Pada praktikum kali ini, dilakukan percobaan uji pirogen terhadap sediaan infus glukosa yang bertujuan untuk mengetahui adanya pirogen hidup atau yang mempunyai daya hidup di dalam suatu sediaan steril (gatau bener atau engga, tanya bagian tujuan prinsip jay). Prinsip dari praktikum kali ini yaitu . Uji pirogen dilakukan terhadap sediaan injeksi termasuk infus dimaksudkan untuk membatasi resiko reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Sediaan injeksi yang sudah disterilisasi terkadang masih mengandung endotoksi karena pada proses sterilisasi produk parenteral (menggunakan panas), bakteri gram negatif yang masih mungkin ada dalam produk, akan mati dan terjadi lisis sehingga endotoksin akan terlepas dan tetap tinggal di dalam produk dimana endotoksin tersebut bersifat stabil terhadap panas. Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif sedangkan pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu tubuh (contohnya akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena). Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin. Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida(LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. Serta berfungsi untuk menyusun membran luar bakteri gram negatif.Uji pirogen dalam praktikum kali ini dilakukan dengan test LAL metode gel clot. Tes Limulus amebocytelysate (LAL) merupakan uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri. Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif selain rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan/binatang dalam percobaan. Pada praktikum kali ini dilakukan test LAL karena dengan pengerjaan yang sederhana karena tidak perlu menggunakan hewan percobaan kelinci, hasil akhir yang cepat, murah, serta praktis. Metode yang digunakan dalam test LAL kali ini yaitu Metode Gel-Clot dimana prinsipnya yaitu LAL akan menggumpal dengan adanya endotoksin.Perlakuan pertama-tama yaitu dengan mempersiapkan alat dan bahan yang digunakan serta mempersiapkan Laminar Air Flow yang akan digunakan. Laminar Air Flow disiapkan terlebih dahulu dengan menyalakan lampu UV selama 15 menit dan kemudian setelah 15 menit, dinyalakan lampu neon dan blower. Dengan dinyalakannya lampu neon dan blower merupakan tanda bahwa Laminar Air Flow siap digunakan untuk pengerjaan. Di dalam lamiar air flow, dimasukkan cairan infus glukosa yang akan diuji pirogenitasnya ke dalam tabung LAL-gel clot menggunakan syringe steril sebanyak 0.2 mL (200 mikro liter atau setara dengan 4 tetes) ke dalam single test vial (STV) hingga seluruh gel terbasahi. Penggunaan syringe steril dan pengerjaan tersebut dilakukan di dalam Laminar Air Flow untuk mempengaruhi adanya kontaminan dari luar yang dapat mempengaruhi hasil akhir menjadi false negatif bukan karena adanya pirogen tetapi karena adanya kontaminan sehingga membentuk gel yang kompak. Setelah pirotel tersebut larut dan tercampur sempurna, kemudian STV dipindahkan ke dalam suatu beaker glass yang diisi kapas untuk menghindari goyangnya tabung LAL karena akan mempengaruhi hasil akhir. Terjadinya goyangan dihindari agar tidak dihasilkan hasil berupa FALSE NEGATIF (pengukuran yang salah) karena guncangan sedikit saja dapat menghancurkan massa gel yang sudah terbentuk sehingga dapat disimpulkan hasil yang negatif namun faktanya berupa hasil positif. Selanjutnya, STV ditempatkan dengan cepat ke dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 1 jam dimana endotoksin yang terdapat dalam larutan infus akan mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus melalui aktivasi enzim (enzim koagulase) yang menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus dan menghasilkan koagulin/ gel yang kompak. Perlakuan inkubasi dimasudkan untuk memberikan suhu dan lingkungan optimal agar enzim dapat bekerja optimal untuk menghasilkan suatu produk yang merupakan gel kompak.

Untuk mendapatkan reaksi yang optimal antara reagensia LAL dengan endotoksin, diperlukan unsur-unsur yang harus ada dalam reagensia LAL, yaitu : pro-clotting enzynze (zymogen). clotting protein (coagulogen).Garam anorganik Uji LAL didasarkan atas kemampuan endotoksin menyebabkan koagulasi "protein coagulogen", sebagai unsur reagensia LAL, sehingga terbentuk "Gel" yang kompak (padat).Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram negatif. Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi. Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi pembentukan gel koagulasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin. Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus dan menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel. Dengan kata lain, hasil pembacaan bernilai positif (+) jika terbentuk gel kompak padat yang tetap, berarti contoh larutan infus tersebut mengandung endotoksin (pirogen) dan sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia (pirotel) yang digunakan. Serta hasil pembacaan dikatakan negatif (-) jika tidak terbentukgel padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia (pirotel) yang digunakan.Food and Drug Administration (FDA) menentukan batas endotoksin berdasarkan dosis maksimum sediaan obat untuk manusia dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat (kecuali intratekal) dari 2,5 EU (endotoksin unit) kg-1 sampai 5,0 EU kg-1.

Setelah dilakukan inkubasi ..