PEMISAHAN DENGAN CARA KROMATOGRAFI

I. TUJUAN

Mengenal dan memahami pemisahan dengan cara kromatografi

Menentukan nilai Rf (Rate of Flow) dengan teknik kromatigrafi

II. TEORI

Kromatografi adalah teknik pemisahan dimana suatu zat dalam campuran

diuraikan berdasarkan kemampuannya untuk diserap oleh komponen lain yang

ada di dalam kromatografi yang dikenal sebagai fasa diam. Dalam kromatograf,

komponen-komponen terdistribusi dalam dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak.

Fasa diam dapat berupa zat cair atau padat. Sedangkan, fasa bergerak dapat

berupa cairan atau gas. Dengan demikian kromatografi dapat dibedakan atas dasar

kombinasi antara fasa diam dan fasa bergerak. Kombinasi tersebut dapat berupa

cair-gas, padat-cair, cair-cair, dan gas-padat.

Transfer masa antara fasa gerak dan fasa diam terjadi bila molekul-molekul

terserap pada permukaan fasa diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair.

Kemampuan fasa diam untuk mengadopsi fasa bergerak sangat bergantung pada

sifat-sifat fasa diam dan fasa bergerak. Untuk setiap zat, hal ini sangat spesifik

sehingga teknik kromatografi di samping bertujuan untuk pemisahan dapat pula

digunakan untuk mengidentifikasi suatu zat. Pada saat ini telah dikenal cukup

banyak teknik kromatografi, diantaranya kromatografi kertas, lapis tipis (TLC),

gas (GC), kolom, dan eksklusi. Dengan berbagai cara tersebut, kegiatan prevaratif

dan analitik semakain valid dan reliable hasil yang diperoleh.

(Tim Kimia Analitik, 2014 : 36-37)

Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan

senyawa-senyawa organik dan anorganik, metode ini berguna untuk fraksionasi

campuran kompleks dan pemisahan untuk senyawa yang sejenis. Metode-metode

kromatografi tidak dapat dikelompokkan dengan hanya meninjau satu macam

sifat, artinya dapat dinyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi

pelarut, penukar ion kedalam satuan gelas.

Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam

kromatografi, komponen-komponen terdistribusu dalam dua fase, fase diam dan

1

fase gerak. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila

molekul-molekul campuran terserap pada permukaan partikel-partikel kedalam

sejumlah cairan yang terikat pada permukaan. Laju perpindahan suatu molekul zat

terlarut tertentu di dalam kolom atau lapis tipis zat penyerap secara langsung

berhubungan dengan bagian-bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan

fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secra selektif, maka masing-masing

komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada

karakteristik masing-masing penyerapan.

(Khopkar, 2008)

Dengan menggunakan cara kromatografi, pemisahan dalam banyak keadaan

lebih cepat dan efektif daripada sebelumnya dan banyak pemisahan, dapat berhasil

yang tidak akan dapat diusahakan dengan teknik lain, pemdobrakan yang tidak

ada bandingnya dalam biokimia mendapatkan pengertian dan fungsi enzim dan

protein yang lain telah berasal secara langsung dari penggunaan kromatografi

dalam penelitian biologik.

Hal yang penting dalam pengukuran atau penentuan pada kromatografi cair

adalah kita pertama-tama meneliti proses distribusi fasa sebagai bentuk biasa yang

terlihat dalam kromatografi cair. Jika dibayangkan adanya suatu zat padat dengan

permukaan yang bersih dan kering, lalu jika sekarang permukaan ini dialiri suatu

fluida atau gas, cairan murni atau larutan, biasanya ada kecenderungan dari

molekul gas, pelarut atau zat terlarut untuk mengadakan interaksi dengan

permukaan tadi. Jika zat padat adalah terbagi atau sangat berpori, atau dengan

kata lain zat mempunyai luas permukaan besar, maka besarnya adsorpsi akan

setara Sebagai contoh, jika suatu adsorben yang baik dimasukkan ke dalam bejana

yang berisi gas, penurunan tekanan sebagai akibat penarikan molekul gas pada

permukaan mudah diukur.

(Underwood, 1999)

Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai

berikut; (a) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam

cairan; (b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada

permukaan padatan halus (adsorpsi=penyerapan); (c) kecenderungan molekul-

molekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion). Komponen yang

2

dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk

berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau

bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan

migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan

untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), penetapan kadar (analisis

kuantitatif), dan pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif).

Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi

kertas karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Kerapkali,

noda tidak berwarna atau tidak berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat

ditampakkan dengan cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod.

(Soebagio, 2000: 54)

Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada

afinitas kepolaran analite dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki

kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi

kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-

polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat

pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak

di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas

aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau

dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai

dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi

(misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.

Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati

yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan

sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi

oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi

tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke

bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer).

Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi

berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan

bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.

(Sastrohamidjojo, 2005)

3

III. PROSEDUR PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Seperangkat alat gelas

Kertas saring whatmann

Plat TLC

Chamber

Pipa kepiler

Gunting

Seperangkat alat kromatografi gas

Seperangkat alat kromatografi kolom

Mistar

Pensil

Lumpang porselin

Pipet tetes

Corong pisah

III.1.2 Bahan

Butanol pa

Kristal iod

Sampel ekstrak daun

Kloroform

n-pentana

n-heptana

n-heksana

Asan nitrat

Anilin pialat

Etanol

Aseton

Kapas

Aseton dan natrium sulfat

III.2 Skema Kerja

4

III.2.1 Pemisahan dan Penentuan Karbohidrat dengan Kromatografi

Kertas

dicampurkan dengan perbandingan (4 : 1 : 5)

sebagai fasa gerak

disiapkan potongan kertas saring whatmann yang

telah dijenuhkan dengan uap air

disiapkan larutan sampel yang terdiri dari

beberapa macam karbohidrat

disiapkan pola larutan penyemprot (anilin pialat)

disiapakan larutan standar yang terdiri dari zat

murni untuk glukosa, fruktosa, maltose dan

amilum

disiapkan perangkat kromatografi kertas

diberi garis pada kertas +0,5 cm dari pingggir

ditotolkan 3-4 larutan standar pada garis tersebut

dimasukkan kertas dalam chumber berisi larutan

standar pada posisi tegak

dibiarkan beberapa lama sampai pelarut naik

diangkat kertas dan dikeringkan

disemprot zat penanda noda yang sesuai dengan

larutan standar

dihitung nilai Rf nya

diulangi kegiatan ini untuk semua larutan standar

dibandingkan nilai Rf untuk mengetahui

kandungan jenis karbohidrat

III.2.2 Pemisahan Komponen Penyusun Daun Bayam secara TLC

5

Butanol, asam asetat

dan air

HASIL

1.Penyiapan kolom

ditambahkan pada klem

dihilangkan gelembung pada kapas yang

ditempatkan pada kolom kering yang ditekan

sampai dasar kolom dengan pengaduk

ditambahkan pasir + 3 mm dari tinggi kapas

*Diperhatikan kolom harus berdiri tegak

dicampurkan dalam gelas kimia 100 mL

diaduk dengan spatel

dimasukkan ke dalam kolom secar perlahan

dipadatkan dengan mengetuk dinding kolom

dengan pensil

dibiarkan lapisan alumina turun

ditambahkan lagi pasir setinggi 5 mm di atas

alumina tersebut

ditambahkan eluen di atas lapisan pasir

*Perhatian!

- Jangan sampai eluen melewati batas

- Jangan ada gelembung udara dalam kolom

- Kolom jangan sampai kering

6

10 mL PE

HASIL

20 mL alumina dan 40 gr PE

HASIL

- Penambahan eluen dilakukan ekstra hati-hati dan perlahan

menggunakan pipet tetes serta zat dialirkan melalui dinding

kolom

2.Pengerjaan kolom kromatografi

dibiarkan turun dan ditampung di dalam gelas

Erlenmeyer 250 mL hingga permukaan pelarut

tepat diatas lapisan eter

ditambahkan 25 tetes zat yang telah diekstrak

(percobaan TLC)

dibuka kran hingga zat ini turun sebagian

ditambahkan 5 mL PE

dibiarkan mengalir melalui kolom dengan

membuka klem

ditambahkan eluen pertama (PE : CH2Cl2 = 4:1)

dibuka klem dan dibiarkan pelarut turun

dipisahkan setiap fraksi yang berbeda warna ke

dalam tabung berbeda

dilakukan penambahan eluen (CH2Cl2 : methanol

= 95 : 5)

diulangi prosedur hingga fraksi berbeda warna

diperoleh

diberi label pada tabung yang berisi fraksi

7

Pelarut

HASIL

III.2.3 Pemisahan Zat dengan Kromatografi Kolom

disiapkan

disiapkan pula campuran larutan sampel

diset alat GC sesuai dengan kondisi percobaan

digunakan syringe yang sesuai

diambil kromatigrafi untuk tiap-tiap senyawa

dibandingkan dengan kromatogram campuran

larutan standard dan kromatogram dari tiap

individu larutan standar

*Campuran standar = terdiri dari 5mL u-pentana, 10mL n-heksana,

dan 15 mL n-heptana

8

Campuran standar

HASIL

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

V. KESIMPULAN

VI. DAFTAR PUSTAKA

9