PERCOBAAN IVSPEKTROFOTOMETRI VISIBLEA. Judul :Penetapan kadar Vitamin B12 dengan Spektrofotometri VisibleB. Tujuan :Mahasiswa mampu menentukan kadar Vtamin B12 dengan Spektrofotometri VisibleC. Dasar Teori :Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak; yang dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299149 kJ/mol.Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan tereksitasi.Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak.Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 C.Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut maks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (AC) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 A 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi tidak linear lagi. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear :1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan berwarna disebut juga metode kolorimetri. Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna (chromogenik reagent).D. URAIAN BAHAN

1. Vitamin B12 (Asam Folat) FI edisi III hal 51.Nama resmi:Acidum Folicum

Nama lain:Asam Folat, Vitamin B12

Rumus struktur:

RM/BM:C19H19N7O6 / 411,40

Pemerian :Serbuk hablur; kuning jingga atau jingga kekuningan; tidak berbau.

Kelarutan:Sangat sukar larut dalm air; praktis tidak larut dalam etanol (95%) p, dalam klorofom p, dalam eter p, dalam aseton p, dalm bensen p; mudah larut dalam asam klorida encer p panas dan dalam asam sulfat encer p panas; larut dalam asam klorida p dan dalam asam sulfat p, larutan berwarna kuning sangat pucat; mudah larut dalam alkali nidroksida dan dalam larutan alkali karbonat encer.

Penimpanan :Dalam wadah tertutup baik dan terindung dari cahaya.

Khasiat:Hematopitekum.

2. Aquadest ( FI edisi III hal 96)

Nama resmi:Aqua Destilata

Nama lain:Air suling, aquadest

Rumus struktur:-

Rm/ Bm:H2O/18.02

Pemerian :Cairan jernih; tidak berwarna; tidak berbau; tidak mempunyai rasa.

Kelarutan :-

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Khasiat :Pelarut

E. Metode Kerja :1. Alat & Bahana. Alat: Labu takarPipet volumePerkamenSendok tandukb. Bahan: Sampel (Vitamin B12)Aquadest2. Cara kerjaa. Pembuatan larutan baku Vitamin B12 diukur pada maksimum 361 nm (A1 = 207 a) dibuat absorbansi antara 0,2-0,8A= a x b x c0,2= 207 x 1 x cC= 9,66 x 10-4 g/100 mL= 9,66 10 ppmA= a x b x c0,8= 207 x 1 x cC= 38,7 x 10-3 g/100 mL= 38,7 40 ppmKonsentrasi larutan baku range 10-40 ppm dibuat 4 titik yaitu 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm dan 40 ppma. Pembuatan larutan baku indukVial Vitamin B12 etiket : 8 mg/8 mLDipipet 5 mL dari vial Vitamin B12, dilarutkan dalam labu takar 50 mL dengan aquadest larutan baku induk 100 ppmb. Pembuatan deret baku1) 10 ppmV1 x N1= V2 x N2V1 x 100= 50 x 10V1= 5 mLDipipet 5 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan aquadest hingga 50 mL2) 20 ppmV1 x N1= V2 x N2V1 x 100= 25 x 20V1= 5 mLDipipet 5 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan aquadest hingga 25 mL3) 30 ppmV1 x N1= V2 x N2V1 x 100= 50 x 30V1= 15 mLDipipet 15 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan aquadest hingga 30 mL4) 40 ppmV1 x N1= V2 x N2V1 x 100= 25 x 40V1= 10 mLDipipet 10 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan aquadest hingga 25 mLb. Penentuan Panjang GelombangPanjang gelombang maksimum yang didapat pada konsentrasi adalah 361.c. Pembuatan Laruta Uji dan Pengukuran1) Pipet 5 mL vitamin B12 larutkan dalam aquadest 50 mL (100 ppm)2) Buat pengenceran 10 ppm:V1 x N1= V2 x N2V1 x 100= V2 x N2V1x 100= 50 x 10 ppmV1 = 5 mL dilarutkan dalam 50 mL (pembuatan larutan uji)F. Data Pengamatan1. Absorbansi deret baku pada = 360 nmKonsentrasi (ppm)Absorbansi

100,162

200,341

300,406

400,639

2. Data konsentrasi vs absorbansiKonsentrasi (ppm)Absorbansi

15,6920,264

14,9970,252

14,4040,241

G. PerhitunganDiketahui : Nilai a : 0,03 b : 0,01496c : 9796

Kurva baku konsentrasi (ppm) Vs absorbansiPersamaan :y = bx + aX1 = 16,7780X2 = 15,9759X3 = 15,2406

1. Perhitungan kadar Vitamin B12 dengan ekstrapolasi persamaan garis%= x 100 %

% sampel 1= = 167,78 %% sampel 2= = 159,79 %% sampel 3= = 152,40 %Kadar (%) rata-rata= = 159,9 %2. Grafik

H. PembahasanSpektrofotometri merupakan suatu perpanjangan dari penelitian visual dalam studi yang lebih terinci mengenai penyerapan energi cahaya oleh spesi kimia, memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam perincian dan pengukuran kuantitatif. Pengabsorpsian sinar ultraviolet atau sinar tampak oleh suatu molekul umumnya menghasilkan eksitasi electron bonding, akibatnya panjang gelombang absorpsi maksimum dapat dikorelasikan dengan jenis ikatan yang ada didalam molekul yang sedang diselidiki. Oleh karena itu spektroskopi serapan molekul berharga untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional yang ada dalam suatu molekul. Akan tetapi yang lebih penting adalah penggunaan spektroskopi serapan ultraviolet dan sinar tampak untuk penentuan kuantitatif senyawa-senyawa yang mengandung gugus-gugus pengabsorpsi.Metode spektroskopi sinar tampak berdasarkan penyerapan sinar tampak oleh suatu larutan berwarna. Oleh karena itu metode ini dikenal juga sebagai metode kalorimetri. Hanya larutan senyawa yang berwarna ynag dapat ditentukan dengan metode ini. Senyawa tak berwarna dapat dibuat berwarna dengan mereaksikannya dengan pereaksi yang menghasilkan senyawa berwarna. Contohnya ion Fe3+dengan ion CNS-menghasilkan larutan berwarna merah. Lazimnya kolorimetri dilakukan dengan membandingkan larutan standar dengan cuplikan yang dibuat pada keadaan yang sama. Dengan kalorimetri elektronik (canggih) jumlah cahaya yang diserap (A) berbanding lurus dengan konsentrasi larutan. Metode ini sering digunakan untuk menentukan kadar besi dalam air minum.Pada metode spektroskopi ultraviolet, cahaya yang diserap bukan cahaya tampak tapi cahaya ultraviolet. Dengan cara ini larutan tak berwarna dapat diukur, contoh aseton dan asetaldehid. Pada spektroskopi ini energy cahaya terserap digunakan untuk transisi electron. Karena energy cahaya UV lebih besar dari energy cahaya tampak maka energi UV dapat menyebabkan transisi electronsdanp. (Kimia Analitik Instrumen, 1994: 4-5)Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar Vitamin B12 dalam larutan sampel vial Vitamin B12 dengan metode spektrofotometri visible. Vitamin B12 dapat di ukur kadarnya dengan menggunakan metode spektrofotometri visible karena sampel vitamin B12 berupa larutan dan tampak berwarna. Prinsipnya adalah pengukuran Vitamin B12 pada panjang gelombang maksimum yang ditentukan yaitu 361 nm, setelah larutan sampel yang mengandung Vitamin B12 dilakukan pengenceran.Penentuan Vitamin B12 dibagi menjadi beberapa tahapan. Tahapan tersebut antara lain pembuatan larutan baku yang terdiri atas pembuatan larutan baku induk dan pembuatan deret baku, pengenceran larutan sampel serta pengukuran dengan spektrofotometer visible.Pengukuran menggunakan spektrofotometer visible, pengukuran pertama dilakukan terhadap blanko atau aquadest. Blanko adalah larutan yang mendapat perlakukan sama dengan analat tetapi tidak mengandung komponen analat. Blanko dibuat untuk mengetahui besarnya serapan yang disebabkan oleh zat yang bukan analat, baik hanya pelarut untuk melarutkan atau mengencerkan ataupun pelarut dan pereaksi tertentu yang ditambahkan. Selisih nilai serapan analat (Aa) dengan nilai serapan blanko (Ab) menunjukan serapan yang disebabkan oleh komponen alat.Praktikum ini tidak perlu dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum karena alat spektrofotometer visible yang digunakan langsung menunjukan panjang gelombang maksimum untuk Vitamin B12.Regresi linear (r) yaitu 0,9995 menunjukkan bahwa hasil analisis ini mempunyai ketelitian yang tinggi dan sangat presisi.Setelah deret standar diukur, langkah terakhir yaitu melakukan pengukuran sampel pada panjang gelombang maksimum. Setelah dilakukan pengukuran, didapat absorbansinya untuk sampel 1 = 0,264, sampel 2 = 0,252, sampel 3 = 0,241 dan absorbansi tersebut termasuk didalam absorbansi deret standar yang telah diukur sebelumnya, sehingga dari perhitungan yang dilakukan, didapat konsentrasi Vitamin B12 dalam sampel vial Vitamin B12 adalah sebesar 167,78 % untuk sampel 1, 159,79 % untuk sampel 2, 152, 40 % untuk sampel 3 dan rata-rata yang diperoleh 159,9 %. Kurva yang terbentuk tidak linier karena diduga terjadi kesalahan saat melakukan praktikum.I. KesimpulanSesuai dengan tujuan praktikum, yaitu mampu menentukan kadar sampel Vitamin B12 (sianokobalamin) dengan Spektrofotometri Visible, maka dari praktikum yang telah dilaksanakan, dapat disimpulkan bahwa konsentrasi rata-rata dari Vitamin B12 dalam sampel vial Vitamin B12 adalah 159,9 %

Daftar PustakaAnonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta : DEPKES RIAnonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : DEPKES RIGandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar : YogyakartaRoy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB : Bandung.