LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI ORAL II

ISOLASI DNA RONGGA MULUT

BAGUS KURNIAWAN

021111139

DEPARTEMEN BIOLOGI ORAL

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA

2013

1. PENDAHULUAN

Pada umumnya, DNA manusia dibagi menjadi 3. Pertama adalah autosomal DNA adalah

yang selalu berpasang – pasangan pada tubuh manusia yang berjumlah 22 buah non-seks

kromosom. Sedangkan yang kedua adalah seks kromosom, yang berjumlah satu pasang yaitu

y-kromosom sehingga total seluruh DNA manusia adalah 23 pasang. Ketiga adalah DNA

yang terdapat pada seluruh sel manusia, yaitu DNA mitokondria. DNA mitokondria ini

berfungsi untuk menghasilkan ATP dan sebagai generator sel. Walaupun letaknya didalam

sel manusia, DNA mitokondria memiliki kemampuan yang sama jika digunakan untuk

identifikasi seorang manusia. Biasanya, DNA mitokondria ini digunakan dalam kasus

kejahatan dan dapat diidentifikasi oleh petugas laboratorium maupun dokter serta dokter gigi

yang sedang bertugas.

Bahan untuk bukti biologis dari DNA mitokondria dapat ditemukan dari hampir seluruh

komponen makhluk hidup, baik di saliva, semen, darah, urin, rambut, gigi, tulang, jaringan

dan seluruh komponen lain yang memiliki inti. Salah satu bukti biologis ini biasanya dapat

ditemukan pada kasus forensik melalui analisis bitemarks. Pada analisis bitemarks dapat

ditmukan gigitan, mikroorganism yang hidup didalamnya dan saliva, yang berisi DNA dan

enzim spesifik yang terdapat hanya pada manusia. Pada praktikum ini akan dilakukan isolasi

DNA dari rongga mulut dan dilakukan ekstraksi. Kelebihan dari organik ekstraksi ini adalah

dapat digunakan untuk DNA double strenght akan tetapi kelemahannya dapat menyebabkan

pintu masuk infeksi jika tidak dilakukan secara hati – hati.

2. TUJUAN

a. Definisi dan pengetahuan mengenai isolasi dan ekstraksi DNA rongga mulut dapat

diketahui.

b. Peran dan fungsi rongga mulut sebagai bahan dari spesimen pemeriksaan DNA dapat

dipahami.

c. Ekstraksi dan isolasi DNA sederhana dapat dilakukan pada praktikum ini.

3. ALAT DAN BAHAN

a. Saliva

b. Clinical tube

c. Centrifuge

d. Mikropipet

e. Etanol

f. Isopropanol

g. DNAZol

h. Chloroform

i. Aquadest

j. Vortex

k. Beakerglass

l. Eppendorf tube

4. CARA KERJA

a. Sampel saliva dimasukkan kedalam tabung sentrifus

b. Sampel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 3 menit

c. Supernatan hasil pemusingan dibuang

d. Endapan / pellet ditambah dengan DNAZol 1 cc kemudian divortex selama 10 detik

e. Inkubasi selama 2 menit

f. Tambahkan chloroform 0,2 cc kemudian divortex selama 10 detik

g. Centifuge 8000 rpm selama 5 menit

h. Ambil supernatan dengan hati-hati, lalu dimasukkan kedalam eppendorf tube baru

i. Tambahkan isopropanol 0,5 cc, dihomogenkan dengan cara dibolak balik dengan pelan.

j. Inkubasi 5 menit

k. Centrifuge 3000 rpm selama 3 menit

l. Buang supernatan

m. Cuci pellet dengan etanol 70 % sebanyak 0,5 cc

n. Centrifuge 3000 rpm selama 2 menit

o. Buang supernatan.

p. Pellet ditambah aquadest steril sebanyak 50 µl.

5. HASIL PRAKTIKUM & PEMBAHASAN

Pada praktikum ini, pertama kali dilakukan adalah saliva dimasukkan dalam sentrifuge ke

dalam clinical tube menggunakan micropipet. Hasilnya didapatkan supernatan dan pellet.

Supernatan adalah hasil centrifuge dengan bobot terendah, berbentuk lapisan diatas yang

jernih, sedangkan pellet adalah hasil centrifuge dengan bobot terberat, yang selanjutnya akan

digunakan lagi.

Pada pellet yang pertama masih banyak ditemukan endapan debris dan bahan – bahan

lain yang tidak digunakan untuk analisis DNA, oleh karena itu selanjutnya ditambahkan

DNAzol untuk memisahkan antara kotoran dengan DNA dan dapat mengisolasi DNA yang

nantinya akan dianalisis. Dan vortex dilakukan untuk menghomogenkan pellet dengan

DNAzol. Selanjutnya dilakukan inkubasi, fungsinya agar DNAzol bekerja. Akan tetapi pada

praktikum kali ini hanya dilakukan inkubasi selama 5 menit sehingga hasil yang didapatkan

gambaran agak keruh karena kurang maksimal DNAzol bekerja.

Langkah selanjutnya dilakukan penambahan kloroform agar terjadi denaturasi protein

sehingga dapat melisiskan protein dan terjadinya ekstraksi DNA. Setelah itu dimasukkan

kedalam centrifuge untuk mendapatkkan pellet yang baru karena supernatan diatasnya sudah

tidak diguanakan lagi. Pada tahap ini terdapat butir – butiran halus dari beberapa protein

yang lisis tadi.

Selanjutnya ditambahkan isopropanol, dan dilakukan bolak – balik pada tabung secara

perlahan fungsinya adalah untuk mengendapkan DNA. DNA yang mengendap ini seharusnya

terdapat benang – benang putih tetapi tidak terlalu terlihat karena jumlah benang ini pada

saliva lebih sedikit dibandingkan dengan darah. Kemudian dilakukan centrifuge lagi dan

didapatkan pellet putih. Pellet putih ini berisi benang – benang putih, yaitu DNA.

Langkah selanjutnya kemudian diberikan etanol untuk membersihkan kotoran yang tidak

perlu dan mempurifikasi DNA. Dilakukan centrifuge lagi untuk memisahkan bahan yang

tidak perlu tadi sehingga didapatkan pellet putih yang hanya berisi DNA yang sudah dapat

dianalisis. Terakhir tambahkan aquadest agar pellet tetap bersih dan DNA siap dianalisis.

6. KESIMPULAN

Saliva merupakan bahan yang dapat digunakan untuk menganalisa DNA manusia.

Biasanya saliva ini digunakan dalam bidang odontologi forensik, dan dalam bidang penelitian.

Saliva dapat diisolasi dan diekstraksi sehingga nantinya akan didapatkan DNA mitokondria

didalamnya. Tetapi tidak hanya saliva yang dapat diisolasi untuk pemeriksaan DNA dalam

rongga mulut, gigi, darah dan jaringan juga dapat digunakan karena memiliki inti sel.

7. PERTANYAAN

1. Isolasi dan ekstraksi DNA adalah suatu cara yang digunakan untuk mendapatkan suatu sampel

DNA dengan mengisolasi bahan pemeriksaan DNA. Dari bahan tersebut, komponen – komponen

lain yang tidak perlu dibuang dan hanya tinggal DNA sehingga DNA dapat dianalisis dengan

akurat nantinya.

2. Saliva dapat digunakan sebagai sampel DNA karena saliva mengandung berbagai macam

komponen, salah satunya adalah inti sel yang didalamnya terdapat mitokondria sehingga kita

dapat mengambil sampel DNA mitokondria dari saliva tersebut.

3. Selain saliva, spesimen apa yang terdapat di dalam rongga mulut yang dapat digunakan untuk

bahan pemeriksaan DNA adalah darah, gigi, tulang dan jaringan yang memiliki inti.

4. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan

berat molekul komponennya.Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung

dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua

macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Pellet ini yang

akan digunakan untuk langkah selanjutnya dan supernatan akan dibuang. Presipitasi merupakan langkah yang

dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Pada praktikum kali ini, DNAzol, kloroform

dan isopropanol merupakan penggunaan prinsip prepitasi untuk ekstraksi DNA.

5. Secara umum, metode ekstraksi pada praktikum ini dilakukan dengan centrifuge, pertama

bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma. Kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari

isi nucleus. ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitas. Sedangkan

vortex berfungsi untuk menghomogenkan larutan, sedangkan bahan yang digunakan pada

metode ekstraksi DNA pada praktikum ini adalah menggunakan empat komponen, yaitu

DNAzol, kloroform , isopropanol dan etanol. DNAzol untuk memisahkan antara kotoran dengan

DNA dan dapat mengisolasi DNA yang nantinya akan dianalisis. Kloroform diberikan agar

terjadi denaturasi protein sehingga dapat melisiskan protein dan terjadinya ekstraksi DNA.

Isopropanol bertujuan untuk mengendapkan dan untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul.

Sedangkan etanol untuk membersihkan kotoran yang tidak perlu dan mempurifikasi DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, et. Al. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Hal 115

Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston: xviii