14

BAB 1

PENDAHULUAN

Populasi lansia meningkat di seluruh dunia. Dikarenakan perawatan kesehatan gigi yang lebih baik, lansia memiliki retensi gigi lebih lama, yang juga berarti jumlah permukaan akar yang rentan terhadap karies lebih besar (24, 32). Beberapa studi menunjukkan bahwa mikroflora di dalam mulut dapat berubah dengan bertambahnya usia, hal ini mungkin dikarenakan oleh fungsi kekebalan tubuh yang melemah dan disusul oleh kolonisasi bakteri non-oral dengan spesies seperti staphylococci dan enterobacteria (9, 22, 24). Hal lain dari mikroba sebagai akibat dari penuaan, misalnya, peningkatan kolonisasi ragi, akibat dari pengobatan jangka panjang, laju aliran saliva, yang berkurang dan pemakaian gigi tiruan (18).

Saat ini tidak banyak yang diketahui tentang etiologi mikroba karies akar (RC) pada lansia, dan tidak ada konsensus untuk mengetahui mikroba mana yang dapat menyebabkan penyakit (6, 8). Dalam beberapa studi terhadap hewan coba, bakteri berfilamen, seperti spesies Actinomyces, terlibat dalam etiologi RC (12, 28). Studi cross-sectional pada manusia berdasarkan kultur, telah difokuskan untuk membandingkan flora bakteri dari plak yang berhubungan dengan permukaan akar karies (2, 3, 7, 15, 30). Streptococcus mutans sendiri atau dalam kombinasi dengan lactobacilli, terdeteksi lebih sering pada plak yang melapisi permukaan gigi yang karies dari pada permukaan gigi dengan akar yang sehat. Studi dengan kultur lainnya, menggunakan nonselektif media dan anaerobik sampling, menunjukkan bahwa mikroflora terkait dengan RC jauh lebih kompleks dari yang telah diasumsikan sebelumnya (3, 12, 27). Spesies tambahan, seperti non-mutans streptokokus, spesies Bifidobacterium, Rothia, dan Veillonella, enterococci, batang gram negatif anaerob, dan ragi Candida albicans, telah terdeteksi (27).

Baru-baru ini, penggunaan metode kultur-independen memiliki peran kunci dalam penemuan sebelumnya yang belum diakui spesies nya dalam rongga mulut, serta dalam mendefinisikan ulang patogenesis infeksi mulut utama (1, 14, 19-21, 23, 31). Hasil dari studi ini menunjukkan bahwa infeksi mulut yang utama adalah berasal dari polymicrobial (11).

Studi kultur-independen sesuai dengan kompleksitas bakteri dari karies koronal tingkat lanjut (4, 20). Studi tersebut mengemukakan bahwa lesi koronal yang dalam terdiri dari spesies bakteri yang sama seperti pada lapisan dalam di RC (10). Namun sejauh ini belum ada studi kultur-independen yang dapat menggambarkan komunitas bakteri pada lansia penderita RC.

Dalam penelitian ini, akar yang sehat maupun dengan karies dari individu yang berusia 82 tahun atau lebih diselidiki. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai keragaman bakteri dari RC pada lansia dengan menggunakan teknik molekuler kultur-independen dan untuk menentukan kumpulan spesies bakteri tertentu atau komunitas bakteri dengan akar yang sehat dan karies.

BAB 2

MATERIAL & METODE

2.1.Populasi Subjek

Populasi penelitian ini adalah pasien lansia dari rumah rawat di Oslo, Norwegia berjumlah 21 orang, terdiri dari 2 laki-laki dan 19 perempuan dengan usia rata-rata adalah 89 tahun. Keseluruhan subjek diperiksa secara klinis satu hingga lima hari sebelum dilakukan pengambilan sampel dan dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol (kelompok yang bebas dari karies) berjumlah 10 orang dan kelompok karies (kelompok dengan satu atau lebih lesi karies saat pemeriksaan klinis). Pada pemeriksaan, kelompok kontrol adalah yang bebas dari karies akar sedangkan kelompok karies memiliki satu atau lebih lesi karies akar. Keseluruhan diagnosis sesuai dengan kriteria WHO (WHO,2002). Lesi pada permukaan akar yang terpapar diklasifikasikan sebagai karies apabila teraba lunak atau kasar saat probing. Keseluruhan subjek tersebut diinstruksikan agar tidak membersihkan gigi mereka saat siang dan pagi sebelum pengambilan sampel. Subjek yang merokok, jumlah gigi subjek yang masih ada, dan kebiasaan menggosok gigi ditampilkan pada tabel 1. Persyaratan dari penelitian ini adalah subjek yang tidak memiliki tanda-tanda klinis terhadap penyakit pada mukosa mulut dan tidak sedang dalam terapi antibiotik hingga 10 hari menjelang pengambilan sampel.

2.2.Sampel

Pada kelompok kontrol akan diambil plak supragingiva dari akar yang sehat, sedangkan pada masing-masing kelompok karies akan diambil 3 sampel, yaitu: plak supragingiva dari akar yang sehat (sampel akar karies sehat), plak dari akar karies (sampel karies), dan dentin yang terlibat dari akar karies yang sama (sampel dentin). Sampel dari akar yang sehat tersebut dipilih secara acak. Keseluruhan sampel diambil dengan penggunaan kuret Graccy. Permukaan akar karies dibersihkan dengan air bersih dan cangkir karet yang steril (Turbo Prophy Cup; Young Dental, Earth City, MO) setelah plak supragingiva diambil. Lapisan luar dentin yang terinfeksi dicabut dengan ekskavator sendok atau bur bulat pada kecepatan rendah handpiece, dan bagian dalam lesi akar karies diambil. Keseluruhan sampel kemudian disuspensi dalam 300 l buffer TE (50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6), dikirim ke laboratorium disimpan dalam kotak es pada -80.

2.3.Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA bakteri dengan QIAmp DNA mini kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany) sesuai instruksi dari manufaktur. Ekstrak tersebut disimpan pada suhu -20.

2.4.Amplifikasi gen 16S rRNA

Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan kondisi dibawah standard pemakaian universal forward primer (5-GAG AGT TTG ATY MTG GCT CAG-3) dan universal reverse primer (5 GAA GGA GGT GWT CCA RCC GCA-3) (Paster et.al, 2001). PCR akan dilakukan pada tabung berdinding tipis dengan sistem GeneAmp PCR 2700 dan 9700 (ABI, Foster City, CA). Dua mikroliter DNA template ditambahkan ke campuran reaksi (volume akhir, 50 l) berisi 20 pmol masing-masing primer, 40 nmol deoxynucleoside triphospate, 1.5 mmol Mg2+ dan 1 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, San Diego, CA). Sampel kemudian dipanaskan pada suhu 95 selama 5 menit, diikuti 30 siklus amplifikasi dengan kondisi: denaturasi 95 selama 45 detik, annealing 60 selama 45 detik dan elongasi 72 selama 1.5 menit, dengan tambahan 15 menit untuk masing-masing siklus. 30 siklus dilakukan diikuti tahap elongasi akhir pada suhu 72 selama 15 menit. Hasil amplifikasi PCR kemudian diperiksa dengan elektroforesis dengan 1% gel agarose.

2.5.Kloning dan Pengurutan

Kloning produk PCR dilakukan dengan menggunakan TOPO TA cloning kit (Invitrogen) berdasarkan instruksi manufaktur. Ringkasnya, transformasi dilakukan dengan sel Escherichia coli TOP10 yang kompeten. Sel transformasi tersebut diletakkan pada Luria-Bertani agar dengan tambahan kanamycin (50g/ml) dan diinkubasi semalaman pada suhu 37. Koloni kemudian ditransfer ke 70l dari 10 mM Tris-HCl. Sisipan amplifikasi dilakukan dengan (M13) primer (forward,5-GTAAAACGACGGCCAG-3 reverse, 5-CAGGAAACAGCTATGAC-3). Produk PCR dengan ukuran yang tepat (mengandung gen 16SrRNA) dimurnikan dengan QIAquick PCR purification kit (Qiagen) dan dirangkai dengan ABI Prism cycle sequencing kit (BigDye Terminator cycle sequencing kit with AmpliTaq DNA polymerase FS dan sistem GeneAmp PCR 2700 dan 9700; ABI). Primer digunakan untuk pengurutan telah dijelaskan sebelumnya (Paster, et.al, 2001). Quarter-dye chemistry digunakan dengan 80 M primer dan 1.5 l produk PCR dengan volume akhir 20l. Siklus pewarnaan dilakukan dengan sistem GeneAmp PCR 9700 (ABI), dengan 25 siklus denaturasi pada 96 selama 10 detik, annealing pada 55 selama 5 detik dan elongasi 60 selama 4 menit. Reaksi pengurutan dilakukan dengan ABI 3730 DNA sequencer (ABI). Pembacaan pengurutan dari 29 klon didapat dari Qiagen Genomic Services dengan pemakaian primer M13.

2.6.Analisis Pengurutan

Masing-masing klon sebanyak 3544 dengan penambahan 1500 basa dianalisis. Jumlah klon pengurutan per sampel berkisar dari 60 sampai 94. Sebuah pengurutan dengan 500 basa didapat dengan menentukan identitas atau posisi filogenetik yang tepat. Untuk identifikasi hubungan secara dekat, pengurutan dari sisipan dibandingkan dengan gen 16S rRNA sequence dengan lebih dari 10.000 mikroorganisme pada database kami dan lebih dari 400.000 sequence di Ribosomal Database Project (Cole, et.al, 2005), EMBL (http:/www.cbi.ac.uk/cmbl/), GenBank (http://www.ncbi.mlm.gov/GenBank/), dan DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) nucleotide sequence database. Koreksi untuk matriks yang mirip (Jukes dan Cantor, 1969) dan chimeric sequences (Chimera Check program in The Ribosomal Database Project [RDP-II] [http://rdp.cme.msu.edu/] dan konstruksi (Saitou dan Nei, 1987) dan menggambar (Van de Peer dan Wachter, 1994) pohon filogenetik selesai berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Paster et.al.

2.7.Pengurutan nukleotida berdasarkan nomor akses

Gen sequence 16S rRNA dari klon yang merepresentasi filotipe baru yang selesai dijelaskan pada studi ini (OCG019 [EU669563], OCG 080 [EU669564], OCH033 [EU669565], OCN091 [EU669566], OCT046 [EU669567], dan OCV103 [EU669568]), sequences dari spesies belum pernah dilaporkan, dan sequences yang dipublikasi telah ada untuk electronic retrieval dari EMBL, GenBank, dan DDBJ nucleotide sequence databases dibawah nomor akses yang tertera di Figure 2 dan di table S6 dan S7 di material tambahan.

BAB 3

HASIL

3.1.Hasil Umum

Dalam penelitian ini, profil bakteri akar sehat dan sakit dari 21 subjek orang tua telah diselidiki. Terdapat keragaman yang sangat tinggi yaitu 245 spesies bakteri yang mewakili delapan filum bakteri, yang dianalisa untuk 3544 klon (Tabel 2 ; Juga lihat Table 4 dibawah). Profil bakteri secara keseluruhan memiliki 112 (46%) spesies yang dibudidayakan dalam genera yang dikenali dan 133 (54%) dari urutan phylotypes yang belum dibudidayakan atau spesies yang saat ini belum diakui (Tabel 4 bawah;. juga lihat Tabel S6 dalam bahan tambahan). Jumlah spesies yang terdeteksi dalam sampel kontrol berkisar antara 16 sampai 41 per sampel dan 8 sampai 35 pada pasien RC (Table3).

Firmicutes adalah kelompok filogenetik yang paling dominan pada semua kelompok sampel, kecuali untuk sampel dentin, dengan Bacteroidetes. Pada dentin, Actinomyces adalah genus kedua yang paling dominan (Tabel 4 dan 5). Spesies Veillonella (20%), Selenomonas (20%), dan Streptococcus (12%) adalah spesies bakteri yang paling dominan dalam hal jumlah klon. Spesies tersebut tercatat sebagai penanda karies terkait taksa, seperti spesies Actinomyces (4,2%) dan lactobacilli (2%), merupakan sebagian kecil dari jumlah spesies bakteri yang terdeteksi (lihat Tabel S6 dalam bahan tambahan). Selenomonas sputigena, Veillonella parvula / Veillonella dispar, dan Veillonella sp. clone AA050 merupakan klon yang paling sering dijumpai. Spesies yang paling umum di antara golongan streptokokus adalah Streptococcus mutans, S. gordonii, dan Streptococcus intermedius (lihat Tabel S6 dalam bahan tambahan). Streptococcus spp. Banyak terdeteksi pada tingkat yang sama di semua kategori, sedangkan Veillonella dan Prevotella spp. kurang dijumpai dalam sampel dentin. Jumlah Selenomonas spp. Pada kedua sampel plak dari subjek pasien RC adalah sebanyak dua kali lebih tinggi pada sampel kontrol dan sampel dentin.

3.2.Mikroflora dari subjek kontrol.

Pada permukaan akar dari subjek kontrol, sebagian besar bakteri dijumpai dalam jumlah yang rendah atau sedang (Gambar 2). Hanya Veillonella spp., Selenomonas noxia, dan S. gordonii yang klon-nya terdeteksi pada level tinggi pada beberapa subjek sehat (antara 16 dan 40% dari klon). Spesies bakteri yang terkait pada kesehatan, seperti Kingella oralis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Leptotrichia spp, Streptococcus cristatus, Campylobacter curvus, Corynebacterium matruchotii, dan Selenomonas noxia, jarang dijumpai di sebagian besar sampel dari subjek pada pasien RC (Gambar 2; Tabel 5). K. oralis, Prevotella conceptionensis, Streptococcus mitis bv. 2, dan Streptococcus anginosus tidak dijumpai dalam sampel dentin. Lactobacilli tidak terdeteksi, S. mutans hanya dijumpai sebanyak 1, dan Actinomyces dijumpai sebanyak 5 dari 10 subjek sehat, dengan tingkat klon kurang dari 5% (kecuali untuk subjek yang sehat no. 3) (Gambar 2). Plak dari subjek kontrol terdiri dari flora bakteri yang beragam dengan dominansi adalah beberapa spesies dengan jumlah rata-rata jumlah rata-rata 28 spesies per sampel.

3.3. Mikroflora dari sampel hrRC

Plak mikroflora yang melapisi permukaan akar yang sehat pada pasien RC (sampel hrRC) memiliki keragaman lebih rendah dari sampel kontrol, yaitu, 9 - 35 dibandingkan 16 - 41 spesies terdeteksi per sampel (Table3). Dibandingkan dengan spesies dominan di subjek kontrol, insidensi Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, S. cristatus, S. gordonii, C. curvus, C. matruchotii, dan S. noxia berkurang, dan spesies bakteri lain seperti Campylobacter gracilis, Selenomonas sp. clone FT050, S. sputigena, P. melaninogenica, dan S. mutans (Gambar 2; Tabel 5) yang dominan. Spesies yang paling umum dijelaskan di atas berbeda dari subjek dengan subjek dalam kategori ini (Gambar 2). Lactobacilli terdeteksi dari tiga subjek. Jumlah S. mutans meningkat, sementara Actinomyces dijumpai di tingkat yang sama dalam sampel sehat dan sampel kontrol (lima subjek). Tingkat Actinomyces yang dijumpai di sampel kontrol dan sampel hrRC adalah sama.

3.4.Mikroflora dari sampel karies

Mikroflora dari plak yang menyelubungi lesi RC (sampel karies) memiliki keragaman bahkan lebih rendah dari mikroflora dari permukaan akar dalam kelompok subjek ini (Tabel 3). Tujuh dari 11 subjek (subjek 1, 4, dan 7 sampai 11) memiliki spesies dengan tingkat klon 16 sampai lebih dari 40% (Gambar 2). Tingkat V. parvula / V. dispar dan Selenomonas sp. clone CS002 lebih dari 40% dalam dua subjek tersebut. Hanya pada 2 subjek (no. 1 dan 8), mikroorganisme yang sama (V. parvula / V. Dispar dan Veillonella sp. Clone AA050) menunjukkan jumlah yang sama pada sampel plak dari kedua permukaan akar sehat dan sakit dari subjek yang sama. Selenomonas sp. clone CS002 (no. 7 dan 10), C. matruchotii (no. 9), dan F. nucleatum subsp. polymorphum (no. 11) adalah taksa bakteri dominan lainnya dalam kategori ini (Gambar 2). Selenomonas sp. clone CS002 dan C. matruchotii jarang dijumpai di hrRC dan subjek sehat. S. mutans dijumpai pada tiga sampel karies. Filotipe Selenomonas sp. clone CS002 menunjukkan prevalensi yang sangat tinggi dan merupakan prevalensi tertinggi di antara spesies bakteri yang dijumpai pada permukaan akar yang sakit.

Hanya satu subjek yang terdapat S. mutans baik di hrRC maupun pada sampel karies. Actinomyces ditemukan sebanyak 4 dan lactobacilli sebanyak 6 dari 11 sampel karies (Gambar 2; Tabel 5). Lactobacilli menunjukkan tingkat yang tidak berubah namun dengan prevalensi yang lebih tinggi (6 dari 11 subjek) dibandingkan pada sampel hrRC.

3.5. Mikroflora sampel dentin

Profil bakteri dari dentin karies (sampel dentin) berbeda dalam keragaman serta dominasi dari kategori lainnya. Jumlah spesies per sampel berkisar antara 10 sampai 34 (Tabel 3). Sembilan dari 11 sampel dentin (no. 1 dan 4 sampai 11) memiliki setidaknya satu spesies dengan tingkat klon dari 16-40% atau lebih tinggi (Gambar. 2). Dalam tiga subjek (no. 4, 7, dan 8), Enterococcus faecalis, S. mutans, dan Pseudoramibacter alactolyticus ditemukan dengan tingkat yang lebih tinggi dari 40%. V. parvula / V. dispar (no. 1), Lactobacillus casei / Lactobacillus paracasei / Lactobacillus rhamnosus (no. 4), Propionibacterium sp. regangan FMA5 (no. 5), Selenomonas sp. clone CS002 (no. 5 dan 7), P. alactolyticus (no. 6), Actinomyces sp. clone IP073 (no. 9), Atopobium dan Olsenella spp. (No. 10), C. matruchotii, dan Leptotrichia spp. (No. 11) memiliki tingkat klon dari 16-40% (Gambar (Gbr.2.) .2). V. parvula / V. dispar, Selenomonas sp. clone CS002, dan C. matruchotii juga dijumpai di plak yang melapisi lesi karies.

Untuk sampel dentin, lebih banyak taksa dengan tingkat tinggi terdeteksi dibandingkan dengan kategori sampel lainnya. Kebanyakan sampel dentin memiliki satu atau beberapa spesies dominan di profil bakteri, tetapi dengan spesies berbeda dari subjek ke subjek. Menariknya, L. casei / L. paracasei / L. rhamnosus dan Atopobium dan Olsenella spp. tidak dijumpai dari subjek kontrol namun dijumpai di sampel hrRC dan sampel karies (Tabel 5). Uncharacterized Propionibacterium sp. Strain FMA5 adalah satu-satunya spesies yang dominan ditemukan secara eksklusif di dentin karies.

S.mutans dijumpai ada 5, lactobacilli ada 7, dan actinomyces spp. Ada 9 dari 11 sampel dentin (tabel 5). S. mutans (no. 7), lactobacilli (L. casei/ L. paracasei/ L. rhamnosus [no.4]), dan Actinomyces spp. (Actinomyces sp. Clone IP073 [no.9]) masing-masing ditampilkan hanya pada satu sampel dentin (Fig 2). Satu sampel dentin (no.6) terdapat S. mutans, lactobacilli, dan Actinomyces spp. Bersamaan. Enam sampel dentin menunjukkan tidak ada tanda dari S. mutans ( no. 1, 2, 4, 8, 10, dan 11 ).

Pada subjek no. 11, tidak ada lactobacilli dan hanya terdapat tingkat sedang Actinomyses spp. Yang terdeteksi. Subjek no. 2 tidak mempunyai spesies dominan atau lactobacilli lain. Profil bakteri dari sampel dentin menunjukkan kombinasi yang sedang ( 5 hingga 16 % dari clones ) dari S. intermedius, Anaeroglobus dan Megasphaera spp., Fusobacterium nucleatum subsp. Animalis, dan beberapa bakteri lainnya dengan tingkat rendah, termasuk Actinomyces spp. ( 1 hingga 5 % dari clones ) (Fig.2).

Tiga sampel dentin ( 2, 8, dan 11 ) terdapat tingkat rendah atau sedang dari Actinomyces dan tidak ada S. mutans atau lactobacilli. Dua sampel dentin menunjukkan Actinomyces ( no. 6 dan 7 ); satu dari sampel tersebut memiliki tingkat tinggi dari S. mutans ( no. 7 ), sementara itu sampel lainnya hanya memiliki tingkat rendah dari S. mutans dan lactobacilli. Actinomyces spp. dideteksi pada 9 dari 11 sampel dentin. Phylotype Actinomyces sp. Clone IP073 dijumpai pada empat sampel dentin pada tingkat tinggi ( Tabel 5 ).

BAB 4

PEMBAHASAN

Penelitian ini memberikan deskripsi pertama tentang keterkaitan mikroflora dengan permukaan akar pada usia lanjut yang berdasarkan metode budaya-independent. Di antara 21 subjek yang diperiksa, perbedaan profil bakteri di observasi. Keragaman bakteri keseluruhan RC adalah cukup ; 245 spesies atau phylotypes diidentifikasi, di mana 54% belum di budidayakan. Banyaknya keanekaragaman juga diamati dalam studi lain dalam lesi karies dentin yang parah. (20)

Secara keseluruhan, keanekaragaman profil bakteri berkurang ketika bergerak dari sehat ke subjek yang sakit. Pengamatan serupa dibuat untuk karies anak-anak (1, 16 ) dan untuk sampel air liur dari karies bebas dan karies aktif individu (17). Dalam subjek kontrol, profil bakteri menunjukkan keragaman bakteri yang tinggi dan tidak ada dominasi spesies bakteri tertentu. Dalam subjek RC, plak dari permukaan akar menunjukkan keanekaragaman bakteri yang rendah, dan keanekaragaman menurun jauh ketika berpindah ke plak dari dentin terinfeksi. Keanekaragaman yang terendah diamati pada sampel dentin, yang mana dapat diperkirakan, sebagaimana di lingkungan yang lebih terpencil dan terisolasi.

Karakteristik lain yang menarik dari profil adalah cukup bervariasi antara subjek ke subjek. Profil bakteri berbeda sebagaimana adanya spesies bakteri yang dominan dan pergeseran dominasi dari satu kategori yang lain. Spesies bakteri tertentu tampaknya sangat terkait dengan kesehatan, karena mereka jarang terdeteksi (misalnya, Leptotrichia spp. Dan S. noxia) untuk atau hilang dari subjek RC (K. oralis, P. conceptionensis, S. mitis bv. 2 dan S. anginosus), tetapi umumnya ditemukan dalam subjek control. F. nucleatum subsp. Polymorphum ditemukan dalam semua 10 subjek kontrol, tetapi juga tampak pada konsentrasi tinggi dalam sampel plak dari akar karies. Dalam sampel hrRC, beberapa spesies, seperti Veillonella sp. Clone AA050, V. parvula/ V.dispar, S.noxia, C. gracilis, S. mutans, S. sputigena, S. infelix, dan F. nucleatum subsp. Polymorphum, ditemukan pada tingkat tinggi. Prevalensi tertinggi dan tingkat dari phylotype Veillonella sp, clone AA050 dan Actinomyces sp. Clone IP073 yang dapat dilihat. Phylotype Selenomonas sp. Clone CS002 menunjukkan prevalensi tinggi yang mencolok dan konsentrasi yang tinggi dalam sampel karies. Lactobacilli ( L. casei/ L. paracasei/ L. rhamnosus), E. faecalis, P. alactolyticus, dan Propionibacterium sp. strain FMA5 tampaknya berhubungan dengan penyakit, karena mereka umumnya berada pada sampel dentin sementara itu jarang atau tidak ada pada kategori lain. Hoshino (10) menggambarkan dominasi Propionibacterium spp. Di lapisan dentin yang dalam, tetapi penelitian ini berbasis budaya, yang mungkin menjelaskan tidak adanya spesies bakteri lain yang disebutkan di atas.

Spesies bakteri yang paling dominan dalam hal asosiasi kesehatan atau penyakit adalah sebagai berikut : F. nucleatum subsp. Polymorphum ( akar yang sehat dalam subjek control ), S. sputigena ( akar yang sehat dalam subjek RC ), Selenomonas sp. Clone CS002 ( plak dalam akar karies ), dan Propionibacterium sp. strain FMA5 ( dentin dari akar karies ).

Untuk subjek control S. mutans yaitu langka dan tidak ada lactobacilli, sedangkan untuk hrRC dan sampel prevalensi karies dan tingkat S. mutans dan lactobacilli meningkat. Prevalensi Actinomyces dan tingkat dalam sampel hrRC dan karies yang mirip dengan apa yang dilihat untuk subjek kontrol. Spesies Actinomyces yang paling umum, phylotype Actinomyces sp. Clone IP073, adalah pengecualian, seperti yang terdeteksi dalam plak yang hanya satu subjek kontrol tetapi untuk empat subjek RC. Jumlah dari S. mutans dan Actinomyces sedikit menurun, sementara lactobacilli meningkat baik prevalensi dan tingkat dari hrRC pada sampel karies. S. mutans tampak hanya 50 % pada sampel dentin, yang menyebabkan peranan dari S. mutans dalam pengembangan RC dipertanyakan (7) dan kultur penelitian bertentangan melibatkan S. mutans sebagai agen utama penyebab RC (26). Prevalensi dari S. mutans sendiri atau dikombinasikan dengan lactobacilli adalah sama dalam sampel hrRC dan karies ( yaitu, hadir dalam setengah sampel ), yang sejalan dengan pengamatan sebelumnya (17,26). Lactobacilli hilang dalam subjek yang sehat, tetapi tampak tinggi dalam karies dentin, mendukung saran bahwa Lactobacilli mungkin tidak memainkan peran penting dalam inisiasi RC, tetapi bisa menjadi perkembangan atau penyebab yang penting (12). Demikian pula, pengamatan menemukan setengah Actinomyces dalam kontrol, sampel hrRC dan karies pada tingkat rendah dan dalam Sembilan sampel dentin pada tingkat tinggi mungkin menunjukkan bahwa mereka tidak terlibat dalam inisiasi tetapi dalam perkembangan proses RC. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa tidak semua tiga spesies bakteri klasik terkait dengan RC memerlukan tampaknya penyakit untuk berkembang.

Flora mikroba yang berhubungan dengan RC jauh lebih kompleks dari yang diperkirakan sebelumnya. Spesies bakteri biasanya terkait dengan RC yang terdeteksi, seperti S. mutans, lactobacilli, dan Actinomyces; Namun, spesies tambahan, seperti Atopobium spp., Olsenella spp., Pseudoramibacter alactolyticus, dan Propionibacterium sp. strain FMA5, juga banyak ditemukan. Data menunjukkan bahwa spesies terakhir ini juga terlibat dalam pengembangan RC.