PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA KROMOSOM DAN PLASMIDKelompok 2:

1. Handariatul Masruroh

(121810301003)2. Endah Retno K.

(121810301019)

3. Beny Akhmat Saputra

(121810301034)

4. Lia Lazimatur Rofiah

(121810301055)

LABORATORIUM BIOKIMIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2014

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) merupakan molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme padasetiap organisme. Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom dengan utas ganda dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir.Plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inangPada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu. Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid, elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV). Berdasarkan pernyataan diatas maka dilakukanlah praktikum isolasi DNA plasmid dan kromosom untuk mempelajari cara mengisolasi DNA dan bagaimana mengetahui berat molekul dari DNA tersebut.1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah yang akan dibahas dalam praktikum ini adalah:

a. Apa yang dimaksud dengan DNA?

b. Bagaimana metode isolasi DNA plasmid?c. Bagaimana cara untuk mengetahui berat molekul DNA plasmid?1.3 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah:

a. Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA kromosom dan plasmid.b. Memahami dan mengetahui berat molekul DNA kromosom dan plasmid.c. Membedakan DNA kromosom dan plasmid.

1.4 Manfaat

Manfaat yang didapatkan dari praktikum kali ini adalah dapat mengisolasi DNA, mengetahui perbedaan dari DNA kromosom dan plasmid serta mengetahui berat molekulnya.BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian DNADNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas Adenin (A) dan Guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan Timin (T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Guanin berikatan dengan sitosin maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen (Sudjadi, 2008).DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. DNA terdapat di setiap sel makhluk hidup yang memiliki peranan sangat penting yaitu sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid (Calladine dan Horace, 2004).DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentukcovalently closed circular(CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Susanto, 2012).Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah (Campbell, 2002).Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus (Susanto, 2012).

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Susanto, 2012).Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentukcovalently closed circular(CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Sakura, 2010).2.2 Isolasi DNA plasmidIsolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah keproses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan DNA. Ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung DNA total. Prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA dari jaringan (Muladno, 2002).Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering menjadi sintesis protein untuk resistensi untuk antibiotik. Plasmid dalam rekayasa genetika sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim isolasi DNA. Prinsip isolasi DNA adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya, yang memiliki berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi (Campbell, 2002).Langkah awal untuk mendapatkan plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Sel yang telah ditumbuhkan kemudian dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Homogenisasi yang dilakukan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA (Muladno, 2002).Plasmid bakteri yang biasanya merupakan molekul DNA untai ganda dengan ukuran dari 1 kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini terdapat dalam berbagai spesies bakteri dan merupakan satuan genetik tambahan yang bereplikasi dengan tidak tergantung pada kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan. Replikasi dan transkripsi tetap tergantung pada enzim yang terdapat pada sel inang. Plasmid membawa gen yang menjadi enzim yang pada keadaan tertentu menguntungkan sel inang, di antaranya resisten terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa organic kompleks, produksi kolkisin, produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim modifikasi (Sudjadi, 2008).Plasmid mempunyai suatu urutan basa tertentu yang berfungsi sebagai daerah awal replikasi (replikon), yang tanpa lokus ini plasmid tidak dapat memperbanyak diri dalam sel inang. Jenis replikon ini yang menentukan jumlah duplikat plasmid dalam setiap sel inang. Plasmid terdapat dalam jumlah 10, 30, sampai 100 molekul plasmid dalam setiap sel. Plasmid jenis ini dinamakan plasmid berduplikat tinggi, sedangkan plasmid jenis lain terdapat 2, 4 dan 8 duplikat persel yang dinamakan plasmid berduplikat rendah (Sudjadi, 2008).Sebagai penyusun genetik yang dapat replikasi sendiri, plasmid dapat merupakan vector yang membawa DNA yang diklon. Akan tetapi, plasmid alam tidak mempunyai sifat-sifat yang diperlukan sebagai vector cloning yang baik. Sifat yang diperlukan sebagai vektor kloning antara lain:1. Berukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dan menaikkan efisiensi transformasi ke dalam E. Coli. Efisiensi transformasi ini menurun sesuai dengan kenaikan ukuran plasmid.2. Mempunyai lokus tunggal restriksi endonuklease tertentu untuk penyisipan DNA yang diklom.3. Mempunyai satu atau lebih penanda genetik seleksi sebagai identifikasi sel yang telah membawa plasmid rekombinan (Calladine dan Horace, 2004).Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Lehninger, 1982).Pemetaan plasmid merupakan penentuan posisi relatif dari gen-gen pada sebuah molekul DNA (kromosom atau plasmid) dan dari jarak antara molekul DNA tersebut baik dalam unit-unit ikatan atau dalam unit-unit fisik. Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkanmembran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Brocket al., 1994).DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total akan menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteriEscherichia coliyang kemungkinan adalah DNA plasmid (Alataret al.,2012).

Sebuahisolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien serta menghasilkan jumlah DNA yang cukup berkualitas tinggi yang cocok untuk analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol yang dioptimalkan diamati secara luas bebas dari polyphenolikdan metabolitsekunder, sebagaimana ditentukan oleh digesti yang sukses dengan restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR. Semua metode tersebut pada umumnya menggunakan detergen seperti SDS untuk melisiskan dinding sel, dan sering menghambat manipulasi pemurnian lebih lanjut (Alataret al,2012).

BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat Tabung reaksi Shaker incubator

Termometer

Pipet mohr

Pipet tetes

Waterbath

Erlenmeyer Gelas beaker

Mikro pipet

Sentrifuge

Tabung eppendorf3.1.2 Bahan

Aquades Buffer TE (50 Mm tris HCl Ph 8 dan 50 Mm EDTA)

Larutan STEP (SDS 1%, tris Cl, EDTA Ph 8 proteinase K)

Larutan fenol jenuh

Natrium asetat 0,3 M

Etanol absolut

Etanol 70%

ddH2O E.coli

Larutan I (Glukosa 50 Mm, Tris-Cl 2.5 Mm Ph 8, Na2EDTA 10 Mm Ph 8) Larutan II (NaOH 0.2 N 20 (L, SDS 1% 100 (L, aqudes steril 880 (L) Larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin) Campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) Agarosa Buffer TAE Larutan EtBr3.2 Alur Percobaan3.2.1 Isolasi DNA plasmid Pet-endo

Sampel diinokulasi di dalam 5 Ml media LB cair yang mengandung 2,5 (L kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. 5 Ml suspensi sel disentrifugasu selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I sebanyak 100 (L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.

Ditambahkan 200 (L larutan II, dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf.

Diinkubasi di es selama 15 menit.

Ditambahkan 150 (L larutan III, diinkubasi dalam es selama 10 menit.

Campuran disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C.

Supernatan yang diperoleh dipindah dalam tabung eppendorf, dan ditambah campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi 2 menit pada 12.000 rpm.

Terbentuk 3 fase, fase atas (fase cair) dipipet dan dipindah dalam tabung eppendorf, fase cair dipekatkan dengan menambah etanol absolut dingin 2 kali volume total dan diinkubasi dalam es selama 1 jam.

Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70%.

Disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di keringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit.

Pellet dilarutkan dalam 30 (L ddH2O.

3.2.2 AnalisisDNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan sampel dalam 40 Ml bufer TAE (40 Mm Tris-asetat dan 1 Mm Na2EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X : 24.2 gram, 5.72 Ml asam asetat glasial dan 10 Ml dengan pemanasan). Setelah agarosa terlarut dan didinginkan sampei kira-kira temperatur 450C, gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat.

Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan bufer pembeban 1x (bufer pembeban 6x : bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)), elektrolisis dilakukan dalam bufer TAE pada tegangan 70-100 volt.

Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel.

Gel agarosa direndam dalam larutan EtBr 250 (g/Ml selama 3-5 menit, selanjutnya direndam dalam bufer TAE selam 5-10 menit atau aquades.

Pita-pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.

3.3 Prosedur Kegiatan3.3.1 Isolasi DNA plasmid Pet-endoKoloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 Ml media LB cair yang mengandung 2.5 (L kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150rpm selama 16 jam. Kemudian sebanyak 5 Ml suspensi sel disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 Mm, Tris-Cl 2.5 Mm Ph 8, Na2EDTA 10 Mm Ph 8) 100 (L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 (Llarutan II (NaOH 0.2 N 20 (L, SDS 1% 100 (L, aquades steril 880 (L) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf, larutan diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 (L larutan III (kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan dengan menggunakan pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm selama 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organikk, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah dengan cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 30 (L ddH2O.3.3.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosaGel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 40 Ml buffer TAE (40 Mm Tris-asetat dan 1 Mm Na2EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X : 24.2 gram, 5.72 Ml asam asetat glasil dan 10 Ml dengan pemanasan). Setelah agarosa terlarut dan didinginkan sampai kira-kira temperatur 450C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban 1x (buffer pembeban 6x : bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)). Elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 70-100 volt. Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan buffer EtBr 250 (g/Ml selama 3-5 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit atau aquades. Pita-pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Isolasi DNA plasmidNo.PerlakuanHasil

1.Suspensi disentrifugasi dengan suhu 40CDihasilkan pellet dan supernatan

2.

Pelet +100(L larutan IWarna kekuning

Dihomogenkan (disentil) dalam es, diamkan 5 menitHomogen

+200(L larutan IIWarna kekuningan

Dihomogenkan (dibolak-balik)Homogen

Diinkubasi Warna kekuningan

3.+larutan III 150(L, diinkubasi 10 menit, disentrifugasi (I)Terbentuk supernatan dan pelet

4.Supernatan diambil 0,15mLTidak berwarna

+larutan IV dengan perbandingan 1:1 (150(L), dikocokTidak berwarna

Sentrifugasi (II)Terbentuk 2 fase (atas: tidak berwarna, bawah: keruh)

5.Bagian atas diambil (0,1mL), +200(L etanolTidak berwarna

Diinkubasi 1 jamTidak berwarna

Disentrifugasi (III)Didapat pelet dan supernatan

6.Pelet ditambah etanol dingin 70%, disentrifugasiDidapat pelet dan supernatan

4.2.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

No.Perlakuan Gambar

1.Dielektroforesis menggunakan agarosa pada tegangan 70-100 volt dan hasilnya diamati dengan sinar UV

4.2 PembahasanDNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk untaian ganda. Kromosom sel prokariot merupakan suatu molekul besar DNA yang berkaitan erat-erat menjadi suatu daerah inti atau nukleoid. DNA adalah materi genetik yang mengandung purin dan pirimidin. Purin terdiri atas adenine dan guanine, sedangkan piridin terdiri atas sitosin dan timin.

Sel eukariot mengandung sejumlah molekul DNA, yang masing-masing pada umumnya berukuran jauh lebih besar dari satu molekul DNA didalam prokaryota. Molekul DNA didalam eukaryota bergabung dengan protein dan dikelompokkan menjadi serabut kromatin di dalam nukleus, yang dikelilingi oleh system membran ganda yang bersifat kompleks. DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan komponen jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri E. Coli. Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.

Prosedur pertama yang dilakukan adalah mensentrifugasi sampel suspensi.kemudian diberikan perlakuan dengan penambahan larutan I larutan II dan larutan III yang masing masing memiliki fungsi yang berbeda-beda pada setiap penambahan dan perlakuannya. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate.Campuran heterogen terdiri dari senyawa-senyawa dengan berat jenis berdekatan sulit dipisahkan. Membiarkan senyawa tersebut terendapkan karena adanya grafitasi berjalan sangat lambat. Salah satu teknik yang dapat dipergunakan untuk memisahkan campuran ini adalah teknik sentrifugasi, yaitu metode yang digunakan dalam untuk mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya.

Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan.

Setelah itu, supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jerbih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisinya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Larutan I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ untuk mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. sedangkan glukosa dari Larutan I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik.Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari Sodium Dodecyl Sulphate ( SDS ) dari Larutan II dapat melubangi membran sel karena SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti) protein membran sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar. NaOH juga mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasiPenambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air, atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut, atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasiPenambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant. Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode) dengan diberikan tegangan sebesr 70 volt. Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan ethidium bromide (EtBr) yang merupakan pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ( 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan melindungi mata dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.Proses running dari elektroforesis berjalan sangat lambat dimana pada proses ini terjadi pergerakan 3 warna sampel pada agarosa, yakni ungu biru dan kuning, running diberhentikan ketika sampel telah bergerak sampai tanda batas, kemudian dilakukan analisa dengan sinar UV untuk melihat adatidaknya DNA. Pita-pita pada lajur-lajur yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. Pada hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat lekukan atau lajur yang berwarna nyala api orange yang menunjukkan bahwa terdapat DNA yang berhasil diisolasi menggunakan metode elektroforesis.BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Adapun kesimpulan untuk praktikum isolasi DNA kromosom dan Plasmid adalah sebagai berikut

a. Suatu DNA plasmid diisolasi dengan beberapa tahap yakni resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. b. Proses elektroforesis digunakan untuk menandai adanya suatu DNA yang berhasil diisolasi dan diindikasi dengan adanya suatu lekukan berwarna orange nyala api pada agarosa yang dianilasa menggunakan sinar ultraviolet5.2 Saran

Adapun saran untuk praktikum ini adalah setiap penambahan larutan baik laritan I, II dan III harus dilakukan dengan hati-hati karena perlakuan masing-masing dapat mempengaruhi hasil dari percobaan, seperti tidak munculnya 3 fase, tidak munculnya pellet dan sedikitnya jumlah tersusupensi yang merupakan DNA yang akan diisolasi dan dielektroforesis untuk mebuktikan adanya DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of PCR-Amplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research.Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker. 1994.Biology of Microorganisms. New Jersey: Prentice Hall.Calladine, C. R., Horace RD. 2004. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.

Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta: Erlangga.

Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.

Sakura. 2010. Isolasi DNA. [serial online]. http://www.muslimahsakura90.com /2010/02/24/isolasi-dna/. Diakses Pada Tanggal 10 Oktober 2014].Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kasinius.Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Purwokerto: Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman.E. coli

Hasil

0,4 gram agarosa

Hasil