ligasi

7/23/2019 LIGASI

http://slidepdf.com/reader/full/ligasi 1/8

LIGASI

7/23/2019 LIGASI


• Ligasi merupakan proses menggabungkan sekuens DNAyang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNAgenom sehingga akan terbentuk DNA rekombinan

• Proses ligasi membutuhkan DNA ligase, yaitu

enzim yang dapat mengkatalisis pembentukan ikatanfosfodiester antara uung !"#fosfat dan $"#hidroksil yangdigunakan saat proses ligasi pada DNA yangmengalami pemotongan dengan enzim restriksisebelumnya%

• DNA ligase digunakan untuk menggabungkan fragmenDNA saat proses replikasi, menyambung potongan#potongan DNA yang baru disintesis, serta berperandalam proses reparasi DNA%

7/23/2019 LIGASI


&enis DNA Ligase

'berdasarkan kofaktor(

ATP

• DNA ligase A)P

dependentditemukan dibakteriofage,euba*teria, ar*haea,dan +irus%

• DNA ligase A)P#dependent yangumum adalah )DNA ligase dan )-DNA ligase%

NAD+

• DNA ligase

NAD.dependentditemukanhanya di bakteri%

• Salah satu DNAligase NAD.adalah /%*oliDNA ligase

7/23/2019 LIGASI


/nzim ) DNA Ligase

• /nzim ini berasal dari /%*oli yang telahterinfeksi +irus ) bakteriofage

• /nzim ini menggunakan kofaktor A)P

• /nzim dapat meligasi fragmen DNAyang menggantung, memiliki uungkohesif maupun uung tumpul%

• Pada proses meligasi fragmen DNAyang memiliki uung tumpul, diperlukankonsentrasi enzim yang lebih besar%

7/23/2019 LIGASI


0emungkinan pada prosesligasi

1% +ektor menyambung pada +ektor itu sendiri

2% +ektor menyambung dengan +ektor lain 'teradi ligasi antar +ektor(

$% +ektor menyambung dengan insert

•Agar teradi kemungkinan ke#$, maka ditambahkan antibiotik pada

larutan +ektor 'belum di*ampur dengan insert( untuk menghilangkangugus P pada !"P sehingga menadi !"34 'defosforilasi(% 5akadiasumsikan kemungkinan yang pertama dan kedua berpeluang sedikitkeadiannya%

•Dengan berubahnya !"P menadi !"34, maka yang diharapkan teradi+ektor hanya berikatan dengan insert% $"34 pada +ektor akan

menyambung pada !"P insert, akan tetapi $"34 insert tidak dapatmenyambung ke +ektor karena !"P +ektor telah berubah menadi !"34sehingga teradi *elah atau *elah% 5eskipun teradi *elah, insert dan+ektor tetap berikatan dan dapat ditransformasikan dimana *elah ininanti akan diperbaiki di dalam sel apabila berhasil ditransformasikan%

7/23/2019 LIGASI


5ekanisme )ahap mekanisme DNA ligase 6

1% hidrolisis kofaktor, yaitu NAD. atau A)P% Peristi7a ini

2% menghasilkan enzim#adenylate A5P yang berikatan ko+alen dengan grup8#amino residu lysin 'AAA atau AAG( pada sisi aktif dengan melepaskanpyrofosfat inorganik 'PPi(, ika kofaktor berupa A)P9 atau ni*otinamidemononu*leotide 'N5N(, ika kofaktor berupa NAD.% 0emudian sebagian

$% A5P akan berpindah dari sisi aktif lysin ke uung bebas !"#fosfat yangberada pada *elah utas DNA% Pada akhirnya,

% ikatan fosfodiester akan terbentuk antara uung $"#34 yang berada diuung *elah dengan !"#fosfat dan melepaskan A5P%

•. 5enyambungkan utas#utas DNA hasil pemotongan enzim restriksi harussaling komplemen agar dapat menempel dengan baik% :ung overhang

pada utas sense akan berpasangan dengan uung overhang utas antisense%Setelah itu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester sehinggakedua utas kini sudah menadi satu dengan ikatan yang sangat kuat%5ekanisme ini *enderung lebih mudah karena kedua uung o+erhang dapatmenempel lebih dulu karena memiliki sekuen yang saling komplemen%

•. 5enyambungkan utas#utas DNA yang memiliki uung blunt hasil

pemotongan enzim restriksi DNA lebih sulit untuk diligasi dengan enzimDNA Ligase karena tidak ada uung overhang yang membantu kedua utas

7/23/2019 LIGASI


ligasi

Documents