BAB IITINJAUAN PUSTAKAII.1. Pengertian IsolasiIsolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuranbermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan denganmenumbuhkannya dalam mediapadat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan murniataubiakan aksenik.Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagaibiakan dua-jenis (1)Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisioptimumuntuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (1).Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (2). II.2. Teknik IsolasiUntuk melakukan isolasi mikroba, dapat dilakukan dengan beberapa cara atau teknik. Teknik atau cara-cara isolasi mikroorganisme adalah :a. Pour plate atau shake cultureBeberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan mediaum yang masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperolehpiaraa adukan.Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar.b. Streak Plate Ujung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel.c. Slant cultureUjung kawat yang membawakan bakteri digesekkan pada permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi.Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarumoseyang bagian atasnya dilengkungkan. Caraini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen.d. Stab cultureUjung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis (3).II.3. AktinomisetesAktinomisetes adalah bakteri Gram positif yang tumbuh sebagai filament sel yang bercabang dan hidup dari berbagai bahan organik yang membusuk. Menurut Alexander, aktinomisetes merupakan bentuk peralihan antara bakteri dan fungi. Aktinomisetes secara umum hamper menyerupai jamur karena mempunyai ciri : miselium aktinomisetes mempunyai karakter percabangan yang luas; seperti umumnya fungi, aktinomisetes membentuk miselium udara dan konidia ; pertumbuhan aktinomisetes pada kultur cair yang menghasilkan kekeruhan seperti umumnya bakteri uniseluler, tetap membentuk pellet-pelet fungi.Aktinomisetes merupakan bakteri yang memiliki kemiripan dengan jamur sebab menghasilkan miselium namun aktinomisetes merupakan sel prokariotik yang menjadi ciri utama dari bakteri, oleh karena itu aktinomisetes digolongkan sebagai bakteri sebab aktinomisetes merupakan mikroba prokariotik. Aktinomisetes menghasilkan miselium bercabang dan biasanya mengalami fragmentasi atau pembelahan untuk membentuk spora. Aktinomisetes apabila ditumbuhkan pada medium maka morfologi akan terleihat seperti gambar berikut : Aktinomisetes banyak hidup pada tanah atau sedimen laut. Namun aktinomisetes juga ternyata hidup pada jaringan dalam tumbuhan sebagai bakteri endofit. Aktinomisetes merupakan bakteri aerob dan dapat hidup pada suhu yang tinggi walaupun hidup di dalam tanah. Aktinomisetes banyak hidup di dalam tanah, sebab aktinomisetes dapat menembus tanah untuk mendapatkan senyawa-senyawa hasil dekomposisi jaringan tanaman yang telah mati. Hal ini berarti, aktinomisetes memerlukan jaringan tanaman sebagai sumber nutrisi bagi kehidupannya. Hal inilah yang menyebabkan bahwa aktinomisetes juga ternyata dapat hidup pada jaringan tanaman sebagai mikroba endofit.Menurut Soetedo, aktinomisetes adalah organisme yang memiliki sifat-sifat umum dimiliki oleh bakteri dan jamru, tetapi juga mempunyai ciri khas yang cukup berbeda. Seperti halnya jamur, aktinomisetes mempunyai miselium uniseluler dan mempunyai susunan hifa yang bercabang yang agak panjang dan diameter 0.5-0.8 mikrometer. Miseliumnya berkembang dalam lapirsan bawah dan tumbuh menjulang seperti antenna yang disebut miselium aerial. Pada lempeng agar, aktinomisetes dapat dibedakan dengan mudah dari bakteri. bakteri memiliki morfologi yang berlendir, mengkilap dan tumbuh dengan cepat sedangkan koloni aktinomisetes dapat dibedakan morfologi yang buram, permukaan konsisten berbubuk, melekat erat pada permukaan agar dan memiliki pertumbuhan yang lambat.Pengendalian biologi sangat diperlukan untuk menekan pertumbuhan filopatogen. Menurut Crueger dan Crueger dan Kenneth aktinomisetes khususnya Streptomyces merupakan mikroorganisme yang menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat dimanfaatkan pada bidang pertanian sebagai pengendali hayati. Selain itu, masih banyak jenis aktinomisetes yang menghasilkan metabolit sekunder seperti antibiotic dan antitumor. II.4. Medium IsolasiMedium pertumbuhan (disingkat medium) adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi dan untuk bahan pembangun sel, untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba mempunyai sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula. Susunan kimia sel mikroba relatif tetap, baik unsur kimia maupun senyawa yang terkandung di dalam sel. Dari hasil analisis kimia diketahui bahwa penyusun utama sel adalah unsur kimia C, H, O, N, dan P, yang jumlahnya + 95 % dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari unsur-unsur lain (Lihat Tabel). Apabila dilihat susunan senyawanya, maka air merupakan bagian terbesar dari sel, sebanyak 80-90 %, dan bagian lain sebanyak 10-20 % terdiri dari protoplasma, dinding sel, lipida untuk cadangan makanan, polisakarida, polifosfat, dan senyawa lain. Susunan unsur-unsur penyusun sel bakteri E. coli

Unsur-unsur kimia Persentase berat kering

Carbon (C) 50 Oksigen (O) 20 Nitrogen (N) 14 Hidrogen (H) 8 Fosfor (P) 3 Belerang (S) 1 Kalium (K) 1 Natrium (Na) 1 Kalsium (Ca) 0,5 Magnesium (Mg) 0,5 Klor (Cl) 0,5 Besi (Fe) 0,2 Lain-lain 0,3 II.4.1. Fungsi Nutrisi untuk MikrobaSetiap unsur nutrisi mempunyai peran tersendiri dalam fisiologi sel. Unsur tersebut diberikan ke dalam medium sebagai kation garam anorganik yang jumlahnya berbeda-beda tergantung pada keperluannya. Beberapa golongan mikroba misalnya diatomae dan alga tertentu memerlukan silika (Si) yang biasanya diberikan dalam bentuk silikat untuk menyusun dinding sel. Fungsi dan kebutuhan natrium (Na) untuk beberapa jasad belum diketahui jumlahnya. Natrium dalam kadar yang agak tinggi diperlukan oleh bakteri tertentu yang hidup di laut, algae hijau biru, dan bakteri fotosintetik. Natrium tersebut tidak dapat digantikan oleh kation monovalen yang lain. Jasad hidup dapat menggunakan makanannya dalam bentuk padat maupun cair (larutan). Jasad yang dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat tergolong tipe holozoik, sedangkan yang menggunakan makanan dalam bentuk cair tergolong tipe holofitik. Jasad holofitik dapat pula menggunakan makanan dalam bentuk padat, tetapi makanan tersebut harus dicernakan lebih dulu di luar sel dengan pertolongan enzim ekstraseluler. Pencernaan di luar sel ini dikenal sebagai extracorporeal digestion. Bahan makanan yang digunakan oleh jasad hidup dapat berfungsi sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor atau donor elektron. Dalam garis besarnya bahan makanan dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber nitrogen. 1. Air Air merupakan komponen utama sel mikroba dan medium. Funsi air adalah sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme.

2. Sumber energi Ada beberapa sumber energi untuk mikroba yaitu senyawa organik atau anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari. 3. Sumber karbonSumber karbon untuk mikroba dapat berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino, asam organik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganik misalnya karbonat dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama terutama untuk tumbuhan tingkat tinggi. 4. Sumber aseptor elektron Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahan dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas, maka harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkap elektron ini disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Pada mikrobia yang dapat berfungsi sebagai aseptor elektron ialah O2, senyawa organik, NO3 NO2 N2O SO4 CO2 Fe3+5. Sumber mineral Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H, dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur mineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn, Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang digunakan dalam jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo, dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke dalam medium lewat kontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu. Selain berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untuk mengatur tekanan osmose, kadar ion H+ (kemasaman, pH), dan potensial oksidasi- reduksi (redox potential) medium. 6. Faktor tumbuh Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan (sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat disintesis dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zat tumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Berdasarkan struktur dan fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino, sebagai penyusun protein; base purin dan pirimidin, sebagai penyusun asam nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif dari enzim. 7. Sumber nitrogenMikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asam amino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantung pada jenis jasadnya. Beberapa mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk gas N2 (zat lemas) udara. Mikroba ini disebut mikrobia penambat nitrogen.II.4.2. Medium Pertumbuhan MikrobaSusunan dan kadar nutrisi suatu medium untuk pertumbuhan mikroba harus seimbang agar mikroba dapat tumbuh optimal. Hal ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa yang menjadi zat penghambat atau racun bagi mikroba jika kadarnya terlalu tinggi (misalnya garam dari asam lemak, gula, dan sebagainya). Banyak alga yang sangat peka terhadap fosfat anorganik. Disamping itu dalam medium yang terlalu pekat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan mikroba dapat berubah. Perubahan faktor lingkungan menyebabkan aktivitas fisiologi mikroba dapat terganggu, bahkan untuk mempertahankan pH medium ditambahkan bahan buffer. Beberapa komponen penyusun medium dapat juga berfungsi sebagai buffer. II.4.3. Macam Medium Pertumbuhan 1. Medium dasar/ basal mineral Medium dasar adalah medium yang mengandung campuran senyawa anorganik. Medium dasar ini selanjutnya ditambah zat lain apabila diperlukan, misalnya sumber karbon, sumber energi, sumber nitrogen, faktor tumbuh, dan faktor lingkungan yang penting seperti pH dan oksigen serta tekanan osmosis. 2. Medium sintetik

Medium sintetik adalah medium yang seluruh susunan kimia dan kadarnya telah diketahui dengan pasti. Sebagai contoh adalah medium dasar yang ditambah NH4Cl (medium 1) dengan sumber karbon berupa gas CO2, apabila diinkubasikan dalam keadaan gelap dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri nitrifikasi khemoototrof, misalnya bakteri Nitrosomonas. Bakteri ini memperoleh energi dari oksidasi amonium, selain itu amonium juga berfungsi sebagai sumber nitrogen. Contoh lain adalah medium dengan susunan sama dengan medium 1 tetapi ditambah glukosa (medium 2). Dalam keadaan aerob merupakan medium untuk perbanyakan jamur dan bakteri yang bersifat heterotrof. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Dalam keadaan anaerob, medium ini dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri fakultatif anaerob maupun anaerob obligat. Energi diperoleh dari hasil fermentasi glukosa. Untuk menumbuhkan mikroba yang memerlukan faktor tumbuh dapat menggunakan medium yang komposisinya sama dengan medium 2 tetapi ditambah asam nikotinat (vitamin) sebagai faktor tumbuh (medium 3). 2. Medium kompleks Medium kompleks adalah medium yang susunan kimianya belum diketahui dengan pasti. Sebagai contoh medium ini adalah medium dasar yang ditambah glukosa dan ekstrak khamir (medium 4). Susunan kimia ekstrak khamir tidak diketahui secara pasti, tetapi mengandung berbagai faktor tumbuh yang sering diperlukan oleh mikroba. Medium ini dapat untuk menumbuhkan mikroba khemoheterotrof aerob maupun anaerob baik yang memerlukan maupun yang tidak memerlukan faktor tumbuh.II.5. FermentasiFermentasi memiliki banyak definisi. Pengertian fermentasi menurut ahli mikrobiologi diartikan sebagai proses untuk menghasilkan suatu produk dari kultur mikrooeganime. Fermentasi dapat juga diartikan sebagai suatu disimilasi senyawa-senyawa organik yang disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme. Disimilasi merupakan reaksi kimia yang membebaskan energy melalui perombakan nutrient. Pada proses disimilasi, senyawa substrat yang merupakan sumber energy diubah menjadi senyawa yang lebih sederhana atau tingkat energinya lebih rendah. Reaksi desimilasi merupakan aktivitas katabolic sel melalui proses kimia. Secara umum, ada empat kelompoj fermentasi yang penting secara ekonomi, yaitu :1. Fermentasi yang memproduksi sel mikrobaProduksi komersial dari biomass dapat dibedakan menjadi produksi yeast untuk industry roti, dan produksi sel mikroba untuk digunakan sebagai makanan manusia dan hewan.2. Fermentasi yang menghasilkan enzim dan mikrobaSecara komersial enzim dapat diproduksi oleh tanaman, hewan, dan mikroba, namun enzim yang diproduksi oleh mikroba memilliki beberapa keunggulan yaitu, mampu dihasilkan dalam jumlah besar dan mudah untuk meningkatkan produktivitas bila dibandingkan dengan tanaman atau hewan.3. Fermentasi yang menghasilkan metabolit mikrobaMetabolit mikroba dibedakan menjadi metabolit primer dan metabolit sekunder. Produk metabolism promer yang dianggap penting contohnya etanol, asam sitrat, polisakarida, aseton, butanol dan vitamin. Sedangkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroba adalah antibiotic, pemacu pertumbuhan, inhibitor enzim dan lain-lain.4. Fermentasi tranformasiSel mikroba dapat digunakan untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang masih memiliki kemiripan struktur namun memiliki komersial yang lebih tinggi. Proses transformasi dengan menggunakan mikroba ini lebih baik bila dibandingkan dengan proses kimia, berkaitan dengan penggunaan reagen kimia yang lebih sedikit. Selain itu, proses dapat berlangsung pada suhu rendah tanpa membutuhkan katalis logam berat yang berpotensi menimbulkan potensi.Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam. Medium kultur permukaan dapat berupa medium padat, semi padat atau cair. Sedangkan kultur terndam dilakukan dengan medium cair menggunakan bioreactor yang dapt berupa labu yang diberi aerasi, labu yang digoyang dengan shaker atau fermentor.Diandingkan dengan medium padat, medium cair memiliki kelebihan yaitu :1. Jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat diatur sesuai dengan yang diinginkan2. Dapat memberikan kondisi yang optimum untuk pertumbuhan3. Pemakaian medium lebih efisien.Kondisi yang optimum untuk suatu proses fermentasi bergantung pada jenis organismenya. Pengendalian factor-faktor fermentasi bertujuan untuk menciptakan kondisi yang optimum bagi pertumbhan dan roduksi metabolit yang diinginkan dari suatu organisme tertentu. Fermentasi medium cair lebih memungkinkan untuk mengendalikan factor-faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi proses fermentasi seperti suhu, pH dan ketuhuan oksigen.Pada fermentasi skala laboratorium yang menggunakan shaker flask, pengendalian suhu dapt dilakukan melalui penggunaan incubator yang dilengkapi dengan thermostat pengatur suhu atau menggunakan penangas air. Penambahan asam atau basa untuk mengatur pHmedium pada fermentasiFermentasi medium cair dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu fermentasi tertutup, fermentasi kontinyu dan fermentasi fedbatchPada fermentasi tertuutp, setelah inokulasi tidak dilakukan lagi penambahan medium ke dalam fermentor, kecuali pemberian oksigen, antibuih dan asam/basa sebagai pengatur pH. Karena itu, pada fermentasi tertutup ini dengan semakun lamanya waktu fermentasi, laju pertumbuhan spesifik mikroba semakin menurun sampai akhirnya pertumbuhan berhenti. Penurunan dan berhentinya pertumbuhan disebabkan karena dengan semakin bertambahnya waktu fermentasi, nutrient-nutrien esensial dalam edium semakin berkurang atau terjadi akumulasi autotoksin yang mempengaruhi laju pertumbuhan atau kombinasi keduanya. Demikian pada fermentasi tertutup jumlah sel pada fase stasioner merupakan jumlah sel maksiumumDalam fermentsai kontinyu, larutan nutrient steril dalam volume tertentu ditambahkan ke dalam fermentor secara terus menerus dan pada saat bersamaa cairan fermentasi yang mengandung sel dan produk-produk fermentasi dikeluarkan dari fermentor dengan volume yang sam. Penambahan medium baru dengan kecepatan tertentu dapat menghasilkan keadaan steady state yaitu keadaan dimana jumlah sel-sel yang terbentuk sama dengan jumlah sel yang dikeluarkan dari fermnetor.