kajian hidrolisis enzimatik minyak ikan untuk … · karakterisasi minyak ikan yang diperoleh...

KAJIAN HIDROLISIS ENZIMATIK

OMEGA-3 MENGGUNAKAN

DITAMBAHKAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

ENZIMATIK MINYAK IKAN UNTUK PRODUKSI

MENGGUNAKAN LIPASE Aspergillus niger PADA MEDIA

DITAMBAHKAN HEPTANA

Oleh

Zulfatun Najah

F 34052594

2010



BOGOR

1

UNTUK PRODUKSI

PADA MEDIA YANG

2

Zulfatun Najah. F34052594. Kajian Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi Omega-3 Menggunakan Enzim Lipase Aspergillus niger Pada Media Yang Ditambahkan Heptana. Di bawah bimbingan Sapta Raharja. 2010.

RINGKASAN

Pengolahan ikan sarden selama ini terbatas pada pemanfaatan daging ikan untuk produk pangan seperti pengalengan ikan atau konsumsi daging ikan segar. Limbah yang berupa minyak dan limbah padat yang dihasilkan dari proses pengalengan tersebut terbuang dan tidak termanfaatkan lebih lanjut. Padahal, minyak ikan maupun limbah padat tersebut mengandung omega-3. Omega-3 bermanfaat untuk kesehatan diantaranya mencegah penyumbatan pembuluh darah, hipertensi, kanker, arthritis, jantung koroner, dan lain-lain (Shahidi et all., 1998).

Omega-3 merupakan asam lemak tak jenuh yang tersusun dari rantai karbon panjang. Proses pengkayaan omega-3 dapat dilakukan melalui reaksi selektif hidrolisis pada sn-1 dan sn-3 gliserida menghasilkan sn-2 gliserida yang kaya akan omega-3 dengan menggunakan enzim lipase Aspergillus niger. Menurut Bockisch (1993), asam lemak tak jenuh dengan rantai panjang menempati posisi ke dua rantai gliserida. Reaksi hidrolisis enzimatik merupakan reaksi pembentukan asam lemak dan gliserol dari triasilgliserol dengan penambahan air dan katalis enzim. Proses pengkayaan dan pemurnian omega-3 dilakukan dengan reaksi hidrolisis. Penambahan media hidrofobik, dapat meningkatkan aktivitas maupun stabilititas enzim atau bahkan meningkatkan selektifitas substrat. Pelarut heptana digunakan sebagai media untuk peningkatan aktivitas dan stabilitas enzim karena nilai hidrofobitasnya berada pada rentang 2-4.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kondisi optimum faktor reaksi yaitu suhu, penambahan air, dan pH terhadap tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan. Selain itu, juga bertujuan untuk menentukan hubungan total omega-3 dengan tingkat hidrolisis. Tahapan penelitian ini dimulai dari karakterisasi minyak ikan, pengukuran aktivitas lipase dengan metode spectrophotometry, kemudian penentuan kondisi optimum faktor reaksi terhadap tingkat hidrolisis sebagai acuan penentuan kondisi optimum untuk reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana. Tingkat hidrolisis menunjukkan aktivitas katalitis enzim terhadap ikatan ester triasilgliserol. Suhu, pH, dan banyaknya air yang digunakan pada rentang 25oC-65oC, 5-9, dan 1%-5%. Prosedur penelitian dimulai dengan melakukan hidrolisis enzimatik minyak ikan kemudian melakukan hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana menggunakan kondisi optimum hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan tanpa penambahan pelarut. Analisa yang dilakukan adalah bilangan asam, bilangan penyabunan dan Gas Chromatography Mass Spectrometry.

Karakterisasi minyak ikan yang diperoleh adalah bilangan asam sebesar 3,26 mg KOH/g minyak dan bilangan penyabunan sebesar 204,81 mg KOH/g. Minyak awal mengandung asam lemak tak jenuh (34,98%) mengandung omega-3 1,81%, asam lemak jenuh (22,76%), alkana (11,19%), aldehid (0,88%), squalene (4,8%) dan kolesterol (24,96%). Aktivitas enzim lipase yang diperoleh adalah 7939 U/g. Pada reaksi hidrolisis enzimatik, diperoleh aktivitas katalitis enzim optimum adalah pada pH5 dan suhu 45oC dengan tingkat hidrolisis sebesar 28,07%. Pada reaksi hidrolisis

3

enzimatik pada media yang ditambahkan heptana diperoleh penambahan air optimum adalah 1% dengan tingkat hidrolisis sebesar 26,16%. Dengan menggunakan nilai optimum tersebut (pH 5, suhu 45oC, dan penambahan air 1%) dilakukan reaksi hidrolisis enzimatik dengan penambahan heptana. Hasil yang diperoleh adalah terjadi peningkatan aktivitas pada setiap perlakuan suhu kecuali 65oC. Suhu optimum yang diperoleh adalah 25oC. Pada perlakuan pH, terjadi penurunan aktivitas pada tiap titik perlakukan pH kecuali pada pH 7. Penurunan aktivitas terjadi karena denaturasi enzim.

Berdasarkan analisa GC-MS, pada reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada suhu 45oC dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar 17,51% dengan tingkat hidrolisis sebesar 28,07%. Sedangkan, pada suhu 45oC dan pH 7, kandungan omega-3 sebesar 16,89% dengan tingkat hidrolisis 6,79%. Pada reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana, kandungan omega-3 pada suhu 45oC, penambahan air 1%, dan pH 5 sebesar 7,14% dengan tingkat hidrolisis sebesar 22,56%. Sedangkan, pada suhu 25oC, penambahan air 1%, dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar 10,48% dengan tingkat hidrolisis 23,94%.

4

Zulfatun Najah. F34052594. Study of Enzymatic Hydrolysis of Fish Oil to Produce Omega-3 Using Aspergillus niger Lipase in Added-Heptane Media. Supervised by Sapta Raharja. 2010.

SUMMARY

Nowadays, the processing of sardine fish was as canned fish. The Waste was solid waste and fish oil which discarded and unusable further. However, this waste contains Omega-3. Omega-3 fatty acids were considered of essential for normal growth. It might be an important role to in the prevention and treatment of coronary artery disease, hypertension, arthritis, other inflammatory and autoimmune disorders, and cancer (Shahidi et al., 1998).

Omega-3 was polyunsaturated fatty acids (PUFAs) contains long chain carbon double bound. Concentrate omega-3 was done by selective hydrolysis in sn-1 and sn-3 glyceride to produce sn-2 glyceride greatly in omega-3 using enzyme lipase from Aspergillus niger yeast. According Bockisch (1993), in the majority of fish oil triglycerides, PUFAs were bound to the 2-position of the glyceride backbone. Enzymatic hydrolysis was produce acylglycerol from triacylglycerol using water as reactant and enzyme as catalyst. Some studies indicate that PUFA were most promptly absorbed from the intestines when FFA was given orally, were moderately absorbed as acylglycerols and were poorly absorbed as PUFA ethyl ester (Carvalho et al., 2009). Organic solvent hydrofobic could be used as medium in the hydrolysis reaction to increased activity and stability enzyme. Even if, it increased substrat selectivity. Solvent hydrophobic heptane almost used as media to increased activity and stability due to it hydrophobocity at the range 2<log p<4.

This research aims to determined reaction factor condition that could produce maximum degree of hydrolysis of fish oil in media without or with added-heptane media. Besides, it determined the correlation between maximum degree of hydrolysis of fish oil and sum amount of omega-3 fatty acid. The step of this research are characterize fish oil, calculate Activity enzyme (unit), and determine correlation between reaction parameter such as temperature, pH, and water addition as basis optimum condition for hydrolysis enzymatic in added-heptane media. Temperature, pH and water content used in this research are 25oC-65oC, 5-9, and 1%-5% respectively. Degree of hydrolysis showed catalytic activity enzyme to the ester bound triacylglycerol. Procedure of this research started with do enzymatic hydrolysis fish oil and do hydrolysis fish oil on the medium heptane. Analysis include acid value, saponification value, and GC MS measurement.

Fish oil in this research had acid value and saponification value as much 3,26 and 204,81 respectively. Fish oil contain 34,98% unsaturated fatty acid include omega-3 as big as 1,81%,22,76% saturated fatty acid, alkana (11,19%), aldehid (0,88%), squalene (4,8%) and lanosterol (24,96%). Unit activity from the spectrophotometry measurement was 7939 U/g. Optimum condition according to the enzymatic hydrolysis were pH 5 and 45oC. The degree of this condition was 28,07%. According to the enzymatic hydrolysis in added heptane media, water addition optimum is 1% with the 26,16% degree hydrolysis. By using this optimum condition (pH 5, temperature 45oC, and water addition 1%), enzymatic hydrolysis in organic solvent were done. Heptane used as organic solvent media. According to this

5

research, in every point of temperature, the degree of hydrolysis increased except at 65oC due to denaturation of protein enzyme at 65oC. Temperature optimum for hydrolysis enzymatic in the organic solvent heptane was 25oC. According to the analysis effect pH on the activity resulted decreasing the activity lipase catalyzed or reduction of degree of hydrolysis in every point of pH except in pH 7. Decreasing of lipase activity due to denaturation of enzyme.

According to the GC MS measurement, total omega-3 at temperature 45oC pH 5 was 17,51% with degree of hydrolysis 28,07%. At the temperature 45oC and pH 7, total omega-3 and degree of hydrolysis was 16,89% and 6,79% respectively. According to the hydrolysis enzymatic with heptane as medium, at the temperature 45oC, water addition 1%, and pH 5, omega-3 and degree of hydrolysis are 7,14% and 22,56% respectively. But at the temperature 25oC, pH 5 and water addition 1% result in 10,48 % total omega-3 and 23,94% degree of hydrolysis. Generally, hydrolysis enzymatic could purify and enrich omega-3 in the product.

6

KAJIAN HIDROLISIS ENZIMATIK MINYAK IKAN UNTUK

PRODUKSI OMEGA-3 MENGGUNAKAN LIPASE Aspergillus niger

PADA MEDIA YANG DITAMBAHKAN HEPTANA

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknologi Pertanian

pada Departemen Teknologi Industri Pertanian

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

Zulfatun Najah

F 34052594

2010



BOGOR

1

SURAT PERNYATAAN

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul

“Kajian Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi Omega-3

Menggunakan Lipase Aspergillus niger Pada Media yang Ditambahkan

Heptana” adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing

akademik kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya.

Bogor, 25 Februari 2010

Yang membuat pernyataan,

Zulfatun Najah

F34052594

2

Judul Skripsi : KAJIAN HIDROLISIS ENZIMATIK MINYAK IKAN UNTUK

PRODUKSI OMEGA-3 MENGGUNAKAN LIPASE Aspergillus

niger PADA MEDIA YANG DITAMBAHKAN HEPTANA

Nama : Zulfatun Najah

NIM : F34052594

Menyetujui,

Pembimbing I,

( Dr. Ir. Sapta Raharja, DEA)

NIP. 19631026 199002 1 001

Mengetahui:

Ketua Departemen

(Prof. Dr.Ir.Nastiti Siswi Indrasti)

NIP. 19621009 198903 2 001

Tanggal Lulus :

3

BIODATA RINGKAS

Penulis bernama Zulfatun Najah dilahirkan di Blora pada

tanggal 1 Juni 1987. Penulis merupakan anak pertama dari

empat bersaudara. Nama orang tua penulis adalah Ahmad

Zainal Arifin dan Sad Triasri. Pada tahun 1999, Penulis

menyelesaikan pendidikan dasar di SD Tempelan II Blora.

Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah

Pertama di SLTPN 1 Blora pada tahun 2002. Kemudian,

penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Atas

di SMAN 1 Blora dan lulus pada tahun 2005. Pada tahun 2005, penulis diterima pada

program sarjana Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI. Pada penentuan

program studi tahun 2006, penulis diberi kesempatan untuk menimba ilmu di

Program Studi Teknologi Industri Pertanian.

Pada saat menjalani kegiatan akademik, penulis pernah aktif dalam kegiatan

kemahasiswaan yaitu menjadi staf reporter pada Bulletin MIND yang diterbitkan

oleh Himpunan Mahasiswa Industri Pertanian. Penulis juga mengikuti kompetisi

ilmiah pada Program Kreativitas Mahasiswa bidang penulisan kewirausahaan (2007).

Penulis juga mejadi penyaji terbaik V dalam kompetisi penulisan ilmiah bidang

lingkungan hidup dengan tema tulisan sampah organik dan sampah non organik.

Penulis menyelesaikan praktek lapang pada tahun 2008 di pabrik pembekuan

udang PT. Misaja Mitra Pati dengan judul “Mempelajari Aspek Produksi dan

Pengawasan Mutu Udang Beku di PT. Misaja Mitra Pati”. Untuk menyelesaikan

pendidikan di Departemen Teknologi Industri Pertanian, penulis melakukan

penelitian yang berjudul “Kajian Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi

Omega-3 Menggunakan Enzim Lipase Aspergillus niger Pada Media yang

Ditambahkan Heptana”. Pada Tahun 2010 penulis menyelesaikan program studi

Strata-I

4

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim,

Segala puji bagi Allah SWT Tuhan Pemilik Alam dan penguasa Ilmu, atas

segala rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan penyususunan skripsi

yang berjudul “Kajian Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi

Omega-3 Menggunakan Lipase Aspergillus niger Pada Media yang

Ditambahkan Heptana”.

Dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini, penulis

mendapat bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu pada kesempatan ini penulis ingin

mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada segenap pihak dibawah ini yang

telah banyak membantu.

1. Dr. Ir. Sapta Raharja, DEA, selaku pembimbing akademik yang telah

memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis selama pendidikan di IPB

dan penulisan skripsi.

2. Prayoga Suryadarma, STP, MT, dan Dr. Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Sc

selaku dosen yang telah memberikan arahan, bimbingan, serta bantuannya

selama penelitian.

3. Drs. Purwoko, Msi dan Ir. S. Ketaren, MS selaku dosen penguji yang telah

memberikan saran kepada penulis

4. Seluruh laboran dan staf di Departemen Teknologi Industri Pertanian atas

segala bantuan selama penulis melaksanakan penelitian.

5. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan yang tidak dapat

Penulis sebutkan satu persatu.

Segala daya dan kemampuan telah diupayakan demi sempurnanya karya tulis

ini, namun penulis menyadari karya tulis ini belum mencapai sempurna karena

adanya keterbatasan penulis. Kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan

untuk kesempurnaan di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi

civitas akademika dan pihak yang membutuhkan

Bogor, Maret 2010

Penulis

iii

5

UCAPAN TERIMAKASIH

Pada kesempatan kali ini, penulis mengucapkan terima kasih dan

penghargaan yang sebesar-besarnya kepada berbagai pihak yang telah membantu

1. Bapak dan ibu atas segala cinta, kasih sayang, perhatian, pengorbanan, dorongan

moral maupun material dan doa senantiasa terlantun untuk penulis. Terimakasih

atas segala cinta dan kasih yang diberikan. Karya ini penulis persembahkan untuk

bapak dan ibu. Semoga karya ini dapat membuat bapak dan ibu bangga.

2. Adik-adik tercinta (Ulun Najib, Ainun Navis, dan Sofia Naim) atas doa, canda

tawa dan dukungannya selama ini. Penulis berharap melalui karya ini, adik-adik

mempunyai dorongan, semangat, dan motivasi yang lebih besar lagi untuk adik-

adik dalam memperjuangkan apa yang menjadi harapan adik-adik.

3. Saudara-saudara, Om Azhar, Bulik Almuftiyah, Bulik Rustin, Bulik Umi, Om

Tito, Bude Sri, Bude Edi, Mbah Putri, Dik Tito dan semuanya terima kasih atas

perhatian, doa dan dukungan moril yang diberikan.

4. Temen-temen satu bimbingan Mbak Zuni, Kak Yayan, Mbak Listya, Mbak Ika,

Ambar, Teni, Choir, Manda atas segala bantuan yang diberikan.

5. Temen-temen TINer’42 khususnya Danu, Aulia, Arif, Ajizah, Eri, terimakasih

atas kerjasamanyadi laboratoratorium Bioindustri selama penelitian serta Diar,

Nutri, Prima, Deni, Rey, Sulis, Mayang, dan semua temen TIN atas

kerjasamanya selama penulis menimba ilmu di IPB.

6. Temen-Temen Crew Edelweis Diar, Mbak Cita, Mbak Ninik, Malya, Risca, Sri,

atas nasehat, canda tawa, dan masukan-masukan untuk penulis

iv

6

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR .................................................................................... iii DAFTAR ISI .................................................................................................. v DAFTAR TABEL .......................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xii

I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG ......................................................................... 1

B. TUJUAN ............................................................................................. 4

II. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5

A. MINYAK IKAN ................................................................................. 5

B. ASAM LEMAK TAK JENUH OMEGA-3 .......................................... 7

C. ENZIM LIPASE Aspergillus niger ...................................................... 10

D. HIDROLISIS ENZIMATIS ................................................................. 15

E. PELARUT N-HEPTANA .................................................................... 16

F. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM LIPASE ........................................................... 19

1. Pengaruh Suhu ................................................................................ 19

2. Pengaruh pH ................................................................................... 20

3. Pengaruh Penambahan Air .............................................................. 21

III. METODOLOGI ....................................................................................... 24

v

7

A. ALAT DAN BAHAN .......................................................................... 24

B. METODE ............................................................................................ 24

1. Tahapan Penelitian .......................................................................... 24

a. Karakterisasi Minyak Ikan ....................................................... 25

b. Penentuan Aktivitas Enzim ...................................................... 26

c. Penentuan Hubungan Derajat Keasaman dan Suhu Terhadap Tingkat Hidrolisis Enzimatis Minyak Ikan ............................... 26

d. Penentuan Hubungan Penambahan Air, Suhu, dan Derajat Keasaman Terhadap Tingkat Hidrolisis Enzimatis Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana .......................... 26

e. Penentuan Hubungan Tingkat Hidrolisis Dengan Kandungan

Total Omega-3 ......................................................................... 27

2. Prosedur Penelitian ......................................................................... 28

a. Hidrolisis Enzimatis Minyak Ikan ............................................ 28

b. Hidrolisis Enzimatis Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana .............................................................. 28

c. Preparasi Konsentrat Hasil reaksi Hidrolisis Untuk Analisa GC-MS .................................................................................... 30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 31

A. KARAKTERISTIK MINYAK IKAN .................................................. 31

1. Sifat Fisiko Kimia Minyak Ikan ...................................................... 31

2. Komponen Kimia di Dalam Minyak Ikan ........................................ 32

B. AKTIVITAS ENZIM .......................................................................... 34

C. HUBUNGAN DERAJAT KEASAMAN DAN SUHU TERHADAP TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKAN ................... 35

1. Hubungan Derajat Keasaman Terhadap Tingkat Hidrolisis ............. 36

2. Hubungan Suhu Terhadap Tingkat Hidrolisis .................................. 38

vi

8

D. HUBUNGAN PENAMBAHAN AIR, DERAJAT KEASAMAN DAN SUHU TERHADAP TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKAN PADA MEDIA YANG DITAMBAHKAN HEPTANA .......................................................................................... 41

1. Hubungan Penambahan Air Dengan Tingkat Hidrolisis................... 41

2. Hubungan Derajat Keasaman (pH) dengan Tingkat Hidrolisis ......... 43

3. Hubungan Suhu dengan Tingkat Hidrolisis ..................................... 45

E. HUBUNGAN TINGKAT HIDROLISIS DENGAN KANDUNGAN TOTAL OMEGA-3 ............................................................................. 47

V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 55

A. KESIMPULAN ................................................................................... 55

B. SARAN ............................................................................................... 55

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 56 LAMPIRAN ................................................................................................... 61

vii

9

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Sifat fisikokimia minyak ikan komersial ......................................... 6 Tabel 2. Komponen asam lemak dalam minyak ikan sarden ......................... 7 Tabel 3. Kandungan omega-3 pada beberapa komoditas pertanian ................ 8 Tabel 4. Jenis asam lemak omega-3 .............................................................. 9 Tabel 5. Aktifitas mikrobial dan karakteristik enzim lipase .......................... 13 Tabel 6. Nilai kepolaran dan laju reaksi esterifikasi pelarut ........................... 18 Tabel 7. Karakterisasi bahan baku minyak ikan ............................................ 31 Tabel 8. Komponen kimia bahan baku minyak ikan ...................................... 32 Tabel 9. Ukuran sampel berdasarkan perkiraan bilangan asam ...................... 62 Tabel 10. Nilai karakterisasi fisiko kimia minyak ikan .................................... 65 Tabel 11 Komponen kimia minyak ikan hasil analisa GC-MS ....................... 67 Tabel 12. Hasil pengukuran aktivitas lipase Aspergillus niger ......................... 69 Tabel 13. Nilai % hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa

penambahan heptana pada perlakuan berbagai macam pH ulangan 1 ........................................................................................ 70

Tabel 14. Nilai % Hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa

penambahan heptana pada perlakuan berbagai macam pH ulangan 2 ........................................................................................ 71

Tabel 15. Nilai % hidrolisis kontrol minyak ikan pada media tanpa

penambahan heptana pada perlakuan berbagai macam pH ............... 71 Tabel 16. Nilai % hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa

penambahan heptana pada perlakuan berbagai suhu ........................ 72 Tabel 17. Nilai % hidrolisis kontrol minyak ikan pada mediatanpa

penambahan heptana pada perlakuan berbagai suhu ........................ 72

vi

10

Tabel 18. Nilai % hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media yang ditambahkan heptana pada perlakuan berbagai penambahan air ulangan 1 ................................................................................... 73

Tabel 19. Nilai % hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media yang

ditambahkan heptana pada perlakuan berbagai penambahan air ulangan 2 ................................................................................... 74

Tabel 20. Nilai % hidrolisis kontrol minyak ikan pada media yang

ditambahkan heptana pada perlakuan berbagai penambahan air ................................................................................................... 74

Tabel 21 Nilai % hidrolisis minyak ikan pada media yang ditambahkan

heptana pada perlakuan berbagai pH ulangan 1 ............................... 75 Tabel 22 Nilai % hidrolisis minyak ikan pada media yang ditambahkan

heptana pada perlakuan berbagai pH ulangan 2 ............................... 77 Tabel 23. Nilai % hidrolisis minyak ikan pada media yang ditambahkan

heptana pada perlakuan berbagai suhu ulangan 1 ............................ 78 Tabel 24. Nilai % hidrolisis minyak ikan pada media yang ditambahkan

heptana pada perlakuan berbagai suhu ulangan 2 ............................ 79 Tabel 25.Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis

enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5 suhu 45oC ...................................................................................... 80

Tabel 26. Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis

enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 7 suhu 45oC ....................................................................................... 83


enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 25oC ....................................................................................... 87


enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 45oC ....................................................................................... 91

ix

11

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Rumus molekul dari asam lemak Omega-3 ................................. 8 Gambar 2. Mekanisme pembentukan asil enzim pada reaksi yang

dikatalisis oleh enzim lipase ....................................................... 11 Gambar 3. Mekanisme hidrolisis spesifik triasilgliserol dengan katalis

lipase .......................................................................................... 13 Gambar 4. Struktur asam amino penyusun enzim lipase Aspergillus

niger ........................................................................................... 14 Gambar 5. Tahapan hidrolisis trigliserida yang dikatalis oleh lipase ............. 16 Gambar 6. Mekanisme pengikatan air dan media pelarut organic dalam

suatu reaksi ................................................................................ 23 Gambar 7. Diagram alir tahapan penelitian .................................................. 25 Gambar 8. Diagram alir proses hidrolisis enzimatik minyak ikan ................. 29 Gambar 9. Mekanisme katalisis enzim pada paranitrobutirat ........................ 34 Gambar 10. Mekanisme pembentukan kompleks substrat-enzim .................... 36 Gambar 11. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan pH pada reaksi

hidrolisis enzimatik .................................................................... 37 Gambar 12. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan suhu reaksi pada

reaksi hidrolisis enzimatik .......................................................... 38 Gambar 13. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan penambahan air

pada reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana .................................................................. 42

Gambar 14. Mekanisme katalisis enzim lipase regioselektif Aspergillus

niger pada media organik ......................................................... 42 Gambar 15. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan pH pada reaksi

hidrolisis enzimatik tanpa penambahan heptana dan reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana ....... 43

x

12

Gambar 16. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan suhu pada reaksi hidrolisis enzimatik dengan penambahan heptana dan pada reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan pelarut heptana ...................................................................................... 45

Gambar 17. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan asam eikosapentanoat

pada reaksi hidrolisis enzimatis terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi ............................................ 48

Gambar 18. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan asam

dokosaheksanoat pada reaksi hidrolisis enzimatis terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi .................. 50

Gambar 19. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan total omega-3 pada

reaksi hidrolisis enzimatis terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi .................................................... 51

Gambar 20. Pathway metabolisme polyunsaturated fatty acid ......................... 52 Gambar 21. Peak area analisa GC-MS minyak ikan ....................................... 66 Gambar 22. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis

enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5 suhu 45oC ................................................................................... 77

Gambar 23. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis

enzimatipada media tanpa penambahan heptana pada pH 7 suhu 45oC ................................................................................... 82


enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 25oC ................................................................................... 86


enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 25oC ................................................................................... 90

Gambar 26. Fragmentasi pada mass spectrometry ........................................... 95 Gambar 27. Chromatogram ............................................................................. 95

xi

13

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Prosedur analisa sifat fisiko kimia minyak ikan ........................... 62 Lampiran 2. Prosedur pengukuran aktivitas enzim lipase dengan metode

spektrofotometri ......................................................................... 64 Lampiran 3. Data hasil karakterisasi minyak ikan ........................................... 65 Lampiran 4. Data hasil pengukuran aktivitas enzim lipase Aspergillus niger

dengan metode spektrofotometri ................................................. 69 Lampiran 5. Data hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan

menggunakan enzim lipase Aspergillus niger dalam media tanpa ditambahkan pelarut heptana ............................................. 70

Lampiran 6. Data hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan

menggunakan enzim lipase Aspergillus niger dalam media yang ditambahkan pelarut n-heptana ........................................... 72

Lampiran 7. Data hasil analisa komponen asam lemak hasil hidrolisis

enzimatik pada kondisi optimum faktor reaksi menggunakan GC-MS (gas chromatography mass spectrometry) ..................... 77

Lampiran 8. Penentuan degree of hydrolysis atau tingkat hidrolisis ................. 94 Lampiran 9. Mekanisme kerja GC-MS ............................................................ 95

xii

1

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Selama ini, sebagian besar industri yang bergerak pada bidang perikanan

memanfaatkan kekayaan laut khususnya ikan terbatas pada dagingnya untuk

pengalengan ikan dan pengolahan ikan segar menjadi produk makanan jadi

seperti nugget dan olahan ikan segar. Pemanfaatan hasil perikanan tersebut

belum optimal. Hal ini dilihat dari masih adanya residu buangan seperti limbah

padat dan minyak residu pemanasan ikan. Potensi limbah tersebut amat besar.

Sebagai gambaran, volume limbah pengalengan ikan di Muncar, Kabupaten

Banyuwangi, Jawa Timur, mencapai 50-60 ton per bulan (Wawasan, 10 Juni

2009). Tidak adanya pemanfaatan lebih lanjut terhadap residu buangan tersebut.

Padahal limbah padat yang menghasilkan 9% minyak ikan maupun minyak ikan

itu sendiri memiliki kandungan omega-3 yang bermanfaat bagi kesehatan.

Semua asam lemak yang ditemukan di dalam minyak ikan dan semua

minyak yang sama merupakan campuran asam lemak jenuh dan asam lemak tak

jenuh. Karakterisasi minyak ikan terdiri dari asam lemak tak jenuh dengan

proporsi yang tinggi. Sebagian besar asam lemak tak jenuh tersebut adalah

C16(palmitoleat), C18(oleat dengan beberapa octadecatrienoat), C20

(eikosapentanoat) dan asam C22 (dokosaheksanoat). Asam lemak tak jenuh di

dalam minyak ikan berkisar antara 10-25% dari total asam (Celik, 2002).

Dengan demikian, minyak ikan memiliki asam lemak tak jenuh lebih banyak.

Asam lemak dengan ikatan rangkap pada rantai atom karbon ke tiga

hingga keempat dinamakan omega-3 dan biasanya disimbolkan dengan n-3.

Omega-3 polyunsaturated fatty acid mempunyai peran penting dalam kesehatan.

Asam lemak taki jenuh dengan banyak ikatan rangkap ini dapat diperoleh dari

minyak ikan. Omega-3 polyunsaturated fatty acids cis-5,8,11,14,17-

eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5) dan cis 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid

(DHA 22:6) merupakan komponen aktif pada minyak tersebut (Carvalho et al.,

2002). Selain asam lemak tersebut, terdapat juga asam lemak lain yang memiliki

ikatan rangkap pada atom ke tiga dengan atom karbon terakhir mengikat gugus

metil. Asam lemak ini dapat mencegah penyakit jantung, penyumbatan

2

pembuluh darah, hipertensi, arthritis, kanker, serta penyakit ketahahan tubuh

lainnya (Carvalho et al.,2009). Selain itu, asam lemak ini diperlukan untuk

nutrisi otak dan mata (Tanaka et al., 1992). Menurut Carvalho et al. (2009),

omega-3 polyunsaturated fatty acid dapat berbentuk free fatty acid (FFA), etil

ester, atau asilgliserol. Asilgliserol dianggap sebagai bentuk kimia yang

diinginkan dalam makanan karena asilgliserol diserap lebih mudah daripada etil

ester selama pencernaan. Asilgliserol dapat diperoleh melalui reaksi hidrolisis

minyak/lemak.

Reaksi hidrolisis memerlukan suatu katalis untuk mempercepat laju

reaksi. Polyunsaturated fatty acid (PUFA) sensitif terhadap panas dan oksidasi,

oleh sebab itu reaksi enzimatik merupakan proses yang cocok untuk pengkayaan

PUFA ini (Shimada et al., 1997). Kelebihan penggunaan enzim sebagai katalis

adalah enzim dapat bekerja bekerja pada suhu rendah dan pH netral sehingga

biaya yang dikeluarkan untuk produksi lebih murah. Disamping itu, enzim juga

dapat direcovery. Dengan demikian, pengaturan prosesnya lebih mudah. Enzim

lipase bereaksi lemah terhadap Omega-3 karena adanya rintangan steric (Shahidi

dan Wanasundara, 1998). Omega-3 pada minyak ikan sebagian besar terdapat

pada posisi beta dari triacylglycerol atau yang sering disebut posisi sn-2

gliserida. Menurut Carvalho et al. (2009), salah satu jenis enzim lipase yang

memberikan hasil hidrolisis selektif terbaik adalah lipase yang dihasilkan oleh

Aspergillus niger. Hal tersebut dikarenakan lipase dari Aspergillus niger

mempunyai spesifisitas posisional memutus ikatan triacylglycerols pada posisi

stereochemical numbering (sn)1 dan 3. Dengan demikian, akan dihasilkan

monoacylglycerols yang pada umumnya kaya akan PUFA omega-3 pada

posisional sn-2 gliserida.

Aktivitas katalisis enzim dipengaruhi oleh pH, suhu, dan konsentrasi

substrat (Kamarudin et al., 2008). Pada reaksi hidrolisis enzimatik, aktivitas

katalitik dipengaruhi oleh suhu, pH, konsentrasi substrat, penambahan air dan

adanya senyawa penghambat (Zaverucka dan Wimmer, 2008). Suhu

berpengaruh terhadap aktivitas dan stabilitas enzim lipase. Suhu yang sesuai

untuk penggunaan enzim lipase sebagai katalis adalah dibawah 70oC karena

pada suhu tinggi menyebabkan terjadinya migrasi alkil secara non enzimatik,

3

oksidasi, isomerisasi dan denaturasi enzim (Shahidi dan Wanasundara, 1998).

Enzim sangat sensitif terhadap perlakuan medium pH, karena memungkinkan

perubahan status ionisasi enzim atau perubahan muatan ion, yang akan

mempengaruhi aktivitas dan selektifitasnya (Kamarudin et al., 2008). Zarevucka

dan Wimmer (2008) menyatakan air berguna untuk menghubungkan substrat ke

sisi aktif enzim melalui ikatan nonkovalen, meningkatkan fleksibilitas dan

mobilitas enzim dalam menghidrolisis substrat.

Enzim lipase memiliki sisi aktif yang ditutup oleh lid. Lid enzim lipase

khususnya yang berasal dari Aspergillus niger terbuat dari triptofan yang

cenderung bersifat hidrofobik. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu pelarut organik

yang mempunyai sifat non polar (hidrofobik) sehingga dapat meningkatkan

kontak antara pelarut organik hidrofobik dan lid enzim yang mampu

meningkatkan pembukaan lid enzim tersebut. Penambahan pelarut non polar

dapat meningkatkan termostabilitas (Gubicza et al., 2000), dan aktivitas (Gupta

et al., 2007).

Berdasarkan penelitian Krieger et al. (2004), stabilitas protein lebih

rendah dalam air yang tak larut dalam pelarut yang ada pada nilai log P (nilai

hidrofobitas) antara 2,5 sampai 0 seperti aseton dan eter daripada pada pelarut

hidrofobik dengan nilai log P antara 2 sampai 4 seperti alkana atau haloalkana.

Pelarut organik hidrofilik bersifat memotong ikatan air dari permukaan enzim.

Ketika pelarut organik memotong ikatan air dari enzim, berakibat pada tidak

adanya ikatan antara molekul gugus amino enzim. Oleh sebab itu, penerimaan

stabilitas enzim lipase pada penggunaan pelarut hidrofilik jarang dilakukan.

Pelarut yang bersifat hidrofobik dimana kepolarannya berada pada rentang

penerimaan stabilitas enzim lipase adalah heptana. Heptana memiliki nilai log p

sebesar 4. Selain itu, titik didih heptana sebesar 98 oC. Dengan demikian

pelaksanaan penelitian pada suhu yang tinggi memungkinkan dilakukan. Pelarut

yang kepolarannya hampir sama dengan lipase adalah heksana. Berhubung

heksana memiliki titik didih yang rendah, maka penggunaan heptana menjadi

solusi dalam reaksi hidrolisis pada medium non aqueous.

4

B. TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk:

a. Menentukan kondisi optimum faktor reaksi yaitu suhu, pH, dan penambahan

air yang menghasilkan tingkat hidrolisis enzimatik tertinggi pada substrat

minyak ikan pada reaksi hidrolisis minyak ikan tanpa dan dengan

penambahan pelarut heptana.

b. Menentukan hubungan antara tingkat hidrolisis enzimatik optimum minyak

ikan terhadap total asam lemak omega-3.

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. MINYAK IKAN

Minyak ikan diproduksi melalui pengirisan, pemotogan, serta

pemasakan pada suhu 90oC selama 15 menit. Minyak ikan diperoleh dari organ

tubuh ikan seperti kepala ikan. Minyak kasar yang diperoleh dipisahkan dan

dimurnikan dengan alkali dan diputihkan. (Chang et al., 1989). Minyak ikan

merupakan fraksi lemak yang diperoleh dari ekstraksi ikan atau sebagai salah

satu hasil samping dari industri pengalengan ikan yang dihasilkan karena

pemanasan dan sterilisasi selama proses sehingga minyak dari ikan terekstrak

dan terbuang bersamaan dengan panas (Aidos, 2002). Minyak ikan

mengandung fraksi lemak seperti triasilgliserol, diasilgliserol,

monoasilgliserol, fosfolipid, steril ester, sterol dan asam lemak bebas (Saify et

al., 2003)

Minyak ikan ini bermanfaat bagi kesehatan. Minyak ikan yang belum

dimurnikan masih berbau ikan, tengik, dan bau amis. Hal ini dikarenakan

autoksidasi dari asam lemak jenuh rantai ganda serta pembusukan bahan

protein (Chang et al., 1989). Menurut Ketaren (1996), bau amis pada minyak

disebabkan karena adanya senyawa trimetil amin oksida akibat oksidasi

komponen trimetil amin oleh peroksida yang berinteraksi dengan asam lemak

tak jenuh, sedangkan minyak yang berbau tengik dapat disebabkan karena

adanya oksidasi pada minyak/lemak dengan udara, aksi mikroba, absorpsi bau

oleh lemak dan aksi enzim dalam jaringan yang mengandung lemak. Bau amis

disebabkan oleh interaksi trimetilamin oksida dengan ikatan rangkap dari

lemak tidak jenuh. Pembentukan trimetilamin oksida disebabkan karena reaksi

oksidasi trimetilamin dengan gugus peroksida dalam lemak. Trimetilamin

sendiri bersumber dari lesithin yang mengalami pemecahan ikatan C-N pada

gugus choline (CH2OH. CH2. NMe) oleh zat pengoksida.

6

Minyak ikan komersial memiliki standar mengenai sifat fisiko kimianya.

Menurut Celik (2002), sifat fisiko-kimia ditunjukkan oleh Tabel 1.

Tabel 1. Sifat fisiko-kimia minyak ikan komersial

Sifat Jumlah

Bilangan asam 10,15

Bilangan penyabunan 187,4

Kadar asam lemak bebas 4,6

Bilangan Iod 64,93

Bilangan Polenske 0,6

Bilangan Reichert-Meissl 1,76

Bahan tak tersabunkan (%) 0,46

Sumber : Celik (2002)

Perbedaan utama minyak ikan dengan minyak lain adalah keunikan

jenis asam lemak yang dikandung minyak ikan. Minyak ikan mengandung

asam lemak tidak jenuh dalam jumlah yang besar. Asam lemak minyak ikan

mengandung 15% hingga 3 % lemak jenuh. Persentase asam lemak tak jenuh

yang tinggi ditemukan di minyak yang berasal dari ikan atau komoditas laut

lain. Banyaknya kandungan asam lemak dalam minyak ikan berbeda

tergantung dari jenis ikan, makanan ikan, tempat hidup ikan, dan lain-lain

(Wang et al., 1990).

Jumlah kandungan omega terbesar terdapat pada ikan. Asam lemak

omega-3 dilambangkan dengan n-3. Minyak ikan merupakan sumber terbaik

asam lemak omega-3. Keuntungan utama konsumsi omega-3 dari minyak ikan

adalah mengurangi penyumbatan pembuluh darah oleh kolesterol sehingga

dapat mencegah tekanan darah tinggi dan mengurangi resiko penyakit jantung

(Wang et al., 1990).

7

Minyak ikan sarden memiliki komponen asam lemak tak jenuh yang

lebih banyak. Komposisi minyak ikan sarden menurut Gutierrez dan Silva

(1993) ditunjukkan oleh Tabel 2

Tabel 2. Komponen asam lemak dalam minyak ikan sarden

Sumber : Gutierrez dan Silva (1993)

B. ASAM LEMAK TAK JENUH OMEGA-3

Asam lemak tidak jenuh jamak (Polyunsaturated Fatty Acid) adalah

asam lemak yang mempunyai ikatan rangkap lebih dari satu pada rantai asam

lemaknya (Rasyid, 2001). Omega-3 merupakan asam lemak dimana terdapat

ikatan rangkap diantara atom karbon ketiga dan keempat terhitung dari gugus

metil atom karbon pertama. Asam lemak ini dinamakan omega-3 dan biasanya

Jenis atom Karbon Nama Komponen Jumlah (%)

C 12:0 Asam Laurat 0,1

C 14:0 Asam Miristat 9,8

C 16:0 Asam Palmitat 16,2

C16:1 Asam Palmitoleat 11,3

C18:0 Asam Stearat 1,3

C18:1 Asam Oleat 9,8

C20:0 Asam Eikosenoat 0,3

C18:3 dan C20:1 Asam Linolenat dan Asam

Gondorunat

2,6

C20:2 Asam Eikosadienoat 2,5

C22:3 dan C22:1 Asam Dokosatrienoat dan

Asam Erukat

4,8

C20:4 Asam Arachidonat 0,2

C20:5 Asam Eikosapentanoat 24,2

C22:4 Asam Dokosatetranoat 2,4

C22:5 Asam Dokosapentanoat 2,2

C22:6 Asam Dokosaheksanoat 6,5

8

disimbolkan dengan n-3 (Wang et al.,1990). Struktur dari asam omega-3 dapat

dilihat dari Gambar 1.

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH

Asam Linolenat (C18:3)

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH= CH-

(CH2)3-COOH

Asam Eikosapentanoaot(C20:5)

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-

CH2-CH CH-(CH2)2-COOH

Asam Dokosahesanoat (C22:6)

Gambar 1. Rumus molekul dari asam lemak omega-3 (Ackman, 1982)

Wang et al. (1990) menyatakan bahwa kandungan minyak ikan

dengan omega-3 tinggi terdapat pada ikan yang hidup pada kadar garam

tinggi. Dinginnya suatu lingkungan hidup ikan tidak menjadikan indikator

dalam menentukan banyaknya kandungan omega-3. Kandungan omega-3

pada beberapa komoditas pertanian menurut Wang et al. (1990) dapat dilihat

pada Tabel 3.

Tabel 3. Kandungan omega-3 pada beberapa komoditas pertanian

Asam Lemak Tipe Lambing Sumber

Asam α-linolenat N-3 α-LA Flax, canola, fish oil

Asam eikosapentanoat N-3 EPA Minyak ikan Asam dokosaheksaenoat N-3 DHA Minyak ikan

Sumber: Wang et al. (1990)

Omega-3 yang terkandung di dalam minyak ikan dapat dimurnikan

melalui proses pada suhu yang rendah. Apabila proses deodorisasi dilakukan

diatas suhu 200oC akan terjadi reaksi kimia sehingga akan menurunkan

manfaat biologis dari minyak ikan tersebut (Chang et al., 1989). Metode untuk

pengkayaan omega-3 bermacam-macam. Namun, hanya sedikit yang cocok

untuk produksi skala besar, diantaranya adsorption chromatography, fractional

molekuler atau distilasi molekuler, hidrolisis enzimatik, kristalisasi temperatur

rendah, dan urea complexation (Shahidi dan Wanasundara, 1998b)

9

Asam lemak omega-3 bermacam-macam jenisnya. Jenis asam lemak

omega-4 dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Jenis asam lemak omega-3

Nama Umum Rumus Nama Kimia

16:3 (n−3) all-cis-7,10,13 hexadecatrienoic

acid

α-Linolenic acid

(ALA)

18:3 (n−3) all-cis-9,12,15-octadecatrienoic

acid

Stearidonic acid

(SDA)

18:4 (n−3) all-cis-6,9,12,15-

octadecatetraenoic acid

Eicosatrienoic acid

(ETE)

20:3 (n−3) all-cis-11,14,17-eicosatrienoic

acid

Eicosatetraenoic acid

(ETA)

20:4 (n−3) all-cis-8,11,14,17-

eicosatetraenoic acid

Eicosapentaenoic acid

(EPA)

20:5 (n−3) all-cis-5,8,11,14,17-

eicosapentaenoic acid

Docosapentaenoic

acid (DPA),

Clupanodonic acid

22:5 (n−3) all-cis-7,10,13,16,19-

docosapentaenoic acid

Docosahexaenoic acid

(DHA)

22:6 (n−3) all-cis-4,7,10,13,16,19-

docosahexaenoic acid

Tetracosapentaenoic

acid

24:5 (n−3) all-cis-9,12,15,18,21-

docosahexaenoic acid

Tetracosahexaenoic

acid (Nisinic acid)

24:6 (n−3) all-cis-6,9,12,15,18,21-

tetracosenoic acid

Sumber : (http://en.wikipedia.org/wiki/omega_3.htm)

Kehadiran cis- ikatan ganda antara atom karbon dengan karbon pada

asam lemak menyebabkan pembengkokan rantai asam lemak. Oleh karena itu,

gugus metil asam lemak yang dekat dengan ikatan ester meyebabkan rintangan

sterik (steric hindrance) pada lipase. Tingginya gugus cis- pada EPA dan DHA

meningkatkan rintangan sterik (steric hindrance), oleh karena itu, lipase tidak

10

dapat mencapai ikatan ester diantara asam lemak dan gliserol. Namun, asam

lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh satu rantai ganda tidak menghalangi

katalisis lipase terhadap ikatan ester dan dengan mudah reaksi hidrolisis terjadi

(Shahidi dan Wanasundara, 1998b). Rintangan sterik (steric hindrance) adalah

penghambatan struktur atom. Steric hindrance terjadi karena suatu gugus

molekul yang membentuk suatu ruang dengan ukuran tertentu menghambat

terjadinya reaksi kimia.

C. ENZIM LIPASE Aspergillus niger

Enzim adalah protein yang terdiri dari asam amino dalam komposisi dan

urutan yang teratur dan tetap. Enzim berfungsi sebagai katalis biologis yang

digunakan makhluk hidup untuk melaksanakan berbagai konversi senyawa

kimia (Web dan Dixon, 1979). Semua enzim yang telah diamati sampai saat ini

adalah protein, dan aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas

strukturnya sebagai protein (Lehninger, 1995).

Enzim lipase didefinisikan sebagai enzim yang mengkatalis hidrolisis

ikatan ester. Menurut system International Union of Biochemistry, enzim

lipase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolase dengan nama sistematik gliserol

ester hidrolase (EC 3.1.1.3) yang menghidrolisis gliserida menjadi asam lemak

bebas, gliserida parsial (monogliserida, digliserida) dan gliserol (Macrae,

1983).

Pengkayaan omega-3 dapat dilakukan melalui reaksi kimia seperti

esterifikasi, hidrolisis, dan perubahan asam lemak dalam ester (asidolisis)

dengan metode enzimatik sebagai katalis (Shahidi dan Wanasundara, 1998b).

Hal ini dikarenakan keuntungan penggunaan enzim lipase sebagai katalis

hanya membutuhkan suhu dan pH mendekati kondisi ruang (Moore et al.,

1996). Selain itu, efisiensi katalitik dari enzim lipase sangat tinggi, sehingga

hanya membutuhkan enzim dalam jumlah yang sedikit. Keuntungan lain

penggunaan enzim lipase adalah selektivitasnya tinggi, menghilangkan

penggunaan katalis inorganik dan bahan kimia berbahaya lainnya, bekerja

optimal pada kondisi ringan sehingga dapat menghemat energi, menghasilkan

produk yang kualitas warna dan kemurniannya baik, dan dapat digunakan

11

kembali jika enzim yang digunakan terimobilisasi (Haraldson et al., 1997).

Menurut Lehninger (1982), enzim merupakan katalis yang dapat mempercepat

reaksi tanpa ikut bereaksi. Mekanisme peningkatan laju reaksinya dengan cara

menurunkan energi aktivasi.

Pada reaksi hidrolisis, enzim lipase mengkatalisis pelepasan ikatan ester

triasilgliserol dengan membutuhkan air secara bersamaan. Penggunaan enzim

sebagai katalis dapat menurunkan penggunaan energi pada suatu proses

industri karena enzim dapat beroperasi pada kondisi mendekati suhu ruang.

Hidrolisis enzimatik dapat dilakukan dalam suatu media organik pada suhu

ruang dan menghasilkan produk yang tidak berwarna gelap serta tidak

teroksidasi. Asam lemak yang diproduksi setelah reaksi hidrolisis dipisahkan

dari enzim menggunakan pelarut organik (Akoh dan Min, 1998)

Gambar 2. Mekanisme pembentukan asil enzim pada reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase (Hariyadi, 1995)

Reaksi yang dikatalis oleh enzim lipase diperkirakan terjadi melalui

pembentukan suatu senyawa antara yaitu asil-enzim (Macrae, 1983).

Mekanisme katalitik yang diasumsikan untuk lipase triasilgliserol berpusat

pada sisi aktif serin. Nukleofil oksigen pada sisi aktif serin berbentuk

tetrahedral hemicetal intermediet dengan triasilgliserol. Hal ini ditunjukkan

oleh Gambar 2. Ikatan ester pada hemicetal tersebut dihidrolisis dan

diasilgliserol dilepaskan. Sisi aktif serin asil ester bereaksi dengan molekul air

dan asil enzim dilepaskan sehingga asam lemak terlepas (Petterson et al,. 2001)

12

Menurut Gandhi (1997) ada dua kategori dimana lipase dapat digunakan

sebagai katalis yaitu :

a Hidrolisis

RCOOR’ + H2O RCOOH + R’OH

b Sintesis

Reaksi sintesis dapat dipisahkan menjadi :

i. Esterifikasi

RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2O

ii. Interesterifikasi

RCOOR’ + R”COOR” RCOOR” + R”COOR’

iii. Alkoholisis

RCOOR’ + R”OH RCOOR” + R’OH

iv. Asidolisis

RCOOR’ + R”COOH R”COOR’ + RCOOH

Penggunaan lipase sebagai katalis untuk menghasilkan konsentrat EPA

dan DHA dapat lebih menguntungkan, hal ini karena :

a. katalis lipase mempunyai efisiensi katalitik yang tinggi dan bila dalam

kondisi immobilisasi dapat dipergunakan kembali.

b. rentangan selektivitasnya terhadap asam lemak telah diketahui dan sangat

penting dalam penggunaan berkelanjutan (Fatimah, 2002).

Lipase mikroba diproduksi dari fermentasi bakteri, kapang dan khamir.

Mikroba penghasil lipase adalah Rhizopus delemar, Aspergilus niger,

Geotrichum candidum, Candida rugosa, dan Chromobacterium viscocum

(Gandhi, 1997). Lipase berdasarkan cara kerjanya dibagi menjadi tiga yaitu:

a lipase non spesifik yaitu lipase yang dapat mengkatalis seluruh ikatan

trigliserida

b lipase spesifik 1,3 atau 2 yaitu lipase yang dapat mengkatalis trigliserida

pada ikatan 1,3 atau 2

c lipase spesifik yaitu lipase yang hanya mengkatalis jenis asam lemak

tertentu (Herawan, 1993).

Menurut Carvalho

selektif enzim regio 1,3 lipase ditunjukkan oleh gambar 3 berikut.

Gambar 3. Mekanisme hidrolisis spes(Carvalho et al.

Tabel 5. Aktifitas mikrobial dan karakteristik enzim lipase Jenis Lipase

Aspergillus niger

Mucor meihei

Rhizopus oryzae

Rhizopus niveus

Candida cylindracea

Chromobacterium viscosum

Geotrichum candidum

Pseudomonas sp

Sumber : Shahidi dan Wanasundara (1998)

Lipase yang

dimensi yang memiliki fenomena interfasial karena adanya loop peptide yan

menutupi enzim yang dikenal dengan lid enzim. Pada suatu interfase air, lipase

mempunyai struktur sekunder yang membuatnya tidak dapat dilalui substrat.

Dengan adanya interfase air

terbuka. Sisi aktif lipa

suatu larutan, segmen heliks akan menutup sisi aktif lipase, namun dengan

adanya lemak/minyak atau pelarut organik, terjadi perubahan bentuk dimana

lid akan membuka (Ozturk, 2001). Lid enzim lipase

Carvalho et al. (2009), mekanisme reaksi hidrolisis oleh


Gambar 3. Mekanisme hidrolisis spesifik triasilgliserol dengan katalis lipase et al., 2009)

Tabel 5. Aktifitas mikrobial dan karakteristik enzim lipase Manufaktur Suhu

Optimal

pH

Optimal

Aspergillus niger Amano Enzyme 30-40 5-7

Novo Nordisk 30-45 6,5-7,5

Rhizopus oryzae Amano Enzyme 30-45 5-8

Rhizopus niveus Amano Enzyme 30-45 5-8

Candida cylindracea Amano Enzyme 30-50 5-8

Chromobacterium viscosum Asahi Chemicals - -

Geotrichum candidum Amano Enzyme 30-45 6-8

Pseudomonas sp Amano Enzyme 40-60 5-9

Sumber : Shahidi dan Wanasundara (1998).

Lipase yang diproduksi oleh Aspergillus niger memiliki struktur tiga

dimensi yang memiliki fenomena interfasial karena adanya loop peptide yan



Dengan adanya interfase air-pelarut hidrofobik, lipase akan menjadi struktur

terbuka. Sisi aktif lipase terdiri dari asam amino aspartat-histidin



lid akan membuka (Ozturk, 2001). Lid enzim lipase Aspergillus niger

13

(2009), mekanisme reaksi hidrolisis oleh


ifik triasilgliserol dengan katalis lipase

Optimal

Spesifik

1,3 >>2

1,3 >>>2

1,3 >>>2

1,3 >>>2

Random

Random

Random

Random

memiliki struktur tiga

dimensi yang memiliki fenomena interfasial karena adanya loop peptide yang



pelarut hidrofobik, lipase akan menjadi struktur

histidin-serin. Pada



spergillus niger

14

terbentuk dari asam amino triptofan yang cenderung hidrofobik (Nuraida et al,

2000). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Nuraida et al. (2000) lipase

Aspergillus niger mengkatalisis asam palmitat, kaprilat, dan asam miristat lebih

banyak.

Asam amino triptofan merupakan asam amino yang cenderung non

polar, sedangkan asam amino aspartat merupakan jenis asam amino yang

bermuatan negatif. Asam amino histidin memiliki muatan positif sehingga

tergolong dalam asam amino positif, sedangkan asam amino serin cenderung

polar (Lehninger, 1982).

Gambar 4. Struktur asam amino penyusun enzim lipase Aspergillus niger (Lehninger, 1982)

Enzim lipase Aspergillus niger dari Amano A Parmaceutical

Manufactures Co. memiliki kandungan karbohidrat 68%, NaCL 0,1%, abu 6%,

uap air 5,1%, lemak 0,1%, dan protein 20,8% pada tiap gram serbuknya

(Boomer et al., 2001). Kadar protein pada enzim lipase tersebut cukup tinggi,

tetapi kadar karbohidrat juga tinggi. Menurut Boomer et al. (2001), kandungan

karbohidrat yang tinggi yang melebihi 50% akan menghambat aktivitas

lipolitik dari enzim. Pada reaksi hidrolisis minyak ikan menhaden, lipase

Aspergillus niger memiliki tingkat hidrolisis sebesar 9% selama 72 jam dengan

kandungan EPA 14% dan DHA 10%. Sedangkan pada reaksi hidrolisis minyak

ikan seal bubber, tingkat hidrolisis yang diperoleh selama 72 jam sebesar 25%

dengan konversi EPA dan DHA sebesar 7% dan 10% (Shahidi dan

Wanasundara, 1998).

Histidin Aspartat Serin Triptofan

15

D. HIDROLISIS ENZIMATIK

Salah satu reaksi yang terjadi pada produk atau bahan pangan

berlemak adalah hidrolisis, yaitu pembentukan gliserol dan asam lemak

bebas melalui pemecahan molekul lemak dan penambahan elemen air

(Hartley, 1977). Winarno (1997) menyatakan bahwa lemak dan minyak

dapat terhidrolisis menjadi gliserol dan asam lemak dengan adanya air.

Reaksi ini dapat dipercepat dengan adanya katalis basa, asam, dan enzim.

Pada umumnya proses hidrolisis disebabkan karena aktivitas enzim

dan mikroba. Proses hidrolisis dapat berlangsung bila tersedia sumber

nitrogen, garam mineral, dan sejumlah air. Hidrolisis yang terjadi pada

minyak atau lemak yang mempunyai asam-asam lemak dengan rantai karbon

panjang mengalami proses yang lebih lambat (Djatmiko dan Wijaya, 1984).

Efek air terhadap kinetika reaksi hidrolisis sangat penting karena air

dapat menyebabkan proses hidrolisis lemak dan akan mempengaruhi mutu

produk yang dihasilkan. Hidrolisis lemak merupakan reaksi kesetimbangan

yang memungkinkan terjadinya pengubahan arah reaksi dengan cara

mengatur kadar air sistem reaksi atau kandungan air (Kurashige et al., 1993).

Pada awalnya hidrolisis minyak dan lemak dilakukan dengan suhu

250 oC dan pada tekanan 50-55 bar (Loebis, 1989). Penggunaan proses ini,

selain membutuhkan energi yang cukup besar dan investasi peralatan yang

mahal, juga menghasilkan produk yang gelap dan berbau yang relatif kurang

disukai konsumen (Herawan, 1983). Untuk meminimumkan biaya,

meminimumkan energi dan meminimumkan produk yang kurang baik maka

dilakukan hidrolisis secara enzimatik (Macrae, 1983).

Menurut Herawan (1993), kelebihan hidrolisis enzimatik antara lain:

a. Reaksi dilakukan pada suhu rendah,sehingga kualitas produk lebih baik

b. Menggunakan lipase spesifik, sehingga produk yang diinginkan dapat

ditingkatkan dan produk samping dapat dikurangi.

c. Investasi lebih murah

d. Lingkungan kerja aman

Reaksi hidrolisis trigliserida terjadi secara bertahap dan merupakan

reaksi yang bersifat reversible (bolak-balik) sehingga akan berakhir dalam

Lipase

16

suatu kesetimbangan (Swern, 1979). Secara sistematik, reaksi hidrolisis yang

dikatalis oleh lipase disajikan pada Gambar 5

Triacylglicerol + H20 Diacylglicerol + Asam Lemak Bebas Diacylglicerol + H20 Monoacylglicerol + Asam Lemak Bebas Monoacylglicerol+H20 gliserol + Asam Lemak Bebas

Triacylglicerol +3 H20 gliserol + 3Asam Lemak Bebas

Gambar 5. Tahapan hidrolisis trigliserida yang dikatalis oleh lipase (Brockman, 1984)

Menurut Rahman et al.(2006), hidrolisis dengan katalis enzim lipase

dapat dilakukan pada media air, pelarut organik maupun media

nonkonvesional lainnya. Keuntungan penggunaan pelarut organik sebagai

media yaitu dapat meningkatkan stabilitas thermal enzim, pemisahan enzim

dari substrat atau produk dapat dilakukan secara mudah dan alami karena

enzim tidak larut dalam pelarut organik, aktivitas lipolitik enzim meningkat,

tidak menyebabkan perubahan pH media dan memungkinkan terjadinya

reaksi hidrolisis dalam lingkungan yang sedikit air.

E. PELARUT HEPTANA

Media yang sesuai untuk reaksi enzimatik adalah media dimana

protein tidak dapat terlarut. Karena pada media tersebut enzim akan

mengubah struktur tiga dimensinya dan non aktif (Zaks dan Klibanov,

1985). Media untuk reaksi enzimatik bermacam-macam, baik yang bersifat

polar maupun non polar. Media yang paling umum digunakan pada reaksi

hidrolisis adalah pelarut organik.

Pelarut dapat menyebabkan modifikasi bentuk enzim yaitu mengubah

efisiensi katalitiknya dan spesifitasnya. Berdasarkan Eeji dan Takashi

(1999), penggunaan media non konvensional akan meningkatkan

enantioselektivitas pada reaksi katalisis oleh biokatalis. Non aqueous media

reaksi seperti n-heksana juga akan meningkatkan stabilitas enzim (Rahman

et al., 2006). Keuntungan lain penggunaan pelarut non aqueous adalah resiko

kontaminasi mikrobial yang lebih rendah daripada pada sistem aqueous.

17

Ketertarikan khusus terhadap non konvensional media pada reaksi hidrolisis

dengan kadar air yang rendah dapat digunakan untuk reaksi sintesis yang

menyediakan kelarutan yang terbaik pada substrat hidrofobik dengan lipase

sebagai katalis (Krieger et al., 2004).

Stabilitas protein lebih rendah dalam air yang tak larut dalam pelarut

yang ada pada -2,5<logP<0 seperti aseton dan eter daripada pada pelarut

hidrofobik (2<logP<4) seperti alkana atau haloalkana. Pelarut organik

hidrofobik tidak dapat memotong ikatan asam amino dengan molekul air

dari permukaan enzim. Ketika pelarut organik memotong ikatan air dari

enzim, berakibat pada tidak adanya ikatan antara molekul. Pelarut organik

yang dapat memotong ikatan tersebut adalah bahan yang bersifat hidrofilik.

Oleh sebab itu, penerimaan stabilitas enzim lipase pada penggunaan pelarut

hidrofilik jarang dilakukan (Krieger et al., 2004)

Pelarut organik menghasilkan berbagai efek fisiko-kimia pada

molekul enzim. Pelarut akan mengubah bentuk asli dari enzim. Mekanisme

perubahan susunan proteinnya adalah dengan mengganggu ikatan hidrogen

dan interaksi hidrofobik. Dengan demikian aktivitas dan stabilitasnya akan

berubah (Kim et al., 2000).

Aktivitas lipase secara normal akan meningkat dengan meningkatnya

kepolaran (Schneider dan Berger, 1991). Namun, walaupun kepolaran suatu

larutan yang direpresentasikan sebagai log P merupakan faktor dalam

optimisasi biokatalisis, faktor lain seperti kelarutan substrat pada media

reaksi, dan penambahan air harus diperhatikan. Pada studi Kim et al. (2000),

esterifikasi trikaprilat dengan asam linoleat terkonjugasi dengan katalis

enzim lipase Rhizomucor miehei regioselektif menunjukkan tingkat

esterifikasi yang lebih tinggi pada pelarut n-hexane (log P 3,5) daripada

isooktana (log P 4,5). Pada media n-heksana.nilai, tingkat esterifikasinya

57% sedangkan pada isooktana bernilai 52%.

Koefisien partisi adalah rasio konsentrasi bahan yang tidak

terionisasi diantara dua larutan. Harga koefisien partisi suatu senyawa atau

yang sering disimbolkan dengan P didefinisikan sebagai kadar

keseimbangan termodinamik senyawa tersebut dalam fase non polar dibagi

18

dengan kadar dalam fase polar. Nilai log p menunjukkan tingkat hidrofobitas

suatu bahan. Semakin tinggi suatu senyawa terikat dengan oktanol, maka

semakin hidrofobik senyawa tersebut. Makin panjang rantai karbon atau

rantai samping karbon, bagian molekul yang non polar semakin tinggi.

Dengan demikian titik didihnya semakin tinggi dan kelarutannya dalam air

semakin kecil (http://en.wikipedia.org/wiki/ Partition_coefficient.htm).

Herees et al. (2008) menyatakan nilai log P suatu pelarut merupakan

fungsi dari laju reaksi esterifikasi untuk menghasilkan asam oleat. Koefisien

opartisi berbanding terbalik dengan konstanta dielektrik. Tabel 6

menjelaskan hubungan koefisien partisi, konstanta dielektrik, dengan laju

reaksi.

Tabel 6. Nilai kepolaran dan laju reaksi esterifikasi pelarut

Pelarut Nilai log

P

Laju reaksi

(x104 mol L-1s-1)

Konstanta dielektrik

heptana 4 8,17a 1,9b

Heksana 3,5 3,33a 2,0b

Toluena 2,5 2a 2,4b

Sumber : a Herees et al. (2008)

b (http://www.engineeringtoolbox.com/liquid-dielectric-constants-d_1263.html)

Menurut Klibanov (1985), penggunaan pelarut organik pada reaksi

hidrolisis ester mempunyai beberapa keuntungan selain penggunaan air,

yaitu:

a. Substrat organik bahan dapat larut dalam pelarut organik, dimana enzim

tidak dapat larut. Oleh karena itu, produk dan enzim mudah didapatkan

kembali dengan metode non ekstraksi. Dengan demikian rendemen

dapat meningkat.

b. Mampu untuk menjalankan reaksi yang tidak mungkin dilakukan

dengan air karena terdapat penghambatan kinetika dan termodinamika.

c. Substrat yang sensitif terhadap air dapat digunakan

d. Kesetimbangan reaksi berubah

e. Meningkatkan kestabilan enzim.

19

f. Ketidaklarutan enzim dalam media sehingga enzim mudah untuk

didapatkan dan digunakan kembali tanpa harus menggunakan

imobilisasi enzim.

Zaks dan Klibanov (1985) menyatakan, suatu model ideal dalam

penggunaan media pelarut organik pada reaksi enzimatik harus memenuhi

syarat seperti

a. Enzim yang digunakan bebas dari ikatan kovalen dengan kofaktor

b. Substrat yang digunakan larut dalam media organik

Pelarut heptana (C7H16) memiliki beberapa karakteristik yaitu nilai

kepolaran 4, bobot molekul 100,21 gram/mol, densitas 0,684 gram/mL

larutan, titik leleh -90,61oC, dan titik didih 98oC

(http://en.wikipedia.org/wiki /heptana.htm). Berhubung titik didihnya tinggi,

oleh sebab itu, penggunaan heptana sebagai media reaksi untuk aplikasi pada

suhu tinggi dapat dilakukan.

F. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM LIPASE

1. Pengaruh Suhu

Suhu yang tinggi dan kontak langsung panas selama distilasi akan

berdampak pada hidrolisis, oksidasi thermal, polimerisasi dan isomerisasi.

Degradasi asam lemak rantai panjang dengan banyak ikatan rangkap

kemungkinan membentuk asam lemak siklik, dan polimer dengan bobot

molekul tinggi (Shahidi dan Wanasundara, 1998b). Oleh karena itu, omega-3

yang cenderung labil membutuhkan suhu dan kondisi pH yang sesuai

(Haraldson et al., 1997).

Termostabilitas enzim merupakan faktor utama pada aplikasi

industri, dikarenakan thermal degradation enzim pada suhu tinggi. Suhu

dihubungkan dengan keterbatasan transfer massa. Suhu yang tinggi akan

menurunkan viskositas campuran minyak dan akan meningkatkan transfer

subsrat-produk pada permukaan atau di dalam partikel enzim. Suhu akan

berpengaruh pada stabilitas enzim dan affinitas enzim terhadap substrat dan

kompetisi reaksi dalam jumlah yang besar. Semakin tinggi suhu, akan

20

berakibat pada penurunan densitas dan viskositas media reaksi. Pada

penurunan densitas media, akan meningkatkan difusitas dan berakibat pada

peningkatan transfer massa substrat dan produk (Kim et al., 2004).

Suhu dapat berpengaruh positif terhadap reaksi hidrolisis maupun

sebaliknya. Kenaikan suhu akan meningkatkan laju reaksi. Namun, pada

reaksi menggunakan suhu tinggi struktur tersier enzim terganggu akibat

terjadi denaturasi. Pada suhu 50oC nilai tingkat konversinya berubah menjadi

cukup rendah. Sedangkan suhu 45oC merupakan suhu optimum reaksi

hidrolisis sebab pada suhu diatas 45oC tingkat konversinya turun secara tiba-

tiba dikarenakan enzim mengalami denaturasi (Kamarudin et al., 2008).

Suhu berpengaruh terhadap aktivitas dan stabilitas enzim lipase, suhu

yang sesuai untuk penggunaan enzim lipase sebagai katalis adalah dibawah

70oC karena pada suhu tinggi menyebabkan terjadinya migrasi alkil secara

non-enzimatic, terjadi oksidasi, isomerisasi dan denaturasi enzim (Shahidi et

al., 1998).

Stabilitas panas enzim dipengaruhi oleh dua faktor yaitu struktur

primer enzim dan komponen lain pada enzim. Tingginya kadar protein

hidrofobik pada molekul enzim akan membuat struktur enzim rapat dan

padat, dimana pada sistem ini enzim tidak mudah terdenaturasi karena

perubahan lingkungan eksternal enzim. Komponen spesifik pada enzim

seperti polisakarida dan kation divalen akan menstabilkan molekul enzim

(Oztrurk, 2001)

2. Pengaruh pH

Enzim sangat sensitif terhadap perlakuan medium pH, karena

memungkinkan perubahan status ionisasi enzim, yang akan mempengaruhi

aktivitas dan selektifitas. Studi yang telah dilakukan menunjukan pH

optimum untuk reaksi hidrolisis minyak sawit pada heksana adalah pH 7,5

dengan asam lemak yang dihasilkan 97,4% menggunakan enzim lipase dari

Candida rugosa. Enzim optimum pada medium alkali namun mendekati

netral (Kamarudin et al., 2008)

21

Berdasarkan studi Microbial Lipase Potential Biocatalist for the

future industry yang dilakukan oleh Saxena et al. (2009), titik isoelektrik

lipase adalah 4,3. Stabilitas lipase pada kondisi asam berada pada pH diatas

4. Stabilitas lipase pada kondisi basa berada pada pH diatas 8.

Katalisis enzim lipase aktif pada pH tertentu tergantung dari asal

enzim tersebut dan status ionisasi asam amino penyusunnya. Asam amino

asam, basa, dan netral hanya aktif pada satu bagian status ionisasi (Ozturk,

2001).

Berdasarkan Staufer (1989), ketertarikan studi mengenai tingkat

enzim sebagai fungsi pH dikarenakan karena beberapa faktor yaitu :

a. Status protonasi sisi rantai asam amino pada sisi aktif kompleks

enzim substrat (ES) mungkin akan berubah. Hasilnya perubahan

kemampuan enzim substrat untuk menjadi produk.

b. Perubahan ionik molekul substrat atau perubahan ionik sisi aktif

yaitu kecenderungan dua molekul tersebut untuk menjadi kompleks

ES.

c. Perubahan pH dari netral yang memungkinkan melemahkan kekuatan

stabilitas bentuk protein, yang berakibat peningkatan denaturasi

enzim (kehilangan aktivitas).

3. Pengaruh Penambahan Air

Air sangat diperlukan untuk aktivitas enzim. Air berpartisipasi dalam

seluruh interaksi non kovalen untuk mempertahankan bentuk sisi aktifnya

baik secara langsung maupun tidak langsung. Reaksi enzimatik yang

dilakukan tanpa keberadaan air akan mengubah sisi aktifnya secara drastis

sehingga menonaktifkan enzim (Zaks dan Klibanov, 1985).

Sejumlah air selalu diperlukan enzim lipase untuk mempertahankan

aktivitasnya. Namun, banyaknya air yang digunakan berbeda-beda

tergantung dari jenis enzim lipase. Banyaknya air juga tergantung pada

media reaksi, polaritas pelarut organik, dan lain-lain. Suatu reaksi yang

dilakukan dengan menggunakan enzim mengandung kurang dari 1% air dan

biasanya pada konsidi tanpa air (Haraldson et al., 1997).

22

Laju reaksi hidrolisis membutuhkan sejumlah air. Namun, terlalu

banyak air akan berakibat pada reaksi hidrolisis trigliserida yang berlebihan

yang berakibat pada peningkatan asam lemak bebas dan gliserida parsial

(monogliserida dan digliserida) (Dordick, 1989). Banyaknya air akan

mempengaruhi fleksibilits enzim (Krieger et al.,2004). Pengaturan kadar air

pada sistem ini menjadi sangat penting karena semua proses berdasarkan

pada manipulasi kesetimbangan kimia secara termodinamik pada reaksi

reversible dimana air berpartisipasi dalam reaksi. Selain itu, air diperlukan

secara esensial untuk menjaga integritas dari struktur tiga dimensi molekul

enzim. Aktivitas lipase merupakan fungsi dari kadar air. Enzim

membutuhkan sedikit layer hidrasi yang bertindak sebagai komponen primer

pada reaksi enzimatik pada suatu media organik. Layer ini akan bertindak

sebagai buffer diantara permukaan enzim dengan medium reaksi (Dordick,

1989)

Sejumlah air dibutuhkan untuk memaksimalkan aktivitas enzim.

Klibanov (1988) menyatakan bahwa sedikit air diperlukan untuk mencapai

aktivitas maksimal pada pelarut hidrofobik daripada pelarut hidrofilik. Pada

aktivitas kadar air yang rendah, semakin rendah polaritas suatu pelarut

berakibat semakin tinggi aktivitas enzim. Ketika aktivitas katalitik diplotkan

terhadap banyaknya air yang terikat dengan enzim, suatu pola muncul untuk

beberapa pelarut yang berbeda.

Menurut (Salis et al., 2008), walaupun air tidak ikut serta dalam

produk, namun kadar air dalam suatu reaksi sangat penting karena

mengekspresikan aktivitas enzimatik secara penuh. Air digunakan sebagai

pelumas pada rantai polipeptida. Hal ini akan mempengaruhi mobilitas.

Mobilitas lipase menjelaskan aktivitas enzimatik. Efek aktivitas enzim

dipelajari sebagai fungsi bobot sejumlah air pada reaksi trigliserida

metanolisis. Terlihat pada lipase Pseudomonas fluorescens inaktif ketika

media yang digunakan kering. Peningkatan aktivitas secara tajam terjadi

ketika 0,5 mg air/mg katalis ditambahkan.

23

Menurut Medina et al. (2003), mekanisme pengikatan air dan media

pelarut organik digambarkan oleh Gambar 6 sebagai berikut:

Gambar 6. Mekanisme pengikatan air dan media pelarut organik dalam suatu reaksi (Medina et al., 2003)

Pada percobaan yang dilakukan oleh Schneider dan Berger (1991)

menyatakan bahwa kenaikan laju reaksi menyebabkan disebabkan oleh

sejumlah air. Namun, total 1,2 dan 1,3 digliserida menurun. Pada media bi-

fase, monogliserida dan digliserida relative lebih stabil terhadap migrasi asil

pada pelarut organik dengan kadar air maksimum 2%.

Konsentrasi minyak dan air sebagai substrat dalam reaksi hidrolisis

juga mempengaruhi aktivitas lipase. Berdasarkan studi yang dilakukan oleh

Shimada et al. (1997), konsentrasi oil water ratio optimum pada reaksi

selektif hidrolisis adalah 50% dan aktivitasnya semakin menurun dengan

meningkatnya oil water ratio

24

III. METODOLOGI

A. ALAT DAN BAHAN

Bahan utama yang digunakan antara lain minyak ikan sarden murni yang

diperoleh dari PT. Muncar, Banyuwangi, Jawa Timur serta enzim lipase dari

Aspergillus niger yang diperoleh dari Amano Pharmaceutical Manufacturing Co,

buffer phosphate (0,1M), nitrogen, pelarut organik heptana, dan metanol.

Sedangkan, bahan yang digunakan untuk analisis terdiri dari KOH alkohol,

toluena, aquades, isopropil alkohol, KOH 0,1N, indikator phenolphtalein, dan

HCl 0,5N.

Alat yang digunakan dalam proses hidrolisis antara lain reaktor gelas

bertutup karet, suntikan, dan shaker waterbath. Sedangkan, alat yang digunakan

untuk analisis antara lain buret, erlenmeyer, pipet, gelas ukur, gelas piala, sudip,

kondensor, dan labu takar. Alat pendukung lainnya antara lain pH meter, vortex,

magnetic stirrer, hot plate, neraca analitik, dan GC-MS (Gas Chromatography

Mass Spectrometry).

B. METODE

1. Tahapan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan, yaitu penelitian

pendahuluan dan penelitian utama. Tahap pertama yaitu penelitian

pendahuluan meliputi karakterisasi minyak ikan dan penentuan aktivitas

enzim lipase dari Aspergillus niger dengan metode spektrofotometri. Tahap

kedua meliputi penentuan derajat keasaman (pH), suhu dan penambahan air

optimum reaksi hidrolisis enzimatik, penentuan hubungan persentase

hidrolisis pada berbagai tingkat pH dan suhu pada reaksi hidrolisis enzimatik

pada media yang ditambahkan pelarut heptana, serta penentuan hubungan

tingkat hidrolisis dengan total omega-3. Diagram alir tahapan penelitian

disajikan dalam Gambar 7.

25

Gambar 7. Diagram alir tahapan penelitian

a. Karakterisasi Minyak Ikan

Minyak ikan sarden yang digunakan dalam penelitian ini

merupakan minyak hasil industri samping yang telah mengalami

pemurnian dan netralisasi dengan NaOH. Minyak ikan memiliki kadar air

1% dengan kadar asam lemak bebas awalnya kurang dari 0,5%.

Karakterisasi yang dilakukan terhadap minyak ikan murni

bertujuan untuk mengetahui sifat fisiko-kimia yang berpengaruh terhadap

tingkat hidrolisis yang meliputi bilangan penyabunan, dan bilangan asam.

Karakterisasi minyak ikan juga dilakukan dengan menganalisa

komponen-komponen kimia yang menyusun minyak ikan. Komponen

26

kimia dalam minyak ikan dianalisa dengan GC-MS (Gas

Chromatography Mass Spectrometry). GC yang digunakan berjenis

Agillent Technology Seri 6890 N dan MS berjenis Agillent Technology

Seri 5973 Inert.

b. Penentuan Aktivitas Enzim

Pengukuran aktivitas lipase dilakukan untuk mengetahui aktivitas

enzim lipase dari Aspergillus niger yang baru dibeli dari Amano

Pharmaceutical Manufacturing Co. yang akan digunakan. Tujuan dari

pengukuran aktivitas enzim ini adalah menentukan unit enzim tiap gram

dimana unit enzim tersebut menjadi acuan penentuan banyak enzim yang

akan digunakan pada penelitian utama. Adapun prosedur penentuan

aktivitas lipase dapat dilihat pada Lampiran 2.

c. Penentuan Hubungan Suhu Dan Derajat Keasaman Terhadap Tingkat Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana

Percobaan ini dilakukan dengan suhu berkisar antara 25oC hingga

65oC dan pH berkisar antara 5 hingga 9. Pemilihan variabel rentang suhu

tersebut dikarenakan pada suhu yang tinggi enzim akan terdenaturasi dan

pada suhu yang semakin rendah, reaksi enzimatik tidak optimal.

Sedangkan pemilihan pH berada pada rentang 5 hingga 9 dikarenakan

titik isoelektrik lipase adalah 4,3. Sementara itu, stabilitas lipase berada

pada pH 6-7,5. Stabilitas lipase pada kondisi asam berada pada pH diatas

4 dan stabilitas lipase pada kondisi basa berada hingga pH 8.

d. Penentuan Hubungan Penambahan Air, Suhu, dan Derajat Keasaman Terhadap Tingkat Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana

Percobaan perlakuan penambahan air pada reaksi hidrolisis

enzimatik pada media yang ditambahkan heptana dilakukan dengan

menggunakan suhu dan pH optimum hasil dari reaksi hidrolisis enzimatik

pada media tanpa penambahan heptana. Rentang variabel yang digunakan

27

berada antara 1% sampai 5% v/v penambahan air dalam volume larutan.

Nilai optimum penambahan air ditentukan berdasarkan hubungan

kenaikan variabel tersebut terhadap kenaikan tingkat hidrolisis dimana

variabel yang memberikan tingkat hidrolisis tertinggi merupakan variabel

optimum.

Percobaan untuk perlakuan suhu dan pH pada reaksi hidrolisis

enzimatik pada media yang ditambahkan heptana dilakukan dengan

menggunakan suhu dan pH optimum yang diperoleh dari reaksi hidrolisis

enzimatik pada media tanpa penambahkan heptana dan menggunakan

penambahan air optimum yang diperoleh dari reaksi hidrolisis enzimatik

pada media yang ditambahkan heptana. Percobaan ini bertujuan untuk

mengetahui hubungan antara kenaikan pH dan suhu terhadap kenaikan

tingkat hidrolisis. Selain itu, untuk menentukan nilai optimum suhu dan

pH yang memberikan tingkat hidrolisis tertinggi pada reaksi hidrolisis

enzimatik pada media yang ditambahkan heptana.

Selain mencari nilai optimum, percobaan hidrolisis enzimatik

pada media yang ditambahkan heptana pada perlakuan suhu dan pH ini

dilakukan untuk mengetahui perubahan stabilitas dan aktivitas enzim

lipase pada reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan pelarut dengan

reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana.

Penentuan perubahan stabilitas dan aktivitas tersebut dilakukan dengan

membandingkan hubungan kenaikan variabel pH dan suhu terhadap

kenaikan tingkat hidrolisis pada masing-masing percobaan.

e. Penentuan Hubungan Tingkat Hidrolisis Dengan Kandungan Total Omega-3

Kandungan EPA (Eicosapentanoic acid) dan DHA

(Docosahexaenoic Acid) diukur dengan menggunakan Gas

Chromatography Mass Spectrometry dari minyak ikan hasil hidrolisis.

Penentuan hubungan tingkat hidrolisis dengan banyaknya total omega-3

dilakukan untuk mengetahui spesifitas, dan selektivitas enzim lipase

terhadap substrat minyak ikan. Selain itu, percobaan ini dilakukan untuk

28

membandingkan aktivitas katalitik enzim lipase pada hidrolisis enzimatik

minyak ikan tanpa penambahan pelarut dan hidrolisis enzimatik minyak

ikan pada media yang ditambahkan pelarut heptana dengan parameter

total omega-3.

2. Prosedur Penelitian

Prosedur penelitian berikut ini dibuat berdasarkan tahapan penelitian

yang telah dijelaskan sebelumnya. Prosedur penelitian yang dilakukan

mencakup hidrolisis minyak ikan secara enzimatik dan prosedur hidrolisis

enzimatik minyak ikan pada media yang ditambahkan pelarut heptana.

Diagram alir proses hidrolisis enzimatik minyak ikan dapat dilihat pada

Gambar 8.

a. Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan

i. Penentuan Suhu Inkubasi dan pH optimum

Minyak ikan sebanyak 4 gram ditempatkan ke dalam wadah

gelas (diameter 4 cm dam tinggi 7 cm), kemudian minyak tersebut

dibilas dengan nitrogen. Wadah gelas kemudian ditutup dengan

sumbat karet dan film. Setelah itu, ditambahkan 6 ml buffer

phosphate 0,1 M yang didalamnya telah dilarutkan 800 unit enzim

lipase Aspergillus niger (200 U/gram minyak). Wadah gelas yang

telah ditambah larutan enzim ditempatkan dalam shaker waterbath

untuk kemudian dihidrolisis selama 48 jam dengan kecepatan 200

rpm pada berbagai suhu inkubasi (25oC, 35oC, 45oC, 55oC, 65oC)

dan pH (5, 6, 7, 8, 9) yang akan diuji. Hidrolisis dihentikan dengan

menambahkan 2 ml methanol. Kemudian dilakukan analisa produk

akhir meliputi bilangan asam dan komponen kimianya dengan Gas

Chromatography Mass Spectrometry.

b. Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana i. Penentuan Penambahan Air

Minyak ikan sebanyak 4 gram ditempatkan ke dalam wadah

gelas (diameter 4 cm dam tinggi 7 cm). Minyak ikan tersebut

29

ditambahkan air dengan perlakuan 1%, 2%, 3%, 4%, atau 5%

kemudian campuran tersebut dibilas dengan nitrogen. Wadah gelas

kemudian ditutup dengan sumbat karet dan film. Setelah itu,

ditambahkan 6 ml buffer phosphate 0,1 M yang didalamnya telah

dilarutkan 800 unit enzim lipase Aspergillus niger (200 U/gram

minyak). Wadah gelas yang telah ditambah larutan enzim

ditempatkan dalam shaker waterbath untuk kemudian dihidrolisis

selama 48 jam dengan kecepatan 200 rpm dengan menggunakan

kondisi optimum reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan

heptana (suhu 45oC dan pH 5). Hidrolisis dihentikan dengan

menambahkan 2 ml methanol. Kemudian dilakukan analisa produk

akhir meliputi bilangan asam dan komponen kimianya dengan Gas

Chromatography Mass Spectrometry.

Gambar 8. Diagram alir proses hidrolisis enzimatik minyak ikan

30

ii. Penentuan suhu dan pH optimum

Minyak ikan sebanyak 4 gram ditambahkan air sesuai

dengan percobaan sebelumnya dan ditempatkan ke dalam wadah

gelas (diameter 4 cm dam tinggi 7 cm). Sebelum ditambahkan

800U enzim yang larut dalam 6mL buffer fosfat 0,1M, campuran

tersebut dibilas dengan nitrogen dan ditutup dengan sumbat karet

dan film. Setelah itu wadah gelas ditempatkan dalam shaker

waterbath untuk kemudian dihidrolisis selama 48 jam dengan

kecepatan 200 rpm pada berbagai suhu reaksi yaitu 25oC, 35oC,

45oC, 55oC, 65oC dan pH (5, 6, 7, 8, 9) yang akan diuji. Hidrolisis

dihentikan dengan menambahkan 2 ml methanol. Kemudian

dilakukan analisa produk akhir meliputi bilangan asam dan

komponen kimianya dengan Gas Chromatography Mass

Spectrometry.

c. Preparasi Konsentrat Hasil Reaksi Hidrolisis Untuk Analisa GC-MS

Hasil hidrolisis terdiri dari dua layer yaitu layer polar dan

non polar. Layer atas yang cenderung non polar terdiri dari heptana

yang bercampur dengan asam lemak, TAG, DAG, MAG.

Acylglycerol diambil setelah pelarut dipisahkan melalui penguapan

pada rotary evaporator. Hasil dari preparasi sampel dianalisis

dengan Gas Chromatography Mass Spectrometry untuk mengetahui

persentase total omega-3nya.

31

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. KARAKTERISTIK MINYAK IKAN

Karakterisasi minyak ikan meliputi karakteristik fisiko-kimia dan analisa

komponen-komponen yang terkandung dalam minyak ikan. Karakteristik fisiko-

kimia dilakukan melalui analisa bilangan asam, bilangan penyabunan, dan

penentuan kadar asam lemak bebas. Sementara analisa komponen yang

terkandung dalam minyak ikan dilakukan melalui analisa Gas Chromatography

Mass Spectrometry (GC-MS).

1. Sifat fisiko kimia minyak ikan

Hasil analisa karakterisasi minyak ikan dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Karakterisasi bahan baku minyak ikan

Karakterisasi Nilai Rujukan

Bilangan asam 3,29 10,15a

Kadar asam lemak bebas (%) 1,49 4,6a

Bilangan penyabunan 204,81 187,4a

Sumber : a Celik (2002)

Berdasarkan Tabel 7 diatas, minyak ikan yang digunakan memiliki

kualitas yang cukup baik, karena memiliki bilangan asam yang kurang dari

5. Menurut Wallace (1935), bilangan asam minyak ikan yang dapat

digunakan proses pemurnian lebih lanjut harus kurang dari 5.

Berdasarkan analisa yang dilakukan Celik (2002), minyak ikan

komersial memiliki bilangan asam 10,15 dengan kadar asam lemak

bebasnya sebesar 4,6%. Berdasarkan hasil pengukuran analisa sifat fisiko

kimia minyak ikan, bahan baku minyak ikan yang digunakan dalam

penelitian ini memiliki bilangan asam sebesar 3,29 dengan kadar asam

lemak bebasnya sebesar 1,49%. Dengan demikian, minyak ikan yang

digunakan dalam penelitian memiliki kualitas yang baik dan layak

digunakan sebagai bahan baku untuk hidrolisis enzimatik. Hal ini

dikarenakan bahan baku minyak ikan masih berada dalam batas maksimal

kandungan bilangan asam dan kadar asam lemak bebas pada minyak ikan

komersial.

32

Menurut Ketaren (1996), bilangan asam menunjukkan ukuran jumlah

asam lemak bebas. Menurut Ketaren (1986), kandungan asam lemak bebas

terbaik adalah serendah mungkin (± 2 %). Tingginya bilangan asam pada

minyak ikan mempengaruhi aktivitas katalitik enzim lipase pada reaksi

hidrolisis.

Bilangan penyabunan menunjukkan banyaknya total asam lemak

yang dapat dinetralkan oleh sejumlah alkali. Menurut Celik (2002), bilangan

penyabunan minyak ikan komersial adalah 187,4. Namun, analisa bilangan

penyabunan menunjukkan bahwa minyak mengandung total asam lemak

sejumlah 204,81. Hal ini menunjukkan bahwa, minyak ikan yang digunakan

dalam penelitian ini telah mulai teroksidasi. Hasil dari reaksi oksidasi

minyak adalah senyawa keton atau aldehid. Kandungan senyawa lain dalam

minyak seperti aldehid atau keton dalam minyak diduga dapat menyebabkan

nilai bilangan penyabunan meningkat. Menurut Ketaren (1996), minyak

yang memiliki bobot molekul tinggi akan memiliki jumlah bilangan

penyabunan yang lebih rendah daripada minyak yang berbobot molekul

rendah. Minyak ikan memiliki bobot molekul 903,01g/mol (Roberto et al.,

2007) dengan bilangan penyabunan yang rendah yaitu 187,4 (Celik, 2002).

2. Komponen kimia di dalam minyak ikan

Asam lemak tak jenuh dalam minyak ikan merupakan komponen

terbesar dalam minyak ikan. Asam lemak tak jenuh berkisar antara 75-90%

dari total asam lemak yang ada dalam minyak (Celik, 2002). Komponen

yang terkandung dalam minyak dapat diketahui melalui analisa Gas

Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS). Analisa GC MS yang

dilakukan dalam penelitian ini adalah untuk mengetahui komposisi asam

lemak dalam minyak ikan serta komponen lain yang terlarut dalam minyak

ikan dari ikan sarden. Hasil dari analisa GC-MS dapat dilihat pada Tabel 8.

33

Tabel 8. Komponen kimia bahan baku minyak ikan

Berdasarkan tabel data hasil analisa GC-MS, komponen terbesar

minyak ikan sebagai bahan baku penelitian ini adalah asam oleat. Asam

lemak tak jenuh yang terdapat pada minyak ikan sebesar 34,98% dimana

sebagian besar merupakan asam lemak tidak jenuh dengan satu ikatan

rangkap (monounsaturated fatty acid) dengan presentase 33,17%, sedangkan

asam lemak jenuh (saturated fatty acid) sebesar 22,76%, sisanya adalah

No Jenis Komponen Golongan Rumus Empiris

Bobot Molekul

Jumlah (%)

1 Pentadecana Hidrokarbon C14H28O2 228

2,9

2 Heptadecana Hidrokarbon C17H36 240

2,9

3 2,6,10,14-tetrametil Pentadecane

Hidrokarbon C19H40 268

5,39

4 Tetradecanoic acid (Asam Miristat)

Asam lemak jenuh

C14H28O2 228

4,18

5 Hexadecenoic acid (Asam Palmitoleat)

Asam lemak tak jenuh dengan satu ikatan rangkap C16H30O2 254

6,8

6 n-Hexadecenoic acid (Asam Palmitat)

Asam lemak jenuh

C16H32O2 256

16,81

7 5,8,11,14,17- Eicosapentaenoic acid

Asam lemak tak jenuh dengan banyak ikatan rangkap C21H32O2 316

1,81

8 9-Octadecenoic acid (Asam Oleat)

Asam lemak tak jenuh dengan satu ikatan rangkap C18H34O2 282

26,37

9 Octadecanoic acid (Asam Stearat)

Asam lemak jenuh C18H36O2 284

1,77

11 9-Octadecenal (oleicaldehyde)

Aldehid C18H24O 266

0,88

12 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene (Squalene)

Hidrokarbon

C30H50 410

2,25

13 Cholesta-3,5-diene (Squalene)

Hidrokarbon C27H44 368

2,55

14 Lanosterol Sterol

C27H46O 386 24,96

34

alkana (11,19%), aldehid (0,88%), squalene (4,8%), dan lanosterol

(24,96%). Persentase perbandingan jumlah asam lemak tidak jenuh dan

asam lemak jenuh menunjukkan bahwa minyak ikan sebagian besar tersusun

dari asam lemak tak jenuh. Tingginya jumlah asam lemah tak jenuh,

memungkinkan adanya oksidasi terhadap asam lemak tersebut. Komponen

lain seperti oktadecenal yang terdapat dalam minyak ikan ini kemungkinan

berasal dari oksidasi asam lemak tersebut. Hasil oksidasi tersebut adalah

golongan aldehid, atau keton yang bereaksi dengan basa yang dapat

meningkatkan bilangan penyabunan.

B. AKTIVITAS ENZIM

Aktitas enzim dinyatakan dalam Unit per gram enzim (U/g). Unit tersebut

menunjukkan banyaknya mikromol asam lemak yang dihasilkan atau mikromol

substrat yang digunakan dalam waktu 30 menit pada kondisi standar. Kondisi

standar untuk pengukuran aktivitas enzim berdasarkan Sigma aldrich adalah

suhu 35oC dan pH 7. Pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan dengan

berbagai cara, salah satu diantaranya adalah dengan metode spektrofotometri.

Pada metode spektrofotometri tersebut digunakan substrat paranitrofenil butirat.

Pada dasarnya, substrat untuk perhitungan aktivitas lipase dengan metode

spektrofotometri adalah paranitrofenil asil ester.

Dasar dari prosedur ini adalah lipase mempengaruhi secara umum

aktivitas katalitik ikatan ester terhadap berbagai macam substrat karboksil ester.

Substrat paranitrofenil asil ester dihidrolisis untuk menghasilkan asam lemak dan

paranitrofenol. Paranitrofenol yang dihasilkan membawa warna kekuningan

yang dapat terbaca pada panjang gelombang λ 400 nm sampai 410 nm.

Menurut Shirai et al. (1982) prinsip kerja katalitik enzim lipase terhadap

substrat dapat dilihat pada Gambar 14.

Gambar 9. Mekanisme katalitik enzim lipase pada paranitrofenil butirat (Shirai et al., 1982)

+

H2O + Paranitrofenol Paranitrofenil butirat

Asam Butirat +

Enzim Lipase

35

Metode perhitungan aktivitas enzim lipase Aspergillus niger pada

penelitian ini menghitung banyaknya paranitrofenol yang dilepaskan setelah

hidrolisis paranitrofenil butirat oleh lipase. Paranitrofenol yang dibebaskan akan

berwarna kuning dan dapat terbaca pada spektrofotometer. Aktivitas lipase

dihitung dengan membandingkan paranitrofenol yang dihasilkan dari

pengukuran aktivitas enzim dengan kurva paranitrofenol standar pada nilai

absorbansi sampel pada λ 410 nm. Berdasarkan perhitungan aktivitas lipase

dengan metode spektrofotometri tersebut, diperoleh aktivitas lipase Aspergillus

niger Amano Pharmaceutical Manufacturing Co sebesar 7939,98 Unit/gram.

Menurut Amano Pharmaceutical Manufacturing Co aktivitas enzim lipase

Aspergillus niger yang tertera pada label kemasan adalah 12000U/g. Lebih

rendahnya hasil pengukuran aktivitas enzim lipase Aspergillus niger pada

penelitian ini diduga dikarenakan kondisi lingkungan yang kurang sesuai selama

penyimpanan atau pada saat distribusi sehingga mempengaruhi nilai

aktivitasnya.

C. HUBUNGAN DERAJAT KEASAMAN DAN SUHU TERHADAP TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIK MINYAK IKAN

Reaksi hidrolisis merupakan yaitu pembentukan gliserol dan asam lemak

bebas melalui pemecahan molekul trigliserida dengan penambahan air. Pada

reaksi hidrolisis trigliserida, satu molekul trigliserida bereaksi dengan tiga

molekul air untuk memproduksi satu molekul gliserol dan tiga molekul asam

lemak bebas.

Selama ini, proses produksi asam lemak dilakukan dengan metode kimia

atau fisik. Kamarudin et al. (2008) menyatakan, industri yang telah ada

menghidrolisis minyak/lemak menjadi asam lemak dan gliserol pada suhu 250oC

dan tekanan 50 bar. Pada kondisi ini, polimerisasi lemak akan terjadi. Dengan

demikian asam lemak akan berwarna gelap dan terjadi pemucatan larutan

gliserol. Selain itu, penerapan proses ini untuk aplikasi industri memerlukan

biaya yang cukup besar dan investasi peralatan yang mahal.

Reaksi hidrolisis dapat dikatalisasi oleh asam, basa, dan enzim.

Pemilihan katalis enzim pada reaksi hidrolisis lebih diutamakan untuk industri

36

pangan karena aman, membutuhkan peralatan yang sederhana, dan hanya

mengkonsumsi energi yang relatif rendah (Kamarudin et al., 2008). Reaksi

hidrolisis minyak atau lemak dapat menggunakan katalis enzim lipase.

Mekanisme pengikatan enzim terhadap substrat minyak diawali dengan

pembentukan kompleks substrat-enzim. Hal ini dikemukakan oleh Michaelis

Menten (Lehninger, 1982). Enzim bergabung dengan molekul substrat sebagai

tahap yang harus dilalui dalam katalitik enzim. Enzim pertama-tama bergabung

dengan molekul substrat dalam reaksi yang reversibel membentuk kompleks

enzim-substrat (ES) dimana reaksi ini berlangsung dengan cepat. Kompleks ES

kemudian terurai dalam reaksi reversibel kedua menghasilkan produk dan enzim

dibebaskan. Mekanisme tersebut ditunjukkan pada Gambar 15.

Gambar 10. Mekanisme pembentukan kompleks substrat-enzim (Lehninger, 1982)

Aktivitas enzim dapat dilihat dari tinggi rendahnya tingkat hidrolisis

enzim terhadap substrat minyak ikan untuk menghasilkan asam lemak bebas.

Aktivitas enzim lipase dipengaruhi oleh faktor suhu dan derajat keasaman atau

pH (Handayani, 2005). Faktor pengaruh suhu dan pH tersebut akan dibahas lebih

lanjut karena berpengaruh pada tingkat hidrolisis enzim lipase terhadap minyak

ikan.

1. Hubungan Derajat Keasaman (pH) dengan Tingkat Hidrolisis

Data hubungan derajat keasaman dengan tingkat hidrolisis minyak

ikan dapat dilihat pada Gambar 11. Pola pembentukan kurva seperti pada

Gambar 11 membuktikan bahwa terdapat adanya pengaruh pH terhadap

aktivitas hidrolisis enzim lipase terhadap substrat minyak ikan. Pada substrat

minyak ikan, enzim lipase Aspergillus niger menunjukkan aktivitas katalisis

optimum di pH 5. Hal ini menunjukkan bahwa, lingkungan asam sesuai

untuk aktivitas enzim lipase Aspergillus niger. Enzim lipase dari kapang

Aspergillus niger memiliki titik isoelektrik 4,3 (Saxena et al., 2009). Pada

titik isoelektrik, kelarutan enzim dalam air sangat kecil. Hal ini

menyebabkan aktivitas katalitiknya rendah, karena enzim dalam melakukan

E + S ES

ES P E +

37

aktivitas katalitik, membutuhkan air secukupnya. Air yang dibutuhkan

digunakan sebagai pembentuk fleksibilitas struktur tiga dimensinya.

Gambar 11. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan pH pada reaksi

hidrolisis enzimatik, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), suhu reaksi (45oC), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)

Hasil yang diperoleh pada penelitian ini dimana enzim lipase

Aspergillus niger memiliki aktivitas katalitik tertinggi pada pH asam

didukung oleh beberapa penelitian sebelumnya. Menurut Saxena et al.

(2009), optimasi produksi enzim lipase secara ekstraseluler oleh kapang

Aspergillus niger pada substrat minyak sawit adalah pada kondisi pH 5,6

dan suhu 25oC. Pada kondisi tersebut enzim lipase yang dihasilkan memiliki

aktivitas spesifik 19 Unit/mg. Menurut Shahidi dan Wanasundara. (1998),

enzim lipase Aspergillus niger melakukan katalitik pada pH optimum 5-7

pada substrat minyak sawit. Pada penelitian dengan substrat minyak ikan,

enzim lipase melakukan katalitik optimal pada pH 5.

Pada penelitian ini, dimana reaksi hidrolisis dilakukan pada kondisi

asam dan pada suhu 45 oC, menunjukkan aktivitas katalitis yang rendah. Hal

ini dikarenakan enzim mengalami denaturasi. Denaturasi sisi aktif enzim

dikarenakan ion H+ berikatan dengan NH3+ pada struktur asam amino

protein membentuk –NH4. Proses pengikatan tersebut menyebabkan ikatan

antara atom nitrogen dengan atom hidrogen lainnya terputus, sehingga

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

4 5 6 7 8 9 10

%

HIDROLISIS

pHKONTROL HIDROLISIS HIDROLISIS ENZIMATIS

38

enzim terdenaturasi. Disisi lain, pada kondisi basa atau mendekati basa,

enzim juga akan inaktif. Rusaknya struktur enzim ini dikarenakan pada

kondisi tersebut gugus OH- dari lingkungan akan berikatan dengan ion H

dari gugus COO- sisi aktif enzim membentuk H2O. Hal ini akan

menyebabkan struktur enzim mengalami kerusakan.

2. Hubungan Suhu dengan Tingkat Hidrolisis

Data hubungan suhu reaksi dengan tingkat hidrolisis minyak ikan

dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan suhu reaksi pada reaksi hidrolisis enzimatik, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M) pH 7

Berdasarkan pola pembentukan kurva pada Gambar 12 membuktikan

bahwa enzim lipase dapat melakukan katalitik optimum pada suhu 45oC.

Semakin rendah suhu reaksi, semakin kecil asam lemak yang dihasilkan

yang berdampak pada semakin rendahnya tingkat hidrolisis. Hal ini

dikarenakan reaksi yang terjadi tidak berjalan optimal. Semakin tinggi suhu

reaksi, asam lemak bebas yang dihasilkan setelah reaksi semakin kecil juga.

Hal ini berakibat semakin rendah tingkat hidrolisis enzim lipase tersebut

terhadap minyak ikan.

0,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

%

HIDROLISIS

SUHU OC

HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKAN KONTROL HIDROLISIS

39

Suhu dapat berpengaruh positif terhadap reaksi hidrolisis maupun

sebaliknya. Kenaikan suhu akan meningkatkan laju reaksi. Pada reaksi

hidrolisis enzimatik, menurut Kamarudin et al. (2008), pada reaksi

menggunakan suhu tinggi struktur tersier enzim terganggu akibat terjadi

denaturasi. Padahal struktur tersier, sekunder, dan struktur primer enzim

mempengaruhi aktivitas katalitiknya. Berdasarkan data, pada suhu 55oC dan

65oC nilai tingkat konversinya berubah menjadi lebih rendah, sedangkan

suhu 45oC merupakan suhu dimana tingkat hidrolisis tertinggi enzim lipase

terhadap ikatan ester terjadi. Pada suhu diatas 45oC tingkat konversi minyak

menjadi asam lemak turun secara tiba-tiba dikarenakan enzim mengalami

denaturasi.

Suhu berpengaruh terhadap kecepatan reaksi pembentukan produk

(asam lemak bebas) dalam reaksi hidrolisis. Peningkatan suhu reaksi pada

reaksi hidrolisis akan mempercepat kenaikan konsentrasi asam lemak bebas,

memperbesar penurunan konsentrasi air, atau dengan kata lain menaikan

hasil konversi. Hal ini disebabkan karena dengan naiknya suhu reaksi, maka

suplai energi untuk mengaktifkan katalis dan tumbukan antar pereaksi untuk

menghasilkan reaksi juga akan bertambah, sehingga produk yang dihasilkan

menjadi lebih banyak. Nilai konstanta kecepatan reaksi (k) meningkat

dengan kenaikan suhu reaksi. Hal ini sesuai dengan teori Arrhenius bahwa

kenaikan suhu akan menaikkan nilai konstanta kecepatan reaksi, di mana

kenaikan 10°C suhu reaksi menaikan konstanta kecepatan reaksi sebanyak 2

kali dari nilai awal.

Pada penelitian hidrolisis minyak ikan, setiap peningkatan suhu 10oC

akan meningkatkan konsentrasi asam lemak bebas. Apabila suhu reaksi yang

digunakan terlalu rendah maka laju reaksi berjalan lambat akibatnya

tumbukan antar pereaksi rendah dan minyak tidak terhidrolisis secara

sempurna. Dengan demikian, asam lemak bebas yang terbentuk juga rendah.

Peningkatan suhu dari 25oC menjadi 35oC, akan meningkatkan nilai

persentase hidrolisis sebesar 1,37%. Nilai persentase kenaikan tersebut

adalah sebesar 49% dari persentase hidrolisis pada kondisi suhu 25oC. Pada

peningkatan suhu dari 35oC menjadi 45oC akan meningkatkan nilai

40

persentase hidrolisis sebesar 2,64%. Nilai persentase kenaikan tersebut

sebesar 63,7% terhadap nilai persentase hidrolisis pada kondisi suhu 35oC.

Peningkatan persentase hidrolisis terjadi pada setiap kenaikan suhu.

Persentase hidrolisis tersebut mencapai titik maksimum pada suhu 45oC

reaksi. Pada hidrolisis enzimatik dengan substrat minyak ikan, suhu reaksi

45oC merupakan suhu optimal.

Pada suhu diatas suhu optimal, tingkat konversi asam lemak menjadi

lebih rendah. Semakin tinggi suhu reaksi, semakin rendah pula tingkat

konversi asam lemak yang terjadi. Pada kenaikan 10oC diatas suhu optimum

yaitu pada suhu 55oC, tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan turun sebesar

2,1%. Persentase penurunan tersebut sebesar 45% dari nilai persentase

hidrolisis pada suhu optimum. Pada kenaikan 10oC berikutnya yaitu suhu

65oC, tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan turun menjadi 1,54%.

Persentase penurunan tersebut sebesar 49% dari nilai persentase hidrolisis

pada kondisi suhu 55oC. Semakin rendahnya tingkat hidrolisis disebabkan

karena terjadi denaturasi enzim pada suhu tinggi.

Enzim merupakan polipetida yang tersusun dari asam amino melalui

ikatan kovalen membentuk struktur tiga dimensi. Suhu yang tinggi akan

merusak struktur tiga dimensi dari enzim tersebut melalui pemutusan ikatan

peptida yang membentuk struktur tiga dimensinya. Sementara, aktivitas

katalitik enzim dipengaruhi oleh bentuk primer, sekunder, dan tersier dari

enzim. Pada penelitian reaksi hidrolisis enzimatik pada suhu 55oC dan suhu

65oC, penurunan tingkat hidrolisis disebabkan karena denaturasi enzim oleh

panas. Denaturasi ini dikarenakan berubahnya struktur tersier atau struktur

tiga dimensi dari enzim lipase Aspergillus niger. Perubahan ini semakin

berlanjut dengan semakin tingginya suhu reaksi hidrolisis. Oleh sebab itu,

aktivitas katalitiknya semakin rendah pada setiap peningkatan suhu.

41

D. HUBUNGAN PENAMBAHAN AIR, DERAJAT KEASAMAN, DAN SUHU, TERHADAP TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIK MINYAK IKAN PADA MEDIA YANG DITAMBAHKAN HEPTANA

Enzim tersusun dari protein dimana pada suhu tinggi akan terdenaturasi.

Termostabilitas enzim merupakan faktor utama dalam aplikasi enzim di Industri

karena sifat thermo degradation yang dimiliki oleh enzim. Penelitian mengenai

penggunaan enzim sebagai biokatalis berkembang, terutama dalam rangka

peningkatan aktivitas atau stabilitas serta kemudahannya dalam hal pemisahan.

Hal ini berhubungan dengan penurunan biaya produksi pada penggunaan enzim

di industri. Oleh karena itu, dikembangkan rekayasa enzim untuk peningkatan

aktivitas atau stabilitasnya dengan penambahan pelarut hidrofobik. Menurut

Kim et al. (2004) penggunaan pelarut akan meningkatkan migrasi alkil pada

sistem reaksi sekitar 18% selama selang waktu 24 jam. Penggunaan pelarut juga

akan memudahkan proses pemisahan konsentrat dengan by productnya. Migrasi

alkil ini terjadi dengan katalis enzim lipase dan dipengaruhi oleh banyaknya air,

suhu, waktu reaksi, jumlah enzim, sistem reaksi, dan jenis reaktor. Menurut

Zaverucke dan Wimmer (2008), hidrolisis enzimatik dipengaruhi oleh suhu, pH,

konsentrasi subsrat, dan adanya senyawa penghambat, dan penambahan air.

1. Hubungan Penambahan Air dengan Tingkat Hidrolisis

Data hubungan penambahan air dengan tingkat hidrolisis minyak

ikan pada media yang ditambahkan pelarut heptana dapat dilihat pada

Gambar 13.

Berdasarkan pola pembentukan kurva pada Gambar 13 membuktikan

bahwa enzim lipase dapat melakukan katalitik optimum pada penambahan

air 1% terhadap volume larutan. Jumlah air tersebut menunjukkan banyakya

air yang dibutuhkan untuk melapisi satu layer molekul enzim. Dengan

demikian, air yang dapat melapisi secara optimum membentuk satu layer

melingkupi molekul enzim sebesar 1%.

Gambar 13. Kurva hubungan tingkat hidrolisis penambahan air pada media yang ditambahkan pelarut heptanaminyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atreaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M) pH 7

Gambar 14. Mekanisme katalisis enzim lipase regioselektif niger

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,0016,0018,0020,0022,0024,0026,0028,00

0

%HIDROLISIS

HIDROLISIS MINYAK IKAN

CH-O-C-R

CH2-O-C-R

CH2-O-C-R

O

O

O

. Kurva hubungan tingkat hidrolisis enzimatik dengan penambahan air pada media yang ditambahkan pelarut heptanaminyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M) pH 7, suhu reaksi (45

Gambar 14. Mekanisme katalisis enzim lipase regioselektif niger pada media organik

1 2 3 4 5PENAMBAHAN AIR (%)

HIDROLISIS MINYAK IKAN KONTROL HIDROLISIS

+ LIPASE-OH

H2O

RCOOH + LIPASE-OH

R

R

R

CH2-O-C-R

CH-O-C-R

CH2-O-C-R

O-

OH O

O

42

dengan persentase penambahan air pada media yang ditambahkan pelarut heptana,

au 800U), waktu , suhu reaksi (45oC)

Gambar 14. Mekanisme katalisis enzim lipase regioselektif Aspergillus

5 6

KONTROL HIDROLISIS

DIGLISERIDA

CH2-OH

CH-O-C-R

CH2-O-C-R

O

O

43

Schneider dan Berger (1991) menyatakan bahwa monoasilgliserol

dan diasilgliserol cukup stabil terhadap migrasi alkil pada media organik

dengan kadar air kurang dari 2%. Mekanisme katalitik enzim lipase

regioselektif Aspergillus niger pada reaksi hidrolisis ditunjukkan oleh

Gambar 14.

2. Hubungan Derajat Keasaman (pH) dengan Tingkat Hidrolisis

Data hubungan derajat keasaman dengan tingkat hidrolisis minyak

ikan pada media yang ditambahkan pelarut heptana dapat dilihat pada

Gambar 15.

Gambar 15. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan pH pada reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan heptana dan reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M), suhu reaksi (45oC), kadar air (1%)

Berdasarkan pola pembentukan kurva pada Gambar 15, titik pH yang

menghasilkan tingkat hidrolisis tertinggi pada reaksi hidrolisis enzimatik

pada media yang ditambahkan heptana adalah pH 5. Hal ini sesuai dengan

pernyataan Saxena et al. (2009) yang menyebutkan bahwa aktivitas katalitik

enzim Aspergillus niger adalah pada kondisi asam pada substrat minyak.

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,0016,0018,0020,0022,0024,0026,0028,0030,00

4 5 6 7 8 9 10

%

HIDROLISIS

pH

HIDROLISIS ENZIMATIS DENGAN PENAMBAHAN HEPTANA

HIDROLISIS ENZIMATIS TANPA PENAMBAHAN HEPTANA

44

Lingkungan asam sesuai untuk siklus hidup kapang Aspergillus niger serta

sesuai untuk aktivitas katalitiknya. Terlihat juga pada percobaan Saxena et

al. (2009) dimana enzim lipase ekstraseluler dihasilkan pada kondisi asam

pada suhu mendekati suhu ruang. Pada pH 7, enzim mengalami peningkatan

aktivitas. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kestabilan sisi

katalitik enzim lipase pada pH 7 apabila media reaksi ditambah heptana.

Stauffer, E.D (1989) menyatakan bahwa perubahan pH akan mempengaruhi

enzim. Perubahan ini dikarenakan protonasi atau deprotonasi grup ion pada

sisi aktif atau pada kompleks substrat-enzim.

Data pada Gambar 15 membandingkan aktivitas enzim lipase

Aspergillus niger yang direpresentasikan melalui tingkat hidrolisis antara

hidrolisis enzimatik dengan hidrolisis enzimatik pada media yang

ditambahkan heptana. Berdasarkan pola pembentukan kurva, pada setiap

perlakuan pH yaitu pada pH 5, 6, 8, dan 9, aktivitas katalitik enzim lipase

mengalami penurunan. Namun, pada pH 7, aktivitas katalitik enzim pada

reaksi hidrolisis enzimatik minyak ikan yang ditambahkan heptana tidak

mengalami perubahan dari hidrolisis enzimatik tanpa penambahan heptana.

Penurunan tingkat hidrolisis ini disebabkan karena terjadi perubahan status

ionisasi ketika heptana ditambahkan. Hal ini menunjukkan bahwa

penambahan pelarut heptana yang cenderung hidrofobik akan menghambat

sisi aktif enzim untuk melakukan katalitik ikatan ester pada triasilgliserol.

Penghambatan terjadi karena perubahan status ionisasi enzim yang membuat

salah satu asam amino enzim inaktivasi.

Tingginya kepolaran suatu pelarut organik tidak mempengaruhi

tingginya aktivitas katalitik enzim. Hal ini terlihat pada data percobaan

hidrolisis enzimatik pada substrat minyak ikan, penggunaan heptana sebagai

media akan menurunkan tingkat hidrolisis dimana tingkat hidrolisis ini

merepresentasikan aktivitas katalitik enzim terhadap substrat minyak ikan.

Semakin tingginya kepolaran suatu media tidak berpengaruh nyata terhadap

aktivitas katalitik enzim. Hal ini didukung oleh percobaan Kim et al. (2000)

yang menyatakan bahwa pada reaksi esterifikasi trikaprilat dengan asam

linoleat dengan menggunakan enzim lipase Rhizomucor miehei sebagai

45

katalis menghasilkan tingkat esterifikasi 57% pada media n-heksana dan

52% pada media isooktana. Padahal, kepolaran isooktana lebih tinggi

daripada n-heksana. Isooktana memiliki nilai kepolaran 4,2 sedangkan n-

heksana memiliki nilai kepolaran 3,5.

Kurva diatas juga menunjukkan tidak adanya perubahan aktivitas

katalisis enzim pada media yang ditambahkan pelarut heptana pada pH 7

bila dibandingkan dengan hidrolisis enzimatik tanpa penambahan pelarut

heptana. Dengan demikian, pada pH netral, enzim tidak akan mengalami

penurunan aktivitas karena tidak terjadi perubahan status ionisasi pada

struktur enzim. Hal ini sesuai dengan Medina et al. (2003) yang

menyebutkan bahwa penambahan pelarut organik tidak mengubah stabilitas

enzim terhadap berbagai pH.

3. Hubungan Suhu dengan Tingkat Hidrolisis

Data hubungan suhu dengan tingkat hidrolisis minyak ikan pada

media yang ditambahkan pelarut heptana dapat dilihat pada Gambar 16.

Gambar 16. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dengan suhu pada reaksi hidrolisis enzimatik dengan penambahan heptana dan pada reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan pelarut heptana, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M) pH 7, kadar air (1%)

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,0016,0018,0020,0022,0024,0026,00

15 25 35 45 55 65 75

%

HIDROLISIS

SUHU (oC)

HIDROLISIS ENZIM DENGAN PENAMBAHAN HEPTANA

HIDROLISIS ENZIM TANPA PENAMBAHAN HEPTANA

46

Berdasarkan data pada Gambar 16, diperoleh tingkat hidrolisis

minyak ikan tertinggi untuk enzim lipase Aspergillus niger terhadap substrat

minyak ikan dengan penambahan pelarut heptana adalah pada suhu 25oC.

Pada suhu reaksi hidrolisis yang semakin meningkat, asam lemak bebas

yang dihasilkan semakin rendah. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat

hidrolisis enzimatik minyak ikan pada pelarut organik semakin rendah

seiring dengan peningkatan suhu reaksi.

Pelarut organik khususnya pelarut dengan nilai hidrofobitas yang

tinggi (Log p>4) dapat mempertahankan konformitas bentuk enzim

khususnya pada media non akueous. Penambahan pelarut organik

merupakan salah satu cara dalam merekayasa enzim. Rekayasa enzim

meliputi mengubah aktivitas dan stabilitasnya. Rekayasa enzim melalui

media reaksi dapat meningkatkan termostabilitas enzim lipase. Hal ini

terbukti dari perubahan sifat enzim lipase Candida cylindracea dari

mesofilik menjadi termofilik (Gubicza, 2000). Penggunaan pelarut organik

juga dapat mengubah aktivitas katalitik dari enzim lipase karena akan

meningkatkan migrasi alkil. Migrasi alkil akan meningkat dengan

penggunaan pelarut organik sebagai media (Kim et al., 2004)

Berdasarkan pembentukan pola kurva hidrolisis pada Gambar 16,

terlihat bahwa penambahan pelarut heptana dapat meningkatkan stabilitas

enzim dan meningkatkan aktivitas enzim. Aktivitas enzim lipase

Aspergillus niger pada reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa

penambahan pelarut heptana memiliki tingkat hidrolisis tertinggi pada suhu

45oC. Namun, pada penambahan pelarut heptana sebagai media reaksi, suhu

yang menghasilkan tingkat hidrolisis tertinggi berubah menjadi 25oC. Hal

ini membuktikan bahwa dengan penambahan pelarut organik, terjadi

pergeseran stabilitas enzim. Hal ini sesuai dengan Medina et al.,2003 yang

menunjukkan bahwa stabilitas suhu meningkat dengan penambahan pelarut

organik sebagai media reaksi. Pada penelitian hidrolisis enzimatik minyak

ikan, penambahan heptana sebagai media reaksi meningkatkan stabilitas

enzim terhadap suhu rendah.

47

Berdasarkan pola pembentukan kurva dan dengan membandingkan

antara kurva hidrolisis enzimatik dengan kurva hidrolisis enzimatik dengan

penambahan pelarut heptana, diketahui bahwa tingkat hidrolisis enzim pada

media yang ditambahkan pelarut heptana memiliki aktivitas yang lebih

tinggi. Hal ini diketahui dari tingkat hidrolisis yang lebih tinggi pada setiap

perlakuan suhu. Pada perlakuan suhu 25oC, aktivitas enzim pada media yang

ditambahkan pelarut heptana mengalami peningkatan 80% terhadap aktivitas

enzim pada reaksi hidrolisis tanpa penambahan pelarut. Pada perlakuan suhu

35oC, penambahan pelarut heptana meningkatkan aktivitas sebesar 30%.

Pada suhu 45oC dan 55oC, hidrolisis enzimatik dengan penambahan pelarut

heptana meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17% dan 16%. Namun, pada

suhu 65oC, penambahan pelarut heptana tidak mengubah aktivitas. Hal ini

dikarenakan pada suhu 65oC enzim telah terdenaturasi. Denaturasi enzim

disebabkan suhu yang semakin tinggi akan menyebabkan terputusnya ikatan

antar asam amino yang membentuk molekul tiga dimensi. Oleh sebab itu,

dengan terputusnya ikatan tersebut, membuat struktur tiga dimensi enzim

berubah. Berubahnya struktur tiga dimensi akan menyebabkan perubahan

pada aktivitas katalitiknya. Berdasarkan fenomena ini, dapat dikatakan

bahwa enzim lipase yang diproduksi oleh kapang Aspergillus niger mampu

melakukan katalitik dan meningkatkan aktivitas katalitiknya dengan

toleransi suhu hingga 65oC pada media reaksi yang ditambahkan pelarut

heptana.

E. HUBUNGAN TINGKAT HIDROLISIS DENGAN KANDUNGAN TOTAL OMEGA-3

Asam lemak omega-3 merupakan asam lemak jenuh rantai panjang

dengan ikatan rangkap pada atom karbon ketiga dan keempat dari gugus metil

omega. Asam lemak omega-3 terdiri dari asam eikosapentanoat, asam

eikosatetranoat, asam eikosatrienoat, asam dokosaheksanoat, asam

heksadekatrienoat, asam oktadekatetranoat, asam oktadekatrienoat, asam

dokosapentanoat, asam tetrakosanoat, asam tetrakosapentanoat.

Pengkayaan asam lemak omega

enzimatik. Enzim lipas

merupakan enzim yang selektif terhadap ikatan ester

reaksi hidrolisis, enzim lipase akan memotong ikatan ester triasilgliserol pada

posisi tersebut secara parsial menjadi monoasi

lemak. Penggunaan enzim yang bersifat regioselektif terhadap sn

dikarenakan menurut Roberto

sn-1 dan sn-3 gliserol. Oleh sebab itu, digunakan enzim lipase ter

mengkatalitik ikatan ester pada sn

lemak jenuh sehingga diperoleh asilgliserol yang kaya asam lemak tidak jenuh

omega-3 pada sn-2 gliserol. Kemampuan enzim dalam memecah triasilgliserol

menjadi monoasilg

tingkat hidrolisis.

Pada pembahasan ini akan dijelaskan lebih lanjut mengenai hubungan

tingkat hidrolisis dengan persentase total omega

Hubungan tingkat hidrolisis enzimati

Omega-3 dibuat berdasarkan data pada Gambar 17.

Gambar 17. Kurva hubungan tingkat hidrolisis reaksi hidrolisis enzimatikoptimum faktor reaksi800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)

02468

1012141618202224262830

minyak awal

0

PERSENTASE

TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKAN

Pengkayaan asam lemak omega-3 dapat dilakukan dengan hidrolisis

enzimatik. Enzim lipase yang diproduksi dari kapang Aspergillus niger

merupakan enzim yang selektif terhadap ikatan ester sn-1 atau sn-3


posisi tersebut secara parsial menjadi monoasilgliserol, diasilgliserol, dan asam

lemak. Penggunaan enzim yang bersifat regioselektif terhadap sn

dikarenakan menurut Roberto et al. (2007), asam lemak jenuh berada pada posisi

3 gliserol. Oleh sebab itu, digunakan enzim lipase ter

mengkatalitik ikatan ester pada sn-1 dan sn-3 gliserol yang mengandung asam


2 gliserol. Kemampuan enzim dalam memecah triasilgliserol

menjadi monoasilgliserol, diasilgliserol dan asam lemak dinyatakan dalam


tingkat hidrolisis dengan persentase total omega-3 hasil reaksi hidrolisis.

Hubungan tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan persentase total

3 dibuat berdasarkan data pada Gambar 17.

. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan asam eikosapentanoat reaksi hidrolisis enzimatik terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)

minyak awal

H1 pH 7 T 45

H1 pH 5 T 45

H2 pH 5 T 45

H2 pH 5 T 25

0

6,79

28,07

22,5623,94

1,81

10,3712,68

7,14

10,23

PERLAKUAN


48

3 dapat dilakukan dengan hidrolisis

Aspergillus niger

3 gliserol. Pada


lgliserol, diasilgliserol, dan asam

lemak. Penggunaan enzim yang bersifat regioselektif terhadap sn-1 dan sn-3

(2007), asam lemak jenuh berada pada posisi

3 gliserol. Oleh sebab itu, digunakan enzim lipase tersebut untuk

3 gliserol yang mengandung asam


2 gliserol. Kemampuan enzim dalam memecah triasilgliserol

liserol, diasilgliserol dan asam lemak dinyatakan dalam


3 hasil reaksi hidrolisis.

k minyak ikan dengan persentase total

dan asam eikosapentanoat pada

terhadap setiap perlakuan pada kondisi yak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau

H2 pH 5 T 25

23,94

10,23

EPA

49

Analisa GC MS dilakukan pada kondisi optimum pada reaksi hidrolisis

enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana dan pada reaksi

hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan pelarut heptana. Pada

penelitian ini diambil titik optimum faktor reaksi dari hasil reaksi hidrolisis

dengan parameter optimum adalah tingkat hidrolisis yang tertinggi. Pada reaksi

hidrolisis enzimatik tanpa penambahan pelarut heptana, titik optimum tersebut

yaitu titik pH 5 dan suhu 45oC yang diperoleh dari perlakuan pH pada reaksi

hidrolisis enzimatik dan pH 7 dan suhu 45oC yang diperoleh dari perlakuan suhu

pada reaksi hidrolisis enzimatik. Kode H1 pH5 T45 menunjukkan perlakuan pH

5 dan suhu 45oC, sedangkan kode H1pH7 T45menunjukkan perlakuan pH 7 dan

suhu 45oC. Analisa GC-MS untuk reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang

ditambahkan pelarut heptana juga mengambil titik optimum faktor reaksi dengan

parameter optimum adalah tingkat hidrolisis. Titik optimum tersebut yaitu titik

pH 5, penambahan air 1%, dan suhu 25oC yang diperoleh dari perlakuan suhu

pada reaksi hidrolisis enzimatik serta pH 5, penambahan air 1%, dan suhu 45oC

yang diperoleh dari perlakuan pH pada reaksi hidrolisis enzimatik tersebut. Kode

H2 pH5 T45 menunjukkan perlakuan pH 5, penambahan air 1%, dan suhu 45oC,

sedangkan kode H2 pH5 T25 menunjukkan perlakuan pH 5, penambahan air 1%,

dan suhu 25oC.

Berdasarkan data Gambar 17, diketahui minyak awal telah mengandung

EPA sebesar 1,81%. Reaksi hidrolisis sebagai salah satu upaya pengkayaan

komponen omega-3 telah terbukti meningkatkan kandungan EPA pada

konsentrat hasil reaksi. Hal ini dapat dilihat dari data pada Gambar 22, bahwa

perlakuan suhu 45oC dan pH 5 dengan tingkat hidrolisis enzimatik 28,07%,

kandungan EPA meningkat menjadi 12,68%. Peningkatan EPA pada perlakuan

ini sebesar 10,87% dari kandungan asam eikosapentanoat minyak awal.

Sementara itu, pada perlakuan suhu 45oC dan pH 7 dengan tingkat hidrolisis

sebesar 6,79%, kandungan EPA sebesar 10,37%. Pada perlakuan ini,

peningkatan omega-3 yang terjadi sebesar 8,56% dari kandungan minyak awal.

Hal ini membuktikan bahwa, pada reaksi hidrolisis enzimatik, semakin tinggi

tingkat hidrolisis, tidak menunjukkan peningkatan total asam eikosapentanoat

yang dihasilkan. Dengan demikian, berdasarkan hasil hidrolisis enzimatik tanpa

penambahan pelarut heptana, pengkayaan EPA lebih baik dilakukan pada pH 5.

Gambar 18. Kurva hubungan tingkat hidrolisis reaksi hidrolisis enzimatikoptimum faktor reaksi800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)

Berdasarkan data Gambar 18, diketahui minyak awal tidak mengandung

DHA. Peningkatan kandungan DHA terjadi setelah minyak ikan dihidrolisis. Hal

ini dapat dilihat dari data pada Gambar 18, bahwa perlakuan suhu 45

dengan tingkat hidrolisis enzimatik 28,07%, kandungan DHA meningkat

menjadi 3,06%. Sementara itu, pada

tingkat hidrolisis sebesar 6,79%, kandungan DHA sebesar 0,85%.

02468

1012141618202224262830

minyak awal

0

PERSENTASE




. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan asam dokosaheksanoat reaksi hidrolisis enzimatik terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)


A. Peningkatan kandungan DHA terjadi setelah minyak ikan dihidrolisis. Hal

ini dapat dilihat dari data pada Gambar 18, bahwa perlakuan suhu 45


menjadi 3,06%. Sementara itu, pada perlakuan suhu 45oC dan pH 7 dengan

tingkat hidrolisis sebesar 6,79%, kandungan DHA sebesar 0,85%.

minyak awal H1 pH 7 T 45

H1 pH 5 T 45

H2 pH 5 T 45

H2 pH 5 T

0

6,79

28,07

22,5623,94

0 0,853,06

0

PERLAKUAN


50



dan asam dokosaheksanoat pada

terhadap setiap perlakuan pada kondisi , minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau


A. Peningkatan kandungan DHA terjadi setelah minyak ikan dihidrolisis. Hal

ini dapat dilihat dari data pada Gambar 18, bahwa perlakuan suhu 45oC dan pH 5


C dan pH 7 dengan

H2 pH 5 T 25

23,94

1,87

DHA

Gambar 19. Kurva hubungan tingkat hidrolisis

hidrolisis enzimatikoptimum faktor rea800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)

Berdasarkan data Gambar 19, diketahui minyak awal dengan tingkat

hidrolisis 0% telah mengandung komponen omega

hidrolisis sebagai sa

meningkatkan kandungan total omega

dapat dilihat dari data pada Gambar 19, bahwa perlakuan suhu 45

kandungan omega-

sebesar 28,07%. Peningkatan omega

kandungan omega-3 minyak awal. Sementara itu, pada perlakuan suhu 45

pH 7, kandungan omega

perlakuan ini, peningkatan omega

minyak awal. Hal ini membuktikan bahwa, pada reaksi hidrolisis enzimatik,

semakin tinggi tingkat hidrolisis, semakin besar pula pengkayaan omega

terjadi.

Pada data yang ditunjukkan oleh Lampir

konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada kondisi optimum faktor reaksi

02468

1012141618202224262830

minyak awal

0

PERSENTASE

TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKANTOTAL OMEGA 3

. Kurva hubungan tingkat hidrolisis dan total omega-hidrolisis enzimatik terhadap setiap perlakuan pada kondisi optimum faktor reaksi, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau 800U), waktu reaksi (48 jam), buffer fosfat (0,1M)


hidrolisis 0% telah mengandung komponen omega-3 sebesar 1,81%. Reaksi

hidrolisis sebagai salah satu upaya pengkayaan omega-3 telah terbukti

meningkatkan kandungan total omega-3 pada konsentrat hasil reaksi. Hal ini

dapat dilihat dari data pada Gambar 19, bahwa perlakuan suhu 45

-3 meningkat menjadi 17,51% dengan tingka

sebesar 28,07%. Peningkatan omega-3 pada perlakuan ini sebesar 15,7% dari

3 minyak awal. Sementara itu, pada perlakuan suhu 45

pH 7, kandungan omega-3 sebesar 16,89% dengan tingkat hidrolisis 6,79%. Pada

ningkatan omega-3 sebesar 15,08% dari kandungan omega


semakin tinggi tingkat hidrolisis, semakin besar pula pengkayaan omega

Pada data yang ditunjukkan oleh Lampiran 7 yaitu pada data hasil analisa


minyak awal

H1 pH 7 T 45

H1 pH 5 T 45

H2 pH 5 T 45

H2 pH 5 T 25

0

6,79

28,07

22,5623,94

1,81

16,89 17,51

7,14

10,48

PERLAKUAN

TINGKAT HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK IKANTOTAL OMEGA 3

51

-3 pada reaksi terhadap setiap perlakuan pada kondisi

, minyak ikan (4 gram), enzim (0,1 gram atau


3 sebesar 1,81%. Reaksi

3 telah terbukti

3 pada konsentrat hasil reaksi. Hal ini

dapat dilihat dari data pada Gambar 19, bahwa perlakuan suhu 45oC dan pH 5,

3 meningkat menjadi 17,51% dengan tingkat hidrolisis

3 pada perlakuan ini sebesar 15,7% dari

3 minyak awal. Sementara itu, pada perlakuan suhu 45oC dan

3 sebesar 16,89% dengan tingkat hidrolisis 6,79%. Pada

3 sebesar 15,08% dari kandungan omega-3


semakin tinggi tingkat hidrolisis, semakin besar pula pengkayaan omega-3 yang

an 7 yaitu pada data hasil analisa


H2 pH 5 T 25

23,94

10,48


52

menggunakan GC-MS, terlihat asam lemak omega-3 yang terkandung dalam

minyak awal adalah asam eikosapentanoat. Namun, pada hasil reaksi hidrolisis

enzimatik asam lemak omega-3 meliputi metil heksadekatrienoat, metil

dokosaheksanoat, metil eikosapentanoat, metil eikosatetranoat, dan metil

oktadekatrienoat. Senyawa asam lemak tersebut merupakan bentuk turunan dari

asam linoleat. Menurut Zaverucke dan Wimmer (2008), asam linoleat dapat

berubah menjadi asam lemak C18 ω3 dan ω6, asam α-linolenat (ALA), asam γ-

linolenat, sampai C20 (asam arachidonat, AA) dan asam dihomo-γ-linolenat

melalui biosintetis pathway. Asam α-linolenat sendiri dapat berubah menjadi

asam lemak omega-3 seperti asam eikosapentanoat (EPA) dan asam

dokosaheksanoat (DHA). Mekanisme pathway metabolisme Polyunsaturated

Fatty Acids ditunjukkan oleh Gambar 20.

Gambar 20. Pathway metabolisme polyunsaturated fatty acid (Zaverucke dan Wimmer, 2008)

Berdasarkan data pada Gambar 17, diketahui bahwa pada hasil reaksi

hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana pada

perlakuan suhu 45oC dan pH 5, kandungan EPA sebesar 7,14% dari total jumlah

asam lemak dalam konsentrat, dengan tingkat hidrolisis pada perlakuan ini

sebesar 22,56%. Peningkatan EPA pada perlakuan ini sebesar 5,33% dari

53

kandungan EPA minyak awal. Sementara itu, pada perlakuan suhu 25oC dan pH

5, kandungan EPA sebesar 10,23% pada tingkat hidrolisis 23,94%. Pada

perlakuan ini, peningkatan EPA sebesar 8,42% dari kandungan EPA minyak

awal. Reaksi hidrolisis enzimatik dengan penambahan heptana terbukti mampu

memperkaya kandungan asam eikosapentanoat.



perlakuan suhu 45oC dan pH 5 dengan tingkat hidrolisis 22,56%, konsentrat hasil

reaksi tidak mengandung DHA. Sementara itu, pada perlakuan suhu 25oC dan

pH 5, dengan tingkat hidrolisis 23,94%, konsentrat mengandung DHA sebesar

1,87%.



perlakuan suhu 45oC dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar 7,14%, dengan

tingkat hidrolisis pada perlakuan ini sebesar 22,56%. Peningkatan omega-3 pada

perlakuan ini sebesar 5,33% dari kandungan omega-3 minyak awal. Sementara

itu, pada perlakuan suhu 25oC dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar 10,48%

pada tingkat hidrolisis 23,94%. Pada perlakuan ini, peningkatan omega-3 sebesar

8,42% dari kandungan omega-3 minyak awal. Reaksi hidrolisis enzimatik

dengan penambahan heptana terbukti mampu memperkaya kandungan omega-3.

Namun, penambahan heptana sebagai media reaksi untuk reaksi hidrolisis

enzimatik tidak meningkatkan persentase hidrolisis dan kandungan total omega-

3 pada konsentrat hasil reaksi bila dibandingkan pada reaksi hidrolisis tanpa

penambahan pelarut heptana.

Berdasarkan data pada Lampiran 7 yaitu pada data hasil analisa


menggunakan GC-MS, dan dengan membandingkan kandungan omega-3 hasil

reaksi hidrolisis pada kondisi yang sama yaitu suhu 45oC dan pH 5 antara reaksi

dengan penambahan pelarut heptana dan tanpa penambahan pelarut heptana,

diperoleh konsentrat hasil hidrolisis untuk konsentrat hasil reaksi hidrolisis

enzimatik tanpa penambahan pelarut heptana memiliki kandungan omega-3 yang

lebih rendah daripada konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media

54

yang ditambahkan pelarut heptana. Perbedaan kandungan total omega-3 pada

kondisi pH 5 dan suhu 45oC tersebut sebesar 10,37%. Tingginya kandungan

omega-3 pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis tanpa penambahan pelarut

heptana disebabkan karena tingkat hidrolisis yang lebih tinggi pula. Penambahan

pelarut heptana pada reaksi hidrolisis enzimatik tidak meningkatkan aktivitas

katalitik enzim. Hal ini kemungkinan dikarenakan kepolaran heptana yang terlalu

besar (log p=4) tidak mendukung stabilitas enzim lipase tersebut pada reaksi

hidrolisis. Pelarut heptana membuat struktur tiga dimensi enzim lipase berubah.

Namun perubahan yang terjadi membuat aktivitas katalitik enzim lipase

menurun. Semakin tinggi kepolaran media hidrofobik yang digunakan untuk

media reaksi secara enzimatik tidak menentukan tingginya aktivitas lipolitik

yang terjadi. Hal ini juga didukung oleh penelitian Kim et al. (2000) yang

menunjukkan bahwa aktivitas lipolitik pada media n-heksana ternyata lebih

tinggi daripada pada media isooktana. Padahal kepolaran isooktana lebih tinggi

daripada n-heksana.

55

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Pada reaksi hidrolisis enzimatik tanpa penambahan heptana, diperoleh

aktivitas katalitik enzim yang menghasilkan tingkat hidrolisis tertinggi adalah pada

pH 5 dan suhu 45oC dengan tingkat hidrolisisnya 28,7%. Pada reaksi hidrolisis

enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana diperoleh penambahan air

optimum adalah 1% dengan tingkat hidrolisis sebesar 26,16%. Dengan menggunakan

kondisi tersebut (pH 5, suhu 45oC, dan penambahan air 1%) dilakukan reaksi

hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana. Hasil yang diperoleh

adalah terjadi peningkatan aktivitas pada tiap perlakuan suhu kecuali 65oC dengan

tingkat hidrolisis tertinggi (23,94%) pada suhu 25oC. Pada perlakuan pH, terjadi

penurunan aktivitas pada tiap titik perlakukan pH kecuali pada pH 7. Namun, tingkat

hidrolisis tertinggi (22,56%) masih pada pH 5.

Berdasarkan analisa GC-MS, pada reaksi hidrolisis enzimatik pada media

tanpa penambahan heptana pada suhu 45oC dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar

17,51% dengan tingkat hidrolisis sebesar 28,07%. Sedangkan, pada suhu 45oC dan

pH 7, kandungan omega-3 sebesar 16,89% dengan tingkat hidrolisis 6,79%. Pada

reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan pelarut heptana,

kandungan omega-3 pada suhu 45oC, penambahan air 1%, dan pH 5 sebesar 7,14%

dengan tingkat hidrolisis sebesar 22,56%. Sedangkan, pada suhu 25oC, penambahan

air 1%, dan pH 5, kandungan omega-3 sebesar 10,48% dengan tingkat hidrolisis

23,94%.

B. SARAN

Penelitian ini merupakan penelitian pendahuluan dalam rangka mendapatkan

kondisi dimana reaksi hidrolisis enzimatik mencapai nilai tertinggi dengan parameter

tingkat hidrolisis. Perlu dilakukan penelitian mengenai Model Persamaan

Matematika untuk mengetahui hubungan parameter terhadap waktu pada kondisi

optimum faktor reaksi. Selain itu, perlu dilakukan penelitian lain mengenai

penggunaan pelarut lain yang memiliki nilai log p yang lebih tinggi.

56

DAFTAR PUSTAKA

Aidos, I. 2002. Production of High Quality Fish Oil from Herring Byproduct. Ph.D. Thesis. Wageningen University, Netherlands. Diperoleh dari http://library. Wur.nl/wda.dissertation/dis3270.pdf. Diakses pada 18 September 2008

Ackman, R.G. 1982. Fatty Acid Composisition of Fish Oil. Di dalam Barlows S.M. dan M.E. Standby. Nutritional Evaluation of Long Chain Fatty Acid in Fish Oil. (ed). 1982. Acad. Press Ltd, London

Akoh, C.C., dan D.B. Min,1998. Microbial Lipases, and Enzymatic Interesterification in Food Lipids-Chemistry, Nutrition and Biotechnology. Di dalam. Ozturk, Banu. 2001. Immobilization of Lipase from Candida rugosa on Hydrophobic and Hydrophilic Supports. Disertasi. Izmir Institute of Technology, Izmir

Amano Pharmaceutical Manufacturing Co. 2009. Dictionary of Enzyme: Lipase Aspergillus niger. Japan

AOCS. 1997. AOCS Official Methode. Association of Oil Chemist’ Society. Washington, D.C.

Bloomer, S., M.A. Bjurlin, dan M.J. Haas, , 2001. Composition and Activity of Commercial Triacylglycerol Acylhydrolase Preparations. Journal of American Oil Chemist Society Vol. (78) : 153-160

Brockman, H.L. 1984. General Feature of Lipolisis Reaction Schem : Interfacial Structure and Approach in Brongstrom and Brockman (ed). Lipases:443-469.

Carvalho P.O., P.R.B.Campos, M.D.A. Noffs, D.H.M. Bastos, dan J.G. Oliviera. 2002. Enzymic Enhancement of ω-3 Polyunsaturated Fatty Acids Content in Brazilian Sardine Oil. Acta Farm. Bonaerense Vol. 21(2) : 85-88

Carvalho, P O., P,R. B. Campos., M.D.A.Noffs, P.B. L. Fregolentes, dan L.V. Fregolentes. 2009. Enzymatic Hydrolysis of Salmon Oil by Native Lipases: Optimization of Process Parameters. Journal of Brazilian Chemist Society Vol. 20(1) : 117-124

Celik, Hulya. 2002. Commercial Fish Oil. ISSN 1302 647X. B serisi Cilt 3(1) : 1-6

Chang S.S., Y.Bao, dan T.J.Pelura. 1989. Fish oil. United Patent States. 5, 023,100

Chaplin, M.F. dan C.Bucke. 1990. Enzyme Technology. Cambridge University Press, New York

Djatmiko, B dan Wijaya. 1984. Teknologi Minyak dan Lemak,I. Agroindustri Press, Fateta. IPB, Bogor

Dordick JS. 1989. Enzymatic Catalysis in Monophasic Organic Solvent. Enzyme Microbial Technology. Di dalam Medina, A.R., B.C.Paez, F.C.Rubio, P.G.Moreno,dan E.M.Grima. 2003. Modelling The Effect of Free Water Enzyme Activity in Immobilized Lipase-Catalyzed Reaction in Organic Media. Enzyme and Microbial technology Vol (33) : 845-853

57

Fatimah, zuhra. 2002. Penyedian Asam Eikosapentanoat (EPA) dan Asam Dokosaheksanoat (DHA) Melalui Transesterifikasi Minyak Ikan Dengan Etanol yang Dikatalisis Oleh Lipase. Universitas Sumatera Utara, Medan.

Gandhi, N.N. 1997. Application of Lipase. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 74 : 621-634

Gubicza L., K. szekely, O. Ulbert, dan K. Belafi-Bako. 2000. Enhancement of The Thermostability of Candida cylindracea Lipase by Medium Engineering. Chem Paper Vol. 54 (6a) : 351-354

Gutierrez, L.E. dan R.C.M. Silva. 1993. Fatty Acid Composition of Commercially Important Fish From Brazil. Science Agricultural, Piracicaba Vol. 50(3) : 473-483

Gupta, Kshitiz. 2007. Ecological Sceening For Lipolitic Molds and Process Optimization for Lipase Production From Rhizopus oryzae KG-5. Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation Vol. 2 (2) : 35-42

Handayani, R. dan J. Sulistyo, 2005. Transesterifikasi Ester Asam Lemak Melalui Pemanfaatan Teknologi Lipase. Jurnal Biodiversitas Vol. 6 : 164-167

Haraldson, G.G., B. Kristinsson, R. Sigurdardottir, G.G.Gudmundsson, dan H.Breivik, 1997. The Preparation of Concentrates of Eicosapentaenoi Acid and Docosahexaenoic Acid by Lipase-Catalized Transesterification of Fish Oil With Ethanol. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 74 : 1419-1424

Hariyadi, P. 1995. Synthesis of Monoester and Mono- and Diacylglycerol from Butteroil by Lipase Catalyzed Esterification in Microaqueous Media. Dissertation.Graduate School of University of Wisconsin-Madison, USA

Hartley, C.W.S. 1977. The Oil Palm. John Willey and Sons Inc., New York

Herawan, T. 1993. Pembuatan Produk-Produk Oleokimia dari Minyak Sawit Menggunakan Proses Enzimatik. Skripsi. Fateta-IPB, Bogor

Heeres H.J. , G.N. Kraai, J.G.M. Winkelman, dan J.G. de Vries . 2008. Kinetic Studies on The Rhizomucor miehei Lipase Catalized esterification Reaction of Olein Acid with 1-Butanol in a Biphasic System. Biochemical Engineering Journal Vol. 41: 87-94

Kamarudin A.H., N.A. Serri, dan S.N. Rahaman. 2008. Preliminary Studies for Production of Fatty Acids from Hydrolysis of Cooking Oil Using Candida rugosa Lipase. Journal of Physical Science Vol 19 (1): 79-88

Kim, I.H., C.S.Yoon, dan K.W. Lee. 2000. Transesterification of Conjugated Linoleic Acid and Tricaprylin by Lipase Inorganic Solvent.Food Researches International Vol. 3: 301-306

Kim, I.H., N.K. Soon, M.L. Sun, H.C.Soo, K. Hakryl, T.L. Ki, dan Y.H. Tae. 2004. Production Of Sructured Lipids By Lipase Catalized Acidolysis in Supercritical Carbon Dioxide: Effect on Acyl Migration. Journal of American Oil Chemistry Society Vol. 81(6) : 537-541

58

Krieger, N., T. Bhatnagar, C.B. Jacques, M.B. Alessandra, M.L.Valeria, dan D.Mitchel. 2004. Non Aqueous Biocatalysis in Heterogenous Solvent Systems. Food Technology Biotechnology Vol.42 (4) : 279-286

Kurashige J., N. Matsuzaki dan H. Takahashi. 1993. Enzimatic Modification of Canola/Palm Oil Mixture Effect on The Fluidity. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 70(9) : 849-852

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Terjemahan oleh Maggy Thenawijaya. Penerbit Erlangga, Jakarta

--------------------. 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Terjemahan oleh Suhartono, M.T. Penerbit Erlangga, Jakarta

Loebis,B. 1989. Cara dan Rancangan Perebusan Tandan Kelapa Sawit. Bul. Perkebunan. Vol 20 (2):89-95. Balai Penelitian Perkebunan Medan (RISPA), Medan.

Macrae,A. R. 1983. Extracelluler Microbial Lipase. Di Dalam W. M Forganti. Microbial Enzyme and Biotechnology. Appl. Sci. Publ., London.

Medina, A.R., B.C. Paez, F.C. Rubio, P.G. Moreno, dan E.M. Grima. 2003. Modelling The Effect Of Free Water Enzyme Activity in Immobilized Lipase-Catalyzed Reaction in Organic Media. Enzyme and Microbial Technology Vol 33 : 845-853

Moore, S.R. dan P.M.Gerald. 1996. Production of Triglyrides Enriched in Long-Chain n-3 Polyunsaturated fatty Acids from Fish Oil. Journalof American Oil Chemist Society Vol.73 : 1409-1414.

Norin, T dan K. Hult. 1992. Enantioselectivity of Some Lipase : Control and Prediction. Pure and Applied Chemical Vol. 64 (8) : 1129-1134

Nuraida, L., R. Dewanti,, P. Hariyadi, dan Budijanto. 2000. Eksplorasi, Karakterisasi, dan Produksi Enzim Lipase dengan Aktivitas Esterifikasi Tinggi dari Kapang Indigenous. Laporan Tahunan Pertama Penelitian Hibah Bersaing VIII/I Perguruan Tinggi. Fateta-IPB, Bogor

Petersen M.T.N., P. Fojan, dan S.B.Petersen. 2001. How do Lipases and Esterases Work: The Electrostatic Contribution. Di Dalam. Ozturk, Banu. 2001. Immobilization of Lipase from Candida rugosa on Hydrophobic and Hydrophilic Supports. Disertasi. Đzmir Institute of Technology, Izmir

Rasyid, A. 2001. Isolasi Asam Lemak Tak Jenuh Majemuk Omega-3 dari Ikan Lemuru (Sardinella sp.). Prosiding Seminar Riptek Kelautan Nasional. Pusat Penelitian Oseanografi LIPI, Jakarta.

Saify, Z.S., S.Akhtar, K.M. Khan, S,Perveen, S.A.M. Ayattollahi, A.Hasan, M.Arif, A.M. haider, F.Ahmad, S.Siddiqui, dan M.Z.Khan. 2003. A Study on The Fatty Acid Composition of Fish Liver Oil from Two Marine Fish Eusphyra blochii and Carcharhinus bleekeri. Turk J Chem Vol. 27 : 251-258

Salis, A., P. Marcella, M. Maura, dan S. Vincenzo. 2008. Comparison Among Immobilised Lipases on Macroporous Polypropylene Toward Biodiesel Synthesis. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic Vol. 54 : 19–26

59

Saxena, R.K. , P. K.Ghosh , R. Gupta, W.S. Davidson, S. Bradoo, dan R. Gulati. 2009. Microbial Lipases: Potential Biocatalysts for The Future Industry. Departement of Microbiology. University of delhi, India

Schneider, P.M. dan M. Berger. 1991. Regioselectivity of Lipases in Organic Solvents. Biotechnology Letters Vol. 13(5) : 333-338.

Shahidi, F. dan U.N.Wanasundara. 1998. Lipase Assisted Concentration of n-3 Polyunsaturated Fatty Acids in Acylglyscerol from Marine Oil. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 75 : 945-951

------------------------------------------------. 1998b. Omega-3 Fatty Acids Concentrates: Nutritional Aspect and Production Technologies. Journal of Food Science and Technology Vol. 9 : 230-240

Shimada Y., M. Kazuaki, S. Akio, M. Shigeru, dan T. Yoshio. 1997. Purification of Docosahexaenoic Acid from Tuna Oil by a Two-Step Enzymatic Method: Hydrolysis and Selective Esterification. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 74 : 1441–1446

Shirai, K. and R. L. Jackson.1982. Lipoprotein Lipase-catalyzed Hydrolysios f p-Nitrophenyl Butyrate. Journal of Biological Chemistry Vol. 257 : 1253-1258

Stauffer, Clyde E. 1989. Enzyme For Food Scientist. Van Nostrand Reinhold, New York.

Swern, D. 1979. Bailley’s Industrial Oil and Fat Products. Vol 1 4th edition. John Willey and Sons, New York

Tanaka, Y.,J. Hirano, dan T. Funada. 1992. Concentration of Docosahexaenoic Acid in Glyceride by Hydrolysis of Fish Oil with Candida cylindracea Lipase. Journal of American Oil Chemist Society Vol. 69(2) : 1210-1214

Rahman, R.N.Z.R.A., S.N. Baharum,A.B. Salleh, dan M. Basri. 2006. S5: An Organic Solvent Tolerant Enzyme. Journal of Microbiology : 583-590.

Roberto E.A., V.Mircea, M.B. Adam, A.K. Jaroslav, J.B. Colin. 2007. Transesterification of Fish Oil to Produce Fatty Acid Ethyl Esters Using Ultrasonic Energy. Journal of American Oil Chemist Society Vol.84 : 1045-1052

Ueji, S. dan T. Okamoto. 1999. Drastic Enhancement of The Enantioselectivity of Lipase-Catalysed Esterification in Organic Solvents By The Addition of Metal Ions. Chem. Commun.: 939–940

Wallace, Alecander. 1935. Fish Oil. Oil and Soup Vol.2 (53) : 89-90

Wang, Y.J., L.A. Miller, M. Perren, dan P.B. Addis. 1990. Omega-3 Fatty acids in Lake Superior Fish. J. Food Sci. 55:71.

Web, Z.C. dan M. Dixon,. 1964. Enzyme. Academic Press Inc. Publ. , New York

Winarno, F.G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

Zaks, A. dan A.M. Klibanov. 1985. Enzyme Catalyzed Processes in Organic Solvent. Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.82 : 3192-3296

60

-------------------------------------. 1988. Enzymatic Catalysis in Nonaqueous Solvents. J Biol Chem Vol. 263(3) : 194–201. Di dalam Medina, A.R., B.C.Paez, F.C.Rubio, P.G.Moreno,dan E.M.Grima. 2003. Modelling The Effect Of Free Water Enzyme Activity In Immobilized Lipase-Catalyzed Reaction in Organic Media. Enzyme and Microbial Technology Vol (33) : 845-853

Zarevucka, M. dan Z . Wimmer. 2008. Plant Product For Pharmacology: Application of Enzyme in Their Transformation. International Journal of Molecular Science Vol. 9 : 2447-2473

61

LAMPIRAN

62

Lampiran 1. Prosedur analisa sifat fisiko kimia minyak ikan

1. Bilangan Asam (AOCS Official Methode Cd 3d-63, 1997)

Minyak ikan yang akan diuji ditimbang sesuai dengan ketentuan pada

tabel berikut dalam erlenmeyer 300mL.

Tabel 9. Ukuran sampel berdasarkan perkiraan bilangan asam

Bilangan asam Massa , gram (±10%) Keakuratan berat ±g

0-1 20 0,05

1-4 10 0,02

4-15 2,5 0,01

15-75 0,5 0,001

75 lebih 0,1 0,0002

Tabel 9 diatas menyebutkan hubungan antara massa yang harus

ditimbang sesuai dengan perkiraan bilangan asam pada minyak yang akan

diuji. Semakin tinggi bilangan asam suatu minyak, maka semakin sedikit

massa minyak yang harus ditimbang. Misalnya suatu minyak memiliki

perkiraan bilangan asam antara 0-1, dengan demikian massa minyak yang

harus ditimbang adalah 20 gram.

Minyak yang telah ditimbang ditambah dengan 125 mL campuran

larutan toluena:isopropanol (1:1). Setelah itu, larutan tersebut ditambah

dengan indikator phenolphtalein 2mL kemudian dititrasi dengan larutan KOH

0,1N. Titrasi dilakukan sampai terbentuk warna merah jambu yang tidak

hilang dalam 30 detik. Selanjutnya, jumlah miligram KOH yang digunakan

untuk menetralkan asam lemak bebas dalam miligram sampel dihitung.

Bilangan asam (mg KOH /g sampel) : �� ,�

Keterangan:

A : Volume (mL alkali pada titrasi sampel)

B : Volume(mL alkali pada titrasi blanko)

N : Normalitas alkali standart

W : Massa sampel

56,1: Bobot Molekul KOH

63

Perhitungan FFA (free fatty acid) sebagai persen oleat, laurat, dan

palmitat, bilangan asam dikalikan/dikonversi dengan faktor konversi 1,99,

2,81, dan 2,19.

Ketelitian ditunjukkan dengan penentuan analisa bilangan asam yang

ditunjukkan oleh dua hasil analisis yang berbeda harus tidak lebih dari 0,22

untuk bilangan asam dengan nilai kurang dari 4, dan tidak lebih dari 0,36

untuk bilangan asam nilai antara 4-20.

2. Bilangan Penyabunan (AOCS Official Methode Cd 3-25, 1997)

Minyak yang akan diuji, ditimbang 4-5 gram di dalam Erlenmeyer

500mL. Kemudian menambahkan 50 mL larutan KOH-Alkohol . Blangko

disiapkan sesuai dengan prosedur namun tidak menggunakan minyak.

Erlenmeyer yang berisi larutan dihubungankan refluks air condenser sampai

seluruh sampel tersabunkan. Waktu yang diperlukan untuk merefluks adalah

1 jam. Setelah itu, tambah indikator phenolphthalein 1mL dan dititrasi dengan

larutan HCL 0,5N hingga warna merah muda menghilang. Selanjutnya,

jumlah mg KOH yang digunakan untuk menyabunkan sampel minyak

dihitung.

Bilangan penyabunan = �� ,�

Dimana :

B : volume 0,5 N HCl untuk titrasi blanko

S : Volume 0,5 N HCl untuk titrasi sampel

N: Normalitas larutan HCl

W : berat sampel

64

Lampiran 2. Prosedur pengukuran aktivitas enzim lipase dengan metode spektrofotometri

Bahan :

a. Enzim lipase Aspergillus niger

b. ρ-nitrophenyl butyrate

c. Buffer phosphate 0,1 M pH 7

d. Larutan standar ρ-nitrophenyl butyrate

Prosedur :

Pipet sebanyak 0.45 ml larutan enzim ke dalam tabung reaksi

bertutup ulir. Tambahkan larutan buffer phosphate 0,1 M pH 7 sebanyak

0,54 ml ke dalam tabung ulir, kocok dengan shaker tube hingga larutan

bercampur rata. Masukkan ke dalam tabung 0,01 ml larutan ρ-nitrophenyl

butyrate 0,2 M, kocok kembali dengan shaker tube hingga larutan

bercampur rata. Inkubasi sampel pada suhu 37oC selama 30 menit. Sampel

kemudian diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang

gelombang 410 nm. Blanko dibuat sesuai dengan prosedur untuk sampel

tanpa penambahan larutan enzim.

Perhitungan :

Unit / ml enzim = ��

��

� � ��

dimana:

A = nilai absorbansi sampel

B = nilai absorbansi blanko

t = lama inkubasi (menit)

Vt = Volume total larutan sampel (ml)

fp = Faktor pengencer

K = Nilai konversi standar ρ-nitrophenyl butyrate (0.0148 µmol)

Ve = Volume larutan enzim (ml)

65

Lampiran 3. Data hasil karakterisasi minyak ikan

Tabel 10. Nilai karakterisasi fisiko kimia minyak ikan

Karakterisasi Nilai Rujukan

Bilangan asam 3,29 10,15a

Kadar asam lemak bebas (%) 1,49 4,6

Bilangan penyabunan 204,81 187,4a

A. Hasil Analisa Komponen Asam Lemak Minyak Ikan Dengan Menggunakan MS)

Hasil Analisa Komponen Asam Lemak Minyak Ikan Dengan Menggunakan Gas Chromatography

Gambar 21. Peak area analisa GC-MS minyak ikan

66

Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-

66

67

Tabel 11. Nama komponen minyak ikan hasil analisa GC-MS

Rate Time

% Area Nama Komponen Qual Rumus Molekul

Bobot Molekul

7.44 2,9 Pentadekana 97 C15H32 212

9.00 2,9 Heptadekana 98 C17H36 240

9.05 5,39 2,6,10,14 tetrametilpentadekana

98 C19H40 268

9.45 4 Asam tetradekanoat (Asam Miristat)

99 C14H28O2 228

9.69 0,18 Asam tetradekanoat (Asam Miristat)

87 C14H28O2 228

10.74 6,8 11-Asam heksadecenoat 91 C16H30O2 254

10.85 15,3 Asam n-heksadekanoat (Asam Palmitat)

99 C16H32O2 256


89 C16H32O2 256


90 C16H32O2 256


59 C16H32O2 256

11.50 0,98 Asam 5,8,11,14,17 eikosapentanoat

55 C21H32O2 316

11.99 2,71 Asam 9-oktadecenoat (Asam oleat)

99 C18H34O2 282


99 C18H34O2 282


98 C18H34O2 282


98 C18H34O2 282


89 C18H34O2 282


87 C18H34O2 282


85 C18H34O2 282


91 C18H34O2 282

68


88 C18H34O2 282

13.66 0,88 9-Oktadecenal (Olealdehid) 86 C18H24O 266


86 C18H34O2 282

14.00 1,77 Asam oktadekanoat (Asam stearat)

91 C18H36O2 284

14.59 0,83 Asam 5,8,11,14,17 eikosapentanoat

46 C21H32O2 316

16.13 2,25 Squalene 95 C30H50 410

17.05 2,55 Cholesta-3,5-diena (Squalene)

99 C27H44 368

19.45 24,96 Lanosterol 99 C27H46O 386

69

Lampiran 4. Data hasil pengukuran aktvitas enzim lipase dari Aspergillus niger dengan metode spektrofotometri

Tabel 12. Hasil pengukuran aktivitas lipase Aspergillus niger

Keterangan : 1mL larutan enzim = 0.4247 g enzim

Kode Nilai

Absorbansi λ 410 nm

Faktor Pengenceran

Volume larutan (mL)

Konversi nitro

phenol

Waktu (menit)

Volume

enzim (mL)

Aktivitas enzim lipase

(unit/g) Blanko 0.33 - - - - - -

Sampel 0.4335 2554.6 1 0.0148 30 0.45 7939.97

70

Lampiran 5. Data hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan menggunakan enzim lipase Aspergillus niger pada media tanpa penambahan pelarut heptana

A. Hubungan Derajat Keasaman (pH) Dengan Tingkat Hidrolisis Pada Reaksi Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Tanpa

Penambahan Heptana

Tabel 13. Nilai % Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Macam pH Ulangan 1

No Suhu Hidrolisis

(oC)

Buffer PH

(0,1 M)

Waktu Hidrolisis

(Jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan

penyabunan %Hidrolisis

1 45 5 48 5,148 88,670 204,81 41,831

2 45 6 48 5,148 17,386 204,81 6,129

3 45 7 48 5,148 18,713 204,81 6,794

4 45 8 48 5,148 17,386 204,81 6,129

5 45 9 48 5,148 14,225 204,81 4,546

70

71

Tabel 14. Nilai % Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Macam pH Ulangan 2

No Suhu

Hidrolisis (OC)

Buffer PH

7 (0,1 M)

Waktu

Hidrolisis (Jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 45 5 48 5,016 61,093 204,81 28,067

2 45 6 48 5,016 25,964 204,81 10,485

3 45 7 48 5,016 13,576 204,81 4,285

4 45 8 48 5,016 10,182 204,81 2,586

5 45 9 48 5,016 13,848 204,81 4,420

Tabel 15. Nilai % Hidrolisis Kontrol Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Macam pH

No Suhu

Hidrolisis (oC)

Buffer PH

(0,1 M)

Waktu

Hidrolisis (Jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 45 5 48 5,016 14,306 204,81 4,650

2 45 6 48 5,016 13,005 204,81 3,999

3 45 7 48 5,016 7,153 204,81 1,069

4 45 8 48 5,016 5,61 204,81 0,29

5 45 9 48 5,016 5,61 204,81 0,29

71

72

B. Hubungan Suhu Dengan Tingkat Hidrolisis Pada Reaksi Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana Tabel 16. Nilai % Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Tanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Suhu

No Suhu

Hidrolisis (oC)

Buffer PH

(0,1 M)

Waktu

Hidrolisis (Jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 25 7 48 3,848 9,418 204,81 2,772

2 35 7 48 4,757 13,054 204,81 4,147

3 45 7 48 5,158 18,713 204,81 6,789

4 55 7 48 4,761 14,109 204,81 4,673

5 65 7 48 4,308 10,589 204,81 3,133

Tabel 17. Nilai % Hidrolisis Kontrol Minyak Ikan Pada MediaTanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Suhu

No Suhu Hidrolisis

(oC)

Buffer PH

(0,1 M)

Waktu Hidrolisis

(Jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 25 7 48 3,848 3,892 204,81 0,022

2 35 7 48 4,771 5,394 204,81 0,312

3 45 7 48 5,158 6,662 204,81 0,753

4 55 7 48 4,761 5,947 204,81 0,593

5 65 7 48 4,308 5,402 204,81 0,545

72

73

Lampiran 6. Data hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan menggunakan enzim lipase Aspergillus niger pada media yang ditambahkan pelarut heptana

A. Hubungan Penambahan Air Dengan Tingkat Hidrolisis Pada Reaksi Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana

Tabel 18. Nilai % Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Penambahan Air Ulangan 1

No Kadar

Air (%)

Suhu

Hidrolisis (oC)

Buffer Fosfat

pH (0,1M)

Waktu

Hidrolisis (jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 1 45 5 48 3,466 76,264 204,81 36,156

2 2 45 5 48 3,466 44,852 204,81 20,555

3 3 45 5 48 3,466 54,260 204,81 25,227

4 4 45 5 48 3,466 45,581 204,81 20,917

5 5 45 9 48 3,466 56,549 204,81 26,364

73

74

Tabel 19. Nilai % Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Penambahan air Ulangan 2

No Kadar

Air (%)

Suhu Hidrolisis

(oC)

Buffer Fosfat

pH (0,1M)

Waktu Hidrolisis

(jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan

Penyabunan %Hidrolisis

1 1 45 5 48 3,466 36,022 204,81 16,169

2 2 45 5 48 3,466 13,801 204,81 5,133

3 3 45 5 48 3,466 29,431 204,81 12,896

4 4 45 5 48 3,466 14,025 204,81 5,244

5 5 45 9 48 3,466 17,672 204,81 7,055

Tabel 20. Nilai % Hidrolisis Kontrol Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Penambahan Air

No Kadar

Air (%)

Suhu Hidrolisis

(oC)

Buffer Fosfat

pH (0,1M)

Waktu Hidrolisis

(jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 1 45 5 48 3,466 9,24 204,81 2,87

2 2 45 5 48 3,466 10,96 204,81 3,72

3 3 45 5 48 3,466 17,07 204,81 6,76

4 4 45 5 48 3,466 14,20 204,81 5,33

5 5 45 9 48 3,466 13,63 204,81 5,05

74

75

B. Hubungan Derajat Keasaman Dengan Tingkat Hidrolisis Pada Reaksi Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media yang Ditambahkan Heptana

Tabel 21. Nilai % Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai pH Ulangan 1

No Kadar

Air (%) Suhu

Hidrolisis (oC)Buffer Fosfat pH (0,1M)

Waktu Hidrolisis (jam)

Bilangan Asam Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam Setelah Hidrolisis

Bilangan Penyabunan

%Hidrolisis

1 1 45 5 48 4,385 49,605 204,81 22,562

2 1 45 6 48 4,385 8,267 204,81 1,937

3 1 45 7 48 4,385 18,188 204,81 6,887

4 1 45 8 48 4,385 7,579 204,81 1,593

5 1 45 9 48 4,385 6,996 204,81 1,303

Tabel 22. Nilai % Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai pH Ulangan 2

No Kadar

Air (%) Suhu

Hidrolisis (oC) Buffer Fosfat pH (0,1M)

Waktu Hidrolisis (jam)

Bilangan Asam Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam Setelah Hidrolisis

Bilangan Penyabunan

%Hidrolisis

1 1 45 5 48 4,385 49,605 204,81 22,562

2 1 45 6 48 4,385 8,267 204,81 1,937

3 1 45 7 48 4,385 12,992 204,81 4,294

4 1 45 8 48 4,385 8,267 204,81 1,937

5 1 45 9 48 4,385 6,063 204,81 0,837

75

76

C. Hubungan Suhu Dengan Tingkat Hidrolisis Pada Reaksi Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Pelarut Heptana

Tabel 23. Nilai % Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Suhu Ulangan 1

No Kadar

Air (%)

Suhu

Hidrolisis (oC)

Buffer Fosfat

pH (0,1M)

Waktu

Hidrolisis (jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 1 25 5 48 4,080 52,936 204,810 24,339

2 1 35 5 48 4,093 44,573 204,810 20,168

3 1 45 5 48 4,385 41,337 204,810 18,437

4 1 55 5 48 3,473 28,956 204,810 12,657

5 1 65 5 48 3,025 8,555 204,810 2,741

Tabel 24. Nilai % Hidrolisis Minyak Ikan Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada Perlakuan Berbagai Suhu Ulangan 2

No Kadar

Air (%)

Suhu

Hidrolisis (oC)

Buffer Fosfat

pH (0,1M)

Waktu

Hidrolisis (jam)

Bilangan Asam

Sebelum Hidrolisis

Bilangan Asam

Setelah Hidrolisis

Bilangan


1 1 25 5 48 4,080 51,332 204,810 23,540

2 1 35 5 48 4,093 44,573 204,810 20,168

3 1 45 5 48 4,385 41,337 204,810 18,437

4 1 55 5 48 3,473 28,232 204,810 12,297

5 1 65 5 48 3,025 8,555 204,810 2,741

76

Lampiran 7. Data analisa konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada kondisi optimum faktor reaksi menggunakan GC(Gas Chromatography Mass Spectrometry

A. Komponen-Komponen di Dalam Konsentrat Hasil Hidrolisis Enzimatik

5 dan suhu 45oC)

Gambar 22. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5 suhu 45oC

konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada kondisi optimum faktor reaksi menggunakan GCGas Chromatography Mass Spectrometry)

Konsentrat Hasil Hidrolisis Enzimatik Tanpa Penambahan Heptana

MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5

77

konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada kondisi optimum faktor reaksi menggunakan GC-MS

Tanpa Penambahan Heptana Pada Perlakuan pH (pH

MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5

77

78

Tabel 25.Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 5 suhu 45oC

Rate Time

% area Nama Komponen Qual Rumus Molekul

Bobot Molekul

7.46 0,1 Pentadekana 98 C15H32 212

7.66 0,13 Metil Laurat 97 C13H26O2 214

8.46 0,07 Metil tridekanoat 96 C14H28O2 228

8.95 0,05 Metil Miristat 90 C15H30O2 242

9.03 0,12 Heptadekana 99 C17H36 240

9.08 0,24 2,6,10,14-tetrametil pentadekana

96 C19H40 268

9.15 0,07 Metil 9-heksadecenoat (metil Palmitoleat)

70 C17H32O2 268

9.26 8,06 Metil isomiristat 98 C15H30O2 242

9.54 1,43 Asam miristat 98 C14H28O2 228

9.68 0,24 Metil-13-metil tetradekanoat 97 C16H32O2 256

9.74 0,09 Metil-12-metil tetradekanoat 93 C16H32O2 256

9.84 0,09 Metil Oleat 93 C19H36O2 296

9.94 0,67 Metil pentadekanoat (metil 9-Oktadesenoat)

98 C16H32O2 256

10.23 0,56 Asam pentadekanoat 97 C15H30O2 242


10.35 0,03 Asam Pentadekanot 90 C15H30O4 242

10.41 0,52 3a,6-methano-3aH-inden-5(4H)-one, hexahydro

90 C10H140 150

10.45 0,72 Metil heksadekatrienoat 99 C17H28O2 264

10.55 0,72 Metil 1-heksadecenoat (metil palmitoleat)

99 C17H32O2 268

10.67 9,05 Metil heksadekanoat (metil Palmitat)

99 C17H34O2 270

10.81 1,81 Asam 11-heksadecenoat 92 C16H32O2 254

10.94 3,63 Asam n-heksadekanoat 99 C16H32O2 256

79

11.02 0,7 7-metil-metil-6-heksadekanoat

99 C18H34O2 282


84 C18H36O2 284

11.16 0,44 Metil-9-oktadecenoat (metil oleat)

76 C19H36O2 296

11.22 0,19 Metil-9-Oktadecenoat (metil oleat)

83 C19H36O3 297

11.29 0,77 Metil heptadekanoat 98 C18H36O2 284



11.59 0,33 2-Cyclopentene-1-acetaldehyde

38 C10H14O2 166

11.66 0,37 Metil 6,9,12-oktadekatrienoat 94 C19H32O2 292

11.72 0,72 1,4,8, Dodekatriena 98 C12H18 162

11.76 1,79 Metil-9,12-oktadekadienoat 99 C19H34O2 294

11.81 5,97 Metil-9-oktadecenoat(metil oleat)

99 C19H36O2 296

11.84 3,91 Metil-9-oktadecenoat(metil oleat)

99 C19H36O2 296

11.93 2,39 Metil oktadekanoat 98 C19H38O2 298

12.05 1,32 Asam 9-oktadecenoat (asam oleat)

99 C18H34O2 282

12.17 0,77 Asam oktadekanoat (asam stearat)

99 C18H36O2 284


95 C18H36O2 284


95 C18H36O2 284

12.38 0,18 Asam 9-oktadecenoat (asam oleat)

89 C18H34O2 282


68 C18H36O2 284

80

12.53 0,2 Metil nonadekanoat 93 C20H40O2 312


45 C18H36O2 284

12.78 2,21 Metil 5,8,11,14-eikosatetranoat

94 C21H34O2 318

12.85 9,57 Metil 5,8,11,14,17-eikosapentanoat

94 C21H32O2 316


64 C21H32O2 316

12.99 3,19 Metil 11-eikosenoat 99 C21H40O2 324

13.02 1,23 Asam miristat-beta-gliserol 74 C17H34O2 302

13.10 1,8 Metil eikosanoat 96 C21H42O2 326

13.21 0,75 Metil 7,10,13-heksadekatrienoat

89 C17H28O2 292

13.39 0,65 Metil 7,10,13-heksadekatrienoat

64 C17H28O2 292

13.66 0,32 Metil heneikosanoat 93 C22H44O2 340

13.70 0,12 9-oktadecenal 60 C18H340 266

13.81 0,35 9-oktadecenal 51 C18H340 266

13.86 0,86 Metil-4,7,10,13,16,19-dokosapentanoat

93 C23H34O2 342

13.94 2,2 Metil-4,7,10,13,16,19-dokosapentanoat

80 C23H34O2 342

14.02 0,34 Metil 14,15 epoksieikosan 5,8,11 trienoat

93 C21H34O3 334

14.07 4,64 3-(2-Methoxy-4-methylphenyl)-8-methoxy-1,4-naphthoquinone-2-carboxylic acid

90 C20H16O6 352

14.12 0,3 Metil 13-dokosanoat (Metil Erukat)

62 C23H44O2 352

14.16 2,83 Asam palmitat beta monogliserida

91 C19H38O4 330

15.08 0,4 Metil 7,10,13- 87 C17H28O2 292

81

heksadekatrienoat

15.18 0,15 3-heptadecen-5-yne 64 C17H30 234

15.23 0,2 Metil 15-tetracosenoat 96 C25H48O2 380

15.27 1 Metil 15-tetrakosenoat 98 C25H48O2 380

15.39 0,24 Metil tetrakosanoat 98 C25H50O2 382

16.17 0,04 Gliseril monooleat 53 C21H40O4 356

16.12 0,12 Squalen 94 C30H50 410

17.11 0,2 Cholesta-5-en-3-ol beta propanoat

70 C27H44 368

19.53 0,95 Lanosterol 99 C27H46O 386

B. Komponen-Komponen di Dalam Konsentrat Hasil Pada Perlakuan Suhu (pH 7 dan suhu 45

Gambar 23. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatipada media tanpa penambahan heptana pada pH 7 suhu 45oC

Konsentrat Hasil Reaksi Hidrolisis Enzimatik Pada Media Tanpa Penambahan Heptana suhu 45oC)

MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatipada media tanpa penambahan heptana pada pH 7

82

k Pada Media Tanpa Penambahan Heptana

MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatipada media tanpa penambahan heptana pada pH 7

82

83

Tabel 26. Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media tanpa penambahan heptana pada pH 7suhu 45oC

Rate Time

% area Nama Komponen Qual RM BM

7.45 0,27 Dodekana 53 C12H26 170

7.65 0,13 Metil laurat (metil dodekanoat) 97 C13H26O2 214



9.01 0,29 Heptadekana 99 C17H36 240

9.07 0,54 Heptadekana 99 C17H36 240

9.13 0,08 Metil tetradekanoat (metil miristat)

98 C15H30O2 242


98 C15H30O2 242

9.48 1,07 Asam n-tetradekanoat 98 C14H28O2 228

9.58 0,07 Asam n-tetradekanoat 98 C14H28O2 228

9.67 0,17 Metil 9-metil tetradekanoat 95 C16H32O2 256


60 C15H30O2 242

9.93 0,54 Metil pentadekanoat 98 C16H32O2 256

10.39 0,25 Metil 6,9,12,15 Heksadekatetraenoat

90 C17H26O2 262

10.43 0,39 Metil Heksadekatrienoat 99 C17H28O2 264

10.52 16,2 Metil-9-heksadecenoat (metil palmitoleat)

99 C17H32O2 268

10.64 9,1 Metil-9-heksadecenoat (metil palmitoleat)

99 C17H32O2 268

10.69 0,1 Metil palmitat 80 C17H34O2 270



11.00 0,85 7-metil-Metil 6 heksadecenoat 94 C18H34O2 282

11.03 0,52 15-metil-Metil 11-heksadecenoat

89 C18H34O2 282

11.14 0,48 15-metil-Metil 11-heksadecenoat

90 C18H34O2 282


84



11.57 0,34 Asam 9,12-oktadekadienoat (Asam linoleat)

45 C18H32O2 280

11.65 0,23 16-Metil-metil heptadekanoat 89 C19H38O2 298

11.70 0,33 1,4,8-Dodekatriena 96 C12H18 162

11.74 2,08 metil 10,13-Oktadekadienoat 99 C19H34O2 294

11.78 7,24 Metil 9-oktadecenoat 99 C19H36O2 296


11.84 0,56 Metil 10,13-oktadekadienoat 99 C19H34O2 294

11.91 1,81 metil oktadekanoat 99 C19H38O2 298

11.96 0,14 Asam-9-oktadecenoat (asam oleat)

62 C18H34O2 282

12.01 0,58 Asam-9-oktadecenoat 99 C18H34O2 282

12.03 0,72 Asam-9-oktadecenoat 99 C18H34O2 282

12.13 0,93 Asam oktadekanoat (asam Stearat)

98 C18H36O2 284

12.51 0,09 Metil nonodekanoat 78 C20H40O2 312

12.67 0,21 Asam oktadekanadionat 27 C18H34O4 314

12.76 1,25 Metil 5,8,11,14 eikosatetranoat 94 C21H34O2 318


95 C21H32O2 316


70 C21H32O2 316

12.96 3,44 Metil-11-eikosenoat 99 C21H40O2 324



58 C21H32O2 316


58 C21H32O2 316

13.79 0,23 9-Oktadecenal 51 C18H34O 266

13.84 0,56 Metil-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoat

49 C23H34O2 342

13.92 1,78 Metil-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoat

46 C23H34O2 342

85

14.00 0,31 3-Heptadecen-5-yne 86 C17H30 234

14.05 5,09 Metil 13-dokosenoat 80 C23H44O2 352

14.13 2 Beta-palmitoleyl-gliserol 68 C19H38O4 330

14.35 0,28 1,2 benzedikarbocilic acid ester 64 C24H38O4 390

14.61 0,22 Metil-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoiat

62 C23H34O2 342

14.91 0,3 Metil-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoiat

84 C23H34O2 342

15.06 0,33 Metil-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoiat

46 C23H34O2 342

15.21 0,16 Metil 15-tetrakosanoat 50 C25H48O2 380

15.24 0,7 Metil 15-tetrakosanoat 99 C25H48O2 380

15.82 0,1 3-Tetradecen-5-yne 46 C14H24 192

16.09 0,10 3-Tetradecen-5-yne 35 C14H24 192

16.15 0,28 Squalene 70 C30H50 410

16.22 0,17 Cis-4-ethoxy-b-methyl-b-nitrostyrena

41 C11H13NO3 207

16.50 0,22 7,10,13 oktadekatrien-1-ol 46 C18H32O 264

16.77 0,27 Heptakosa 5-9-diena 25 C27H52 376

17.08 0,35 Cholesta-3,5-diene 99 C27H44 368

17.77 0,13 Trans-2-Ethoxy-b-methyl-b-nitrostirena

38 C11H13NO3 207

19.49 2,5 Lanosterol 99 C27H46O 386

C. Komponen-Komponen di Dalam Konsentrat Hasil Hidrolisis Enzimatik Perlakuan Suhu (suhu 25oC dan pH 5)

Gambar 24. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 25oC

Konsentrat Hasil Hidrolisis Enzimatik Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Pada C dan pH 5)

MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5

86

Yang Ditambahkan Heptana Pada


86

87

Tabel 27. Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5suhu 25oC

Rate Time

% Area Nama Komponen Qual Rumus Mokekul

Bobot Molekul

7.46 0,16 Pentadekana 98 C15H32 212

7.67 0,08 Metil dodekanoat 97 C13H26O2 214


8.95 0,03 Metil tetradekanoat 70 C15H30O2 242

9.03 0,18 Oktadekana 91 C18H38 254

9.08 0,33 2,6,10,14, tetrametil pentadekana

99 C19H40 268

9.15 0,05 Metil 9-heksadecenoat 70 C17H32O2 268

9.26 6,28 Metil tetradekanoat (Metil miristat)

97 C15H30O2 242

9.58 3,56 Metil tetradekanoat (Metil miristat)

98 C15H30O2 242

9.68 0,19 13-metil-metil tetradekanoat 95 C16H32O2 256

9.72 0,05 Asam tetradekanoat (asam miristat)

96 C14H28O2 228

9.75 0,12 12 metil-asam tetradekanoat 64 C16H32O2 256

9.84 0,1 12 metil-asam tetradekanoat 97 C16H32O2 256

9.95 0,58 Metil pentadekanoat 98 C16H32O2 256



10.39 0,12 14-metil-metil pentadekanoat 90 C17H34O2 270

10.45 0,11 Metil Heksadekatrienoat 98 C17H28O2 264

10.55 7,8 Metil 9-hekdadecenoat 99 C17H32O2 268

10.67 7,22 Metil heksadekanoat (metil palmitat)

99 C17H34O2 270







88



11.59 0,48 11,13-heksadekadoen-1-ol-acetat

42 C18H32O2 280

11.67 0,26 Asam n-heptadekanoat 62 C17H34O2 270

11.72 0,24 Asam n-heptadekanoat 70 C17H34O2 270

11.77 1,06 Asam 9,12-oktadekadienoat 99 C19H34O2 294

11.81 3,06 Metil-9-oktadecenoat 99 C19H36O2 296



11.93 1,9 Metil oktadekanoat 99 C19H38O2 298


99 C18H34O2 282


98 C18H36O2 284


93 C18H36O2 284


87 C18H36O2 284


48 C18H36O2 284

12.78 0,54 Metil 5,8,11,14-eikosapentanoat

99 C21H34O2 318


99 C21H34O2 318


13.03 1,33 beta-monotetradecanoil-gliserol

83 C17H34O4 302


93 C21H34O2 318


64 C21H34O2 318

13.67 0,6 Metil heneikosanoat 43 C22H44O2 340

13.82 0,6 Metil 4,7,10,13,16,19 dokosaheksanoat

80 C23H34O2 342


53 C23H34O2 342

89


95 C23H34O2 342

13.96 0,57 5-metil-1H-indole 38 C9H9N 131

14.08 3,94 Metil-13-dokosenoat 35 C23H44O2 352

14.18 3,17 2-monopalmitoyl-gliserol 96 C19H38O4 330



14.64 0,79 9-oktadecenal 83 C18H34O 266

14.95 0,81 9,12,15-oktadekatrien-1-ol 46 C18H32O 264

15.09 0,85 9,12,15-oktadekatrien-1-ol 95 C18H32O 264

15.27 1,32 9-oktadecenal 84 C18H34O 366

15.41 1,14 Metil tetrakosanoat 53 C25H50O2 382

15.85 0,34 2-Monooleoylglycerol 53 C21H40O4 356

16.13 0,31 4,5-Diphenylocta-1,7-diene 38 C20H22 262

16.26 0,25 Glycerol 1-monooleate 38 C21H40O4 356



16.81 0,49 9-oktadecenal 47 C18H34O 366

17.13 0,38 Cholestadiena 96 C27H44 368

17.82 0,08 6-etil-1,2,3,4,tetrahidro-naftalena

38 C12H16 160

18.43 0,08 3-tetradecen-5yne 53 C14H24 192

19.57 1,78 Lanosterol 99 C27H46O 386

21.05 0,1 Ergosta-5,24-dien-3-ol(3 beta) 43 C28H46O 398

D. Komponen-Komponen di Dalam Konsentrat Hasil Hidrolisis pH (pH 5 suhu 45oC)

Gambar 25. Peak area analisa GC-MS konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5 suhu 45oC

Konsentrat Hasil Hidrolisis Enzimatik Pada Media Yang Ditambahkan


90

Pada Media Yang Ditambahkan Heptana Perlakuan


90

91

Tabel 28. Komponen kimia pada konsentrat hasil reaksi hidrolisis enzimatik pada media yang ditambahkan heptana pada pH 5suhu 45oC

Rate Time

% Area

Nama Komponen Qual Rumus Molekul

Bobot Molekul

7.47 0,21 Pentadekana 97 C15H32 212

7.68 0,05 Metil Dodekanoat 97 C13H26O2 214

9.03 0,22 Heptadekana 98 C17H36 240

9.08 0,4 2,6,10,14-tetrametil Pentadecana

99 C19H40 268

9.24 3,44 Metil tetradekanoat (Asam Miristat)

98 C15H30O2 242

9.59 7,18 Asam tetradekanoat (asam Miristat)

98 C14H28O2 228

9.69 0,17 Asam tetradekanoat 96 C14H28O2 228



9.95 0,23 Metil 9-metil tetradekanoat 95 C16H32O2 256


10.46 0,05 Metil heksadekatrienoat 83 C17H28O2 264



10.65 3,22 Metil heksadekanoat 99 C17H34O2 270


10.99 13,99 Asam n-heksadekanoat (asam Palmitat)

99 C16H32O2 256


98 C16H32O2 256


84 C16H32O2 256


86 C16H32O2 256

11.56 0,44 Asam heptadekanoat 95 C17H34O2 270

11.60 0,57 Asam heptadekanoat 95 C17H34O2 270

11.76 0,81 Metil 9,12-oktadedienoat 99 C19H34O2 294



92

11.93 0,84 metil oktadekanoat 99 C19H38O2 298



98 C18H36O2 284


92 C18H36O2 284

12.69 0,7 Asam 9-oktadecenoat (asam Oleat)

62 C18H34O2 282

12.78 0,4 Asam 9-oktadecenoat (asam Oleat)

59 C18H34O2 282

12.83 1,85 metil 5,8,11,14,17-eikosapentanoat

93 C21H32O2 316

12.96 1,41 gliserol tetradekanoat 46 C17H34O4 302

13.03 1,43 gliserol tetradekanoat 95 C17H34O4 302


81 C21H32O2 316

13.23 3,71 (2.alfa.,6.alfa.)-trans-9,10-Dietil-4-oxatetrasiklo undekana

80 C12H180 178


70 C12H180 178

13.70 0,57 asam 9-oktadecenoat 62 C18H34O2 282

13.83 0,77 asam 9-oktadecenoat 56 C18H34O2 282


64 C12H180 178

13.96 1,31 2-etil-2 metil etil tridekanoat 42 C18H36O2 284

14.00 0,4 9-oktadecenal 43 C18H340 266

14.08 3,32 9-oktadecenal 70 C18H340 266

14.18 3,91 2-monopalmitoyl gliserol 52 C19H38O4 330

14.31 1,59 2-monopalmitoyl gliserol 55 C19H38O4 330


89 C21H32O2 316


46 C21H32O2 316

14.98 0,3 2-Monooleoylgliserol 41 C21H40O4 356



93


16.19 0,23 Squalene 94 C30H50 410


16.61 0,13 Gliserol -alpha.-monooleat 55 C21H40O4 356

17.14 0,1 Cholestadiena 98 C27H44 368

18.83 0,1 trimiristin 45 C45H86O6 723

19.06 0,09 trimiristin 55 C45H86O6 723

19.58 2,17 Lanosterol 99 C27H46O 386

21.43 0,01 1,4-Dihydroxy-5-

nitroanthraquinone

C14H7NO6 285

21.55 0,03 9-Formyl-7-methoxy-1,2-dihydro-1a1a-dimethyl-3H-1,2-cycloproprpyrrolo[1,2-a]indole-5,8-dione

50 C16H15NO4 285


47 C16H15NO4 285


50 C16H15NO4 285

21.71 0 9-Formyl-7-methoxy-1,2-dihydro-1a1a-dimethyl-3H-1,2-cycloproprpyrrolo[1,2-a]indole-5,8-dione

53 C16H15NO4 285

28.38 0,73 Tetradecanoic acid, 2-hydroxy-1,3propanediyl ester

50 C31H60O5 512

94

Lampiran 8. Penentuan degree of hydrolysis (dh) atau tingkat hidrolisis

Tingkat hidrolisis ditentukan dengan pengukuran bilangan asam dari

minyak yang tidak dihidrolisis dengan minyak yang dihidrolisis pada

beberapa waktu yang berbeda. Bilangan penyabunan ditentukan berdasarkan

American Oil Chemist Society Methode dengan blanko adalah minyak tanpa

enzim pada setiap perlakuan. Tingkat hidrolisis ditentukan berdasarkan

persamaan di bawah

%�� !�!

" �� #$%#$ #!#& !�� #' '�� !�! ( )� #$%#$ #!#& !�)� *& '�� !�!

�� #$%#$ ��$+#)*$#$ ( )� #$%#$ #!#& !�� #' '�� !�!�

95

Lampiran 9. Mekanisme kerja GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry)

Sampel yang telah diinject akan diubah menjadi gas di dalam GC. Gas

tersebut akan masuk ke FID (Film Ionisation Detector). FID berada di dalam MS. Di

dalam FID ini gas akan difragmentasi berdasarkan bobot molekulnya. Fragmentasi

adalah proses pemisahan molekul berdasarkan bobot molekulnya. Fragmentasi dari

FID terlihat seperti Gambar 26.

Gambar 26. Fragmentasi pada mass spectrometry

Hasil fragmentasi tersebut akan dicocokkan dengan database yang ada dan

akan dimunculkan sebagai Chromatogram pada layar. Gambar Chromatogram dapat

dilihat pada Gambar 27.

Gambar 27. Chromatogram

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

m/z-->

Abundance

Scan 1035 (9.009 min): H1 PH 7 AIR.D57

71

85

99

113127

141 240155 169 183 207196 281

8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

Time-->

Abundance

TIC: H1 PH 7 AIR.D

kajian hidrolisis enzimatik minyak ikan untuk … · karakterisasi minyak ikan yang diperoleh...

Documents