KAJIAN AWAL TINGKAT TOKSISITAS AKUT PROTEIN ISOLAT TEPUNG TEMPE YANG TELAH MENGALAMI

PROSES PENCUCIAN MENGGUNAKAN n-h~ksan

Disusun oleh:

A. Prima Kristijarti

Y.l.P. Arry Miryanti

lgn. Suharto

LEMBAGA PENELITIAN UNIVERSITAS KATOLIK PARAHYANGAN

BANDUNG 1999 - 2000

KATA PENGANTAR

Laporan penelitian ini ditujukan sebagai kajian awal untuk mengetahui

tingkat toksisitas akut dari protein isolat tepung tempe yang telah mengalami

banyak sekali perlakuan selama pembuatannya. Diantaranya dengan

pencucian mengunakan larutan n-heksan. N-heksan sendiri merupakan zat

kimia yang beracun dan mudah terbakar.

Penulis berharap dengan penelitian ini dapat memberi masukkan

bahwa protein isolat tepung tempe ini tidak berbahaya.

Terimakasih ingin penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Koesdarminta

atas segala saran dan nasihatnya, Bapak Suwarno dan Bapak Muchtar atas

segala bantuannya serta seluruh pihak yang telah membantu hingga dapat

terselesaikannya penelitian dan laporan ini.

Penulis

INTI SARI

Tujuan penelitian ini adalah untuk membuat protein isolat tepung tempe serta melihat toksisitas akutnya. Sehingga dapat diketahui reaksinya terhadap hewan uji (tikus).

Metoda yang digunakan untuk pembuatan protein isolat dengan cara ekstraksi minyak dari tepung tempe dengan n-heksan, pelarutan protein dengan NaOH 0,05 M dan pengendapan protein dengan HCI 0, 1 M dan pengeringan. Sehingga diperoleh protein isolat dengan kadar 84,06%. Kemudian protein isolat ini diujikan kepada hewan uji (tikus jenis wistar), dengan mengalami proses pengenceran sampai 8,406% dan diberikan dengan dosis 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml dan 2 ml. Hewan uji diamati 4 jam pertama dan dilihat tingkat kematiannya selama 14 hari.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan uji toksisitas akut, tidak ada hewan uji yang mati untuk dosis protein isolat yang diberikan. Kenaikkan berat badan rata-rata hewan uji dalam 14 hari sekitar 5 - 10 % dari pada hewan kontrol.

11

DAFTAR ISi

KATA PENGANTAR .. ....... ...... ..... ..... ....................... ...... .. ... ....... ... i INTISARI ............... .... .... .... .. ... . .. .............. .. ... .... .. .......... ..... : ... ... .. Ii DAFT AR ISi ...... ....... ..... ... ......... .. ..... ... ............. ................ ... ......... iii DAFTAR TABEL ...... .. ... ........ ..... .... .. ... .................... .. ....... ... ..... .... . v DAFTAR GRAFIK ... ... ...... ....... .. ... ... ... .. ... . ······- ···· ················ .. ........ vi DAFTAR GAMBAR. .... ... ............. .. .... . .. ..... ... .......... ......... .......... ..... vii

BABI PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ........................ ........ ... .... .. .. .. ... ................... .. 1.2. Terna Sentral Masalah Penelitian ................ ......... ............ ...... .. 2 1.3. ldentifikasi Masalah Penelitian ..... ... ...... . ........................... .. ..... 2 1.4. Hipotesls .................................. .. .... ...... ... .. ... ..... . ... .. ............ 2 1.5. Tujuan Penelitian ..................... ... ... .... ... ........ ...... ................. . 2 1.6. Manfaat Penelitian ................... ...... .... ... .. ...... ......................... 2 1.7. Lokasi Penelitian ...................... ....... .. ...... ........................ .... .. 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tempe ...................................... ............ ........ .. ............... .. .... .. 4 2.2. Protein ....................................... ...... .. ...................... ........ ...... 4 2.3. Protein lsolat dari Tepung Tempe ..... ......... ..... .... ... .. .................... 5 2.4. Pembuatan Protein I sol at .............. .. .... .. .. . ... ... .. ..... .... .... ........... .. 6 2.5. Toksikologi ................................ ......... .. ...... .... . .................. ...... 8 2.6. Uji Toksisitas Akut.. .... .............. ............ .. ................................ .. . 9 2.6.1. Pemilihan Species Hewan ....... ... ...... .. ...... ..... . ..... ........ ............ 10 2.6.2. Dosis dan Jumlah Hewan ........... .............. .... ........... .. ........ ... .. . 10 2.6.3. Kondisi Lingkungan .................. .... .................. ................ ... ..... 11 2.6.4. Nilai LO 50 .............................. ............. .... ........ ..... ... .. .. ... .... .. 11

BAB Ill MF.TODE PENELITIAN 3.1. Bahan dan Alat. .............................................. .. ........... ........ .... 13 3.1.1. Bahan Baku .......... .. ... .......... .. ....... ... ........ ... ......................... 13 3.1.2. Alat. ................................... .... .. ................ ........................... 13 3.2. Metode Penelitian ................................................ .................... 13 3.2.1. Pembuatan Bahan Protein lsolat Tepung Tempe ... .. .................... 14 3.2.1.1. Pembuatan Tepung Tempe Rendah Lemak ..... ....................... .. 14 3.2.1.2. Pembuatan Protein lsolat. ........................... .................. ....... . 14 3.2.2. Pembuatan Sediaan Uji. ................................ .. . .. ................. .... 14 3.2.3. Penyiapan Hewan Uji ............. ... ..... .. .. .... .. .............. ................. 15 3.2.4. Cara Pemberian ................... .. .. ........ ..... ..... ... .............. .. ......... 15

11 I

BAB IV HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN 4.1. Tepung Tempe Rendah Lemak............ ..... .... .. .. . .. .. .. .... ... .. .. ... ... 17 4.2. Protein lsolat Tepung Tempe........ ...... ............. ... ...................... 17 4.3. Uji Toksisitas Akut ................... .. ......... ........................... ........ .. 18

BABV KESIMPULAN ......... ... .................. .................. ... ..................... ..... .. 23

DAFTAR PUSTAKA ....... ............ .. .. .... ................... ............... 24

Lampiran ............. ........... ... .... .. .. ................ .. ..................... ..... 2s

IV

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Klasifikasi Toksisitas ....... .......... ...... ............. ...... ........ ... .. ... 11

Tabel 4.1. Tanda Toksik Pad a Tikus Jantan .... .... ........ .............. .. ... .. ... .. 19

Tabel 4.2. Tanda Toksik Pada Tikus Betina .......... .. .. .. .. .. .......... .... .. ...... 20

v

DAFTAR GRAFIK

Grafik 4.1. Kenaikan berat badan tikus putih jantan ..... ........ ........ .. .. ..... . 21

Grafik 4.2. Kenaikan berat badan tikus putih betina .. . .......... ...... : .... .. .. ... 22

VI

DAFTAR GAMBAR

Garn bar 2.1. Rum us Bangun Protein ...... .. ...................... .... ........... .. .... ... 5

Gambar 3.1. Kondisi hewan uji dalam kandang." ........ .................... ......... 15

Gambar 3.2. Penimbangan hewan uji ......... ..................................... .... . 16

Garn bar 3.3. Pemberian sampel pada hewan uji ........ .... ........ ....... ........ .. 16

Vll

SABI

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Protein adalah salah satu bahan pembangun tubuh yang penting guna

pertumbuhan dan perkemb-~mgan sel. Dalam Sudarmadji, et . al. (1975)

dikatakan bahwa kebutuhan atau target konsumsi protein adalah sekitar 1

gram protein per kg berat badan per hari.

Salah satu kandungan protein yang cukup tinggi di Indonesia dapat

diperoleh dari tempe yang berbahan dasar kacang kedelai. Tempe

mengandung banyak sekali protein dan lemak selain karbohidrat dan

bahan-bahan mineral. Protein yang ada di dalam tempepun baik mutunya

karena mengandung asam-asam amino esensial, yaitu asam amino yang

sangat dibutuhkan oleh tubuh untuk pertumbuhan sel.

Menurut Sukendro (1977) protein konsentrat didefinisikan sebagai

bahan dengan kadar protein sekitar 70% atau lebih sedangkan pada

kadar protein sekitar 90% didefinisikan sebagai isolat protein . Berbagai

zat kimia organik dapat digunakan sebagai pelarut, dalam proses

pembuatan protein isolat tepung tempe menggunakan pelarut n-heksan

untuk melarutkan lemak yang terkandung didalamnya.

Tingkat toksisitas akut dari isolat protein tepung tempe yang kami

hasilkan perlu diketahui, guna melihat sejauh mana tingkat keamanan

bahan tersebut bila diberikan pada hewan percobaan mengingat proses

pembuatannya menggunakan bahan pelarut organik yang sifatnya

beracun.

l

1.2. Terna Sentral Masai ah Penelitian

Ketidakjelasan dan ketidakpastian tingkat toksisitas akut dari isolat

protein tepung tempe yang telah mengalami proses pencucian menggunakan

n-heksan dalam proses pembuatannya.

1.3. ldentifikasl Masalah Penelitian

Mengetahui sejauh mana toksisitas akut dari isolat protein tepung

tempe yang dihasilkan.

Mengetahui sejauh mana kenaikan berat badan yang terjadi setelah

pemberian isolat protein tepung tempe.

1.4.Hipotesis

lsolat protein tepung tempe yang telah mengalami proses pencucian

dengan menggunakan n-heksan aman diberikan dan berpengaruh pada

kenaikan berat badan hewan uji mencit putih.

1.5. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah melihat tingkat toksisitas akut dari isolat

protein tepung tempe yang telah mengalami proses pencucian dengan

menggunakan n-heksan.

1.6. Manfaat Penelitlan

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk mengetahui keamanan isolat

protein tepung tempe sehingga dapat diharapkan dapat dikonsumsi oleh

manusia.

2

1.7.Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,Fakultas Teknologi

lndustri, UNPAR dan Farmasi ITB.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tempe

Tempe merupakan salah satu makanan hasil proses fermentasi oleh

kapang Rhizopus Oligosporus dan Rhizopus oryzae dengan substrat kacang

kedelai. Enzim-enzim yang dihasilkan oleh kapang tersebut akan

menguraikan protein, lipida dan amilum dari substrat sehingga menjadi bentuk

yang lebih sederhana yaitu asam amino esensial.

Miselium Rhizopus oryzae lebih panjang daripada Rhizopus

Oligosporus sehingga tempe yang dihasilkan lebih padat dan kompak. Bila

dilihat dari nilai gizinya Rhizopus O/igosporus memegang peranan penting

karena selama fermentasi kapang ini mensintesis lebih banyak enzim

protease, sedangkan Rhizopus oryzae mensintesis lebih banyak enzim

amilase.

2.2. Protein

Protein adalah suatu senyawa organik yang terdiri unsur-unsur

C,H,O,N, S dan kadang-kadang P. Tiap molekul protein terdiri dari ratusan

sampai ribuan asam amino yang saling berikatan dengan ikatan peptida.

lkatan ini dapat lepas karena pengaruh panas, reaksi dengan asam atau

basa, atau karena kerja suatu enzim.

4

H H I I

- N - C - C -N - C - C -

I I II I I II H R1 0 H Rz 0

Gambar 2.1. Rumus Bangun Protein

Asam amino mempunyai gugus amino (-NH2) yang bersifat basa dan

karboksil (-COOH) yang bersifat asam, sehingga asam amino dapat bereaksi

dengan asam, basa dan pereaksi-pereaksi lainnya. Gugus asam amino yang

terdapat pada asam amino dapat bereaksi dengan gugus karboksil dari asam

amino lainnya dengan mengeluarkan satu molekul H20 dan membentuk

ikatan peptida (-CO-NH-). (Page, 1989).

2.3. Protein lsolat dari Tepung Tempe

lsolat merupakan suatu bentuk yang paling murni dari protein tepung

tempe. Protein isolat mempunyai kadar protein sekitar 90% (Sukendro, 1977).

Dalam proses pembuatannya, berada satu tingkat diatas pembuatan

konsentrat protein.

Selama proses pembuatannya, protein isolat mengalami banyak sekali

perlakuan diantaranya pemisahan polisakarida yang larut di dalam air, gula

dan kornponen minor lainnya. Hasil dari pemisahan ini kemudian diekstrak

dengan basa encer (pH 7-9) pada suhu sekitar 50 - 55°C. Kemudian

disentrifuga, ekstrak yang dihasilkan ini akan mengandung protein terlarut.

Nilai pH diatur sekitar 4,5 dimana kondisi ini merupakan titik isoelektrik

protein kedelai dan merupakan pH dengan kelarutan yang paling minimum

dan mengakibatkan protein akan mengendap. Kemudian disentrifuga kembali,

endapan yang diperoleh dicuci kembali untuk memisahkan senyawa yang

5

dapat larut. Setelah itu dipekatkan agar menjadi 15 - 30% padatan dan

dikeringkan untuk mendapatkan bentuk protein isoelektrik yang mempunyai

sifat yang tidak larut di dalam air. Kadangkala mengalami proses pencucian

kembali dan kadar pHnya dinetralkan, setelah itu dikeringkan dengan

pengering semprot. (Karnas dan Harris, 1989).

Dengan banyaknya perlakuan dan menggunakan bermacam-macam

zat kimia maka dalam penelitian ini dilakukan uji toksisitas (terutama toksisitas

akut) untuk mengetahui apakah isolat protein tepung tempe ini bersifat toksin

atau tidak.

2.4. Pembuatan Protein lsolat

Protein isolat tepung tempe dalam proses pembuatannya mengalami

beberapa tahap, yaitu :

1. Tahap ekstraksi minyak

Tepung tempe diekstrak kandungan minyaknya dengan n-heksan agar

diperoleh tepung rendah lemak. Pengambilan minyak dari tepung

tempe dapat dilakukan dengan cara tekan (press) dan ekstraksi.

Deng an cara press dapat dihasilkan 10% minyak, sedangkan dengan

cara ekstraksi dapat dihasilkan 18 - 22% minyak .Proses ekstraksi

minyak dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut-pelarut organik

seperti n-heksan, eter, benzene, alkohol dan aseton. Pelarut yang

paling baik digunakan pada proses ekstraksi lemak adalah n-heksan

dengan perbandingan F:S = 1 :3 (kg/L) [Sudarmajdi, 1975; Harris dan

Karmas, 1989]. Setelah proses ekstraksi selesai, bagian minyak ampas

tepung dikeringkan pada udara terbuka selama 1 hari.

6

2. Tahap pemisahan protein

Tahap pemisahan protein terdiri dari empat tahap, yaitu:

a. Tahap pelarutan protein

Pada tahap ini protein dilarutkan dalam suasana basa dengan

menggunakan NaOH 0, 1 N [Suhadijono, 1978]. Pelarutan

protein akan efektif bila dilakukan diatas titik isoelektriknya yaitu

dalam suasana basa pH 7 - 8,5 [Sudarmadji, 1975], 7 - 9

[Harris & Karnas, 1989]. Pelarutan protein dengan NaOH efektif

pada suhu 60°C selama 2 jam [Sukendro, 1977]. Larutan protein

dan residu padatannya dipisahkan dengan ultrasentrifuga

berkecepatan 10000 rpm [Suhadijono, 1978].

b. Tahap pengendapan protein

Kandungan protein tepung tempe sebagian besar berupa

globulin yang tidak dapat larut pada titik isoelektriknya.

Kelarutan minimum protein tepung tempe pada titik

isoelektriknya yaitu pH 4,5 [Sudarmadji, 1975], pH 3,5 - 5,5

[Suhadijono, 1978], dan protein akan mengendap.

Pengendapan dapat dilakukan juga dengan menggunakan HCI

0, 1 N pada suhu 60°C selama 40 menit [Suhadijono, 1978].

c. Tahaµ pencucian

Pada tahap ini diharapkan sisa asam dan bahan kimia lain

dihilangkan dan dilakukan dengan menggunkan air suling.

d. Tahap netralisasi

Pada netralisasi ini digunakan larutan NaOH agar diperoleh

isolat protein dengan pH netral.

7

3. Tahap pengeringan

Proses pengeringan dilakukan dengan suhu sekitar 45°C selama 60

menit. Hal ini dilakukan agar protein yang diperoleh tidak rusak karena

pan as.

2.5. Toksikologi

Toksikologi adalah suatu kajian mengenai hakikat dan mekanisme efek

toksik berbagai bahan terhadap mahluk hidup dan sistem biologik .

Toksisitas konvensional dengan menggunakan hewan uji dapat

mengungkapkan beberapa efek akibat pemberian sampel (toksikan) dengan

berbagai dosis dalam jangka waktu pengamatan. Dalam uji toksisitas ini pula

dapat melihat efek pada organ tubuh tertentu misalnya organ ginjal, sistem

metabolisme tubuh dan toksisitas khusus misalnya karsinogenesitas dengan

penelitian lebih lanjut.

Dari uji toksisitas yang ada, dibagi dalam :

a. Uji Toksisitas Akut

Pemberian zat kimia uji dilakukan satu kali atau beberapa kali dalam

kurun waktu 24 jam. Sehingga dapat diketahui berapa dosis yang

sebaiknya digunakan untuk pengujian yang lebih lama.( WHO, 1978),

(Lu,FC, 1995).

b. Uji Toksisitas Jangka Pendek (Subkronik atau subakut)

Pemberian zat kimia uji dilakukan secara berulang-ulang. Pada

umumnya setiap hari atau lima kali dalam seminggu, selama kurang

lebih 10% dari jangka waktu hid up dari hewan uji. Biasanya tiga bulan

untuk tikus dan satu atau dua tahun untuk anjing. Pengujian ini juga

untuk memperoleh sifat mengenai efek kualitatif dan kuantitatif zat

8

kimia yang mungkin tidak terdeteksi pada toksisitas akut. ( Loomis, TA,

1978), (Lu,FC, 1995).

c. Uji Toksisitas Jangka Panjang (Kronis)

Pemberian zat kimia uji dilakukan berulang selama siklus hidup dari

hewan uji atau sekurang-kurangnya sebagian besar dari waktu masa

hidupnya. Pengujian ini untuk mengetahui ada tidaknya toksisitas bila

dosis yang digunakan mewakili suatu tingkat dosis yang lazim serta

untuk mengetahui potensial teratogenik, mutagenik atau karsinogenik

suatu zat kimia. (WHO, 1978), (Lu,FC, 1995).

2.6. Uji Toksisitas Akut

Proses pengujian toksisitas akut dirancang untuk menentukan dosis

lethal median (LO 50) dari zat kimia yang diuji (toksikan). LO 50 didefinisikan

sebagai dosis tunggal suatu zat yang secara statistik diharapkan akan

membunuh 50% hewan percobaan. Menurut The Organization for Economic

Cooperation and Development (OECD) mengatakan bahwa toksisitas akut

adalah untuk mengetahui pengaruh yang terjadi dalam waktu yang singkat

dengan pemberian sampel melalui oral selama 24 jam. Dalam pengujian ini

organ sasaran dan efek toksisitas spesifik dapat diketahui juga dosis yang

sebaiknya digunakan dengan pengamatan yang lebih lama.

Zat kimia dengan nilai toksisitas akut yang rendah tidak perlu

ditentukan LO 50 secara tepat, cukup dengan angka perkiraan. Suatu

informasi bahwa pada dosis yang cukup besar tidak memberikan pengaruh

terhadap kematian, dianggap bahwa semua toksisitas akut yang berbahaya

dapat disingkirkan dan tidak perlu ditentukan LD 50nya.(Lu,FC, 1995).

(Hayes, 1976)

9

2.6.1. Pemilihan Species Hewan

Hewan uji yang biasa digunakan untuk uji ini adalah tikus atau mencit.

Karena murah, mudah diperoleh, dan mudah ditangani. Selain itu data

toksisitas hewan ini sudah banyak sehingga mudah untuk membandingkan

toksisitas zat kimia.

Untuk penentuan LO 50 dilakukan pada 2 jenis kelamin yang berlainan,

juga pada hewan dewasa atau muda karena tingkat kerentanannya ada

kemungkinan berbeda.

2.6.2. Dosis dan Jumlah Hewan

Oalam menentukan species-species hewan uji haruslah cermat, karena

hewan uji harus berada dalam tingkat kesehatan yang baik. Sebelum

mengalami pengujian harus diamati selama 1 kurun waktu ( lebih kurang 1

minggu untuk tikus) di laboratorium.

Urutan dalam menentukan toksisitas akut suatu zat kimia terdiri dari

eksperimen penentuan kisaran dosis kasar, kemudian kisaran dosis efektif

dipersempit untuk pengukuran letalitas dan akhirnya eksperimen definitive

untuk mendapatkan kurva dosis respons untuk letalitas.

Uji awal penemuan dosis kasar berdasarkan atas toksisitas dugaan

yang hanya diperoleh dari suatu pengetahuan tetang struktur senyawa uji dan

informasi sebelumnya.Oalam menentukan LO 50 dengan tepat, perlu

ditentukan rentang dosis yang kemungkinan besar akan membunuh sekitar

separuh jumlah hewan-hewan uji itu. Pada umumnya digunakan empat dosis

atau lebih dengan harapan bahwa sekurang-kurangnya tiga diantaranya akan

berada dalam rentang dosis yang dikehendaki.

LO 50 akan lebih akurat apabila mengunakan lebih banyak hewan uji

pada setiap dosis dan ratio antara dosis yang berurutan lebih kecil. Banyak

peneliti menggunakan 40 - 50 hewan per LO 50 dan memilih ratio 1,2 - 1,5 .

10

Namun peneliti lain menggunakan 4 hewan per dosis dan rasio 2,0 antara

dosis yang berurutan.

Kadang diperlukan penentuan LO 50 yang lebih tepat, maka ratio antar

dosis yang berurutan harus lebih kecil. Oalam menentukan LO 50 pada

hewan besar seperti anjing umumnya digunakan hewan yang lebih sedikit.

2.6.3. Kondisi Llngkungan

Kandang tempat hewan uji dipelihara dapat mempengaruhi LO 50

suatu zat kimia. Jenis kandang dan jenis alas kandang dapat mempengaruhi

reaksi dari hewan terhadap zat kimia (toksikan) yang diberikan.

Suhu lingkungan juga kelembaban relatif dapat pula mempengaruhi

efek toksik serta dapat meningkatkan toksisitas akut, sehingga nilai dari LO 50

akan lebih rendah.

2.6.4. Nilai LD 50

Nilai LO 50 sangat berguna untuk:

1. Klasifikasi zat kimia sesuai dengan toksisitas relatifnya. Klasifikasi

lazim adalah sbb:

Tabel 2.1. Klasifikasi Toksisitas

Kategori LD 50

Supertoksik 5 mg/kg atau kurang

Amat sangat toksik 5-50 mg/kg

Sangat toksik 50 - 500 mg/kg

Toksik sedang 0,5- 5 g/kg

Toksik ringan 5-15 g/kg

Praktis tidak toksik > 15 g/kg

(sumber Lu, 1995)

11

2. Kegunaan lain dari nilai LO 50 ialah dalam evaluasi dampak keracunan

yang tidak disengaja; perencanaan penelitian toksisitas subakut dan

kronik pada hewan ; memberikan informasi tentang:

a. Mekanisme toksisitas

b. Pengaruh umur, jenis kelamin, faktor penjamu dan faktor

lingkungan lainnya

c. Variasi respons antar species dan antar strain hewan;

memberikan informasi yang dibutuhkan dalam merencanakan

pengujian obat pada manusia dan dalam pengandalian mutu zat

kimia, deteksi pencemaran toksik serta perubahan fisik yang

mempengaruhi bioavailabilitas. (Lu, 1995)

12

BAB Ill

METODE PENELITIAN

3.1. Bahan dan Alat

3.1.1. Bahan

- Tepung Tempe

N-heksan, NaOH, HCI, Aquadest

Mencit putih jantan dan betina jenis wistar usia 1 bulan diperoleh dari

Jur. Farmasi ITB.

Serbuk kayu

Makanan tikus berupa pelet

3.1.2. Alat

Ekstraktor, Erlenmeyer, pipet, buret, labu ukur, labu takar, gelas ukur,

waterbath, sentrifuga, spray dryer, spektrofotometer

- Timbangan

Kandang besi

3.2. Metode Penelitian

3.2.1. Pembuatan Bahan Protein lsolat Tepung Tempe

Dalam pembuatan bahan protein isolat tepung tempe dilakukan

dengan dua tahap, yaitu pembuatan tepung tempe rendah lemak dan

pembuatan protein isolat.

13

3.2.1.1. Pembuatan Tepung Tempe Rendah Lemak

Ekstraksi minyak dilakukan pada suhu ruang dengan perb.andingan

tepung tempe dan n-heksa.n adalah 1 :3 (kg/L) . Campuran diaduk setiap Y2

jam sekali dan ditambahkan n-heksan setiap 2 jam. Proses ini berlangsung

selama 6 jam.

Supernatan dipisahkan dan dikeringkan pada udara terbuka selama 1

hari, sehingga diperoleh tepung tempe yang rendah lemak.

3.2.1.2. Pembuatan Protein lsolat

50 gr tepung tempe rendah lemak dilarutkan dengan NaOH 0,05 M

dengan perbandingan F:S = 1 :9 (gr/L), pada suhu 60°C, pH 8 - 12,selama 2

jam. Kemudian disentrifuga 6000 rpm selama 10 menit sehingga diperoleh

supernatannya (cair).

Supernatan yang mengandung protein ditambahkan HC! 0, 1 M sampai

pH 4,5, pada suhu 60°C selama 40 menit dan diaduk. Kemudian disentrifuga

8000 rpm selama 15 menit, sehingga diperoleh endapan protein.

Endapan protein yang dihasilkan dicuci dengan menggunakan

aquadest 1 ;2 (b/v). Dan dinetralisasi dengan larutan NaOH 0, 1 M sampai

merr.peroleh pH 7. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan sray dryer

dan diperoleh protein isolat tepung tempe.

3.2.2. Pembuatan Sediaan Uji

Protein isolat tepung tempe dalam bentuk serbuk diencerkan dengan

menggunakan aquadest steril. Kemudian siap untuk diberikan pada hewan

percobaan dengan dosis: 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; dan 2 ml.

14

3.2.3 . Penyiapan Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan adalah mencit putih jenis wistar dengan

jenis kelamin jantan dan betina dengan usia kurang lebih 1 bulan ,sebanyak

50 ekor. Hewan uji ditimbang dan dikelompokkan secara acak, tiap kelompok

terdiri dari 5 ekor tikus jantan dan 5 ekor tikus betina . Hewan dibiarkan puasa

selama 12 jam sebelum diuji, minum tetap diberi . Pada uji ini dilakukan

dengan memberi 1 kali bahan uji. Yang diamati adalah mortalitas dan uji

perilaku selama 4 jam kemudian dievaluasi kematian selama 14 hari.

3.2.4. Cara Pemberian

lsolat protein tepung tempe yang sudah berupa larutan diberikan pada

hewan uji melalui jalur oral dengan menggunakan alat bantu yaitu sonde.

Gambar 3.1. Kondisi hewan uji dalam kandang

15

Gambar 3.2. Penimbangan hewan uji

Gambar 3.3. Pemberian sampel pada hewan uji

16

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Tepung Tempe Rendah Lemak

Pencampuran tepung tempe dengan n-heksan dengan perbandingan

1 :3 (kg/L} pada suhu ruang bertujuan untuk menghilangkan sebagian besar

kandungan lemak yang ada pada tepung tempe. Oleh sebab itu dilakukan

pengadukan setiap ~ jam sekali serta penambahan n-heksan setiap 2 jam .

Perlakuan ini berlangsung selama 6 jam.

Setelah 6 jam, supernatan dipisahkan dan dikeringkan pada udara

terbuka selama 24 jam. Sehingga diperoleh serbuk tepung tempe yang kering

dengan kadar lemak yang rendah serta diharapkan terjadinya penguapan dari

n-heksan yang digunakan dalam proses penghilangan kandungan lemak

pada tepung tempe.

4.2. Protein lsolat Tepung Tempe

Tepung tempe rendah lemak yang telah dihasilkan kemudian dilarutkan

dengan menggunakan NaOH 0,05 M, dengan perbandingan F:S = 1 :9 (gr/L)

pada suhu 60°C, pH 8 - 12 selama 2 jam. Kondisi seperti ini dibe:ikan dengan

tujuan untuk melarutkan protein yang ada pada tepung tempe tersebut.

Karena pada larutan yang bersifat basa dan suhu 60°C protein akan larut.

Setelah 2 jam dan protein larut dalam larutannya, untuk memperoleh

supernatannya kami lakukan sentrifugasi pada 6000 rpm selama 1 O menit.

Untuk memperoleh endapan dari protein yang sudah dilarutkan tadi,

supernatan ditambahkan HCI 0, 1 M sedikit demi sedikit sampai diperoleh nilai

pH larutan 4,5. Hal ini dilakukan pada suhu 60°C selama 40 menit. pH diatur

17

sampai 4,5 karena merupakan titik isoelektrik sehingga pada titik tersebut

protein dapat :-7lenggumpal. Kemudian untuk memgumpulkan semua

endapan, larutan tersebut kami sentrifuga dengan kecepatan 8000 rpm

selama 15 menit.

Endapan protein yang dihasilkan dicuci dengan menggunakan

aquadest 1 :2 (b/v). Kemudian ditambahkan larutan NaOH 0, 1 M untuk proses

netralisasi sehingga dicapai nilai pH 7. Untuk proses pengeringannya agar

diperoleh serbuk protein isolat tepung tempe digunakan alat spray dryer.

4.3. Uji Toksisitas Akut

Setelah mengalami beberapa tahap perlakuan dari tepung tempe

sampai dihasilkannya protein isolat, diperoleh protein isolat tepung tempe

dengan kadar protein 84,06%. Untuk mempermudah tepung tersebut

diberikan kepada hewan uji, tepung dilarutkan dalam aqudest steril sehingga

diperoleh konsentrasi 8,406%. Kemudian diberikan kepada hewan uji (tikus

putih jenis wistar) dengan dosis 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml dan 2 ml.

Setelah pemberian sampel dengan dosis yang sudah ditetapkan, kami

melihat reaksi yang dihasilkan selama 4 jam . Reaksi tersebut dapat dilihat

pada tabel berikut:

18

label 4.1. Tanda toksik pada tikus jantan

Sistem Tanda toksik

kontrol 0,5 mg 1 mg 1,5 mg 2 mg

Autonomik

- hipersekresi hidung N N N N .N

- keluar air seni N N N N N

Perilaku

- agresif N + + + +

- depresi N N N N N

Sensorik

- peka terhadap bunyi N N N N N

-peka terhadap sentuhan N N N + +

Neuromuskuler

- tremor - - - - -

- lemas - - - - -

Gastrointestinal

- berak/kencing darah - - - - -Ku lit

I - bengkak - - - - -Keterangan : N = Normal -= tidak ada + = ada

Pada sistem autonomik pada tikus jantan normal, sekresi dari hidung

dan air seni semuanya terlihat normal. Sedangkan pada perilaku, hewan uji

jantan kelihatan menunjukkan lebih agresif dari pada kontrol dan tidak

menunjukkan tanda-tanda depresi. Pada sistem sensorik kepekaan terhadap

bunyi dan sentuhan cenderung normal, sedikit ada reaksi pada kelompok

hewan uji ke 3 dan 4 dengan dosis pemberian yang lebih tinggi yaitu 1,5 mg

dan 2 mg. Seluruh hewan uji tidak memberikan tanda-tanda tremor, lemas,

berak/kencing darah dan bengkak pada kulit.

19

Tabel 4.2. Tanda toksik pada tikus betina

Sistem Tanda toksik

kontrol 0,5 mg 1 mg 1,5 mg 2 mg

Autonomik

- hipersekresi hidung N N N + +

- keluar air seni N N N N N

Perilaku

- agresif N N N + +

- depresi N + N N N

Sensorik

- peka terhadap bunyi N N N N N

-peka terhadap sentuhan N + + + +

Neuromuskuler

- tremor - - - - -

- lemas - - - - -

Gastrointestinal

- berak/kencing darah - - - - --

Ku lit

- bengkak - - - - -Keterangan : N = Normal - = tidak ada + = ada

Sistem autonomik pada tikus betina normal, sekresi dari hidung

normal kecuali pada kelompok hewan uji ke 3 dan 4 dengan pemberian

sampel yang lebih tinggi . Pada beberapa hewan uji terlihat hidungnya lebih

basah daripada hewan uji yang lainnya. Sedangkan produksi air seni

semuanya terlihat normal, hal ini dapat dilihat dari serbuk kayu yang

digunakan sebagai alas kelihatan kering. Perilaku kelompok hewan uji ke 3

dan 4 menunjukkan lebih agresif dari pada kontrol dan kelompok hewan uji

ke 1 dan 2. Semua hewan uji tidak menunjukkan tanda-tanda depresi kecuali

pada kelompok hewan uji ke 1, itu pun hanya 2 ekor kemungkinan hal ini

disebabkan hewan uji merasa stress pada saat pemberian makanan. Pada

sistem sensorik kepekaan terhadap bunyi normal. Sedangkan kepekaan

terhadap sentuhan cenderung lebih tinggi dari pada normal, ini terlihat bila

20

punggung tikus disentuh, hewan uji akan cenderung untuk lari menjauh.

Seluruh hewan uji tidak memberikan tanda-tanda tremor, lemas,

berak/kencing darah dan bengkak pada kulit.

Dari keseluruhan data pengamatan diatas tidak ada perubahan atau

efek yang berarti setelah pemberian sampel selama 4 jam. Pada semua

hewan uji mempunyai kecenderungan memberikan tanda yang normal .

Dari hasil pengamatan yang dilakukan selama 14 hari dengan satu kali

pemberian sampel pada beberapa variasi, ternyata tidak ada hewan uji yang

mati. Hal ini menunjukkan bahwa protein isolat tepung tempe yang telah

mengalami proses pencucian dengan menggunakan n-heksan dalam proses

pembuatannya ternyata tidak memberikan efek racun. Dan bila kita lihat dari

kenaikan berat badannya semakin hari semakin meningkat.

140 ,..-~~~~~-,,....-.,-~~~~~~~~~~~~

Ci 120 ;----,--~---,---,;;r--:--.,--="'~

-; 100 -t-r.~~~""" ~ 80 r-=.=...<.;27i'-'::':'-7-~ ro .0 60 ++~~ ... ~ 40i~~~

OJ 20 -s::~==

0 -l-~=

1' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Hari

Grafik 4.1 . Kenaikan berat badan tikus putih jantan

-+-Kontrol

-11-0,5 m 1m

1,5m

~2m

Dari grafik diatas terlihat bahwa scjak hari pertama pemberian protein

isolat tepung tempe kenaikkan dari berat badan tikus jantan terus meningkat,

bahkan sedikit melebihi kenaikkan berat badan dari tikus kontrol . Di hari

pertama setelah pemberian sampel terlihat ada kenaikkan yang cukup tinggi

sekitar 5 - 10 g dan selanjutnya sekitar 0 - 5 g. Pengamatan dilakukan

21

BABV

KESIMPULAN

- Pada uji toksisitas akut protein isolat tepung tempe yang dihasilkan

dengan proses pencucian menggunakan n-heksan tidak menimbulkan

kematian pada hewan uji tikus jenis wistar.

- Pemberian protein isolat tepung tempe membantu meningkatkan berat

badan hewan uji yaitu sekitar 10% pad a jantan dan 5% pad a betina

dari pada kontrol.

23

DAFTAR PUSTAKA

Ditjen POM, Depkes RI, Prosedur Operasional Baku Uji Toksisitas, Depkes

RI, Jakarta, 1991. 26 -29, 30 -38.

Koeman, JH, Pengantar Umum Toksikologi, Terj. RH Yudono, UGM-Press,

Yogya, 1977, 1 O - 17.

LU, Frank C., Edi Nugroho, Toksikologi Oasar, 1995, ed-2,Ul-Press, Jakarta,

85 -104.

Loomis, TA, Essential Toxicology, 3rd ed, Lea Febiger, Philadelphia, 1978, 6-

8, 225 - 272.

Page S, David dan Soendoro, R, Prinsip-prinsip Biokimia, Ed ke 2, Erlangga,

Jakarta, 1989, 21 - 40.

Soepandi, Apotik Hijau, cet 2, PT Puma Warna, Surakarta, 1964, 1 O - 16.

Sudarmadji, S., Kedelai sebagai Sur:iber Protein di Indonesia, LIPI, Bandung,

1975.

Sukendro, Pembuatan Protein Konsentrat dengan Cara lsolasi, LIPI,

Bandung, 1977.

Suhadijono, Pembuatan Protein Konsentrnt dari Bahan Dasar Bungkil Kacang

Tanah dengan Cara Pencucian Memakai Larutan Asam Klor!da, UGM,

Yogyakarta, 1977.

Suhadijono, Pembuatan Protein Konsentrat dengan Pencucian Alkohol 95%,

LIPI, Bandung, 1978.

WHO, Principles Methods for Evaluating The Toxicity of Chemicals, part 1,

Geneva, 1978, 16-32, 95 - 134.

24

Lampiran

Rata - rata kenaikan berat badan tikus putih betina (g)

Hari ke- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 kontrol 73,4 78,2 80,3 82 83 84 86,6 88,8 90,8 87 90,6 94 97 96 P.5 ml 76,4 80,2 83,2 85,8 87,6 90,6 92,6 91,6 97,6 98,2 103 103 104 108 1 ml 76,4 80,8 84 85,8 88,6 90,4 94,4 93,6 95,6 95,6 102 103 103 105 1,5 ml 84,2 88,2 90,2 92,6 94 95,f 98,8 101 103 102 106 107 108 109 2ml 76,8 80,6 85,2 87,2 88,6 90,8 92,2 96,2 97,8 97 103 105 107 108

Rata - rata kenaikan berat badan tikus putih jantan (g)

Hari ke- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Kontrol 89,5 94,8 104 101 102 105 107 109 111 111 117 119 121 122 0,5 ml 87,6 93,2 98 101 103 105 107 111 113 114 120 121 ~23 127 ~

1 ml 84,2 90,4 95 97,6 98 102 105 109 112 113 116 118 120 123 1,5 ml 87,8 95,4 99,6 104 106 108 113 1151 117 118 124 125 127 130 2 ml 89,2 91,8 97,8 101 103 106 111 113 115 116 120 121 123 127

Persentase kenaikan berat badan (%)

jantan betina

Kontrol 36 31

0,5 ml 45 41

1 ml 46 37

1,5 ml 48 29

2 ml 42 40

25