Pemeriksaan Agregasi Trombosit

Rahajuningsih Dharma

Pengurus Pusat PDS PatKLIn

Suramade Denpasar 7 Agustus 2019

Megakaryoblast Megakaryocytes Platelets

Trombosit : berasal dari megakariosit1/3 disekuestrasi di limpa2/3 berada di sirkulasi

Jumlah trombosit : 150 – 400 x 103/L

Trombosit

Morfologi trombosit

Trombosit

• Bentuk cakram bikonveks 1-4 m, tebal 0,5 – 1 m,

volume 5 – 7 fl

• Tidak berinti, berisi granula a, padat, lysosom

• Membran : fosfolipid 2 lapis, glikoprotein (reseptor)

• Fungsi : membentuk sumbat hemostatik dan ikut

berperan pada proses koagulasi

• Komponen utama trombus arteri

• Platelet derived growth factor (PDGF) proliferasi

dan migrasi sel otot polos ke tunika intima

Fungsi trombosit pada hemostasis

• Membentuk sumbat hemostatik untuk menghentikanperdarahan

• Proses pembentukan sumbat :

– Adhesi trombosit: perlekatan trombosit ke jaringansubendotel memerlukan von Willebrand factor sebagaijembatan

– Agregasi trombosit perlekatan sesama trombosit, memerlukan fibrinogen sebagai jembatan antar trombosit

– Reaksi pelepasan: pengeluaran isi granula trombosit keplasma.

• Menyediakan permukaan bermuatan negatif (fosfatidilserin) untuk aktivasi koagulasi

Platelet FunctionFungsi Trombosit

Agregasi trombosit

Agonis trombosit

Trombin

Kolagen

Adenosin diphosphate (ADP)

Epinefrin

Tromboksan A2

Reseptor trombosit

• Fibrinogen

• Von Willebrand factorGP IIbIIIa

• Von Willebrand factorGP IbIXV

• KolagenGP IaIIa, GP

VI

PAR 1-4

P2Y12, P2Y1 • ADP

• Trombin

Aktivasi trombosit

Agregasi trombosit

Pengeluaran Isi granula

Peningkatan ion kalsium

Reorganisasi sitoskeleton Perubahan bentuk

Interaksi agonis dengan reseptor

transduksi sinyal

Indikasi pemeriksaan agregasi trombosit

Gangguan fungsi trombosit

• Masa perdarahan >

• Jumlah trombosit normal

Mendeteksi trombosit hiperaktif

Memantau terapi anti platelet

Pemeriksaan agregasi trombosit

Born : Perubahan transmisi cahaya

PRP keruh

transmisi cahaya rendah

ADP

Trombosit beragregasi lalu mengendap

plasma jadi jernih

Transmisi cahaya meningkat

Kurva agregasi dengan berbagai kadar ADP

Agregasi primer

Agregasi sekunder

Agregasi primer

Deagregasi

Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry

A consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of Scientific and

Standardization Committee of International Society on Thrombosis and Hemostasis

Catanneo M,Cerletti C, Harrison P, Hayward CPM, Kenny D, Nugent D, Nurdent P, Rao AK, Schmaier AH, Watson SP, LussanaF, Pugliano MT, Michelson AD

Standardisasi LTA meliputi

1. Kegunaan klinis

2. Variabel pre analitik

3. Pengambilan darah

4. Pembuatan PRP dan PPP

5. Penilaian kualitas PRP

6. Metodologi

7. Pemilihan agonis

8. Pelaporan hasil

Working Party on LTA , SSC of ISTH

Kegunaan klinis LTA

1. Subjek dengan kelainan perdarahan

2. Tidak dipakai untuk identifikasi subjek denganrisiko trombosis kecuali untuk riset

3. Tidak dipakai untuk monitoring terapi antiplatelet kecuali untuk riset.

Jadi LTA hanya dipakai untuk diagnosis pasien dengankelainan perdarahan yang diduga ada gangguan fungsitrombosit

Kegunaan klinis

Sebelum pengambilan darahduduk istirahat sebentar

Variabel pre analitik

Tidak bolehmerokok paling sedikit 30 menitsebelumsampling

Tidak bolehminum kopi paling sedikit 2 jam sebelumsampling

Variabel pre analitik: Obat-obatan

1. Semua obat yang diminumdalam minggu terakhir harusdicatat.

2. Obat yang dapat mengganggufungsi trombosit secarareversibel seperti NSAID harusdihentikan 3 hari sebelumsampling.

3. Obat yang dapat mengganggufungsi trombosit secara menetapseperti aspirin harus dihentikanselama 10 hari.

Puasa /Tidak

Tidak harus puasaTidak bolehmakanan yang tinggi lemakkarenameningkatkankilomikron

Pengambilan darah

• Bendungan minimal

• Ukuran jarum paling kecil 21 gauge

• Penampung plastik atau gelas berlapis silikon

• Anticoagulan natrium sitrat 0,109M atau 0,129 M yang di bufer untuk mempertahankan pH selama prosessing

• 3-4 mL darah yang pertama keluar dibuang atau dipakaiuntuk pemeriksaan lain

• Bila ada kesulitan sampling, darah yang underfilled hanyadipakai untuk menyingkirkan gangguan fungsi trombositberat seperti GT, BSS

Pengiriman darah

Posisi tabung harus tegak Tidak boleh dengan pneumatic tube

Pembuatan PRP dan PPP

1. Darah harus diistirahatkan 15 menit pada suhu kamarsebelum sentrifugasi

2. PRP: darah disentrifusdengan kecepatan 200 g selama 10 menit pada suhukamar (21oC), tidak bolehmenggunakan brake

3. PPP:darah disentrifus dengankecepatan 1500 g selama 15 menit.

Penilaian kualitas PRP

Sampel grossly hemolysedharus ditolak

Jika sampel lipemik, kondisi iniharus dicantumkan pada hasil

Jumlah trombosit di PRP

• Hasil LTA tidak akurat jika jumlah trombositkurang dari 150 000/µL

• Harus hati hati dalam interpretasi hasil abnormal pada sampel dengan jumlah trombosit rendah

• Jangan melakukan adjustment terhadap jumlahtrombosit dalam PRP dengan PPP. Hasil LTA lebihsering abnormal jika menggunakan adjustment

Metodologi

Penambahan agonis, volume max 10% dr total

Agregasi dimonitor min 3 menit, maksimal 10 menit

PRP transmisi 0%, PPP transmisi 100%, 37 o C, 1000rpm

Amati oscilasi pada baseline tracing selama 1menit

Disertakan subjek normal sebagai kontrol

PRP dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit

LTA harusselesai 4 jam stl sampling

Metodologi

• Harus disertakan subjek normal sebagai kontrol

• Setelah sentrifugasi, PRP dibiarkan 15 menit di suhu kamar

• PRP dipakai untuk 0% transmisi dan PPP untuk 100% transmisi, suhu 37oC dan kecepatan stirrer 1000 rpm

• Sebelum penambahan agonis , baseline tracing diamatiadanya oscilasi dan stabilitas selama 1 menit

• Volume agonis tidak boleh lebih dari 10% dari volume total

• Agregasi trombosit harus dimonitor minimum 3 menit danmaksimum 10 menit setelah penambahan agonis jika kontrolbelum mencapai maksimal.

• LTA harus selesai dalam 4 jam setelah pengambilan darah

Pemilihan agonis• ADP 2 µM. Jika hasil abnormal ulangi dengan kadar ADP >

• Epinefrin 5 µM. Jika hasil abnormal ulangi dengan kadar epinefrindinaikkan

• Kolagen 2 µg/mL. Jika hasil abnormal ulangi dengan kadar kolagendinaikkan

• Thrombin Receptor Activating Peptide (TRAP) 10 µM. Jika hasilabnormal ulangi dengan kadar TRAP dinaikkan.

• Thromboxane A2 mimetic U46619 1 µM. Jika hasil abnormal ulangidengan kadar U46619 dinaikkan.

• Asam arakidonat (AA) 1 µM. Jika hasil abnormal ulangi dengankadar AA dinaikkan.

• Ristocetin 1,2 mg/mL. Jika hasilnya normal, ulangi dengan kadarristocetin 0,5 – 0,7 mg/mL . Jika dengan 1,2mg/mL tidak adaaglutinasi ulangi dengan ristocetin 2mg/mL.

Pemilihan agonis untuk LTA

Agonis Kadar

ADP 2 M

Epinefrin 5 M

Kolagen 2 g/mL

Thrombin Receptor Activating Peptide (TRAP) 10 M

TxA2 mimetic U46619 1 M

Asam arakhidonat 1 M

Ristocetin 1,2 mg/mL

Jika hasil abnormal ulangi pemeriksaan dengan kadar agonislebih tinggi.Untuk ristocetin jika hasil normal ulangi dengan kadar 0,5 –0,7 mg/mL

Evaluasi dan pelaporan hasil

• Platelet aggregation tracings:– Adanya shape change (oscilasi)

– Lamanya lag phase

– Slope agregasi

– Maximal amplitudo (% aggregation)

– % aggregation pada akhir monitoring

– Deaggregasi

– Pengamatan secara visual

– Adanya secondary wave

• Jika pemeriksaan selesai > 4 jam harus dijelaskan

• Tiap lab harus menentukan nilai rujukan, yang harusdivalidasi jika ganti lot reagen

Kurva agregasi trombosit

Metode lain untuk memeriksa

agregasi trombosit

Whole blood impedance aggregometry

Diukur impedance sebelum dan setelah penambahanagonis. Dengan penambahan agonis terjadi agregasi impedance meningkat

Platelet Works

Alat : Cell counter yang dasarnyaimpedance

Hitung jumlah trombosit dalambotol EDTA sebagai baseline

Hitung jumlah trombosit dalambotol berisi agonis (ADP, kolagen)

% agregasi = (Jl.trombosit baseline – jl trombosit +agonis)jl trombosit baseline

X 100 %

Ringkasan

• Indikasi untuk mencari gangguan fungsi trombosit padapasien dengan perdarahan.

• Indikasi mendeteksi risiko trombosis dan monitoring obatantiplatelet hanya untuk riset

• Pre analitik istirahat sebelum sampling, dilarang merokokdan minum kopi, makanan yang berlemak. Tidak harus puasa

• Semua obat dalamminggu terakhir dicatat, ada yang harusdihentikan 3 hari atau 10 hari.

• Pengambilan darah : stasis minimal, antikoagulan natriumsitrat yang dibufer, jarum paling kecil 21g, penampungplastik/gelas berlapis silikon, 3 ml darah pertama dibuang.

• Pengiriman : tabung tegak tidak boleh dengan pneumatic tube

• Sentrifugasi : PRP 200 g,10 menit suhu kamar, PPP 1500 g selama 15 menit. Gross hemolysis harus ditolak.

• Jumlah trombosit < 150 000 hasil tidak akurat.

• Tidak boleh melakukan adjustment jumlah trombosit PRP dengan PPP.

• Harus diperiksa subjek normal untuk kontrol

• Agonis dapat dipilih, jika hasil tidak normal kadar agonis

• Tiap lab menentukan nilai rujukan sendiri

• Evaluasi : shape change, lag phase, slope, secondary wave, % agregasi maksimal, % agregasi pada akhir monitoring, deagregasi.

• Harus selesai dalam 4jam setelah ambil darah

Terima kasih