 0.360 1.373 0.241 0.144 0.129 0.088 0.147 24 0.884 1.242 0.713 0.482 1.879 0.232 0.182 0.151 0.105 0.220 30 1.275 1.209 1.028 0.604 1.981 0.265 0.241 0.307 0.137 0.405 48 1.995 1.200 1.605 0.747 2.626 0.628 0.467 0.822 0.221 0.827 72 2.543 3.656 2.253 0.900 2.881 1.120 0.668 0.980 0.225 0.982 96 2.645 5.891 2.291 0.882 2.603 0.998 0.891 1.007 0.232 0.788

120 2.558 6.763 2.081 0.852 2.652 1.107 1.528 1.001 0.229 0.779 144 2.644 7.255 2.139 0.887 3.035 1.087 1.435 0.992 0.250 0.854 168 3.090 7.636 1.861 0.844 2.809 1.124 1.523 0.903 0.239 0.705

84

Lampiran 6 Konsentrasi sel dan pigmen pada perlakuan sumber nitrogen

Jam Perlakuan Sumber Nitrogen Konsentrasi sel (OD 540 nm)

Pepton Eks. khamir NaNO (NH4)3 2SO4

0 0.010 0.050 0.010 0.010 3 0.010 0.120 0.010 0.010 6 0.050 0.250 0.010 0.010 9 0.090 0.420 0.010 0.010

12 0.170 0.600 0.004 0.014 15 0.230 0.820 0.004 0.014 18 0.220 0.860 0.002 0.020 24 0.230 1.120 0.002 0.020 30 0.260 1.320 0.002 0.020 48 0.280 1.680 0.002 0.030 72 0.330 1.800 0.002 0.032 96 0.340 2.000 0.010 0.038

120 0.340 1.980 0.010 0.030 144 0.320 1.960 0.010 0.040 168 0.330 1.920 0.012 0.032

Jam Perlakuan Sumber Nitrogen Konsentrasi pigmen

OD 232 nm OD 258 nm OD 312 nm OD 368 nm OD 656 nm Pepton Ekstrak

khamir Pepton Ekstrak khamir Pepton Ekstrak

khamir Pepton Ekstrak khamir Pepton Ekstrak

khamir 12 2.940 3.200 2.990 3.320 0.940 2.970 0.460 1.400 0.110 0.150 15 2.930 3.120 3.000 3.190 0.960 2.920 0.490 1.450 0.100 0.150 18 2.940 3.180 3.020 3.280 0.980 2.840 0.500 1.440 0.100 0.180 24 2.950 3.270 3.030 3.400 1.007 3.240 0.640 1.600 0.100 0.210 30 2.960 4.460 3.050 4.580 1.040 4.290 0.710 3.080 0.100 0.380 48 2.970 8.620 3.150 8.780 1.220 8.660 0.980 6.460 0.110 0.680 72 3.040 12.120 3.140 12.640 1.340 10.560 1.160 10.240 0.120 0.840 96 3.040 12.520 3.160 13.000 1.320 10.600 1.170 11.880 0.140 1.240

120 3.040 12.600 3.160 12.640 1.340 11.000 1.200 12.220 0.140 1.270 144 3.050 12.680 3.170 13.000 1.350 11.400 1.220 12.280 0.140 1.320 168 3.120 12.520 3.190 13.040 1.530 11.880 1.450 12.760 0.150 1.320

85

Lampiran 7 Peralatan-peralatan yang digunakan dalam penelitian

autoclave

clean bench

inkubator

sentrifus

inkubator goyang

spektrofotometer

86

Lampiran 8 Perubahan warna pada media pertumbuhan selama kultivasi

Perubahan warna medium pada perlakuan suhu dan pH

Jam 25o 30C o 35C o pH 5 C pH 7 pH 9

0 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 3 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning keruh Kuning keruh 6 Kuning jernih Oranye Kuning jernih Kuning jernih Oranye Oranye 9 Kuning jernih Oranye Kuning jernih Kuning jernih Oranye Oranye 12 Kuning jernih Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 15 Kuning jernih Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 18 Kuning jernih Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 24 Kuning jernih Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 30 Kuning jernih Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 48 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning jernih Oranye Oranye 72 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning keruh kental Oranye Oranye 96 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning keruh kental Oranye Oranye

120 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning keruh kental Oranye Oranye 144 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning keruh kental Oranye Oranye 168 Oranye kekuningan kental Oranye Oranye Kuning keruh kental Oranye Oranye

Perubahan warna medium pada perlakuan cahaya Jam 4700 Wm tanpa 4700 Wm-2 12500 Wm-2 tanpa 12500 Wm-2 -2

0 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 3 Kuning keruh Kuning keruh Kuning keruh Kuning keruh 6 Kuning keruh Kuning keruh Kuning keruh Kuning keruh 9 Oranye kekuningan Oranye kekuningan Oranye kekuningan Oranye kekuningan

12 Oranye kekuningan Oranye kekuningan Oranye kekuningan Oranye kekuningan 15 Oranye Oranye Oranye Oranye 18 Oranye Oranye Oranye Oranye 24 Oranye Oranye Oranye Oranye 30 Oranye Oranye Oranye Oranye 48 Oranye Oranye Oranye Oranye 72 Oranye Oranye Oranye Oranye 96 Oranye Oranye Oranye Oranye 120 Oranye Oranye Oranye Oranye 144 Oranye Oranye Oranye Oranye 168 Oranye Oranye Oranye Oranye

87

Lampiran 8 (Lanjutan) Perubahan warna medium pada perlakuan salinitas Jam 0 Permil 10 Permil 20 Permil 30 Permil 40 Permil

0 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 3 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 6 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 9 Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih Kuning jernih 12 Kuning jernih Hijau muda jernih Hijau muda jernih Kuning jernih Kuning jernih 15 Hijau muda jernih Hijau muda jernih Hijau muda jernih Kuning kehijauan Kuning jernih 18 Hijau muda jernih Hijau muda jernih Hijau muda jernih Kuning kehijauan Kuning jernih 24 Hijau muda jernih Hijau toska Hijau muda jernih Kuning kehijauan Kuning jernih 30 Hijau daun jernih Hijau daun Hijau daun Hijau muda jernih Kuning jernih 48 Hijau daun ++ Hijau daun ++ Hijau daun ++ Hijau daun ++ Kuning jernih 72 Hijau kecoklatan muda Hijau kecoklatan muda Hijau kemerahan Hijau kemerahan Kuning jernih 96 Hijau kemerahan Hijau kemerahan Merah maron Merah maron Kuning jernih 120 Hijau kemerahan Merah maron kehijauan Merah maron Merah maron ++ Kuning jernih 144 Merah maron kehijauan Merah maron kehijauan Merah maron ++ Merah maron ++ Kuning jernih 168 Merah maron Merah maron Merah maron +++ Merah maron ++ Kuning jernih

Perubahan warna medium pada perlakuan sumber karbon Jam Media Kompleks Glukosa Asetat Asam Sitrat Maltosa

0 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 3 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 6 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 9 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 12 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 15 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 18 Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning muda Kuning 24 Hijau melon muda Kuning muda Hijau melon muda Kuning muda Kuning 30 Hijau toska > Hijau daun muda Biru toska Hijau melon Kuning 48 Hijau toska >> Hijau daun Biru toska > Hijau melon Hijau daun tua 72 Hijau toska >>> Hijau tua > Biru toska >> Hijau melon Hijau daun tua 96 Hijau toska >>> Hijau tua >> Biru toska >>> Hijau melon Hijau daun tua 120 Hijau kebiruan > Hijau tua >>> Biru toska >>> Hijau melon Hijau daun tua 144 Hijau kebiruan > Hijau tua >>> Biru toska >>> Hijau melon Hijau daun tua 168 Hijau kebiruan >> Hijau tua >>> Biru toska >>> Hijau melon Hijau daun tua

Perubahan warna pada medium dengan sumber nitrogen yang berbeda

Jam Pepton Ekstrak Khamir NaNO3 (NH 4)2SO4

0 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 3 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 6 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 9 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 12 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 15 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 18 Kuning muda Kuning jernih Bening Bening 24 Hijau melon Hijau lumut Bening Bening 30 Hijau melon >> Hijau lumut >> Bening Bening 48 Hijau melon >>> Hijau lumut >>> Bening Bening 72 Kuning kehijauan Hijau daun Bening Bening 96 Kuning kehijauan Hijau daun >> Bening Bening

120 Hijau melon Hijau daun >>> Bening Bening 148 Hijau melon Hijau daun >>> Bening Bening 168 Hijau melon Hijau daun >>> Bening Bening

88

Lampiran 9 Perubahan pH medium selama kultivasi

Jam Perlakuan Suhu

(pH 7) Perlakuan pH

(suhu 30o

Perlakuan Cahaya

C) Perlakuan Salinitas

(permil) 4700 Wm

12500 Wm-2 -2

25o 30C o 35C o pH 5 C pH 7 pH 9 + - + - 0 10 20 30 40 0 7 7 7 5 7 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 7 6.5 6.5 5 6.5 8 8.5 8.5 8.5 9 9 9 9 9 9 6 6.5 6.5 6 5.25 6.5 8 8.5 8 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 9 6.5 6.5 7 5.25 6.5 8 8.5 7.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5

12 7 7.5 7 5.25 7.5 8 8 8 8.5 8 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 15 7 8 7.5 5.25 8 7.5 8 8 8.5 8 8 8 8 8 8 18 7.5 8 7.5 5.25 8 8 8 8 8.5 8.5 8 8 8 8 8 24 7.5 9 8 5.25 9 9 8.5 8 8.5 8.5 8 8 8 8 8 30 8 9 8 5.25 9 9 9 8.5 9 8.5 8 8.5 8.5 8.5 8.5 48 8 10 9 5.25 10 9 9 9 9 8.5 9 9 9 9 9 72 8 10 9 7 10 10 9 9 9 8.5 9 9 9 9 9 96 9 10 9 7 10 10 9 9 9 9 10 9 10 10 9 120 9 10 9.5 8 10 10 9 9.5 9 9 10 10 10 10 10 144 9 10 10 8 10 10.5 9 9.5 9 9 10 10 10 10 10 168 9 10 10 9 10 10.5 9 9.5 9 9 10 10 10 10 10

Jam Perlakuan Sumber Karbon Perlakuan Sumber Nitrogen

Kompleks Glukosa Asetat Sitrat Maltosa Pepton Ekst. khamir NaNO (NH3 4)2SO

4 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 9 9 9 9 9 9 9 9 9 6 9 9 9 9 9 8.5 8.5 9 9 9 9 9 9 9 9 8.5 8.5 9 9

12 8 8 8 9 9 8 8 9 9 15 8 7.5 8 9 7 8 8 9 9 18 7.5 7 7.5 9 7 8 8 7 9 24 8 7 7.5 9 7 8 8 7 9 30 8.5 7 8.5 9 8 8 8 7 9 48 8.5 7 8.5 8 8 8 8 7 8.5 72 9 7.5 9 8.5 8 8 8 8 8.5 96 9 7.5 9 8.5 8.5 8.5 8 8 8 120 9 7.5 9.5 9 9 8.5 8 7 8 144 9 8 9.5 9 9 8.5 8 7 8 168 9 8 9.5 9 8.5 8.5 8 7 8

89

Lampiran 10 Medium pertumbuhan yang mengandung glukosa yang telah berubah warna menjadi merah

a. Kondisi medium pertumbuhan sesaat setelah bakteri laut Mesophilobacter sp. diinokulasi

b. Medium pertumbuhan berubah menjadi keruh setelah tiga jam inkubasi

c. Perubahan warna pada medium setelah 24 jam inkubasi

d. Perubahan warna pada medium setelah 30 jam inkubasi

e. Perubahan warna pada medium

setelah 168 jam inkubasi

f. Perubahan warna pada medium setelah

9 hari inkubasi

68