PENGENALAN ALAT SPEKTROFOTOMETER UV-VIS, KALIBRASI DAN PENGUKURAN PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM KLOROFIL DAUN RAMA

I. DASAR TEORIMolekul-molekul dapat mengabsorbsi atau mentransmisi radiasi gelombang elektromagnetik. Berkas cahaya putih adalah kombinasi semua panjang gelombang spektrum tampak. Perbedaan warna yang kita lihat sebenarnya ditentukan dengan bagaimana gelombang cahaya tersebut diabsorbsi dan ditransmisikan (dipantulkan) oleh objek atau suatu larutan.

Gambar 1. Pola difraksi cahaya polikromatik ( Sofyan, 2009)

Spektrofotometer digunakan untuk mengukur jumlah cahaya yang diabsorbsi atau ditransmisikan oleh molekul-molekul di dalam larutan. Ketika panjang gelombang cahaya ditransmisikan melalui larutan, sebagian energi cahaya tersebut akan diserap (diabsorbsi). Besarnya kemampuan molekul-molekul zat terlarut untuk mengabsorbsi cahaya pada pada panjang gelombang tertentu dikenal dengan istilahabsorbansi(A), yang setara dengan nilai konsentrasi larutan tersebut dan panjang berkas cahaya yang dilalui (biasanya 1 cm dalam spektrofotometer) ke suatu point dimana persentase jumlah cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi diukur dengan phototube. Sebuah spektrofotometer memilikilimabagian penting yaitu:a) Sumber cahaya, untuk UV umumnya digunakan lampu deuterium (D2O), untuk visible digunakan lampu tungstent xenon (Auc).b) Monokromator, suatu alat yang berfungsi mengubah cahaya polikromatik menjadi cahaya monokromatikc) Sel penyerap/ wadah pada sample, cell dalam spektrofotometer disebut juga dengan kuvet.d) Photodetektorberfungsi untuk mengubah energi cahaya menjadi energi listrike) Analyzer(pengolah data), untuk spektrofotometer modern biasanya dilengkapi dengan komputer.

Gambar 2. Skema Kerja alat Spektrofotometer UV-Vis ( Sofyan, 2009)

Suatu spektrometer UV-Vis biasanya bekerja pada daerah panjang gelombang sekitar 200 nm (pada ultraviolet dekat) sampai sekitar 800 nm (sinar tampak). Ketika sinar melewati suatu senyawa, energi dari sinar tersebut digunakan untuk mendorong perpindahan elektron dari orbital ikatan atau orbital non-ikatan ke salah satu orbital anti-ikatan yang kosong. Pada tiap kemungkinan, suatu elektron tereksitasi dari orbital yang terisi penuh ke orbital anti-ikatan yang kosong. Tiap lompatan elektron memerlukan energi dari sinar dan lompatan yang besar pasti membutuhkan energi yang lebih besar daripada lompatan yang kecil. Jika besarnya energi tersebut cukup untuk membuat suatu lompatan, maka panjang gelombang akan diserap dan energinya akan digunakan untuk promosi satu elektron.Lompatan yang penting diantaranya:a) Dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan;b) Dari orbital non-ikatan ke orbital pi anti-ikatan;c) Dari orbital non-ikatan ke orbital sigma anti-ikatan.Penyerapan sinar pada daerah antara 200 - 800 nm (pada daerah dimana spektra diukur), suatu senyawa harus mengandung ikatan pi atau terdapat atom dengan orbital non-ikatan. Orbital non-ikatan biasanya mengandung pasangan elektron bebas, misalnya pada oksigen, nitrogen, atau halogen. Bagian molekul yang dapat menyerap sinar disebut sebagaigugus kromofor.Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visible karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan.a.Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-VisHal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu.b.Waktu operasional (operating time)Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.c.Pemilihan panjang gelombangPanjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.d.Pembuatan kurva bakuDibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (X).e.Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikanAbsorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik). (Gandjar & Rohman, 2007).Komponen-komponen peralatan spektrofotometer UV-Vis dijelaskan secara garis besar sebagai berikut.1.Sumber CahayaSebagai sumber radiasi UV digunakan lampu Hidrogen (H) atau lampu Deutirium (D). Sedangkan sumber radiasi tampak yang juga menghasilkan sinar Infra Merah (IR) dekat menggunakan lampu filament tungsten yang dapat menghasilkan tenaga radiasi 350-3500 nm.2.MonokromatorRadiasi yang diperoleh dari berbagai sumber radiasi adalah sinar polikromatis (banyak panjang gelombang). Monokromator berfungsi untuk mengurai sinar tersebut menjadi monokromatis sesuai yang diinginkan. Monokromator terbuat dari bahan optic yang berbentuk prisma.3.Tempat SampelDalam bahasa sehari-hari tempat sampel (sel penyerap) dikenal dengan istilah kuvet. Kuvet ada yang berbentuk tabung (silinder) tapi ada juga yang berbentuk kotak. Syarat bahan yang dapat dijadikan kuvet adalah tidak menyerap sinar yang dilewatkan sebagai sumber radiasi dan tidak bereaksi dengan sampel dan pelarut.4.DetektorDetektor berfungsi untuk mengubah tenaga radiasi menjadi arus listrik atau peubah panas lainnya dan biasanya terintegrasi dengan pencatat (printer). Tenaga cahaya yang diubah menjadi tenaga listrik akan mencatat secara kuantitatif tenaga cahaya tersebut.(Sitorus, 2009).Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi dari cahaya matahari melalui fotosintesis. Daun merupakan organ terpenting bagi tumbuhan dalam melangsungkan hidupnya karena tumbuhan adalah organisme autotrof obligat, ia harus memasok kebutuhan energinya sendiri melalui konversi energi cahaya menjadi energi kimia (Dwidjoseputro, 1994)Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. Daun juga memiliki pigmen lain, misalnya karoten (berwarna jingga), xantofil (berwarna kuning), dan antosianin (berwarna merah, biru, atau ungu, tergantung derajat keasaman). Daun tua kehilangan klorofil sehingga warnanya berubah menjadi kuning atau merah (dapat dilihat dengan jelas pada daun yang gugur) yang dapat diketahui melalui analisis dengan spektofotometer. Oleh sebab itu dilakukan praktikum ini untuk mengetahui panjang gelombang maksimum kandungan klorofil daun Rama dengan menggunakan alat spektrofotometer.

II. TUJUAN PRAKTIKUMPraktikum ini bertujuan untuk mengetahui prinsip kerja, kalibrasi dan penentuan panjang gelombang maksimum klorofil pada daun Rama yang berada di lingkungan Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) dengan spektrofotometer UV-VIS

III. METODE PRAKTIKUM3.1 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah Kuvet Quarts, spektrofotometer Uv-Visible Lamda 25 Perkin Elmer, tabung reaksi, penangas air, erlenmeyer.Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah akuades, aseton, sampel daun.3.2 Posedur Kerjaa) Preparasi sampelSampel daun dihancurkan dengan menggunakan mortar lalu ditambahkan pelarut aseton, dan disaring kemudian diambil hasil ekstraksinyab) Kalibrasi alat spektrofotometer Uv-VisDinyalakan alat spektrofotometer selama 15 menit untuk menstabilkan cahaya dan fotodetektor. Disiapkan larutan blanko (aquades), dimasukan kedalam kuvet yang telah dibersihkan sebelumnya dengan tisue. Dipilih menu aplikasi waveength scan. Dimasukan range panjang gelombang, yaitu jika scan range UV 400-200 nm, jika range Visible 800-400 nm Dilakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan blanko (minimal 2 kali dengan menekan tombol autozero)c) Penentuan panjang gelombang maksimum klorofil daun RamaDitentukan range panjang gelombang yang akan digunakan. Dimasukan sampel ekstrak daun kedalam kuvet yang kering dan bersih. Dilakukan scanning panjang gelombang maksimum untuk sampel daun hingga dihasilkan nilai lamda maksimun.

IV. HASIL DAN PEMBAHASANPrinsip dari spektrofotometer UV-Vis adalahpenyerapan sinar tampak untuk ultraviolet dengan suatu molekul dapat menyebabkan terjadinya eksitasi molekul dari tingkat energi dasar (ground state) ketingkat energi yang paling tinggi (excited stated). Pengabsorbsian sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu molekul umumnya menghasilkan eksitasi elektron ikatan, akibatnyapanjang absorbsi maksimum dapat dikolerasikan dengan jenis ikatan yang ada didalam molekul(Hendayana,1994).Panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar, 1990). Pengukuran panjang gelombang maksimum pada sampel daun yang memiliki kandungan klorofil dilakukan dengan menggunakan spektofotometer UV-VIS. Range panjang gelombang yang digunakan yaitu 400-800 nm dan blanko yang digunakan yaitu aseton karena aseton inilah yang digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi daun. Blanko yang digunakan dalam spektrofotometer UV-VIS adalah akuades ataupun pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi (Sofyan, 2009).

Gambar 4. Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum

Hasil pengukuran yang dilakukan diketahui ada dua puncak serapan, serapan pertama memiliki panjang gelombang sebesar 662,17 nm dan menyerap spektrum warna merah dan serapan kedua memiliki panjang gelombang sebesar 432,03 nm dan menyerap spektrum warna biru (Gambar 4) serta terdapat kandungan senyawa klorofil. Menurut Sofyan ( 2009) pada panjang gelombang 625 740 nm menyerap spektrum warna merah, dan pada panjang gelombang 425 500 nm menyerap spektrum warna biru. Data yang diperoleh terdapat panjang gelombang 432.03 dan 661.93 nm yang mendekati literatur klorofil yang berwarna hijau karena menyerap cahaya dengan kuat di daerah biru (430 nm) dan merah (662 nm) pada spektrum tampak. Panjang gelombang maksimum bervariasi tergantung pada pelarut yang digunakan. (Gross, 1991)

Gambar 5. Spektrum absorpsi klorofil a dan klorofil b Sasmitamihardja (1990)

Menurut Sasmitamihardja (1990) dan Dwidjoseputro (1994) panjang gelombang pada senyawa klorofil memiliki dua puncak serapan yang berada pada panjang gelombang 662 nm untuk klorofil A dan 453 nm untuk klorofil B (Gambar 5). Pigmen klorofil akan menyerap cahaya dengan panjang gelombang dan cahaya yang diserap akan hilang dengan melepaskan panas. Pigmen klorofil menyerap lebih banyak cahaya tampak pada warna biru pada panjang gelombang 400-450 nm dan merah pada panjang gelombang 650-700 nm.Pengukuran panjang gelombang maksimum klorofil pada daun hanya memiliki rentang daerah serapan, bukan suatu nilai yang diskrit. Hal ini dikarenakan adanya pengaruh pelarut yang digunakan pada proses ekstraksi. Dengan bertambahnya kepolaran pelarut pada transisi *, bentuk puncak bergeser ke panjang gelombang yang lebih pendek (pergeseran biru atau hipsokromik), sedangkan jika bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang (pergeseran merah atau batokromik). Pergeseran biru disebabkan bertambahnya solvasi pasangan elektron hingga berakibat energinya turun. Pergeseran merah terjadi akibat bertambahnya kepolaran pelarut (~ 5 nm), disebabkan gaya polarisasi antara pelarut dan spesies, sehingga berakibat menurunnya selisih tingkat energi eksitasi dan tingkat tidak tereksitasi (Kristianingrum,2014).Spektrum penyerap warna untuk klorofil A dan B pada daun menunjukkan keefektifan relatif panjang gelombang berbeda yang menggerakkan reaksi fotosintesis, karena cahaya dapat bekerja dengan menyerap energi didalam kloroplas. Energi foton yang akan diserap akan dirubah menjadi energi potensial elektron yang dinaikkan dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi, tetapi keadaan eksitasi ini berlangsung singkat dan elektron-elektron kembali ke tingkat energi semula dengan melepaskan energi berlebihnya sebagai panas (Sofyan, 2009).

V. KESIMPULAN Kesimpulan yang didapat dalam praktikum ini adalah1. Prinsip kerja pada spektrofotometer UV-VIS berdasarkan interaksi materi dengan energi cahaya.2. Mengkalibrasi spektrofotometer UV-VIS dengan melakukan scanning wavelength terlebih dahulu menggunakan pelarut sampel daun yaitu aseton.3. Panjang maksimum yang dihasilkan terdapat dua puncak serapan yaitu sebesar 662,16 nm dengan spektrum warna merah dan 431,59 nm dengan spektrum warna biru dan diidentifikasi terdapat kandungan senyawa klorofil.4. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan larutan blanko yaitu aseton, diatur nilai absorbansinya 0 dan nilai transmitannya 100%.

VI. DAFTAR PUSAKAAdnan, Mochamad. 1997.Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. ANDI.Yogyakarta.Dwidjoseputro, D. 1994. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. PT. Gramedia Pustaka Utama. JakartaGandjar, I.G. & A. Rohman. 2007.Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.Gross, J. 1991. Pigment in Vegetables (Chlorophylls and Carotenoids). Van Norstran Reinhold. New York. 775 pp. Hendayana, Sumar. (1994).Kimia Analitik Instrumen. Semarang: Semarang Press.Jatim, Sofyan. 2009. Spektometri Serapan dan Emisi Atom. Jakarta : PT. Gramedia Jakarta.Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press. Kristianingrum, Susila. 2014. Handout spektroskopi ultra violet dan sinar tampak (spektroskopi uv vis). Universitas Negeri Yogyakarta.PaviaL. Donald, et al. 1995,Introduction to Organic Laboratory Techniques,Saunders College,USA.R.A. Day, JR and Underwood, 1986,Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga,Jakarta.Sitorus, M. 2009. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik Edisi Pertama. Graha Ilmu. Yogyakarta.Sasmitamihardja, 1990. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Bandung: ITB BandungSkoog, D.A. 1996.Fundamental of Analytical Chemistry, &nd ed. Sauders College Publishing.Willerd, H.H.et al. 1988.Instrumental Methods of Analysis,Wadsworth.