i

Lembar Pengesahan

OPTIMASI METODE PURIFIKASI DARI EKSTRAK DAUN SIRIH

HIJAU (Piper betle Linn) YANG MEMILIKI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

TERHADAP BAKTERI Propionibacterium Acnes

Skripsi

Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm) di

Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Udayana

Oleh

Wayan Agus Wijaya

NIM. 1308505026

Menyetujui:

Pembimbing I Pembimbing II

N. L. P Vidya Paramita, S.Farm., M.Sc., Apt. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M. Si., Apt.

NIP. 198401032008122004 NIP. 198302132006042002

Mengesahkan:

Ketua Jurusan Farmasi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Si., Apt.

NIP. 19830213200604200

ii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, karena

atas berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Optimasi Metode Purifikasi Dari Ekstrak Daun Sirih Hijau (Piper betle

Linn) Yang Memiliki Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri

Propionibacterium acnes” tepat pada waktunya.

Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, saran dan bimbingan

dari berbagai pihak. Maka dari itu, pada kesempatan ini penulis ingin

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

2. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

3. N. L. P. Vidya Paramita, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing I

yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat,

bimbingan dan saran dengan sabar selama penulis mengikuti pendidikan di

Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini.

4. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing II

yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat,

bimbingan dan saran selama penulis mengikuti pendidikan di Jurusan

Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini.

iii

5. Seluruh dosen dan staf pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas MIPA

Universitas Udayana yang telah memberikan bantuan kepada penulis

selama penyusunan skripsi ini.

6. Orang tua kandung yang sangat saya cintai dan hormati, Mamin shen dan

Ida Ayu Rintis yang telah mengasuh dan membesarkan penulis,

membimbing dan memberi motivasi dalam penyusunan skripsi ini.

7. Adik kandung saya, Nyoman Kanda Satyawan yang selalu memberi

motivasi dan dukungan.

8. Sahabat terkasih saya, Nita Pratiwi yang selalu memberi semangat dan

motivasi dalam pengerjaan skripsi ini.

9. Seluruh rekan mahasiswa Jurusan Farmasi angkatan 2013 Tredecim

Paracelcius khususnya teman teman Bebangkaan 13 Angga, Cok arys,

Arya wiraguna, Gungde, Lova, Rio, Prima, Krisna, Wisnu, Rama, wijaya,

Wisesa dan Wiracana.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.

Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat

membangun sehingga di masa yang akan datang dapat menjadi lebih baik. Penulis

berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang

memerlukan.

Bukit Jimbaran, juli 2017

Penulis

iv

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. ii

KATA PENGANTAR ..................................................................................... iii

DAFTAR ISI .................................................................................................... v

DAFTAR TABEL ............................................................................................ ix

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... x

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xi

DAFTAR ISTILAH ......................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xiv

ABSTRAK ....................................................................................................... xv

BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................... 1

1.1 Latar Belakang.................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .............................................................. 4

1.3 Tujuan ................................................................................. 4

1.4 Manfaat ............................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5

2.1. Sirih Hijau (Piper betle L.) ....................................................... 5

2.1.1. Klasifikasi ..................................................................... 5

2.1.2. Deskripsi ....................................................................... 5

2.1.3. Kandungan Kimia ......................................................... 7

v

2.1.4. Bioaktivitas Daun Sirih Hijau ....................................... 7

2.2. Ekstrak ...................................................................................... 8

2.2.1. Definisi Ekstrak ............................................................. 8

2.2.2. Metode Ekstraksi ........................................................... 8

2.2.3. Purifikasi ........................................................................ 10

2.3. Acne Vulgaris ........................................................................... 11

2.4. Propionibacterium acnes .......................................................... 12

2.5. Minyak Atsiri ............................................................................ 13

2.6. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Disk ............ 14

BAB III. METODE PENELITIAN ................................................................ 16

3.1. Rancangan Penelitian ............................................................... 16

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian................................................... 16

3.3. Objek Penelitian ....................................................................... 16

3.4. Bahan Penelitian ....................................................................... 17

3.4.1. Bahan Ekstraksi dan Purifikasi ....................................... 17

3.4.2. Bahan Uji Skrining Fitokimia ........................................ 17

3.4.3. Bahan Uji Antibakteri ..................................................... 17

3.5. Alat Penelitian ......................................................................... 18

3.6. Batasan Operasional Penelitian ............................................... 18

3.7. Variabel Penelitian .................................................................. 19

3.7.1. Variabel Bebas ............................................................. 19

3.7.2. Variabel Terikat ............................................................ 19

vi

3.7.3. Variabel Terkontrol ...................................................... 19

3.8. Prosedur Penelitian ................................................................... 19

3.8.1. Determinasi Tumbuhan ................................................ 19

3.8.2. Pengambilan dan Preparasi Sampel .............................. 20

3.8.3. Pembuatan Ekstrak dan Purifikasi Ekstrak Sirih Hijau 20

3.8.4. Penetapan Kadari Air Dengan Destilasi Toulena ......... 22

3.8.5. Uji Skrining Fitokimia dengan KLT............................. 22

3.8.6. Uji Aktivitas Fraksi uji dengan Metode Difusi Disk ... 24

3.9. Uji KLT Bioautografi kontak ................................................... 25

3.10. Analisis Data .......................................................................... 26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 28

4.1. Determinasi Tanaman ............................................................... 28

4.2. Preparasi Sampel ..................................................................... 28

4.3. Penetapan Kadar Air Dengan Destilasi .................................... 30

4.4. Pembuatan Ekstrak dan Purifikasi Ekstrak Etanol Daun Sirih

Hijau (Piper betle L.). .............................................................. 31

4.5. Uji Konfirmasi Bakteri ............................................................. 33

4.6. Skrining Fitokimia Dengan KLT .............................................. 35

4.7. Uji Aktivitas Antibakteri .......................................................... 44

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 51

5.1. Kesimpulan ............................................................................... 51

5.2. Saran ......................................................................................... 51

vii

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 53

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Klasifikasi daya hambat pertumbuhan bakteri .............................. 15

Tabel 3.1. Jenis pereaksi pendeteksi dan hasil positif setelah dideteksi ........ 23

Tabel 3.2. Sampel, konsentrasi dan jenis bakteri uji aktivitas antibakteri ..... 25

Tabel 3.3. Klasifikasi zona hambatan ............................................................ 26

Tabel 4.1. Hasil Uji Konfirmasi isolat bakteri P. acnes ................................. 34

Tabel 4.2. Hasil identifikasi FH dan FEA I dengan pereaksi pendeteksi

dan perbandingan dengan pustaka................................................ 36

Tabel 4.3. Hasil identifikasi FK, FEA II, FD dan FEA III dengan

pereaksi pendeteksi dan perbandingan dengan pustaka................ 40

Tabel 4.4. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ............................................. 45

ix

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Tanaman sirih (Piper betle L.) .................................................... 5

Gambar 4.1. Hasil Skrining KLT FH dan FEA I ............................................. 35

Gambar 4.2. Hasil Skrining KLT FK, FEA II, FD dan FEA III ...................... 39

Gambar 4.3. Hasil uji KLT bioautografi FH dan FD ..................................... 50

x

DAFTAR SINGKATAN

ANOVA : Analysis of variance

CFU : Colony Forming Unit

KLT : Kromatografi Lapis Tipis

LSD : Least Significant Differences

MHA : Mueller Hinton Agar

CLSI : Clinical and Laboratory Standart Institute

UV : Ultra Violet

xii

DAFTAR ISTILAH

Inokulasi : Kegiatan pemindahan mikroorganisme dari

sumber asalnya ke media baru dengan

ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis.

Intermediate : Merupakan kategori yang menjelaskan

bahwa isolat sebagai agen antimikroba pada

konsentrasi hambat minimal yang mendekati

darah dan tingkat jaringan dimana dari rata

rata respon dari isolat memiliki daya hambat

lebih kecil dibandingkan dengan kategori

susceptible.

Like dissolve like : Prinsip kelarutan dimana suatu zat cenderung

akan terlarut pada pelarut yang memiliki

kepolaran yang sama.

Resistant : Merupakan kategori yang menyatakan bahwa

isolat mikroorganisme tidak dapat dihambat

oleh agen antibakteri dengan konsentrasi

tertentu.

Sebum : Zat berminyak terdiri dari lemak, keratin,

dan bahan selular yang diproduksi oleh

kelenjar sebasea kulit.

xiii

Streak for single colony : Metode untuk memisahkan mikroorganisme

menjadi koloni tunggal dengan cara

menggoreskan isolat pada media agar.

Susceptible : Merupakan kategori yang menyatakan bahwa

isolat mikroorganisme dapat dihambat oleh

agen antibakteri dengan konsentrasi tertentu

secara maksimal.

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran.1. Komposisi larutan ....................................................................... 60

Lampiran.2. Perhitungan Pembuatan Fase Gerak ........................................... 61

Lampiran.3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Hijau ..................................... 62

Lampiran.4. Uji Konfirmasi Bakteri P. acnes ................................................. 64

Lampiran.5. Hasil Pengamatan KLT .............................................................. 66

Lampiran.6. Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (Media MHA) ............ 71

Lampiran.7. Tabel Hasil Penetapan Kadar Air ............................................... 72

Lampiran.8. Hasil uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi ................... 73

xv

ABSTRAK

Propionibacterium acnes merupakan bakteri utama penyebab jerawat,

dimana dilaporkan dalam suatu penelitian bahwa persentase ditemukannya bakteri

P. acnes pada lesi jerawat sebesar 78,8%. Daun sirih hijau telah banyak

dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antibakteri Kemampuan antibakteri daun

sirih hijau disebabkan karena adanya senyawa golongan fenol yang terdiri dari

kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol, eugenol, carvacrol dan golongan

senyawa seskuiterpen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode optimum

yang menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri P. acnes dari ke-enam

fraksi uji yaitu FH, FEA I, FEA II, FEA III, FK dan FD.

Metode purifikasi yang digunakan untuk mendapatkan ke-6 fraksi tersebut

adalah LLE dengan penggunaan pelarut polar etanol-air yang tidak bercampur

dengan pelarut heksan, kloroform dan dietileter. Ke-6 fraksi uji tersebut

selanjutnya di uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi disk dan dilanjutkan

dengan metode tambahan yaitu KLT bioautografi kontak. Analisis data secara

dilakukan secara deskriptif terhadap nilai diameter zona hambat dengan

mengkategorikannya berdasarkan CLSI dan terhadap hasil skrining fitokimia

serta KLT-Bioautografi. Analisis statistik dilakukan terhadap data diameter zona

hambat menggunakan ANOVA-one way.

Hasil penelitian ini diperoleh hanya dua fraksi yaitu fraksi n-heksan dan

fraksi dietileter yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri bakteri P. acnes

dengan nilai diameter zona hambat sebesar 8 mm dan 9 mm. Metode purifikasi

ekstrak daun sirih hijau yaitu gabungan metode maserasi dan LLE yang

dilakukan belum optimal dilihat dari ke-6 fraksi yaitu fraksi etanol-air (FEA I),

fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi kloroform, fraksi

dietil eter dan fraksi n-heksan yang belum mampu menghambat pertumbuhan

bakteri P. acnes dimana ke-6 fraksi tersebut termasuk dalam kategori resistant.

Kata Kunci: sirih hijau, optimasi metode, difusi disk, Propionibacterium acnes.

xvi

ABSTRACT

Propionibacterium acnes is the main cause of acne bacteria, which is

reported in a study that the percentage of P. acnes bacteria found in acne lesions

was 78.8% (Sylvia, 2010). Green betel leaf has been reported to have antibacterial

activity. The antibacterial ability of green betel leaves is caused by the phenol

group compound consisting of kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol,

eugenol, carvacrol and sesquiterpen compound class. The aim of this research is

to find out the optimum method that produces antibacterial activity against P.

acnes bacteria from six test fractions ie FH, FEA I, FEA II, FEA III, FK and FD.

The purification method used to obtain the six fractions is LLE with the

use of water-soluble ethanol solvent with hexane, chloroform and diethylether

solvents. The six fractions of the test are then tested for antibacterial activity by

the disk diffusion method and followed by additional method of contact TLC

bioautography. The data analysis was done descriptively to the value of drag zone

diameter by categorizing it based on CLSI and on the results of the phytochemical

scores and TLC-Bioautography. Statistical analysis was performed on the drag

zone diameter data using ANOVA-one way.

The results of this study obtained only two fractions of the fraction of n-

hexane and diethylether fraction capable of inhibiting the growth of bacterial

bacteria P. acnes with the value of inhibit zone diameter of 8 mm and 9 mm. The

purification method of green betel leaf extract that is combination of maseration

and LLE method is not optimal yet from 6 fractions ie ethanol-water fraction

(FEA I), ethanol-water fraction (FEA II), ethanol-water fraction (FEA III)

Chloroform fraction, diethyl ether fraction and n-hexane fraction that have not

been able to inhibit the growth of P. acnes bacteria where the 6 factions are

included in the resistant category.

Key word: Piper betle, optimization methods,disk diffusion, Propionibacterium

acnes.

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Propionibacterium acnes merupakan bakteri utama penyebab jerawat,

dimana dilaporkan dalam suatu penelitian bahwa persentase ditemukannya bakteri

P. acnes pada lesi jerawat sebesar 78,8% (Sylvia, 2010). Daun sirih hijau telah

banyak dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Berdasarkan penelitian

Putri (2010), ekstrak etanol daun sirih hijau memiliki aktivitas antibakteri

terhadap bakteri P. acnes dengan nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) sebesar

0,25%. Menurut Kursia et al., (2016) bahwa pada konsentrasi 5% ekstrak

etilasetat daun sirih hijau menghasilkan daya hambat 15 mm terhadap bakteri

Staphylococcus Epidermidis yang merupakan salah satu bakteri penyebab jerawat.

Salah satu komponen penting dalam daun sirih hijau adalah minyak atsiri.

Kemampuan antibakteri daun sirih hijau disebabkan karena adanya senyawa

golongan fenol yang terdiri dari kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol,

eugenol, carvacrol dan golongan senyawa seskuiterpen. Senyawa fenol dengan

inti katekol dalam daun sirih (Piper betle L.) adalah allylpyrocatechol dan

hydroxychavicol. (Moeljanto dan Mulyon, 2003). Hasil uji bioautografi ekstrak

terpurifikasi daun sirih hijau dengan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan

fase gerak n-heksan: etilasetat (7,2: 2,8) v/v diperoleh satu spot dengan nilai Rf

3.7 dimana dari nilai Rf 3.7 itu diketahui senyawa aktif yang berperan sebagai

2

antibakteri terhadap P. acnes yaitu golongan senyawa fenol dan terpenoid

(Paramita et al., 2016). Berdasarkan penelitian Jesonbabu et al., (2011), dikatakan

bahwa hydroxychavicol berperan sebagai antibakteri. Hydroxychavicol mampu

menghambat pertumbuhan bakteri dengan MIC 200 μg/mL untuk Staphylococcus

aureus dan Staphylococcus pyogenes dan 400 μg/ml untuk E. coli, Salmonella

typhi dan Shigella dysentriea (Jesonbabu et al., 2011).

Metode yang digunakan untuk memperoleh ekstrak terpurifikasi sirih hijau

adalah gabungan metode maserasi dan Liquid-liquid extraction. Proses maserasi

dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 96% hingga diperoleh ekstrak

kasar dan dilakukan partisi menggunakan dua macam pelarut yaitu n-heksan dan

akuades (1:2) v/v sehingga diperoleh fraksi heksan dan fraksi etanol-air. Fraksi

etanol-air yang dihasilkan termasuk dalam katagori intermediate (Budiningrum,

2016). Kekurangan dari metode ini adalah pengunaan pelarut yang kurang tepat

dimana polaritas antara pelarut dengan senyawa aktif berbeda sehingga tidak

dapat menarik senyawa aktif yang mempunyai aktivitas antibakteri. Untuk

mendapatkan fraksi dengan kategori suspectible, perlu dilakukan optimasi metode

fraksinasi.

Hasil uji bioautografi minyak atsiri daun sirih hijau (Piper betle L.)

menggunakan fase diam silika Gel GF254 dan fase gerak toluen: etilasetat (93: 7)

v/v menunjukan adanya dua spot yaitu hRf 62 dan hRf 48 yang mengandung

golongan senyawa fenol dan terpenoid (Wintari, 2016) dimana setelah dilakukan

identifikasi dengan GC-MS dan KLT Densitometer didapatkan bahwa senyawa

3

fenol yang aktif sebagai antibakteri terhadap bakteri P. acnes adalah eugenol dan

kavikol (Wirasuta dan Paramita, 2016).

Pada penelitian ini metode purifikasi dilakukan menggunakan pelarut yang

sesuai dengan polaritas dari senyawa aktif, dimana pelarut yang digunakan adalah

kloroform dan dietileter. Menurut Samy and Gopalakrishnakon (2008)

penggunaan pelarut kloroform saat dilakukannya proses ekstraksi dapat

melarutkan golongan senyawa terpenoid, falvonoid dan steroid sedangkan

penggunaan pelarut dietileter dapat melarutkan golongan senyawa alkaloid dan

terpenoid. Jadi pada penelitian ini dilakukan optimasi metode fraksinasi dengan

maserasi serbuk daun sirih hijau menggunakan etanol 96% dan LLE dengan n-

heksan: air (1:1) v/v hingga diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etanol air. Fraksi

etanol air selanjutnya di LLE dengan masing masing pelarut kloroform dan

dietileter. Fraksi n-heksan (FH), fraksi etanol-air (FEA I), fraksi etanol-air (FEA

II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi klorofrom (FK) dan fraksi dietileter (FD)

diuji aktivitas antibakteri untuk mengetahui metode optimumnya. Metode

optimum adalah metode yang menghasilkan aktivitas antibakteri suspectible.

Kelebihan metode ini dibandingkan dengan metode sebelumnya adalah

penggunaan pelarut yang sesuai dengan polaritas dari senyawa aktif yang

mempunyai aktivitas antibakteri.

4

1.2 Rumusan masalah

Bagaimana metode purifikasi ekstrak daun sirih hijau yang optimum

ditunjukan dengan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam katagori suspectible?

1.3 Tujuan

Mengetahui metode optimum saat dilakukannya proses LLE yang

ditunjukan dengan diameter zona hambat yang besar dari fraksi n-heksan (FH),

fraksi etanol-air (FEA I), fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III),

fraksi klorofrom (FK) dan fraksi dietileter (FD) dengan menggunakan metode

difusi disk sehingga menghasilkan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam

kategori suspectible.

1.4 Manfaat

Melalui penelitian ini akan diperoleh informasi mengenai aktitas

antibakteri yang dihasilkan dari fraksi n-heksan (FH), fraksi etanol-air (FEA I),

fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi klorofrom (FK) dan

fraksi dietileter (FD) dengan menggunakan metode difusi disk sehingga

menghasilkan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam katagori suspectible.