manipulasi ekspresi gen 2015.pdf

8/16/2019 MANIPULASI EKSPRESI GEN 2015.pdf

1/39

MANIPULASI EKSPRESI GEN

A. ANITA ARTARINI


2/39

PUSTAKA

1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular

Biotechnolo!" Princi#les and A##lications o$

Reco%&inant 'NA, A(M Press, )ashinton '*,hala%an 121+1- and 13+1/

2. Bron TA, 200, Gene *lonin 'NA anal!sis,

Blackell Pu&l. 4$ord, hala%an 2 + 300


3/39

Target Kuliah

• Penunaan 5ektor eks#resi

• (tratei o5er#roduksi 6%ani#ulasi eks#resi en #ada5ektor7

• Pe%ilihan 5ektor

• e% an se nan


4/39

Ekspresi Gen


5/39

ORGANISASI GEN PROKARIOT

promotor

kerangka baca terbuka (openreading frame = ORF) /

coding sequence = CDS

3’

RBS

kodon start kodon stop3’ 5’

5’

operator

situs aktivator

Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi,situs aktivator, operator

Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop


6/39

TRANSKRIPSI


7/39

TRANSLASI


8/39

VEKTOR (Plasmi!

• 89:TR :;NING

NT>: M9N'APAT:AN 'NA 6copy number tini7ko%#onen untuk re#likasi 6harus sesuai denan inan &aru7

• 89:TR 9:(PR9(I

>NT>: M9N'APAT:AN PRT9IN6 ko%#onen untuk transkri#si translasi 6harus sesuai denan inan &aru7,

ta%&ahan ko%#onen untuk %e%#er%udah #roses

?donstrea%@#e%urnian7


9/39

TRANSKRIPSI "AN #IOTEKNOLOGI

• PRMTR 'AN T9RMINATR :>AT

• PRMTR 'AN T9RMINATR 'I:9NA;I ;9< RNA


10/39


11/39

REGULASI EKSPRESI "NA SISIPAN PA"A VEKTOR EKSPRESI

• P9NGG>NAAN PRMTR :>AT

• PRT9IN R9:MBINAN =ANG 'I


12/39

Sistem$Kaset Ekspresi

promotor operator RBS ATG MCS STOP codon terminator

Kaset ekspresi


13/39

Regulasi ekspresi "NA sisipan


14/39

Regulasi ekspresi "NA sisipan


15/39


16/39

VEKTOR (Plasmi!

• 89:TR :;NING

NT>: M9N'APAT:AN 'NA 6copy number tini7ko%#onen untuk re#likasi 6harus sesuai denan inan &aru7

• 89:TR 9:(PR9(I

>NT>: M9N'APAT:AN PRT9IN6 ko%#onen untuk transkri#si translasi 6harus sesuai denan inan &aru7,

ta%&ahan ko%#onen untuk %e%#er%udah #roses

?donstrea%@#e%urnian7


17/39

TU%UAN PROTEIN &USI

Ban!ak tuuan, diantaran!a "

• Me%#er%udah #roses #e%urnian

– 'ireka!asa #ada tinkat 'NA

–


18/39

Kaset ekspresi:Komponen transkripsi:PromotorTerminator

Kaset Ekspresi (&USI PROTEIN untuk pemurnian!

Komponen translasi:Operator (lac O)RBSKodon startKodon stop

6xHis:Untuk mempermudahPemurnian protein

MCS (multiple cloning site ):untuk penyisipan DNA

yang akan diekspresikan


19/39

PROTEIN &USI

Met

His-His-His-His-His-His

Sisi pengenal enterokinase

Protein rekombinan

Protein fusi


20/39

Vekt'r Ekspresi an Pr'tein &usi

(inal #e#tida ;uci$erase


21/39

ENZIM PEMBENTUK IKATANENZIM PEMBENTUK IKATAN

DISULFIDA (PERIPLASMA)DISULFIDA (PERIPLASMA)SUASANA HARUS OKSIDASISUASANA HARUS OKSIDASI


22/39

LOKASI PROTEIN

PROTEIN EKSTRASEL


23/39

ONTO) )ASIL OVERPRO"UKSI "AN PURI&IKASI

1 2 3 4 5 6 7 8

94 kDa

67

43

30

20

1 = PROTEIN MARER ! "AN # = PROTEIN TOTA$ %TI"A "IIN"&SI'()*)+ = PROTEIN TOTA$ %"IIN"&SI IPT,') . = PROTEIN HASI$ PEM&RNIAN


24/39

SEL INANG UNTUK TEKNOLOGI "NA REKOM#INAN

• P9MI;ING PA'A"

– J9NI( 'AN J>M;A< PRT9IN =ANG A:AN 'I:(I

• CA:TR+CA:TR =ANG ( 'IP9R


25/39

Eukari't *s Pr'kari't


26/39

SISTEM EKSPRESI EUKARIOT

(9; INANG =ANG 'APAT 'IG>NA:AN"

• Saccharomyces cerevisiae

• Pichia pastoris

• Baculo5irus+serana

• (el %a%alia


27/39

VEKTOR S)UTTLE + EKSPRESI

• :N(TR>:(I 89:TR 'I E. coli

• 9:(PR9(I G9N 6PR'>:(I PRT9IN7 'I INANG :9+2

• :MPN9N R9P;I:A(I 'I:9NA;I E. coli 'AN INANG :9+2

• . co +

• :MPN9N 9:(PR9(I 'I:9NA;I INANG :9+2

•(I(T9M (9;9:(I 89:TR 6( A'A >NT>: E. coli 'AN

INANG :9+27


28/39

SUII"E VEKTOR + EKSPRESI

• :N(TR>:(I 89:TR 'I E. coli

• 9:(PR9(I G9N 6PR'>:(I PRT9IN7 'I INANG :9+2

• :MPN9N R9P;I:A(I 'I:9NA;I NT>: E. coli 'ANINANG :9+27


29/39

VEKTOR S)UTTLE

• 89:TR =ANG 'APAT R9P;I:A(I 'A;AM '>A INANG

B9RB9'A

• M9MP>N=AI '>A ori


30/39

Pr'seur stanar kl'ning paa ragi

• Menunakan 5ektor shuttle

• :lonin aal dilakukan diEscherichia coli "

– Pen!ia#an 'NA sisi#an dan

– ;iasi dan trans$or%asi – :on$ir%asi ke&enaran klon

• Puri$ikasi #las%id reko%&inan

• Trans$or%asi ke dala% sel rai

• :on$ir%asi ke&enaran klon


31/39

PROSES KLONING PA"A RAGI

KLONING 2 TAHAP:• KLONING PADA E. coli • KLONING PADA RAGI


32/39

SISTEM RAGI

• G;I:(I;A(I

• SACCHAROMCES CERE!"S"AE " 89RG;I:(I;A(I 6D7

• P"CH"A PASTOR"S" P;A G;I:(I;A(I ;9BI< MIRIP P;A PA'A(9; MAMA;IA


33/39

SISTEM PROKARIOT VS EUKARIOT

PR:ARIT• J>M;A< PRT9IN ↑

• M9'I>M (9'9RMB>M :MP;9:(• P9RT>MB>(I• TI'A: MAMP>

M9NG:>RAN PRT9IN ↑• :NCRMA(I PRT9IN

:MP;9:(

• TI'A: :9*9N'9R>NGAN

P9MB9NT>:AN BA'AN IN:;>(I• MAMP> M9NG


34/39

PER#AN"INGAN SI&AT VEKTOR EKSPRESI

PARAMETER PROKARIOT EUKARIOT

MARKA SELEKSI ampR, kanR, tetR leu2 , ura3 , trp1,

NEOR Dihidrofolat

reduktasePROMOTOR lac, trp ; t7 ; nirB Gal; AOX;

β-actin; CMV IE; SV40early

REGULASI EKSPRESI GEN PA"A


35/39

REGULASI EKSPRESI GEN PA"A

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Promotor GALIn/uksi ole0 galaktosa

Represi ole0 glukosa

Upstream activating sequences


36/39

MARKA SELEKSI PA"A RAGI

• Gen resistensi terhada# inhi&itor"

%ethotre4at dan te%&aa

• Gen #enkode &iosintesis asa% a%ino &asanukleotida" 6(9;9:(I A>:(TRP7

– Gen LEU#" %enkode E+iso#ro#il+%alat dehidroenase!an %enkatalisis #eru&ahan asa% #iru5at %enadi leusin

– Gen TRP$" %enkode N+6F+#hos#hori&os!l7+ anthranilateiso%erase, terli&at dala% &iosintesis tri#to$an

– Gen URA%" %enkode orotidin++$is$at dekar&oksilase6enHi% !an %enkatalisis 1 taha# &iosintesis nukleotida#iri%idin7


37/39

SISTEM EKSPRESI Pichia pastoris

• Rai %etilotro#ik

• Pro%otor" AO&" 6diinduksioleh %etanol7

• Marka seleksi" en resistensiterhada# Heocin

37


38/39


39/39

PRO"UK ,ANG "ISETU%UI OLE) &"A

• JAN 1-- N89MB9R 2000"

– 21 33 (I(T9M (9; MAMA;IA

– Tia lini sel %a%alia uta%a 611 dari 217"

• (el *hinese

manipulasi ekspresi gen 2015.pdf

Documents