LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIAI. II. III. Nomor Percobaan : VII Nama Percobaan : Kromatografi Lapis Tipis

Tujuan Percobaan : 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan KLT 2. Mengetahui harga Rf asam amino

IV.

Dasar Teori Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup

dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi; ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. (Lehninger Kunci struktur ribuan protein yang berbeda-beda adalah gugus pada molekul unit pembangun protein yang relative sederhana. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masingmasing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. (Lehninger, 1982) Asam amino adalah senyawa dan amina organik yang (biasanya -NH2).

memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH)

Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon yang sama (disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang

paling banyak

dipelajari

karena

salah

satu

fungsinya

sangat

penting

dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Gambar Struktur asam -amino, dengan gugus amina di sebelah kiri dan gugus karboksil di sebelah kanan

Atom C pusat tersebut dinamai atom C ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C ini, senyawa tersebut merupakan asam -amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Asam amino dalam bentuk tidak terion (kiri) dan dalam bentuk zwitterion.

Karena asam amino memiliki gugus aktif amina dan karboksil sekaligus, zat ini dapat dianggap sebagai sekaligus asam dan basa (walaupun pH alaminya biasanya dipengaruhi oleh gugus-R yang dimiliki). Pada pH tertentu yang disebut titik isolistrik, gugus amina pada asam amino menjadi bermuatan positif (terprotonasi, NH3+), sedangkan gugus karboksilnya menjadi bermuatan negatif

(terdeprotonasi, COO-). Titik isolistrik ini spesifik bergantung pada jenis asam aminonya. Dalam keadaan demikian, asam amino tersebut dikatakan

berbentuk zwitter-ion. Zwitter-ion dapat diekstrak dari larutan asam amino sebagai struktur kristal putih yang bertitik lebur tinggi karena sifat dipolarnya. Kebanyakan asam amino bebas berada dalam bentuk zwitter-ion pada pH netral maupun pH fisiologis yang dekat netral. Menurut Lehninger (1982), Asam amino dapat digolongkan berdasarkan gugus R. Terdapat empat golongan asam amino: (1) golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik, (2) golongan dengan gugus R polar, tetapi tidak bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan negatif, dan (4) golongan dengan gugus R bermuatan positif. 1. Golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik Gugus R dalam golongan asam amino ini merupakan hidrokarbon, dan bersifat hidrofobik. Meliputi lima asam amino dengan gugus R alifatik (alanin, valin, leusin, isoleusin, dan prolin), dua dengan lingkaran aromatic (fenilalanin dan triptofan), dan satu yang mengandung sulfur (metionin). 2. Golongan dengan gugus R polar tidak bermuatan Gugus R dari asam amino polar lebih larut di dalam air, atau lebih hidrofilik, dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung gugus fungsionil yang membentuk ikatan hydrogen dengan air. Meliputi: glisin, serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin, dan glutamine. 3. Golongan dengan gugus R bermuatan negative Mengandung gugus R dengan muatan total negative pada pH 7 adalah asam aspartat dan asam glutamate, masing-masing mempunyai tambahan gugus karboksil. Asam amino ini merupakan senyawa induk asparagin dan glutamine berturut-turut. 4. Golongan dengan gugus R bermuatan positif Asam amino yang mengandung gugus R dengan muatan total positif pada pH 7 adalah lisin, yang mengandung tambahan gugus amino (kedua) pada posisi di rantai alifatiknya; arginin, yang mengandung gugus guanidine bermuatan positif; dan histidin yang mengandung gugus inidazol yang mengion sedikit.

Asam amino mempunyai sifat yaitu dapat dipisahkan. Pada umumnya, asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh dengan campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masingmasing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroferosis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan

kromatografi penukar ion.

1. Kromatografi Kertas Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi, yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit pada kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dlam pelarut tertentu. Pelarut itu akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pealrut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu dengan lain, dan dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang telah terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatu asam amino tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang ditempuh pelarut dari gas awal hingga garis akhir (a), lambang Rf. Harga Rf yaitu bila b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah

diketahui macamnya pada kromatografi kertas, sehingg dapat diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan asam amino dapat dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino, kemudian dibandingkan dengan harga Rf asam amino yang terdapat pada tabel yang ada.

2. Kromatografi penukar Ion Pemisahan asam amino dengan metode ini menggunakan polimer sintetik yang mempunyai gugu fungsi yang bersifat asam dan dapat melepaskan ion H+ atau bersifat basa dan dapat melepaskan ion OH-. Ion-ion tersebut dapat dilepaskan apabila ada ion lain yang dapat menggantikannya. Pada pelaksanaanya, larutan yang mengandung beberapa asam amino dituangkan di bagian atas suatu kolom penukar ino yang terdapat dalam sebuah tabung atau pipa gelas. Kemudian dilakukan elusi dengan jalan mengalirkan sutau larutan buffer (misalnya pH = 3,0) secara perlahan-lahan dari atas ke bawah.

3. Elektroferosis Elektroferosis merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus alirtan fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.

4. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak. Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung

beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata maka lempeng dikeringkan. Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kirakira setengah jam. Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium. Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 10 g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Teknik ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan pada suhu kamar, sampai permukaan pelarut mencapai 15-18 cm. Waktu yang diperlukan antara 20-40 menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat juga digunakan dalam kromatografi lapis tipis. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam kromat

seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan penegrokan setelah pemisahan selesai. Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya : 1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan. 2. Tidak memerlukan waktu yang banyak 3. Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT 4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan menggunakan kromatografi lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat. Pada KLT terdapat adsorben yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide), kieselguhr (iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang sering dipakai adalah silika gel. Selain terdapat fasa stationer atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, kloroform (kloroform yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum.

V.

Alat Dan Bahan 1. alat : a. pelat kromatografi

b. selembar kaca c. penggerus d. beker gelas e. gelas ukur f. pipet tetes g. botol semprot h. penggaris i. pensil

2. Bahan a. silika gel b. pelarut etanol c. larutan ninhidrin d. larutan Kuprinitrat e. larutan asam amino (asam glutamat, arginin, alanin) f. aquades

VI.

PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25

gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada

plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. (b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifat irreversibel.

VII.

Hasil PengamatanLarutan Asam Glutamat Arginin Alanine 8 cm 7,5 cm 3 cm Jarak Warna Merah Biru Ungu

VIII.

Persamaan ReaksiREAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANOL O H3N+

O O

C CH R

+

CH 3CH 2OH etanol

H3N

+

C CH R OCH 2CH 3

+

H2O

asam amino REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRINO C C C O OH

HOH

+

R

C

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2O C C C O H OH

asam amino H

+

R

C O

O C C C O OH OH

ninhidrinO C C C O

O C

N

C C O

+

3H2O

+

H

+

berw arna merah muda

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRITO H2N CH R C OH O O O C Cu R NH 2 O++

+

Cu(NO 3)2 kuprinitrit

C R

+

2NO 3-

NH 2

asam amino senyaw a kompleks ungu

IX.

Analisa Data

Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir. 1. Pada Arginin, Rf =7,5cm 0,75 10cm 8cm 0,8 10cm

2. Pada Asam Glutamat, Rf = 3. Pada Alanin, Rf =

3cm 0,3 10cm

X.

Pembahasan Percobaan kromatografi lapis tipis pada asam amino bertujuan

untuk mengetahui

cara

pemisahan

asam

amino

dengan

menggunakan

kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf dari asam-asam amino yang diselidiki. Untuk uji KLT ini digunakan beberapa asam amino, seperti arginin, asam glutamate, dan alanin. Fase diam yang digunakan pada percobaan KLT ini adalah silica gel, sedangkan fase geraknya adalah etanol. Pembuatan lapisan silika gel pada plat kaca, harus secara hati-hati dan juga harus menggunakan plat kaca yang benar-benar bersih dan terbebas dari lemak. Kemudian, siilika gel yang telah dibuat pada plat kaca terlebih dahulu dikeringkan baru bisa digunakan. Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penyemprotan ninhidrin dilakukan untuk mendapat bercak noda atau untuk membuat pewarnaan sehingga akan diperoleh harga Rf dari masing-masing asam

amino tersebut. Sedangkan kegunaan dari penyemprotan kuprinitrat untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnai dengan ninhidrin sehingga akan terjadi kupri-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya akan stabil bila tidak ada asam bebas. Dan seharusnya setelah disemprot, plat hanya dikenakan uap amino, dan plat tidak boleh terkena uap air karena ikatan kompleks tersebut akan terdisosiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. Pada analisa data, diperoleh nilai Rf untuk Arginin sebesar 0,75 , asam glutamate sebesar 0,8 , dan alanin 0,3. Dari analisa data yang diperoleh ini,

Rf untuk teori dan praktek agak berbeda. Hal ini dapat saja disebabkan oleh : 1. kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya. 2. kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang digunakan 3. suhunya tidak dibuat tetap atau dijaga pada saat kromatografi dilakukan. 4. penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang terlalu dekat.

XI.

Kesimpulan 1. Kromatografi merupakan salah satu cara untuk melakukan

pengidentifikasikan suatu asam amino. Kromatografi Lapis Tipis merupakan salah satunya. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen (fase gerak)nya adalah etanol. 2. Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membnadingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat. 3. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya.

XII.

Daftar Pustaka

Lehninger, 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ERLANGGA Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

XIII.

Gambar Alat

Plat Kaca

Botol semprot

Pipet Tetes

Beker gelas

Gelas Ukur

Batang Pengaduk

Penggaris

Pensil

XIV.

Jawaban Pertanyaan

1. Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Suatu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya? Jawab: 25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amino, masing-masing adalah alanin, asam glutamat, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol 95%). Stelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan engan ninhidrin dan dikeringkan kemabli selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya : Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah :

Harga Rf = Maka : 1. Pada Arginin, Rf =7,5cm 0,75 10cm 8cm 0,8 10cm

2. Pada Asam Glutamat, Rf = 3. Pada Alanin, Rf = 4. Pada sampel, Rf =

3cm 0,3 10cm7,5cm 0,75 10cm

2. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRINO C C C O OH

HOH

+

R

C

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2O C C C O H OH

asam amino H

+

R

C O

O C C C O OH OH

ninhidrinO C C C O

O C

N

C C O

+

3H2O

+

H

+

pigmen berw arna ungu

3. Sebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT? Jawab : Kepolaran senyawa, jarak penetesan, kualitas adsorben, ketebalan lapisan, kejenuhan ruang kromatografi, tehnik pengembangan (elusi), suhu, dan kualitas pelarut.

4. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis? Jawab : Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam eetanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai noda-noda coklat. Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lmepeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak luus dari arah semula.

5. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu? Jawab: Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.