[jurnal]...

AKTIVITAS PENGHAMBATAN BAKTERI ASAL SALURANPENCERNAAN AYAM BROILER TERHADAP Escherichia coli

dan Salmonella spp. PADA BERBAGAI MEDIA, AERASI, pHdan SUHU

GUSMINARNI

SEKOLAH PASCA SARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DANSUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang berjudulAktivitas Penghambatan Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam BroilerTerhadap Escherichia coli dan Salmonella spp. Pada Bebagai Media, Aerasi,pH dan Suhu. adalah hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbingdan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupuntidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkandalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2009

GusminarniG 351070071

ABSTRACT

GUSMINARNI Inhibitory Activity of Bacteria Isolated from Digestive Track ofChicken Broiler Against Escherichia coli and Salmonella spp. at Several GrowthMedia, Aeration, pH, and Temperature. Under Direction of YULIN LESTARIand MIN RAHMINIWATI

This research aim to study the Inhibition activity of bacteria isolated fromdigestive track chicken broiler against Echerichia coli and Salmonella sp. atseveral growth media, aeration, pH and temperature. Isolation of digestive trackbroiler bacteria was conducted by using Nutrient Agar (NA) media at pH 7.0 andpH 4.5. The isolates were assayed against Echerichia coli and Salmonella sp.The isolates which showed inhibition capability were selected, microscopicallyidentified, Gram stained and used for further assay The inhibitory activity ofselected isolates was examined using De Man Ragosa (MRS ) and TriptonGlucosa Yeast Extract (TGY) media, with and without agitation. The selectedmedia was then modified with molasses and soybean meal as source of carbon andnitrogen, respectively. The stability of inhibitory activity was examined at fivelevels of temperature (250C, 300C, 370C, 400C, 500C), and seven pH levels (3.0,4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, and 9.0). The selected isolates were also enzimaticallyassayed for amylase, protease, lipase, and cellulose activity. The results showedthat 7n isolate produced the highest inhibition activity against E. coli andSalmonella enteric. For E coli strong inhibition showed by 7n isolate at MRSmodified media, pH 6.0-8.0, and temperature at 370C, and similar conditionapplied also for EPEC K1-1, except the highest inhibition occured at 500C. ForSalmonella enteric growth inhibition by 7n isolate was obtained using MRSmodified media, pH 5, and temperature at 300C. For other Salmonella subsp.2small inhibition by 34n occurred at both MRS and TGY modified at pH 4.0-5.0and temperature at 370C. Both 7n and 34 isolates showed amylase, protease,lipase and cellulose activity. The results indicate that both isolates have theirpotency to be developed as probiotics, served as feed additive. The isolates areexpected can function as growth promoter through their antibacterial anddegrading enzymes activities.

Keywords: chicken broiler bacteria, antibacterial activity, E. coli, Salmonella sp.,MRS modified media, pH, temperature, degrading enzyme.

RINGKASAN

GUSMINARNI. Aktivitas Penghambatan Bakteri Asal Saluran PencernaanAyam Broiler Terhadap Escherichia coli dan Salmonella spp. Pada BerbagaiMedia, Aerasi, pH dan Suhu. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MINRAHMINIWATI.

Indonesia merupakan negara berkembang dengan tingkat pertumbuhanpenduduk yang cukup tinggi. Peningkatan jumlah penduduk serta meningkatnyakesadaran masyarakat akan kebutuhan gizi yang baik untuk keluarga, mendorongmeningkatnya permintaan akan bahan pangan hewani sebagai sumber protein.Salah satu bahan pangan hewani yang bermutu tinggi adalah produk asal ayam.Akan tetapi pemenuhan akan bahan pangan ini sering mendapat kendala. Masalahutama dalam peningkatan produksi ternak termasuk ayam adalah penyediaanpakan, terutama sebagai sumber protein dan energi yang masih diimpor dansebagai konsekuensinya harga pakan meningkat. Untuk efisiensi pakan biasanyadengan pemberian feed additive sebagai zat pemacu tumbuh (growth promotant).Zat pemacu tumbuh yang umum dipakai berasal dari kelompok antibiotik.Penggunaan antibiotik mempunyai sifat positif seperti meghambat infeksi bakteripatogen dan memacu pertumbuhan. Akan tetapi antibiotik mempunyai efeksamping yaitu ikut hadirnya residu antibiotik dalam produk yang dihasilkansehingga mengakibatkan efek teratogenik, karsinogenik, mutagenik, resistensibakteri patogen serta. membunuh bakteri pencernaan yang menguntungkan.

Untuk memicu produksi dan reproduksi ternak yang lebih aman maka dicarizat pengganti antibiotik seperti probiotik, dan enzim. Probiotik adalah makanantambahan (feed additive) berupa mikroba hidup, baik bakteri maupun kapang atauyeast yang dapat menguntungkan bagi inagnya dengan jalan meningkatkankeseimbangan mikroflora dalam saluran pencernaan ternak. Enzim adalahsenyawa protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat reaksipemecahan senyawa komplek menjadi sederhana yang tersusun dari serangkaianasam amino dalam susunan yang teratur dan tetap. Sebagai protein, enzimdiproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lainkonversi energi dan metabolisme pertahanan sel.

Penelitian ini bertujuan mengkaji aktivitas antibakteri, dari metabolitbakteri asal saluran pencernaan ayam broiler terhadap Escherichia coli danSalmonella sp. Kajian juga dilakukan terhadap aktivitas proteolitik, amilolitik,lipolitik, selulolitik dari metabolit yang dihasilkan bakteri asal saluran pencernaanayam pada beberapa media, aerasi, pH, dan suhu.

Isolasi bakteri asal saluran pencernaan ayam broiler (tanpa antibiotik)dengan menggunakan media NA pH 7.0 dan pH 4.5. Bakteri yang didapat di ujiantagonis terhadap EPEC K1-1, E. coli, Salmonela subsp.2, Salmonella entericdengan metode double layer (Lisboa et al. 2006). Aktivitas penghambatanditunjukkan olah adanya zona bening di sekitar koloni. Isolat bakteri terpilihdiidentifikasi dan dioptimasi aktivitas penghambatannya pada media MRS danTGY, diagitasi dan tanpa agitasi. Media yang paling tinggi aktivitasnya digunakanuntuk membuat media modifikasi dengan mengganti sumber karbon denganmolase dan sumber nitrogen dengan tepung kedelai. Optimasi dilakukan pada lima

tingkatan suhu (250C, 300C, 370C, 400C, 500C) dan tujuh tingkatan pH (3.0, 4.0,5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0).

Hasil isolasi diperoleh 72 isolat terdiri dari 38 isolat pada media NA denganpH 7.0 dan 34 isolat pada media NA dengan pH 4.5. Bagian saluran yangdigunakan untuk isolasi bakteri antara lain duodenum, ileum dan intestinumcrasum. Pada duodenum diperoleh 11 isolat, ileum 14 isolat dan intestinumcrasum 47 isolat. Hasil uji antagonis menunjukkan 19 isolat mampu menghambatEPEC K1-1 yang terdiri dari 13 isolat dari pH 7.0 dan 6 isolat dari pH 4.5.Penghambatan terhadap E. coli diperoleh 30 isolat, terdiri dari 18 isolat daripH 7.0 dan 12 isolat dari pH 4.5. Penghambatan terhadap Salmonella entericdidapatkan 21 isolat terdiri dari 7 isolat dari pH 7.0 dan 14 isolat dari pH 4.5.Waktu inkubasi yang paling baik adalah 48 jam. Setelah diseleksi dandiidentifikasi diperoleh empat isolat terpilih yaitu isolat 7n, 25n, 27n, dan 34n.Keempat isolat merupakan kelompok Bacillus yang mempunyai aktifitaspenghambatan terhadap EPEC K1-1, E. coli, Salmonella enteric dan Salmonellasubsp.2.

Isolat terpilih dioptimasi aktivitas penghambatannya terhadap media, pHdan suhu. Dari hasil optimasi terhadap media MRS modifikasi dan TGYmodifikasi diperoleh isolat 7n, 25n, dan 27n aktivitas penghambatannya terbaikditumbuhkan pada media MRS modifikasi tanpa agitasi dan untuk isolat 34nmedia terbaiknya adalah media TGY modifikasi tanpa agitasi. Hasil optimasiterhadap suhu dan pH diperoleh aktifitas penghambatan tertinggi terhadapEPEC K1-1 oleh isolat 7n sebesar 19mm pada media MRS modifikasi suhu 500Cdan pH 7.0. Penghambatan tertinggi terhadap E.coli asal ayam oleh isolat 25nsebesar 29 mm pada media MRS modifikasi suhu 400C dan pH 8.0. Aktifitaspenghambatan terhadap Salmonella enteric oleh isolat 7n pada media MRSmodifikasi dengan suhu 300C dan pH 5.0. Penghambatan terhadap Salmonellasubsp.2. oleh isolat 34n sebesar 19mm pada media MRS modifikasi suhu 370Cdan pH 9.0. Keempat isolat menunjukkan aktifitas penghambatan pada kisaransuhu 300C hingga 500C dan kisaran pH 5.0 hingga pH 9.0.

Hasil uji enzim menunjukkan bahwa isolat 7n, 25n, 27n, 34n mempunyaikemampuan menghasilkan enzim amilase, protease, lipase dan selulaseekstraseluler. Dimana isolat 7n mempunyai nilai indeks paling tinggi denganindeks amilase 0.67, indeks protease 1.5, indeks lipase 1, dan indeks selulase 2.Isolat 27n menghasilkan enzim amilase, protease dan selulase tapi tidakmenghasilkan enzim lipase.

Dengan demikian isolat 7n, 25n, 27, dan 34n efektif menghambatpertumbuhan EPEC K1-1, E. coli, Salmonella enteric, Salmonella subsp.2 asalayam sehingga berpotensi sebagai biokontrol pada ternak ayam pedaging (broiler).Aktivitas penghambatan yang lebih kecil pada media modifikasi dibanding mediaumum diduga disebabkan oleh kandungan molase dan tepung kedelai masihkompleks. Keempat isolat diharap dapat digunakan sebagai probiotik danmakanan tambahan (feed additive) pengganti antibiotik.

Kata kunci: bakteri, bakteri asal ayam broiler, aktivitas antibakteri, E.coli,Salmonella sp., media MRS modifikasi, media TGY modifikasi, pH,suhu, aktivitas enzim degradatif.

©Hak cipta milik IPB tahun 2009Hak cipta dilindungi Undag Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkanatau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atautinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentinganyang wajar IPB.Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulisdalam bentuk apapun tanpa izin IPB

AKTIVITAS PENGHAMBATAN BAKTERI ASAL SALURANPENCERNAAN AYAM BROILER TERHADAP Escherichia coli

dan Salmonella spp. PADA BERBAGAI MEDIA, AERASI, pHdan SUHU

GUSMINARNI

Tesissebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains padaMayor Mikrobiologi

SEKOLAH PASCA SARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2009

Penguji Luar Komisi Ujian Tesis: Dr. Ir. Iman Rusmana

Judul Tesis : Aktivitas Penghambatan Bakteri Asal Saluran Pencernaan AyamTerhadap Escherichia coli dan Salmonella spp. Pada BerbagaiMedia, Aerasi, pH dan Suhu

Nama : GusminarniNRP : G351070071

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Yulin Lestari drh. Min Rahminiwati, M.S.PhDKetua Anggota

Diketahui

Ketua Mayor Mikrobiologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Gayuh Rahayu Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodipuro, M.S

Tanggal Ujian: 10 Agustus 2009 Tanggal lulus:

PRAKATA

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atassegala karuniaNya sehingga karya ilmiah (tesis) ini berhasil diselesaikan. Judulyang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2008 sampaiApril 2009 adalah Aktivitas Penghambatan Bakteri Asal Saluran PencernaanAyam Broiler Terhadap Escherichia coli dan Salmonella spp. Pada BebagaiMedia, Aerasi, pH dan Suhu. Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapanterima kasih yang sebesar besarnya terutama kepada pembimbing, yaitu Dr. Ir.Yulin Lestari dan drh. Min Rahminiwati, M.S. PhD yang telah banyakmemberikan bimbingan dan saran selama penelitian dan penulisan tesis ini.Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Iman Rusmana selaku PengujiLuar Komisi yang telah banyak memberikan koreksi dan arahan untuk perbaikantesis Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibupengelola Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB atas segala bantuan danfasilitas yang diberikan selama penelitian dilakukan.

Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan pula kepadaDepartemen Agama Republik Indonesia yang telah memberikan beasiswa untukmelanjutkan studi S2 di Sekolah Pascasarjana IPB melalui Program PeningkatanMutu Guru Madarasah. Penulis juga mengucapkan banyak terima kasih kepadaKepala MAN 2 Batusangkar, Bapak Drs. Anasril yang telah memberi izin penulisuntuk tugas belajar di IPB, serta teman-teman guru MAN 2 Batusangkar atasdukungannya. Akhirnya ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepadasuami dan anak-anak tercinta atas doa, motivasi dan keihkhlasan mereka untukditinggalkan selama penulis menempuh pendidikan di IPB serta Bapak dan Ibumertua, kakak, adik, kakak ipar, adik ipar yang membantu dalam merawat anakanak penulis selama penulis studi. Tidak lupa kepada rekan-rekan yang tidak dapatsaya sebutkan satu persatu, penulis mengucapkan banyak terima kasih atasbantuan dan kebersamaannya.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itukritik dan saran sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah iniibermanfaat bagi pembaca.

Bogor, Agustus 2009

Gusminarni

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bukitinggi pada tanggal 26 Agustus 1968 dari bapakMislam (Alm) dan ibu Nurma (Almh). Penulis merupakan putri kelima dari enambersaudara.

Pendidikan Dasar sampai Menengah Atas diselesaikan di Bukittinggi,Sumatera Barat. Tahun 1987 penulis lulus SMA Negeri 2 Bukittinggi dan padatahun yang sama penulis lulus masuk perguruan tinggi Institut Keguruan IlmuPendidikan (IKIP) Padang melalui jalur Penelusuran Minat Dan Kemampuan(PMDK) pada jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA, dan lulus pada tahun 1991.

Penulis bekerja sebagai guru honorer di SMA YPP Lubuk Alung SumateraBarat dari tahun 1991 hingga 1992. Dari tahun 1993 hingga 1996 penulismengajar di Madrasah Sumatra Tawalib Parabek Bukittinggi. Pada tahun 1994penulis diangkat menjadi guru Biologi pada MAN 2 Batusangkar, KabupatenTanah Datar, Provinsi Sumatera Barat. Tahun 2007 penulis mendapatkanbeasiswa dari Departemen Agama Republik Indonesia melalui programPeningkatan Mutu Guru Madarasah untuk melanjutkan studi pada mayorMikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB.

Penulis menikah dengan Sumintarto Nurwahyudi. Spd pada tahun 1996 dandikaruniai 4 orang anak, Syafiq Wahyu Hidayat (12 tahun), Fadhel GhalibWahyudi (10 tahun), A.Nouval Dzakwan Wahyudi (5 tahun) dan Ghina NasywaFauzana (2 tahun).

Alamat Rumah sekarang di Perumahan Arai Pinang II Blok A No 2Batusangkar telp (0752) 574185 Tanah Datar-Sumbar. Alamat sekolahMAN 2 Batusangkar jl Sudirman Lima Kaum (0752) 71640. [email protected].

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................. vi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ vii

DFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ viii

PENDAHULUAN ............................................................................................. 1Latar Belakang .......................................................................................... 1Tujuan ...................................................................................................... 2Manfaat .................................................................................................... 2

TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 4Mikroflora Usus ....................................................................................... 4Probiotik ................................................................................................... 6Prebiotik ................................................................................................... 8Bacillus sp................................................................................................ 8Escherichia coli......................................................................................... 10Salmonella sp ............................................................................................ 12Antibiotik .................................................................................................. 14Enzim ........................................................................................................ 15Protease .................................................................................................... 16Amilase .................................................................................................... 17Lipase ....................................................................................................... 19Selulase .................................................................................................... 19Molase ....................................................................................................... 20Tepung kedelai ......................................................................................... 21

BAHAN DAN METODE .................................................................................. 22Waktu dan Tempat ................................................................................... 22Bahan dan Alat ......................................................................................... 22Metode ..................................................................................................... 23Isolasi Bakteri Saluran Pencernaan Ayam ............................................... 23Pemurnian Bakteri Hasil Isolasi ............................................................... 23Peremajaan Bakteri Target ....................................................................... 24Uji Antagonis Langsung Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayamterhadap EPEC K1-1, Salmonella enteric dan E. coliAsal Ayam serta Salmonella subsp.2 Asal Ayam ................................... 24Identifikasi / Karakterisasi Isolat Bakteri.................................................. 24Esei Antagonis Isolat Terpilih Terhadap Pertumbuhan E. coli,Salmonella subsp.2, EPEC K1-1, Salmonella entericdengan Metode Kirby-Bauer..................................................................... 25Optimasi Produksi Senyawa Bioaktif ...................................................... 25Uji Kualitatif Aktivitas Amilase, Protease, Lipase, Selulase .................. 26

HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 27Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asal Saluran PencernaanAyam Broiler ............................................................................................ 27

Peremajaan Bakteri target ........................................................................ 30Kemampuan Penghambatan Bakteri Asal Saluran PencernaanAyam Terhadap EPEC K1-1, Salmonella enteric dan E. ColiAsal Ayam Serta Salmonella subsp.2 Asal Ayam ................................... 31Identifikasi Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam Broiler ................... 32Esei Antagonis Isolat Terpilih Terhadap PertumbuhanE. coli, Salmonella subsp.2, EPEC K1-1, Salmonella entericDengan Metode Kirby-Bauer ................................................................... 37Optimasi Produksi Senyawa Bioaktif ...................................................... 40Optimasi Media ........................................................................................ 40Optimasi Waktu Produksi ........................................................................ 45Pertumbuhan Isolat .................................................................................. 46Optimasi Suhu .......................................................................................... 47Optimasi pH ............................................................................................. 49Aktivitas Amilase, Protease, Lipase, Selulase ......................................... 51

SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 58

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 59

LAMPIRAN ....................................................................................................... 67

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Mikroorganisme dalam saluran pencernaan ternak....................................... 5

2 Tabel 2 Hasil Isolasi Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam Broiler.......... 28

3 Tabel 3 Aktivitas penghambatan bakteri asal saluran pencernaan ayam

broiler erhadap E.coli, EPEC K1-1, Salmonella enteric.............................. 31

4 Tabel 4 Hasil uji katalase isolat 7n, 25n, 27n, 34n ....................................... 35

5 Tabel 5 Hasil uji penghambatan ekstrak kasar isolat 7n, 25n, 27n, 34n

terhadap EPEC K1-1, E. coli, Salmonella enteric,dan

Salmonella subsp.2 ...................................................................................... 37

6 Tabel 6 Indeks amilolitik, proteolitik, lipolitik, selulolitik isolat7n, 25n, 27n, 34n............................................................................................. 51

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur amilosa dengan ikatan α-1.4 D-glukosidik ..................................... 17

2 Struktur amilopektin dengan ikatan α-1.4 dan α-1.6- D glikosidik ............. 18

3 Strutur selulosa dengan ikatan β- (1,4) ....................................................... 20

4 Hasil pewarnaan Gram a (isolat 7n) diisolasi dari jejenum, (isolat 25n)

dari intestinum crasum ayam broiler berbentuk batang

(perbesaran 40 x 100) .................................................................................. 33

5 Hasil pewarnaan Gram a (isolat 27n) b (isolat 34n) diisolasi dari

intestinum crasum ayam broiler berbentuk batang Gram positif

(perbesaran 40 x 100) ................................................................................... 33

6 Hasil pewarnaan spora (isolat 7n), b (isolat 25n) diisolasi dari

intestinum crasum ayam broiler (perbesaran 40 x 100) ............................. 34

7 Hasil pewarnaan spora (a) isolat 27n, (b) isolat 34n diisolasi

dari intestinum crasum ayam broiler (perbesaran 40 x 100) ........................ 34

8 Aktifitas penghambatan isolat terpilih terhadap bakteri target

(a)EPEC K1-1, (b) E.coli Ф cakram kertas 8mm ....................................... 38

9 Aktifitas penghambatan isolat terpilih terhadap bakteri target

(a) Salmonella enteric (b) Salmonella sp. asal ayam,

Ф cakram kertas 8mm .................................................................................. 38

10 Perbandingan aktivitas penghambatan antara sel dan filtrat kultur

dari isolat 7n, 25n, 27n, 34n terhadap E.coli ............................................... 39

11 Aktifitas penghambatan isolat terpilih terhadap (a) EPEC K1-1

(b) E. coli asal ayam ..................................................................................... 41

12 Aktifitas penghambatan isolat terpilih terhadap (a) Salmonella enteric

(b) Salmonella subsp.2 asal ayam ................................................................ 42

13 Hubungan lama inkubasi dengan aktivitas penghambatan terhadap E.coli

(a) filtrat kultur (b) sel ................................................................................. 45

14 Kurva tumbuh Isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada media NB ............................ 46

15 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) EPEC K1-1 (b) E. coli ............ 47

16 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) Salmonella enteric,

(b) Salmonella subsp.2 asal ayam .............................................................. 48

17 Aktifitas penghambatan isolat terhadap (a) EPEC K1-1 (b) E. coli ............ 49

18 Aktifitas penghambatan isolat terhadap (a) Salmonella enteric

(b) Salmonella subsp.2 asal ayam ................................................................ 50

19 Zona bening yang dihasilkan isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada uji enzim

(a) amilase (b) protease ............................................................................... 52

20 Zona bening yang dihasilkan isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada uji enzim

(a) lipase (b) selulase ................................................................................... 54

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi kimia molase ............................................................................. 68

2 Komposisi kimia tepung kedelai ................................................................ 68

3 Komposisi media peremajaan, produksi, serta uji daya hambat isolat .

asal saluran pencernaan ayam broiler terhadap EPEC K1-1,

E. coli asal ayam, Salmonella enteric, Salmonella subsp.2 asal ayam ....... 69

4 Komposisi Pereaksi Pewarnaan .................................................................. 71

5 Hasil isolasi dan identifikasi bakteri asal saluran pencernaan

ayam broiler pada media NA pH 7.0 .......................................................... 72

6 Hasil isolasi dan identifikasi bakteri asal saluran pencernaan

ayam broiler pada media NA pH 7.0 .......................................................... 73

7 Kurva Standar Isolat 7n .............................................................................. 74

8 Kurva Standar Isolat 25n ............................................................................ 75



11 Diameter (Ф) zona bening Isolat 7n, 25n, 27n, 34n yang diantagonis

dengan EPEC K1-1 diinkubasi pada berbagai tingkatan suhu .................. 78


dengan E. coli diinkubasi pada berbagai tingkatan suhu .......................... 78


dengan Salmonella enteric diinkubasi pada berbagai tingkatan suhu ....... 78


dengan Salmonella subsp.2 diinkubasi pada berbagai tingkatan suhu ...... 78

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Indonesia merupakan negara berkembang dengan tingkat pertumbuhan

penduduk cukup tinggi. Peningkatan jumlah penduduk serta meningkatnya

kesadaran masyarakat akan kebutuhan gizi yang baik untuk keluarga,

menyebabkan meningkatnya permintaan akan bahan pangan hewani sebagai

sumber protein. Salah satu bahan pangan hewani yang bermutu tinggi adalah

produk asal ayam. Akan tetapi pemenuhan akan bahan pangan ini sering

mendapat kendala. Masalah utama dalam peningkatan produksi ternak termasuk

ayam pedaging (broiler) adalah penyediaan pakan. Pakan merupakan 70% biaya

pemeliharaan. Pakan yang diberikan harus memberikan nutrisi yang dibutuhkan

ayam, yaitu karbohidrat, protein, lemak, vitamin dan mineral, sehingga

pertambahan berat badan perhari Average Daily Gain (ADGnya) akan

tinggi..Pada saat ini pakan terutama sebagai sumber protein dan energi dipenuhi

dari impor dan sebagai konsekuensinya harga pakan menjadi mahal.

Untuk meningkatkan efisiensi pakan biasanya dilakukan dengan cara

memberi bahan tambahan (feed additive) sebagai zat pemacu tumbuh (growth

promotant). Zat pemacu tumbuh yang umum dipakai berasal dari kelompok

antibiotik seperti zinkbasitrasin, monensin, tetrasiklin dan penicilin. Selain untuk

pemacu tumbuh antibiotik juga digunakan untuk megendalikan penyakit yang

disebabkan oleh mikroba. Akan tetapi penggunaan antibiotik yang berlebihan

mengandung resiko yaitu ikut hadirnya residu antibiotik dalam produk yang

dihasilkan (telur dan daging) yang bersifat teratogenik, karsinogenik dan

mutagenik. Resiko lainnya yaitu terjadinya resistensi mikroorganisme patogen

seperti Salmonella sp. resisten streptomisin, E. coli resisten Enrofloxasin, dan

membunuh bakteri yang menguntungkan.

Pakar nutrisi (nutritionist) telah mengalihkan penggunaan zat pemacu

tumbuh yang berasal dari antibiotik ke bahan bioaktif alami dan probiotik. Bahan

bioaktif alami adalah bahan bahan pemacu pertumbuhan yang bersumber dari

organisme. Probiotik adalah makanan tambahan berupa mikroba hidup, baik

bakteri maupun kapang/yeast yang dapat menguntungkan bagi inangnya dengan

2

jalan meningkatkan keseimbangan mikroflora dalam saluran pencernaan ternak

(Fuller 1992).

Probiotik menggantikan penggunaan antibiotik sebagai pemacu tumbuh

telah terbukti dapat meningkatkan produktivitas ternak. Mikroba yang sudah

dinyatakan aman sebagai bahan pakan untuk ayam yaitu golongan bakteri seperti

Lactobacillus sp., Bacillus subtilis, serta dari golongan kapang seperti

Saccharomyces sp. (Martin 1995; Haddadin et al. 1996; Jin et al. 1996).

Untuk produksi mikroba sebagai probiotik dari segi industri harus

memperhatikan efisiensi sehingga diperlukan optimasi produksi metabolit dari

mikroba. Pertumbuhan mikroba sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti

suhu, pH, oksigen, tekanan osmosis dan faktor nutrisi terdiri dari sumber karbon,

nitrogen, mineral (unsur makro dan mikro), vitamin (Stainer et al. 1976; Fardiaz

1989). Kebutuhan akan karbon untuk pertumbuhan mikroba yang paling baik

diperoleh dari sumber karbohidrat yang dapat larut seperti glukosa, dan sumber

nitrogen yang mudah larut seperti kasein. Namun penggunaan glukosa dan kasein

memerlukan biaya yang tinggi, oleh karena itu untuk produksi sel mikroba dengan

biaya yang lebih murah dan mudah didapat pada umumnya digunakan sumber

karbon lain seperti molase dan sumber nitrogen dari tepung kedelai. Optimasi

aktivitas senyawa bioaktif dari bakteri terpilih dilakukan terhadap media produksi

yang menggunakan molase dan tepung kedelai, agitasi dan tanpa perlakuan agitasi,

pH, dan suhu.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengkaji aktivitas antibakteri dan aktivitas

enzimatik dari metabolit bakteri asal saluran pencernaan ayam broiler. Aktivitas

antibakteri dilakukan terhadap Escherichia coli dan Salmonella sp., sedangkan

aktivitas enzimatik meliputi proteolitik, amilolitik, lipolitik, selulolitik. Optimasi

produksi metabolit yang dihasilkan bakteri dilakukan pada berbagai media,

aerasi, pH, dan suhu.

Manfaat

Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan bakteri unggul asal saluran

pencernaan ayam broiler yang berpotensi sebagai probiotik pada kondisi

3

pertumbuhan optimum untuk menghasilkan senyawa anti bakteri. Penggunaan

bakteri asal saluran pencernaan ini diharapkan dapat menjadi alternatif

penggunaan antibiotik sebagai pemacu pertumbuhan, sehubungan kemampuannya

dalam menghasilkan enzim ekstraseluler yang membantu konversi pakan secara

optimal sehingga penggunaan pakan lebih efisien dan pertumbuhan menjadi

optimum.

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroflora Usus

Mahluk hidup sebelum lahir atau menetas berada dalam keadaan steril,

Ketika sudah berhubungan dengan dunia luar berbagai tipe mikroba masuk ke

dalam tubuh baik dalam proses kelahiran atau menetas, maupun lewat makanan

dan kontak dengan lingkungan. Mikroorganisme tersebut tinggal pada saluran

pencernaan sampai makhluk hidup itu mati. Bagian dari saluran pencernaan yang

paling banyak dihuni oleh bakteri adalah saluran usus. Mikroorganisme yang

menempel pada saluran usus tersebut dinamakan mikroflora usus

(Nakazawa 1992).

Mikroflora usus merupakan ekosistem yang kompleks terdiri dari sejumlah

besar bakteri. Zat yang terdapat dalam ekosistem usus dapat berasal dari bahan

luar yang berupa pakan dan dapat berasal dari dalam tubuh (endogeneus) seperti

produk metabolisme yang harus dibuang. Mikroflora detrimental umumnya

sangat aktif merombak zat yang terdapat dalam usus besar baik berasal dari bahan

makanan beracun, obat obatan, steroid, maupun metabolit yang berasal dari

bahan makanan (Hasono 2002). Hasil akhirnya adalah metabolit yang bersifat

toksik (beracun), karsinogenik (menyebabkan kanker) atau metagenik

(membentuk gas metan). Metabolit ini sering menyebabkan kerusakan mukosa

usus bahkan membentuk tumor atau beberapa penyakit lain. Dalam kaitan ini

proporsi bakteri “baik” akan mendesak atau mengencerkan mikroflora aktif diatas,

sehingga zat toksik yang akan dibentuk tidak jadi karena, bahan pembentuknya

sudah dibuang terlebih dahulu.

Menurut Savage yang dikutip oleh Nakazawa (1992) mikroflora normal

usus mempunyai sifat (1) dapat tumbuh dalam kondisi anaerobik, (2) terdapat

pada saluran pencernaan dewasa normal, (3) dapat mengkolonisasi pada bagian

specifik saluran pencernaan, (4) dapat membangun habitat sendiri selama proses

perantian dari manusia dan hewan muda, (5) dapat menjaga populasi pada dewasa

normal, (6) dapat melekatkan diri dengan permukaan epitel usus. Kemampuan

bakteri untuk melekat pada jaringan epitel usus (lapisan lendirnya), dapat

dibuktikan dengan kemampuannya megkolonisasi saluran usus dan menjaga

5

populasi tetapnya. Bakteri bakteri ini dapat diselidiki keberadaannya dengan

menguji feses dari hostnya.

Pada saluran pencernaan ayam terdapat sekitar 100-400 mikroba yang

menguntungkan dan merugikan. Mikroba menguntungkan seperti E. Coli,

Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, Enterococcus, Clostridia, dan yang

merugikan seperti Salmonella sp. Bakteri bakteri itu hidup dalam keseimbangan.

Kestabilan flora usus bisa terganggu antara lain oleh antibiotik, infeksi bakteri dan

virus, kemoterapi, radiasi, pola makan, stres dan iklim (Gsianturi 2002).

Menurut Utomo (2002 ) mikroorganisme pada saluran pencernaan ternak

terdiri dari mikroorganisme seperti tercantum pada (Tabel 1).

Tabel 1 Mikroorganisme dalam saluran pencernaan ternak

Seikum Feses LambungHewan Bakteri Ileum

(CFU) (CFU) (CFU) (CFU)

Ayam E.coli - - 106 106

Lactobacillus 109 109 106 109

Streptococcus 104 - - -

Bacteroides - - 109 107

Enterococcus - 104 107 107

Clostridia - - - -

Babi E.coli 105 106 107 105

Lactobacillus - 109 109 109

Streptococcus 106 - - 106

Bacteroides - - - -

Enterococcus - 107 107 -

Clostridia - 107 108 -

Kucing E.coli 104 - - 105

Lactobacillus 107 108 109 -

Streptococcus - - - 107

Bacteroides - 109 109 -

Enterococcus 106 108 108 -

Clostridia 106 108 108 108

6

Dari tabel terlihat pada saluran pencernaaan ayam Lactobacillus ditemui

hampir diseluruh saluran pencernaan, bakteri ini kelompok bakteri baik.

Sementara E.coli dan Bacteroides banyak ditemui pada pada lambung dan pada

ileum dan seikum tidak ditemui dan pada feses kembali ditemui dengan jumlah

yang sama dengan di lambung. Enterococcus ditemui pada lambung dan pada

seikum jumlahnya menurun kemudian pada feses jumlahnya meningkat kembali.

Streptococcus hanya ditemui pada saluran pencernaan bagian ileum

Mikroflora usus ayam pada umumnya bersumber dari permukaan telur

yang tidak steril sebagai hasil kontak induk dengan sangkarnya. Sedangkan pada

peternakan komersial, kolonisasi pada saluran usus ada hubungannya dengan

kebersihan di hatchery dan kontak dengan lingkungan bebas. Jika saluran usus

terkolonisasi dengan mikroba yang merugikan, maka akan berdampak patogen

bagi tubuh. Untuk mengantisipasi serangan patogen, bakteri menguntungkan

(probiotik) akan membangun pertahanan tanpa memberi ruang bagi bakteri

patogen untuk menyerang tubuh (Gsianturi 2002).

Probiotik

Probiotik berasal dari bahasa Yunani yang artinya for life (untuk hidup)

memiliki pemahaman yang berbeda-beda. Istilah probiotik pertama kali digunakan

oleh Lilley dan Stiwell pada tahun (1965) menyatakan bahwa substansi yang

dihasilkan mikroba untuk menstimulir pertumbuhan mikroba lainnya dalam

saluran pencernaan. Lebih lanjut Fuller (1989) mendefinisikan probiotik sebagai

bahan pangan yang mengandung mikroorganisme dalam keadaan hidup yang

mempunyai pengaruh menguntungkan bagi inangnya dengan meningkatkan

keseimbangan mikroflora usus.

Definisi probiotik berkembang setelah adanya data hasil penelitian ilmiah,

seperti yang dikemukakan oleh Fuller (1992) bahan probiotik itu adalah makanan

tambahan (feed suplement) berupa jasad hidup yang mempunyai pengaruh

menguntungkan bagi ternak induk semangnya. Dan mikroorganisme yang dapat

dimanfaatkan sebagai probiotik antara lain tidak toksik, mampu bertahan pada

suasana asam dan cairan empedu, dapat berkoloni dan melakukan kegiatan

metabolisme di dalam usus dan dapat tumbuh lama dan menghambat mikroba

patogen dan dapat hidup pada berbagai kondisi dalam tubuh ternak. Pernyataan ini

7

kemudian diperbaharui oleh Salminen et al. (1999) probiotik yaitu sediaan sel

mikroba atau komponen dari sel mikroba yang mempunyai pengaruh

menguntungkan pada kesehatan dan kehidupan inangnya.

Menurut Fuller (1991) bakteri probiotik harus memiliki persyaratan yaitu

memberikan efek yang menguntungkan pada host, tidak patogenik dan tidak

toksik, mengandung sejumlah besar sel hidup, mampu bertahan dalam kondisi

yang tidak menguntungkan dan melakukan kegiatan metabolisme dalam usus,

tetap hidup selama dalam penyimpanan sampai waktu digunakan, mempunyai

sifat sensori yang baik, diisolasi dari host.

Beberapa penelitian mengungkapkan pengaruh positif dari probiotik

terhadap kesehatan adalah:

1. Memperbaiki keluhan malabsorbsi laktosa (Legowo 2003)

2. Meningkatkan ketahana alami terhadap infeksi di usus (Siswono 2002)

3. Mencegah diare yang diakibatkan oleh antibiotik (Gsianturi 2002)

4. Menurunkan resiko terjadinya penyakit tumor dan kanker kolon

(Prangdimurti 2001)

5. Mengurangi kadar kolesterol darah (Tannock 1999)

6. Memperbaiki pencernaan (Fuller 1997)

7. Stimulasi imunitas gastrointestinal (Mc Cracken dan Gaskin 1999; Mc

Farlane dan Cummings 1999).

Probiotik dapat digolongakan menjadi dua yakni golongan bakteri dan

golongan cendawan. Menurut Mujiasih (2001) mikroorganisme yang sering

digunakan sebagai probiotik dari kedua kelompok ini adalah Aspergilus niger,

A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentis, B.pumilus, B. brevis, B. alvei,

B. circulans, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. infantis,

B. longum, B. thermopilus, Bacteroides amylophilus, B. ruminicola, Lactobacillus

acidophilus, L. brevis, Streptococcus oremoris, S. faecium, S. lactis,

S. thermophilus, Leiconostoc mesenteroides, Pediococcus acidolacticii,

Propionibacterium shemani dan Saccharomyces cerevisiae.

Penggunaan probiotik pada ternak unggas bertujuan untuk memperbaiki

saluran pencernaan dengan cara: (1) menekan reaksi pembentukan racun dan

metabolit yang bersifat karsinogenik (penyebab kanker), (2) merangsang reaksi

8

enzim yang dapat menetralisir senyawa beracun yang tertelan atau dihasilkan oleh

saluran pencernaan, (3) merangsang produksi enzim (enzim protease dan alfa-

amilase) yang digunakan untuk mencerna pakan, (4) memproduksi vitamin dan

zat zat yang tidak terpenuhi oleh tubuh (Seifert dan Gessler 1997). Menurut

Sartika et al. (1994) penggunaan probiotik dapat memperbaiki performance ayam

broiler meliputi rataan bobot hidup, konversi pakan dan menurunkan mortalitas.

Prebiotik

Prebiotik pada umumnya adalah karbohidrat yang tidak tercerna dan tidak

tidak diserap biasanya dalam bentuk oligosakarida (oligofruktosa) dan inulin

(dietary fiber) (Reddy 1998; Grizard dan Barthomeuf 1999; Reddy 1999). Zat ini

akan mengalami proses peragian di dalam usus besar, untuk menghasilkan

makanan bagi bakteri yang menguntungkan (Karyadi 2003). Makanan tersebut

sangat berguna bagi perkembangbiakan bakteri baik menjadi lebih banyak

sehingga dapat mendominasi populasi bakteri dalam usus. Prebiotik dikenal juga

sebagai nutrisi yang sesuai bagi bakteri baik akan tetapi tidak cocok bagi bakteri

jahat.

Bacillus sp.

Bacillus sp. merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, dapat

tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Sporanya tahan terhadap panas (suhu

tinggi), mampu mendegradasi Xylan dan karbohidrat (Cowan dan Stell’s 1973).

Bacillus spp mempunyai sifat : (1) mampu tumbuh pada suhu lebih dari 500C dan

suhu kurang dari 50C, (2) mampu bertahan terhadap pasteurisasi, (3) mampu

tumbuh pada konsentrasi garam tinggi (>10%), (4) mampu menghasilkan spora

dan (5) mempunyai daya proteolitik yang tinggi dibandingkan mikroba lainnya.

Bacillus adalah salah satu genus bakteri yang berbentuk batang dan merupakan

anggota dari divisi Firmicutes. Menurut Turnbull (1996) Bacillus merupakan

bakteri aerob obligat atau fakultatif, dan positif terhadap uji enzim katalase.

Bacillus secara alami terdapat di mana-mana, dan termasuk spesies yang

hidup bebas atau bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim

ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa membantu

pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul 2007). Jenis Bacillus

(Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus pumilus) termasuk dalam lima produk

9

probiotik komersil terdiri dari spora bakteri yang telah dikarakterisasi dan

berpotensi untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan aktivitas anti mikrobanya

(Duc et al. 2004).

Beberapa penelitian telah berhasil mengisolasi dan memurnikan bakteriosin

Bacillus sp. Gram positif diantaranya yaitu subtilin yang dihasilkan oleh Bacillus

subtilis (Klein et al. 1993), megacin yang dihasilkan oleh B. megaterium

(Tagg et al. 1976), coagulin dihasilkan oleh B. coagulans I4 (Hyronimus 1998),

cerein dihasilkan oleh B. cereus (Oscariz dan Pisabarro 2000), dan tochicin yang

dihasilkan oleh B. thuringiensis (Paik et al. 1997).

Senyawa antimikrob lain yang dihasilkan oleh Bacillus sp adalah basitrasin,

pumulin, laterosporin, gramisidin, dan tirocidin yang efektif melawan bakteri

Gram positif serta kolistin dan polimiksin bersifat efektif melawan bakteri Gram

negatif. Sedangkan difficidin memiliki spektrum lebar, mikobacilin dan

zwittermicin bersifat anti jamur (Todar 2005).

Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif biasanya merupakan

polipeptida bermuatan positif yang dapat menembus membran sel dan tersusun

kurang dari 60 residu asam amino. Berdasarkan struktur asam aminonya

bakteriosin dapat diklasifikasikan ke dalam dua kelompok, yaitu:

1. Lantibiotik, yaitu kelompok bakteriosin yang dikarakterisasi oleh adanya

jembatan sulfur intra rantai dan mengandung asam amino yang tidak lazim

yaitu dehidrolanin, lantionin, dan β-metil lantionin, misalnya pada nissin yang

dihasilkan oleh bakteri Lactococcus lactis (Hurst 1981) dan variacin

(Pridmore et al. 1996).

2. Non-lantibiotik, yaitu kelompok bakteriosin yang dapat dibagi dua berdasarkan

bobot molekulnya, yaitu:

a. Bakteriosin dengan berat molekul relatif kecil yaitu sekitar 2 – 6 kDa

(Lozano et al. 1992), misalnya pediocin Ach yang dihasilkan oleh

Pediococcus acidilactici .

b. Bakteriosin dengan berat molekul relatif besar biasanya di atas 30 kDa

(Benoit et al. 1994), contohnya helveticin J yang dihasilkan oleh

Lactobacillus helviticus.

10

Bakteriosin merupakan zat antimikroba berupa polipeptida, protein, atau

senyawa yang mirip protein. Bakteriosin disintesis di ribosom oleh bakteri selama

masa pertumbuhannya dan umumnya hanya menghambat pertumbuhan galur-

galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin

(Kone & Fung 1992; Jack et al. 1995). Menurut Tagg et al. (1976), kriteria yang

merupakan ciri-ciri bakteriosin adalah sebagai berikut: (1) memiliki spektra

aktivitas yang lebih sempit, (2) senyawa aktif merupakan polipeptida atau protein,

(3) bersifat bakterisida, (4) mempunyai reseptor spesifik pada sel sasaran,

(5) gen determinan terdapat pada plasmid.

Escherichia coli

E. coli tergolong bakteri Gram negatif, an aerob fakultatif, berbentuk batang,

tidak membentuk spora, tidak tahan asam dan ukuran 2−3 x 0.6 μm (Gordon dan

Jordan 1982). Bakteri ini hidup dalam saluran pencernaan hewan. Uji fisiologis

menunjukkan bereaksi positif terhadap indol dan merah metil, negatif terhadap

Vogues-Proskauer, serta tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-

satunya (Krieg dan Holt 1984).

Penyakit yang ditimbulkan oleh E. coli dapat digolongkan menjadi dua

kelompok. Pertama E. coli yang bersifat oportunistik, artinya dapat menyebabkan

penyakit dalam keadaan tertentu, misalnya kekurangan makanan atau mengikuti

penyakit lain. Kedua bersifat enteropatogenic/enterotoksigenic, E. coli yang

mempunyai antigen perlekatan dan memproduksi enterotoksin sehingga dapat

menimbulkan penyakit. (Lay dan Hastowo 1992).

Faktor virulensi E. coli dipengaruhi oleh ketahanannya terhadap

pagositosis, kemampuan perlekatan terhadap epitel sel pernafasan dan

ketahanannya terhadap daya bunuh oleh serum. E.coli yang patogen mempunyai

struktur dinding sel yang disebut “pili”, yang tidak ditemukan pada serotipe yang

tidak patogen (Tabbu 2000), dan “pili” inilah yang berperan dalam kolonisasi

(Lay dan Hastowo 1992).

Ada tiga macam struktur antigen yang penting dalam klasifikasi E. coli

yaitu, antigen O (Somatik), antigen K (Kapsel) dan antigen H (Flagella)

(Gupte 1990; Lay dan Hastowo 1992). Determinan antigen (tempat aktif suatu

antigen) O terletak pada bagian liposakarida bersifat tahan panas dan dalam

11

pengelompokannya diberi nomor 1,2,3 dan seterusnya. Antigen K merupakan

polisakarida atau protein, bersifat tidak tahan panas dan berinterferensi dengan

aglutinasi O, Antigen H mengandung protein, terdapat pada flagella yang bersifat

termolabil.

Pada saat ini telah diketahui ada 173 grup serotipe antigen O74 jenis

antigen K dan 53 jenis antigen H (Barnes dan Gross 1997). Serotipe yang banyak

menyebabkan penyakit pada unggas adalah O1, O2, O35 dan O78 (Tabbu 2000),

dan dikenal patogenitasnya cukup tinggi (Charlton et al. 2000).

Kolibasilosis adalah penyakit pada unggas yang disebabkan oleh bakteri

E. coli yang patogen, sebagai agen primer ataupun sekunder. Infeksi E. coli atau

koliseptikemia ini dapat terjadi pada ayam pedaging dan petelur dari semua

kelompok umur, serta unggas lain seperti kalkun dan itik (Charlton et al. 2000).

Tanda klinis kolibasilosis tidak spesifik dan dipengaruhi oleh umur ayam, lama

infeksi, organ yang terserang dan adanya penyakit lain bersamanya. Pada ayam

pedaging umur 4−8 minggu dan ayam petelur umur ±20 minggu dapat terjadi

septikemia akut dan menimbulkan kematian, yang didahului dengan hilangnya

nafsu makan, malas bergerak/inaktif dan mengantuk (Lee dan Lawrence 1998).

Penularan kolibasilosis biasanya terjadi secara oral melalui pakan, air

minum atau debu/kotoran yang tercemar oleh E. coli. Debu dalam kandang ayam

dapat mengandung 105–106 E. coli/gram dan bakteri ini dapat tahan lama,

terutama dalam keadaan kering. Apabila debu tersebut terhirup oleh ayam, maka

dapat menginfeksi saluran pernafasannya (Tabbu 2000).

Penyakit kolibasilosis dapat dimanifestasikan dalam bentuk kelainan organ,

seperti: septikemia, enteritis, granuloma, omfalitis, sinusitis, airsacculitis,

rithritis/synovitis, peritonitis, pericarditis, selulitis dan Swollen Head

Syndrome/SHS (Zanella et al. 2000), oovoritis ,salpingitis, panopthalmitis dan

bursitis sternalis (Barnes dan Gross 1997; Tabbu 2000). Kolibasilosis mempunyai

arti penting bagi industri perunggasan, karena dapat menimbulkan gangguan

pertumbuhan, penurunan produksi, penurunan kualitas karkas dan telur, serta,

kualitas anak ayam (DOC). Di samping itu, adanya infeksi E. coli dapat

merupakan faktor pendukung timbulnya penyakit komplek pada saluran

pernafasan, pencernaan atau reproduksi yang sulit ditanggulangi (Tabbu 2000).

12

Sekitar 10−15% dari seluruh E. coli yang ditemukan di dalam usus ayam

yang sehat tergolong serotipe patogen. Bagian usus yang paling banyak

mengandung kuman tersebut adalah jejunum, ileum dan sekum. Jenis E. coli yang

terdapat di dalam usus tidak selalu sama dengan jenis yang ditemukan pada

jaringan lain. Sebagai agen penyakit sekunder, E. coli sering mengikuti penyakit

lain, misalnya pada berbagai penyakit pernafasan dan pencernaan yang

menyerang ayam. Kenyataan di lapangan, timbulnya kasus kolibasilosis, terutama

akibat pengaruh imunosupresif dari Gumboro (ayam pedaging lebih dominan

dibanding petelur) dan sebagai penyakit ikutan pada Chronic Respiratory Disease

(CRD), Infectious Coryza (Snot), Swollen Head Syndrome (SHS), Infectious

Laryngo Tracheitis (ILT) dan koksidiosis (Tabbu 2000).

Galur E. coli yang menyebabkan diare dibedakan dalam enam kategori,

yaitu enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), enterohaemorrhagic Escherichia

coli (EHEC), enteroaggregative Escherichia. coli (EAEC), enteropathogenic

Escherichia coli (EPEC), enteroinvasive Escherichia. coli (EIEC), dan cell-

detaching Escherichia. coli (CDEC) (Nataro & Kaper 1998).

EPEC merupakan penyebab utama diare pada anak-anak di negara

berkembang. Studi yang dilakukan di Brazil, Meksiko, dan Afrika Selatan

memperlihatkan bahwa 30-40% diare pada anak-anak disebabkan oleh EPEC.

Terapi yang dilakukan terhadap diare bertujuan untuk menjaga keseimbangan

cairan tubuh, diantaranya melalui pemberian cairan (rehidrasi) secara oral dan

konsumsi beberapa antibiotik (Nataro & Kaper 1998). Budiarti et al.(1998)

mengisolasi EPEC dari feses anak-anak penderita diare. Salah satu isolat yaitu

EPEC K1-1 diketahui memiliki resistensi terhadap ampisilin dengan

menghasilkan enzim β-laktamase secara ekstraseluler (Wahyuni 2006).

Salmonella sp.

Salmonella sp. adalah bakteri berbentuk batang Gram negatif, bersifat

anaerob fakultatif tidak membentuk spora dan dapat bergerak. Uji fisiologis

Salmonella sp. menunjukkan H2S, merah metil, reduksi nitrat, sitrat, dulcitol, lisin,

dekarboksilasi dan ornitin dekarboksilasi bersifat positif. Reaksi biokimia lain

seperti oksidasi, indol, Vogues-Proskauer (VP), urease, glukonat, laktosa, dan

fenilalanin deaminasi bersifat negatif (Krieg dan Holt 1984). Salmonella sp.

13

termasuk ke dalam famili Enterobactericeae tribus escherichea (Fardiaz 1985).

Bakteri ini dapat tumbuh pada suhu 50- 470C dengan suhu optimum 350- 370C,

dan kisaran pH 4.1-9.0 dengan pH optimum 6.5-7.5. Pada pH dibawah 4.0 dan

diatas 8.0 sel Salmonella sp akan mati secara perlahan.

Tempat hidup primer dari Salmonella sp. adalah saluran pencernaan burung,

reptil dan mamalia. Salmonella sp. dapat ditemukan dalam berbagai makanan asal

ternak. Karena hidup dalam saluran pencernaan, maka adanya Salmonella sp.

pada manusia dan hewan dapat terjadi tanpa disertai tanda tanda infeksi. Manusia

dan hewan dapat dikatakan pembawa (carier). Pembawa sering menjadi masalah

dalam kesehatan masyarakat karena dapat menularkan penyakit tetapi sulit untuk

mendeteksinya. Pada unggas dapat ditemukan pembawa sebesar tiga-lima persen

(Anonim 2008).

Menurut Jay (1986) Salmonella sp. diklasifikasikan berdasarkan pada

analisis antigen, dan ini pertama kali dilakukan oleh Kauffmann dan White,

sehingga klasifikasi ini disebut skema Kauffmann-White. Klasifikasi ini

menggunakan dua macam antigen yaitu antigen somatik yang disebut antigen O

dan antigen flagella yang disebut antigen H. Dengan klasifikasi ini maka spesies

dan varietas ditempatkan pada kelompok A,B,C, dan seterusnya sesuai dengan

persamaan dalam kandungan satu atau lebih antigen O. Hasilnya adalah

Salmonella schottmuellerri winlow dan Salmonella typhimurium loeffler

ditempatkan pada kelompok B, karena menunjukkan antigen O4 dan 12.

Salmonella typhi, Salmonella enteridis dan Salmonella gallinarum ditempatkan

pada kelompok D dengan antigen O.9 dan 12. Antigen H dipisahkan menjadi fase

spesifik atau fase satu dan fase kelompok atau fase dua. Fase spesifik hanya

dimiliki oleh beberapa spesies atau varietas, sedang fase kelompok dimiliki oleh

hampir semua spesies.

Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella sp. yaitu salmonelosis dengan

gejala gastroenteritis yaitu Salmonella yang menyerang saluran gastrointestin

(lambung, usus halus dan usus besar) dan demam typus. Salmonelosis pada ayam

muda (umur 2 minggu ) gejalanya seperti berak putih dan pada ayam dewasa

gejalanya tidak terlihat. Salmonellosis dapat juga menyerang manusia dengan

gejala demam, diare dan nyeri pada daerah abdomen. Gastroenteritis akut terjadi

14

dengan gejala muntah dan diare, sebagian kecil penderita mengalami pendarahan

(septikemia). Pada orang-orang yang memiliki daya tahan tubuh yang sangat

rendah, bakteri Salmonella dapat menginvasi aliran darah dan menyebabkan

infeksi yang akan mengancam jiwa (Anonim 2008).

Antibiotik

Antibiotik berasal dari kata antibiosis yang berarti substansi yang

dihasilkan oleh suatu mikroorganisme atau zat yang sama, sebagian atau

seluruhnya dibuat secara sintetis kimia, yang dalam jumlah kecil dapat

menghambat pertumbuhan atau mematikan mikroorganisme lain dengan cara

menghentikan suatu proses biokimia sehingga terputusnya satu mata rantai

metabolisme di dalam tubuh mikroorganisme. Penemuan antibiotik diawali oleh

Alexander Fleming pada tahun 1928 yang mengamati adanya penghambatan

pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus pada cawan petri oleh kontaminan

yang akhirnya dikenal dengan Penicillium notatum. Zat aktif yang kemudian

diisolasi dari P. notatum ini diberi nama penicillin (Crueger dan Crueger 1984).

Sifat kerja antibiotik secara umum menurut Brander et al. (1991) dibagi

dua yaitu bakteriostatik dimana sifat kerja antibiotik meghambat pertumbuhan

bakteri lain, yang termasuk kedalam kelompok ini adalah sulfadinamid, tetrasiklin,

kloramfenikol dan eritromisin. Bakterisidal adalah antibiotik menghambat

pertumbuhan bakteri patogen sekaligus membunuh bakteri tersebut, sehingga

banyak dipakai untuk terapi, yang termasuk kedalam kelompok ini adalah

penisilin dan derifatnya, streptomisin, flavomisin, kolostin, vankomisin,, basitrasin,

dan sefalosporin.

Dalam dunia peternakan kegunaan antibiotik ada dua yaitu antibiotik

untuk pemacu pertumbuhan dab antibiotik untuk terapi. Antibiotik untuk pemacu

tumbuh dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen yang berakibat

meningkatnya populasi bakteri menguntungkan dalam saluran pencernaan.

Penggunaan antibiotik untuk pemacu tumbuh terbukti dapat meningkatkan

produksi ternak (Wiryosuharto 1990).

Antibiotik untuk terapi digunakan untuk mengembalikan kondisi ternak

secepat mungkin, agar ternak tersebut dapat berproduksi kembali secara penuh

dan menghilangkan penderitaan ternak serta mencegah penyebaran patogen ke

15

lingkungan. Antibiotik untuk terapi ada beberapa macam, diantaranya antibiotik

berspektrum sempit yang bertujuan untuk membunuh bakteri negatif atau gram

positif saja, antibiotik berspektrum luas yang mampu mengatasi kedua jenis

bakteri tersebut (Brander et al. 1991).

Antibiotika yang ditambahkan ke dalam pakan atau air minum mempunyai

potensi tinggi menimbulkan residu antibiotika dalam produk hewan (daging, telur)

untuk manusia (FAO/WHO 1992). Seperti yang dilaporkan oleh Rusiana (2008)

dengan meneliti 80 ekor ayam broiler di Jabotabek menemukan 85% daging ayam

broiler dan 37% hati ayam tercemar residu antibiotik tylosin, penicilin,

oxytetracycline dan kanamycin. Antibiotika yang sering dicampur kedalam pakan

adalah : Bacitracin, kuramisin, higromisin, kolistin, kiamisin, spiramisin, tiamulin,

tilosin, virginiamisin, avilamisin, enramisin, flavomisin (bambermisin), tetrasiklin

(Dirjen Peternakan 1990).

Penggunaan antibiotik yang terus menerus pada peternakan berakibat

buruk bagi ternak, munculnya mikroba target yang resisten antibiotik tetapi juga

mikroba lain yang memiliki habitat yang sama dengan mikroba target. Hal ini

dimungkinkan karena adanya transfer materi genetik (plasmid resisten) di antara

genus bakteri yang berbeda yang masih memiliki hubungan dekat, meliputi

bakteri E. coli, Klebsiella, dan Salmonela. Resistensi kolonisasi (colonization

resistance) adalah istilah yang menggambarkan imunitas alami yang diperoleh

manusia /hewan melalui keberadaan flora normal dalam saluran pencernaan

sehingga manusia/hewan akan terlindungi dari kolonisasi/infeksi mikroorganisme

dari luar tubuh (Naim 2007).

Enzim

Merupakan senyawa protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk

mempercepat reaksi pemecahan senyawa komplek menjadi sederhana yang

tersusun dari serangkaian asam amino dalam susunan yang teratur dan tetap

Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk

mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel

(Grisham et al 1999).

16

Enzim saat ini banyak dikembangkan sebagai bahan aditif mendampingi

probiotik seperti proteinase, amilase, selulase, xylanase, pectinase, lipase dan lain

sebagainya yang diberikan kepada ternak. Dalam tubuh makhluk hidup enzim

dapat diproduksi sendiri sesuai dengan kebutuhan, akan tetapi penambahan enzim

pada pakan kadang masih dibutuhkan. Hal ini disebabkan beberapa hal seperti

antinutrisi faktor pada bahan pakan (lekctins dan trypsin inhibitor), rendahnya

efesiensi kecernaan bahan pakan, dan ketidak tersediaan enzim tertentu dalam

tubuh ternak seperti xylanase dan ß-glucanase yang merupakan enzim untuk

meningkatkan daya cerna pada ternak monogastrik ( Sjofjan 2009)

Protease

Enzim protease merupakan biokatalisator untuk reaksi pemecahan protein

menjadi molekul yang sederhana seperti asam asam amino. Enzim ini akan

mengkatalisis reaksi hidrolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur air pada ikatan

spesifik substrat. Karena itu, enzim ini termasuk dalam kelas utama enzim

golongan hidrolase (Winarno 1983). Menurut Ward (1983) protease ialah enzim

yang sangat kompleks, mempunyai sifat fisiko kimia dan sifat katalitik yang

sangat bervariasi.

Protease dapat dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler dan

mempunyai peranan penting dalam metabolisme sel dan keteraturan proses dalam

sel. Berdasarkan letak pemecahan peptida protease dapat dibedakan atas dua

bagian, yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase memotong ikatan

peptida pada terminal amino atau karboksil dari substrat, sedangkan

endopeptidase memotong bagian tengah dari ikatan peptida (Ward 1983).

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mempoduksi enzim protease

ekstraseluler, yaitu enzim yang memecah protein yang diproduksi di dalam sel

kemudian di lepaskan keluar dari sel. Semua bakteri memiliki enzim protease di

dalam sel, tetapi tidak semua bakteri memiliki enzim protease ekstraseluler.

Bakteri proteolitik dapat digolongkan menjadi beberapa kelompok: (1).Bakteri

aerobik atau anaerobik fakultatif, tidak membentuk spora, misalnya Pseudomonas

dan Proteus, (2). Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif, membentuk spora,

17

misalnya Bacillus, (3). Bakteri anaerobik pembentuk spora, misalnya sebagian

spesies Clostridium ( Wikepedia 2006).

Amilase

Ezim yang menghidrolisis amilum menjadi molekul yang larut dalam air serta

mempunyai berat molekul yang rendah seperti glukosa. Anderson (1958) dan

Winarno (1983) mengelompokkan amilase ke dalam tiga golongan besar, yaitu

α-amilase, ß-amilase dan glukoamilase (amiloglukosidase). Enzim α–amylase

menghidrolisis ikatan -1.4 secara acak di bagian dalam (endoamilase) dan

enzim ß-amilase bekerja menghidrolisis ikatan -1.4 bagian ujung (eksoamilase).

Enzim glukoamilase (EC.3.2.1.3) atau sering disebut amiloglukoksidase atau

α-1,4-glukano glukohidrolase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu

menghidrolisis ikatan α-1.4 pada rantai amilosa, amilopektin, glikogen, dan

pullulan. Enzim glukoamilase juga dapat menyerang ikatan -1.6 pada titik

percabangan, walaupun dengan laju yang lebih rendah. Hal ini berarti bahwa pati

dapat diuraikan secara sempurna menjadi glukosa (Soebiyanto 1986;

DeMan 1997).

Amilum terbagi menjadi dua fraksi yaitu amilosa dan amilopektin yang

keduanya memiliki sifat yang berbeda secara fisik. Amilosa larut dalam air dan

mudah terhidrolisa dibandingkan dengan amilopektin. Amilosa merupakan hasil

kondensasi molekul-molekul glukosa yang terdiri dari 300 atau lebih molekul

-D glukosa, tersusun dalam bentuk rantai panjang yang lurus (Anderson 1958).

Molekul-molekul ini berhubungan satu dengan yang lainnya melalui ikatan

-1,4 D-glukosidik seperti pada gambar 1 .

Gambar 1 Struktur amilosa dengan ikatan -1.4 D-glukosidik(http://id.wikipedia.org/wiki/Amilosa)

18

Amilopektin (Gambar 2) merupakan polimer dari glukosa, yang

mengandung banyak rantai cabang yang terdiri dari 2000-3000 molekul glukosa

pada rantai lurusnya dan 24-30 unit glukosa pada rantai cabang utama

(Anderson 1958). Molekul molekul dari glukosa dihubungkan satu dengan yang

lainnya dengan ikatan -1.4 dan -1.6- D glikosidik (Meyer 1978; Bergman

1981)

Gambar 2 Struktur amilopektin dengan ikatan -1.4 dan -1.6- D glikosidik(http://id.wikipedia.org/wiki/Amilopektin)

Enzim -amilase termasuk kedalam enzim endoamilase yang kerjanya

menghidrolisis pati dari tengah-tengah rantai yang mengandung ikatan -1.4,

dengan menghasilkan dua molekul dextrin. Dextrin adalah suatu homopolimer

dari glukosa yang merupakan produk antara pada hidrolisa pati menjadi maltosa.

Enzim ß-amilase bekerja dari ujung rantai polimer (eksoamilase) menghasilkan

maltosa dan ß-limit dekstrin. Sama halnya dengan enzim -amilase, enzim

ß-amilase juga tidak dapat memutus rantai ikatan -1.6, pada molekul amilopektin,

sehingga degradasi amilopektin oleh enzim ini tidak sempurna, dekstrin yang

dihasilkan berupa ß-limit dekstrin yang memiliki berat molekul yang tinggi.

Enzim glukoamilase memecah polimer pati dari bagian luar (exoamilase),

yakni dari ujung rantai yang tidak bersifat mereduksi (Rose 1980; Winarno 1980),

Enzim ini memiliki keistimewaan dibandingkan dengan enzim -amilase dan

enzim ß-amilase karena enzim ini mampu memutuskan rantai polimer yang

mengandung ikatan glukosidik - 1.6 disamping - 1.3 dan -1.4 (Fogarty 1983).

Oleh karena itu hasil pemecahan polimer pati oleh enzim ini hanya berupa

19

molekul-molekul glukosa. Itulah sebabnya oleh Alagaratnam (1977) tahap

pemecahan ini disebut juga tahap sakarifikasi.

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling

besar, pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari

total enzim yang lainya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti

tanaman, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme

banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode

pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase

yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira 2004).

Lipase

Enzim lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi

dalam hidrolisis lemak, mono-, di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam

lemak bebas dan gliserol (Suzuki et al. 1988; Kosugi et al. 1990). Asam lemak

amat dibutuhkan dalam metabolisme mikroorganisme yang bersangkutan. Enzim

lipase bersifat konstitutif artinya terus-menerus diekspresi tanpa membutuhkah

induser. Ekspresi enzim lipase meningkat saat mikroorganisme memasuki fase

kematian karena jumlah produk lemak dari sel-sel yang mati meningkat

(Madigan et al. 2003).

Lipase memiliki potensi untuk memproduksi asam lemak, yang merupakan

prekursor berbagai industri kimia. Produksi asam lemak secara industri

menggunakan katalis kimia menghasilkan efek samping bagi lingkungan. Selain

itu enzim lipase telah banyak dikenal memiliki cakupan aplikasi yang amat luas

dalam bidang bioteknologi, seperti biomedikal, pestisida, pengolahan limbah,

industri makanan, biosensor, detergen, untuk industri kulit dan industri oleokimia

(memproduksi asam lemak dan turunannya) (Macrae 1983).

Selulase

Selulase adalah enzim penghidrolisa selulosa dengan memecah ikatan β-1.4-

D-glycosidic. Selulosa merupakan polimer rantai lurus glukosa yang tersusun atas

10.000 atau lebih unit-unit D-glucosa yang dihubungkan oleh ikatan 1,4-D-

glycosidic (Gambar 3). Karena ikatan ini menyebabkan selulosa sukar didegradasi

20

(Saxena dan Brown 2005). Ikatan ini hanya dapat dipecah oleh enzim selulase

yang hanya dapat disekresikan oleh mikroba selulolitik (Mc Donald et al. 2002).

Gambar 3 Struktur selulosa dengan ikatan β- (1,4)

Mikroba selulolitik pada umumnya akan mensekresikan tiga jenis enzim

selulase, yaitu endoglukanase atau carboxymethylcellulase (CMC-ase),

eksoglukanase, dan β-glukosidase (Cai et al. 1999; Beauchemin et al. 2003).

Proses degradasi selulosa pada prinsipnya melibatkan ketiga jenis enzim diatas

yang bekerja secara sinergis, yaitu endo- dan exo- 1.4-β-glucanase serta β-

glucosidase. (1) Endoglukanase, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, CMC-ase,

secara acak menghidrolisis bagian dalam 1.4-D-glycosidic dari glukosa. Hasil dari

reaksi ini adalah memendeknya polimer glukosa secara cepat yang diikuti dengan

meningkatnya gula reduksi secara perlahan-lahan; (2) Eksoglukanase, 1.4-β-D

glucan cellobiohydrolase, Avicelase, menghidrolisis rantai ujung selulosa yang

tidak tereduksi dengan selobiosa sebagai struktur primer; (3) β-glucosidase,

cellobiase, menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa (Robson dan

Chambliss, 1989). Enzim CMC-ase merupakan enzim pertama dalam sistem

enzim selulase sehingga tingkat aktivitasnya sangat menentukan dalam proses

degradasi selulosa (Hobson 1988; Ding et al. 2001; dan Chen et al. 2004).

Molase

Lebih dikenal dengan tetes tebu merupakan hasil samping dari proses

pembuatan gula tebu yang masih mengandung kadar gula sekitar 48-58 %

(Novita 2001). Meningkatnya produksi gula tebu Indonesia sekitar sepuluh tahun

terakhir ini akan meningkatkan produksi molase. Industri yang banyak

memanfaatkan molase seperti industri alkohol, bir, asam amino, sodium glutamat.

Unsur C merupakan unsur utama yang berperan dalam penyusunan sel-sel

bakteri, pada dasarnya semua mikroganisme memerlukan karbon sebagai sumber

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Institut Pertanian

Bogor (IPB) dari bulan Agustus 2008 – April 2009.

Bahan dan Alat

Kultur

Isolat bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan (duodenum, ileum dan

intestinum crasum) ayam broiler strain hybro tanpa diberi antibiotik. Bakteri

patogen yang digunakan untuk uji antagonis adalah Escheria coli asal ayam,

Salmonela subsp.2 asal ayam yang diperoleh dari Laboratorium Bakteriologi FKH,

dan EPHEC K1-1 koleksi Dr. dr. Sri Budiarti , Salmonela enteric koleksi dari

Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, IPB Bogor.

Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan adalah bahan untuk menumbuhkan

mikroorganisme meliputi nutrient broth (NB) dengan komposisi 8 g/l, trypticase

soy broth (TSB) dengan komposisi 30 g/l, De Man Ragosa sharpe (MRS) dan

tripton glucosa yeast ekstract (TGY). Media padat yaitu nutrient agar (NA) dan

trypticase soy agar (TSA) dengan menambahkan 15g/l bacto agar, dan untuk

media NA dan TSA semi solid ditambahkan 10 g/l bacto agar. Media MRS dan

TGY modifikasi yang mengandung molase, dan tepung kedelai (Lampiran 3).

Reagen untuk pewarnaan Gram yang meliputi kristal violet, garam yodium,

alkohol asseton, dan safranin gram, reagen pewarnaan spora terdiri dari malakit

hijau, safranin spora, aquades steril dan NaCl 0.85% (Lampiran 4).

Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas,

laminar air flow (LAF), inkubator, shaker, spektrofotometer, mikroskop,

hemasitometer, autoklaf, inkubator, penangas air bergoyang, timbangan analitis,

refrigerator, homogeniser, vortex, kuvet, pipet mikro, tip bunsen, ose, sentrifus,

pH meter, hot plate, pengaduk magnetik dan timbangan.

23

Metode

Penelitian ini meliputi isolasi kultur bakteri asal saluran pencernaan ayam,

pengujian aktivitas antagonis, identifikasi terhadap bakteri yang terpilih serta

optimasi aktivitas senyawa bioaktif dari bakteri terpilih terhadap pertumbuhan

bakteri patogen pada kondisi media, aerasi, pH dan suhu tertentu, serta uji

kualitatif amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulolitik.

Isolasi Bakteri Saluran Pencernaan Ayam

Isolasi bakteri asal saluran pencernaan ayam broiler strain hybro tanpa diberi

antibiotik dilakukan menurut metode F.Tomota (Lumyong et al. 2001 dalam

(Simarmata 2007). Saluran pencernaan ayam dicuci bersih, kemudian dilakukan

sterilisasi permukaan dengan cara merendam dalam etanol 70% selama 1 menit,

natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, kembali dengan etanol 70% selama 30

detik, kemudian saluran pencernaan dibilas dengan air steril beberap kali. Isolasi

dilakukan dengan mengambil saluran pencernaan pada bagian duodenum, ileum,

dan intestinum crassum seberat 1 gr dan dilarutkan dalam larutan pepton 1 % yang

mengandung 0.1% agar agar sebanyak 9ml. Larutan di vortex supaya homogen.

Kemudian dilakukan pengenceran berseri dari 10-1- 10-6 dengan aquades 9 ml

yang mengandung NaCl 0.85%.. Pada pengenceran 10-3 hingga10-6 diambil 100µ1

larutan dan disebar kecawan petri yang berisi media NA dengan pH 7.0 dan

media NA dengan pH 4.5, dengan menambahkan asam klorida 10%, dilakukan

secara duplo. Diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pertumbuhan koloni

diamati secara periodik.

Pemurnian Bakteri Hasil Isolasi

Koloni koloni yang tumbuh terpisah diambil dengan ose secara aseptis dan

dilakukan pemurnian dengan menggunakan metode kwadran. Metode ini akan

memisahkan sel dari koloni hingga jarak tertentu kemudian koloni yang benar

banar murni dapat diambil dan diletakkan pada agar miring. Kemudian mikrob

yang didapat dipindahkan atau ditransfer secara aseptis ke media nutrient broth

(NB) disebut subculturing atau peremajaan. Teknik ini sangat penting dan secara

rutin digunakan untuk membuat atau menyiapkan kultur stok yang diperlukan

dalam uji mikrobiologi.

24

Peremajaan Bakteri Target

EPEC K1-1 diremajakan pada media NA + 100 μg/ml ampisilin diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 370C. Satu koloni tunggal EPEC K1-1 dari media

NA+ampisilin diinokulasikan ke dalam media NB+100 μg/ml ampisilin. Biakan

ditumbuhkan pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama kurang lebih 2 jam.

E. coli diremajakan pada media NA dan ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu

370C. Satu koloni tunggal E. coli diinokulasikan ke dalam media NB, diinkubasi

pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama 24 jam. Salmonella enteric dan

Salmonella subsp.2 asal ayam diremajakan pada media TSA selama 24 jam pada

suhu 370C. Satu koloni tunggal Salmonella enteric dan Salmonella subsp.2 asal

ayam pada media TSA diinokulasikan ke dalam media TSB. Sel ditumbuhkan

pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama 24 jam. Bakteri bakteri target ini

untuk uji antagonis.

Uji antagonis langsung bakteri asal saluran pencernaan ayam terhadapEPEC K1-1, Salmonella enteric dan E. coli asal ayam serta Salmonellasubsp.2 asal ayam.

Isolat diuji aktivitas penghambatannya terhadap EPEC K1-1, E. coli,

Salmonela subsp.2, Salmonella enteric dengan menggunakan metode agar double

layer (Lisboa et al. 2006). Bakteri target yang sudah diremajakan diinokulasikan

sebanyak 100 μl ke dalam 10ml media NA/TSA 50% dengan konsentrasi minimal

106 sel/ ml. Media tersebut dituangkan pada NA/TSA 100% padat (cawan

overlay). Setelah media memadat, isolat terpilih diinokulasikan dan diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 370C. Pengamatan dilakukan terhadap koloni bakteri

yang mampu membentuk zona bening. Isolat isolat yang mampu membentuk zona

bening akan diidentifikasi.

Identifikasi / Karakterisasi Isolat Bakteri

Penentuan karakteristik morfologi bakteri asal saluran pencernaan ayam

secara mikroskopis dilakukan dengan pengamatan sel dan pewarnaan Gram

(Hadioetomo 1993). Bakteri yang merupakan Gram positif kemudian dilakukan

kemampuan pembentukan spora dengan pewarnaan malachite green dan safranin

(Hadioetomo1993). Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda

dapat tampak serupa. Karena itu diperlukan uji uji fisiologis seperti uji katalase.

25

Dan untuk identifikasinya mengacu pada Bergeys Manual of Determinative

Bacteriology (Krig dan Holt. 1984).

Esei Antagonis Isolat Terpilih Terhadap Pertumbuhan E. coli, Salmonellasubsp.2, EPEC K1-1, Salmonella enteric dengan Metode Kirby-Bauer

Uji antagonis isolat terpilih dilakukan terhadap bakteri EPEC K1-1, E. coli,

Salmonela subsp.2, Salmonella enteric dengan menggunakan filtrat kultur.

Pengujian dilakukan untuk mengetahui aktivitas filtrat kultur isolat terpilih

terhadap bakteri target. Media NA semi padat berisi 100μl biakan bakteri patogen

(E. coli, Salmonela sp., Salmonella enteric, EPEC K1-1.) dengan konsentrasi

minimal 106 sel/ml dituangkan ke dalam media NA padat (cawan overlay). Setelah

seluruh media memadat, kertas cakram berdiameter delapan mili meter diletakkan

diatas media dengan sedikit ditekan dan pada masing masing kertas cakram

ditetesi sebanyak 15 μl filtrat kultur dari isolat bakteri terpilih. Inkubasi dilakukan

selama 24 jam pada suhu 370C. Parameter yang diamati adalah kemampuannya

membentuk zona bening. Besarnya diameter zona bening yang dihasilkan

berdasarkan diameter seluruh zona yang terbentuk dikurangi dengan diameter

cakram kertas.

Optimasi Produksi Senyawa Bioaktif

Optimasi pertama dilakukan terhadap media, aerasi dan waktu produksi

Isolat terpilih diremajakan pada media pertumbuhan. Kultur isolat terpilih

diinokulasikan dalam media produksi. Optimasi dilakukan terhadap dua media

yaitu De Man Ragosa (MRS) dan Tripton Glucosa Yeast ekstratc (TGY) dengan

agitasi (100 rpm) dan tanpa agitasi. Media yang didapat dioptimasi waktu

produksi yang terbaik dengan waktu produksi 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 96 jam.

Media terbaik yang didapat dimodifikasi dengan mengganti sumber karbon dan

nitrogen dengan molase dan soybean meal (MRS modifikasi dan TGY modifikasi).

Optimasi kedua yaitu optimasi terhadap suhu, yang bertujuan untuk

mengetahui suhu optimum terhadap aktivitas antibakteri dalam menghasilkan

penghambatan pertumbuhan bakteri target. Filtrat kultur dari isolat yang

diisolasikan pada media produksi modifikasi diinkubasi pada lima tingkatan suhu

(270, 300 , 370

, 400, 500 C), diujikan aktivitasnya terhadap E. coli, Salmonella

subsp.2, EPEC K1-1, Salmonella enteric, diukur zona hambat yang dihasilkan.

26

A=Ø zona bening dan B= Ø isolat.

Optimasi ketiga terhadap pH. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui

pengaruh media, suhu dan pH optimum terhadap aktifitas antimbakteri dalam

menghasilkan penghambatan pertumbuhan empat bakteri patogen. Pada tahap ini

isolat terpilih ditumbuhkan pada media terbaik pada tujuh tingkatan pH yang

berbeda yaitu 3.0 ,4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, diinkubasi pada suhu terbaik

(optimum). Filtrat kultur (supernatan) dari isolat yang ditumbuhkan pada pH yang

berbeda, diantagoniskan dengan empat bakteri target, diukur zona bening yang

dihasilkan.

Uji Kualitatif Aktivitas Amilase, Protease, Lipase, Selulase

Kemampuan amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulolitik isolat terpilih

diuji secara kualitatif. Untuk uji amilase media nutrient agar ditambah 1% soluble

starch, setelah itu isolat terpilih (7n, 25n, 27n, 34n) diinokulasikan, diinkubasi

selama dua hari. Zona bening akan terlihat setelah ditetesi kalium iodida (KI) 3%.

Adanya zona menunjukkan adanya aktivitas amilase. Zona yang terdapat disekitar

koloni diukur diameternya begitu juga diameter koloni untuk menghitung indeks

amilase yang dihasilkan.

Uji protease menggunakan media NA ditambah susu skim 1% dan

disterilkan pada suhu 1100 selama 15 menit. Isolat terpilih diinokulasikan,

diinkubasi selama dua hari, adanya zona menandakan isolat menghasilkan

protease. Zona bening yang dihasilkan diukur untuk untuk menentukan indeks

proteasenya.

Uji lipase dengan menggunakan media NA ditambah tween 80 1% dan

disterilkan, kemudian diinokulasikan isolat 7n, 25n, 27n, 34n. Diinkubasi selama

dua hari, aktivitas lipase ditandai oleh adanya zona bening disekitar koloni bakteri.

Untuk uji selulase media NA ditambah carboximetil celulase (CMC) 1%

dan disterilkan. Isolat terpilih diinokulasikan dan diinkubasi selama dua hari.

Zona bening akan terlihat dengan ditambahkannya Congo red dan NaOH 10% ke

media. Nilai indeks amilase, protease, lipase cellulase dihitung dengan persamaan:

A BBI

21

energi untuk aktivitasnya. Molase telah banyak digunakan sebagai bahan

pembuatan media produksi mikroba dalam skala besar. Komposisi kimia molase

menurut Paturau (1982) terdiri dari sukrosa 35%, glukosa 7%, gula pereduksi 3%,

karbohidrat lain 4% serta abu 12 %.

Tepung Kedelai

Tepung kedelai dapat digunakan sebagai sumber nitrogen bagi pertumbuhan

bakteri. Menurut Sukmadi (1996) diacu dalam Suryanti (1998), tepung kedelai

(Soybean meal) mengandung 34.8% karbohidrat, 42% protein dan 19-20% lemak

(lampiran 2). Kandungan nutrisi lain adalah vitamin A, vitamin B6, vitamin B12,

vitamin C, vitamin K, Kalsium, zat besi, magnesium, fosfor, kalium, dan seng.

Protein pada kedelai tersusun oleh sejumlah asam amino: arginin, lisin, glisin,

niasin, leusin, treonin, triptofan, fenilalanin (Anonim 2008).

Unsur C, N, P merupakan tiga nutrisi utama (makro nutrien) yang

dibutuhkan oleh bakteri dalam melakukan metabolisme sel untuk menghasilkan

senyawa senyawa yang penting dalam pertumbuhan bakteri nitrogen dan fosfor

merupakan bahan penyusun senyawa-senyawa penting dalam sel yang

menentukan aktivitas pertumbuhan mikrooganisme.

Rasio C:N yang tinggi (kandungan unsur N yang relatif rendah) akan

menyebabkan proses pertumbuhan berlangsung lebih lambat karena nitrogen

akan menjadi faktor penghambat (growth-rate limiting factor) (Alexander 1994).

Unsur N memiliki peranan yang sangat penting dalam penyusunan asam nukleat,

asam amino dan enzim-enzim. Sedangkan unsur P berperan dalam pembentukan

asam nukleat dan fosfolipid. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa rasio C:N:P

optimum untuk pertumbuhan mikroba adalah 100:10:1 (Shewfelt et al. 2005).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam Broiler

Isolasi yang dilakukan lebih ditujukan pada bakteri kelompok non asam

laktat, karena bakteri dari golongan ini masih jarang diteliti. Media yang

digunakan untuk isolasi adalah media nutrient agar (NA) yang bersifat umum

sehingga memungkinkan diperolehnya beragam kelompok bakteri yang terisolasi.

Ayam broiler yang digunakan dalam penelitian ini tidak diberikan antibiotik

dalam makanannya supaya didapatkannya banyak ragam mikroorganisme yang

terdapat dalam saluran pencernaan. Hasil isolasi bakteri asal saluran pencernaan

ayam broiler tersebut diperoleh 72 isolat bakteri terdiri dari 38 isolat yang tumbuh

pada media NA dengan pH 7.0 (Lampiran 5) dan 34 isolat yang tumbuh pada

media NA dengan pH 4.5 (Lampiran 6). Penggunaan media dengan pH 4.5 untuk

isolasi dimaksudkan untuk memberikan kondisi asam yang menyerupai kondisi

dalam saluran pencernaan ayam yang rata rata berkisar pada pH 4.5. Diperolehnya

bakteri yang mampu tumbuh pada pH 4.5 menunjukkan bahwa bakteri itu tahan

terhadap kondisi lingkungan asam pada saluran pencernaan. Keberhasilan

mendapatkan isolat bakteri yang cukup banyak dari saluran pencernaan ayam

broiler ini kemungkinan disebabkan ayam yang digunakan sebagai sampel adalah

ayam broiler strain Hybro yang tidak diberi antibiotik, sehingga populasi

bakterinya masih cukup tinggi.

Bagian dari saluran pencernaan yang paling banyak dihuni oleh milyaran

mikroba adalah saluran usus, dan mikroba dalam saluran pencernaan tersebut

berperan bagi kesehatan. Saluran pencernaan ayam yang baru menetas sebetulnya

dalam keadaan steril, ketika berhubungan dengan dunia luar berbagai tipe mikroba

masuk ke dalam tubuh baik lewat makanan atau kontak dengan lingkungan.

Mikroorganisme itu akan tinggal pada saluran pencernaan sampai makhluk hidup

itu mati. Berdasarkan kenyataan tersebut isolasi bakteri asal saluran pencernaan

ayam perlu guna mendapatkan beragam bakteri yang mampu menghambat

pertumbuhan bakteri patogen dan dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai

makanan imbuhan pakan (feed additive) untuk memacu pertumbuhan ayam.

Dalam saluran pencernaan mahkluk hidup tedapat terdapat bakteri jahat dan

bakteri baik. Keseimbangan antara kedua jenis mikroba dalam saluran pencernaan

28

penting bagi kehidupan yang sehat. Dimana keseimbangan itu terjadi apabila

komposisinya 85% bakteri baik dan 15% bakteri jahat (Sjofjan 2009). Tingginya

mikroflora yang baik dapat merangsang terbentuknya senyawa-senyawa

antimikrobial seperti asam lemak bebas dan zat zat asam sehingga tercipta

lingkungan kurang nyaman bagi pertumbuhan bakteri patogen. Beberapa bakteri

saluran pencernaan yang baik seperti Eubacterium, Lactobacillus, dan bakteri

jahat seperti Clostridium, Shigella, Veilonella terdapat di dalam saluran

pencernaan ayam.

Bagian saluran pencernaan yang digunakan untuk isolasi bakteri antara lain

daerah duodenum, ileum dan intestinum crasum. Bakteri hasil isolasi berdasarkan

bagian saluran pencernaan terlihat seperti tabel 2.[

Tabel 2 Hasil Isolasi Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam Broiler

Bagian Saluran Pencernaan pH Media Isolasi Total

4.5 7.0

Duodenum 3 8 11

Ileum 7 8 15

Intestinum crasum 22 24 46

Jumlah 34 38 72

Pada tabel terlihat bakteri yang ditemukan pada duodenun sebelas isolat

terdiri dari tiga isolat dari pH 4.5 dan delapan isolat dari pH 7.0. Pada bagian

duodenum isolat bakteri yang diperoleh lebih sedikit dibandingkan saluran

pencernaan yang lain. Keadaan ini diduga berkaitan dengan letak saluran

pencernaan yang dekat dengan proventriculus yang mempunyai pH<3.0 dan

disekresikannya garam empedu kedalam duodenum dari pangkreas. Duodenum

berfungsi menyelenggarakan pencernaan protein dan lemak, sehingga lingkungan

yang sedikit asam ditambah adanya garam empedu berfungsi untuk mengaktifkan

enzim pepsinogen (Anonim 2007). Adanya bakteri yang terisolasi asal duodenum

diduga bakteri itu mampu bertahan pada lingkungan asam dan garam empedu.

Pada lingkungan pH yang sangat rendah (pH dibawah 3.0) umumnya bakteri akan

mati tetapi sebagian bakteri ada yang mampu bertahan dengan membentuk spora

sehingga pada pH 4.5 bakteri itu mulai tumbuh kembali dan berkolonisasi, ini

terlihat pada pH 4.5 diperoleh tiga isolat sementara pada pH 7.0 diperoleh delapan

isolat.

29

Ileum merupakan bagian usus kecil yang berfungsi sebagai tempat

penyerapan zat makanan (Anonim 2007). Diduga dengan pH yang hampir sama

dengan doudenum dan tidak disekresikannya garam empedu pada saluran ini

menyebabkan bakteri yang mengalami kolonisasi lebih banyak dibandingkan pada

duodenum. Dinding ileum berbentuk jonjot jonjot sesuai dengan fungsinya

sebagai tempat penyerapan zat makanan. Kondisi pH pada ileum dipengaruhi oleh

zat zat dari luar tubuh, dan zat sekretori yang dihasilkan dinding saluran

pencernaan, serta letaknya yang jauh dari proventriculus membuat pH pada

saluran ini tidak terlalu asam. Isolat bakteri yang diperoleh pada bagian saluran

pencernaan ini ada 15 isolat yang terdiri dari tujuh isolat yang tumbuh pada pH

4.5 dan delapan isolat yang tumbuh pada pH 7.0.

Intestinum crasum atau usus besar merupakan bagian saluran pencernaan

paling ujung, dekat dengan kloaka. Banyaknya isolat bakteri ditemukan pada

bagian saluran pencernaan ini adalah 46 isolat, terdiri dari 22 isolat pada pH 4.5

dan 24 isolat pada pH 7.0. Intestinum crasum fungsinya tempat mencerna sisa

pencernaan oleh miroorganisme menjadi feses dan tempat penyimpanan sisa

pencernaan (Anonim 2007). Berdasarkan fungsi yang demikian menyebabkan

banyak mikroorganisme mampu berkolonisasi di tempat ini, didukung pula

dengan kondisi pH yang yang sudah mendekati normal (pH 7.0) serta banyaknya

sisa pencernaan yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi mikroba.

Bakteri bakteri itu akan berkolonisasi dan membentuk mikroekosistem yang

bermanfaat untuk kesehatan (Drassar dan Barrow 1985).

Mikroekosistem dalam saluran pencernaan hewan monogastrik seperti ayam

komponennya terdiri atas komponen biotik dan abiotik. Biotik terdiri dari

bermacam macam jenis mikroba baik yang menguntungkan maupun yang

merugikan. Abiotik terdiri dari zat zat yang berasal dari bahan luar yang berupa

pakan dan dari dalam tubuh (endogeneus) yaitu produk metabolisme yang harus

dibuang. Mikroflora detrimental umumnya akan sangat aktif merombak zat yang

terdapat dalam usus besar dan hasil akhirnya adalah metabolit yang bersifat toksik

(beracun), karsinogenik (menyebabkan kanker) atau metagenik (membentuk gas

metan) (Hasono 2002). Metabolit ini sering menyebabkan kerusakan mukosa usus

bahkan membentuk tumor atau beberapa penyakit lain. Dalam kaitan ini bakteri

30

baik akan mendesak atau mengencerkan senyawa aktif diatas dan merubah zat

toksik menjadi zat yang tidak toksik, dengan cara membuang zat zat yang akan

menyusun toksik terlebih dahulu sehingga tidak dapat membentuk zat toksik.

Dalam hal ini proporsi bakteri baik ditingkatkan dan bakteri jahat ditekan

jumlahnya. Dengan mengkonsumsi bakteri baik (probiotik) dan menyediakan

nutrisi (prebiotik) yang sesuai untuk bakteri probiotik agar dalam usus terjadi

perkembangan bakteri baik lebih pesat (Karyadi 2003) sehingga pertumbuhan

ayam dapat ditingkatkan.

Penggunaan probiotik pada ternak unggas bertujuan memperbaiki saluran

pencernaan dengan cara: (1) menekan reaksi pembentukan racun dan metabolit

yang bersifat karsinogenik (penyebab kanker), (2) merangsang reaksi enzim yang

dapat menetralisir senyawa beracun yang tertelan atau dihasilkan oleh saluran

pencernaan, (3) merangsang produksi enzim (enzim protease dan alfa-amilase)

yang digunakan untuk mencerna pakan, (4) memproduksi vitamin dan zat zat

yang tidak terpenuhi dalam tubuh (Seifert dan Gessler 1997). Menurut

Sartika et al. (1994) penggunaan probiotik dapat memperbaiki performance ayam

broiler meliputi rataan bobot hidup, konversi pakan dan menurunkan mortalitas.

Pemurnian isolat bakteri asal saluran pencernaan ayam dilakukan dengan

metode kwadran dengan menggunakan media yang sama dengan media isolasi

yaitu nutrient agar (NA). Isolat murni yang diperoleh selanjutnya diuji ke bakteri

target guna menseleksi bakteri bakteri yang mempunyai kemampuan

penghambatan terhadap patogen. Sebagai kultur induk, isolat juga disimpan dalam

media penyimpanan yang disimpan pada suhu 4°C.

Peremajaan Bakteri Target.

EPEC K1-1, E. coli asal ayam, Salmonella enteric, dan Salmonella subsp.2

asal ayam adalah bakteri penyebab penyakit (patogen) pada manusia dan juga

pada ayam, sehingga bakteri-bakteri asal saluran pencernaan ayam perlu diuji

aktivitasnya terhadap keempat patogen untuk mengetahui kemampuan

penghambatannya terhadap patogen tersebut. Isolat EPEC K1-1 memiliki

pertumbuhan yang sangat cepat dibandingkan E. coli umumnya, pada jam ke-3

isolat ini sudah mencapai jumlah sekitar 108 sel/ml (OD 0,32; λ= 620nm).

Peremajaan EPEC K1-1 pada media NA+ampisilin 100μg/ml dimaksudkan untuk

31

menjaga resistensinya. Isolat E. coli diremajakan pada media NA selama 24 jam

untuk mencapai jumlah sel 108 sel/ml (OD 0,924 ; λ= 620nm). Isolat Salmonella

enteric diremajakan pada media TSA selama 24 jam (OD 1.328; λ=620nm), dan

Salmonella subsp.2 diremajakan pada media TSA selama 24 jam (OD 1.507;

λ=620nm).

Kemampuan Penghambatan Bakteri Asal Saluran Pencernaan AyamTerhadap EPEC K1-1, Salmonella enteric dan E. Coli Asal Ayam sertaSalmonella subsp.2 Asal Ayam.

Hasil uji antagonis langsung dari 72 isolat hasil isolasi terhadap empat

bakteri target (EPEC K1-1 penyebab diare pada anak anak, E. coli asal ayam yang

menyebabkan kolibasilosis pada ayam, Salmonella subsp.2 asal ayam dan

Salmonella enteric penyebab salmonellosis pada ayam dan manusia). Kemampuan

penghambatan isolat hasil isolasi terhadap keempat target terlihat dalam tabel 3.[

[

Tabel 3 Aktivitas penghambatan bakteri asal saluran pencernaan ayam broilerterhadap E.coli, EPEC K1-1,Salmonella enteric

E.coli EPEC K1-1 S.entericBagian Saluran Pencernaan

pH4.5

pH7

total pH4.5

pH7

total pH4.5

pH7

total

Duodenum 1 1 2 - 1 1 1 1 2

Ileum 3 4 7 1 - 1 4 - 4

Intestinum crasum 8 13 21 5 12 17 9 6 15

Jumlah 12 18 30 6 13 19 14 7 21

Untuk aktivitas penghambatan terhadap E. coli, diperoleh 30 isolat yang

menghasilkan zona bening disekitar koloninya. Terdiri dari 18 isolat yang berasal

dari media pH 7.0 yaitu isolat: 7n, 8n, 9n, 10n, 12n, 13n, 15n, 17n, 19n, 20n, 21n,

22n, 24n, 25n, 26n, 27n, 34n, 38n, dan 12 isolat yang berasal dari media pH 4.5

yaitu isolat 5a, 6a, 7a, 20a, 21a, 22a, 25a, 26a, 27a, 28a, 29a, 30a. Isolat bakteri

yang tumbuh pada media pH 7.0 dan 4.5 hampir sama banyak yang mampu

menghambat E.coli. Berdasarkan daerah isolasi ditemukan bakteri yang paling

banyak menghambat E.coli pada bagian inestinum crasum. Diduga karena pH

saluran pencernaan ini mendekati normal sehingga banyak bakteri yang dapat

berkolonisasi, ditambah banyaknya nutrisi yang terdapat dalam saluran ini.

Aktivitas penghambatan terhadap EPEC K1-1 diperoleh 19 isolat. Terdiri

dari 13 isolat yang berasal dari media pH 7.0 (17n, 18n, 19n 20n, 21n, 23n, 24n,

32

25n, 26n, 27n, 28n, 35n) dan 6 isolat yang tumbuh pada media pH 4.5 (25a, 28a,

29a, 30a, 33a, 34a). Ini mengindikasikan bahwa bakteri bakteri yang tumbuh pada

lingkungan netral banyak yang dapat menghambat pertumbuhan EPEC K1-1,

sedangkan bakteri yang tumbuh pada lingkungan asam tidak sebanyak pada

pH 7.0. Berdasarkan asal isolat maka bakteri yang mampu menghambat

EPEC K1-1 banyak berasal dari intestunum crassum. Pada bagian duodenum dan

ileum masih ditemui bakteri dalam jumlah yang sangat sedikit.

Aktivitas penghambatan terhadap Salmonella enteric diperoleh 21 isolat

yang terdiri dari tujuh isolat berasal dari media pH 7.0 yaitu isolat 15n, 16n, 17n,

21n, 25n, 27n, 37n dan 14 isolat berasal dari media pH 4.5 yaitu isolat 2a, 4a, 5a,

7a, 11a, 16a, 17a, 18a, 22a, 27a, 29a, 30a, 31a, 32a. Isolat bakteri yang tumbuh

pada pH 4.5 lebih banyak yang mampu menghambat Salmonella enteric

dibandingkan isolat yang tumbuh pada pH 7.0. Ini diduga karena Salmonella

dapat tumbuh pada pH 3.6-9.5, sehingga pada pH 4.5 aktivitas penghambatan juga

lebih banyak. Berdasarkan asal daerah isolasi, bagian intestinum crasum diperoleh

isolat bakteri lebih banyak karena bagian saluran ini mempunyai suhu, pH, dan

nutrisi yang sesuai bagi mikroorganisme. Isolat bakteri yang mempunyai aktivitas

penghambatan terhadap bakteri target diatas merupakan isolat yang potensial

untuk dikembangkan menjadi probiotik dalam mengendalikan penyakit seperti

salmonelosis dan kolibasilosis. Untuk itu dipilih bakteri dengan aktivitas

penghambatan yang bagus sebagai calon isolat terpilih.

Identifikasi Bakteri Asal Saluran Pencernaan Ayam Broiler

Untuk memilih bakteri sebagai isolat terpilih dilakukan uji lanjut. Dimana

isolat isolat yang mempunyai aktivitas bagus terlebih dahulu diidentifikasi.

Morfologi koloni dan bentuk sel diobservasi secara mikroskopis terhadap 19 isolat

yang mempunyai aktivitas penghambatan yang bagus terhadap EPEC K1-1,

E. coli asal ayam, Salmonella subsp.2 asal ayam dan Salmonella enteric.

Pinggiran koloni ditemukan ada yang bergerigi dan ada yang licin, dengan

permukaan yang rata dan yang seperti kawah. Morfologi sel secara mikroskopis

menunjukkan bentuk kokus 11 isolat yaitu isolat 17n, 28n, 2a, 4a, 5a, 7a, 11a, 16a,

17a, 22a, 30a dan bentuk basil (batang) 8 isolat yaitu isolat 7n, 8n, 17n, 25n, 27n,

34n, 18a, 33a.

33

Bakteri yang berbentuk batang, Gram positif dan non patogen dapat dipilih

sebagai probiotik (Panigraphy, Ling 1990; Natalia, Priadi 2005). Berdasarkan

kriteria tersebut diperoleh 5 isolat yang tergolong bentuk batang dan Gram positif

yaitu isolat 7n, 8n, 25n, 27n, dan 34n (Gambar 4 dan 5).

(a) (b)

Gambar 4 Hasil pewarnaan Gram a (isolat 7n) diisolasi dari jejenum, (isolat 25n)diisolasi dari intestinum crasum ayam broiler berbentuk batang(perbesaran 40 x 100).

(a) (b)Gambar 5 Hasil pewarnaan Gram a (isolat 27n) b (isolat 34n) diisolasi dari

intestinum crasum ayam broiler berbentuk batang gram positif(perbesaran 40 x 100).

Gram positif dapat dilihat dari warna sel yang ungu. Terbentuknya warna

ungu karena komponen utama penyusun dinding sel bakteri Gram positif adalah

peptidoglikan, sehingga mampu mengikat warna kristal ungu. Kandungan lipid

pada dinding selnya rendah, sehingga pada waktu diberikan etanol dinding sel

Gram positif terdehidrasi, pori pori mengecil, permeabilitas berkurang dan zat

warna kristal ungu tidak dapat terekstraksi dan terperangkap di dalam dinding sel.

Bakteri Gram negatif memiliki peptidoglikan yang tipis dan mengandung

lipid, lemak dalam persentase yang lebih tinggi. Pada perlakuan dengan etanol

34

(alkohol) menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga pori pori pada

peptidoglikan cukup besar memperbesar daya rembes atau permiabilitas dinding

sel. Sehingga kompleks ungu kristal-yodium yang telah memasuki dinding sel

selama langkah awal pewarnaan dapat diekstraksi. Bakteri ini akan kehilangan

warna ungu kristal. Ketika diberi warna safranin maka warna ini akan diserap.

Warna bakteri Gram negatif akan terlihat merah muda, merupakan warna dari

safranin (Pelzar dan Chan 1986)

Bakteri berbentuk batang dan Gram positif selanjutnya diteliti

kemampuannya dalam membentuk spora dan letak sporanya dengan pewarnaan

spora (Gambar 6 dan 7).

(a) (b)Gambar 6 Hasil pewarnaan spora (isolat 7n), b (isolat 25n) diisolasi dari

intestinum crasum ayam broiler (perbesaran 40 x 100)

(a) (b)Gambar 7 Hasil pewarnaan spora (a) isolat 27n, (b) isolat 34n diisolasi dari

intestinum crasum ayam broiler (perbesaran 40 x 100)

Hasil pewarnaan spora pada bakteri Gram positif menunjukkan bahwa isolat 7n,

25n, 27n, dan 34n memiliki endospora sementara isolat 8n tidak berspora. Bakteri

yang berspora ini diambil sebagai isolat bakteri terpilih. Spora merupakan bentuk

Selvegetatif endospora

Selvegetatif

Selvegetatif

endospora

endospora

endospora

Selvegetatif

35

adaptasi sel terhadap lingkungan yang tidak menguntungkan. Pada kondisi yang

sesuai akan berkecambah dan menghasilkan sel yang sama seperti asalnya. Spora

yang terdapat pada isolat 7n, 25n, 27n, 34n terletak didalam (endospora). Letak

endoporanya isolat 7n, 27n dan 34n di bagian dekat ujung (sub terminal) dan

isolat 25n bagian tengah (sentral). Bakteri yang memiliki endospora biasanya dari

kelompok Bacillus dan Clostridium, hanya saja Bacillus bersifat aerob/anaerob

fakultatif, Clostridium bersifat anaerob.

Endospora bakteri mengandung sejumlah asam dipikolinat yaitu suatu

substansi yang tidak terdeteksi pada sel sel vegetatif. Lima-sepuluh persen berat

kering endospora adalah asam dipikolinat. Sejumlah kalsium juga terdapat dalam

endospora, sehingga diduga lapisan korteks endospora terdiri dari kompleks

Ca2+-asam dipikolinat-peptidoglikan. Spora sangat resisten terhadap beragam

kondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan kekeringan

serta terhadap bahan kimia. Spora bakteri dapat bertahan misalnya pada

lingkungan pH rendah (asam), suhu tinggi atau rendah.

Untuk menentukan golongan apa isolat bakteri terpilih dilakukan uji

katalase. Hasil uji katalase terhadap 4 (empat) isolat terpilih yang ditumbuhkan

pada media nutrient agar yang diinkubasi selama 24 jam menunjukkan adanya

gelembung gelembung putih (gas oksigen) setelah koloni bakteri ditetesi larutan

H2O2 3%. Keempat isolat bakteri terpilih tersebut digolongkan pada bakteri

katalase positif (Tabel 4).

Tabel 4 Hasil uji katalase isolat 7n, 25n, 27n, 34n

Isolat Uji Katalase (+/-)

7n +

25n +

27n +

34n +

Katalase adalah suatu enzim yang dapat ditemukan dalam sebagian besar

bakteri. Bakteri katalase positif akan menghasilkan gas oksigen sebagai hasil

reaksi penguraian hidrogen peroksida oleh enzim katalase dan membebaskan gas

oksigen dan molekul air sesuai reaksi berikut:

2H2O2 + katalase 2H2O2 + O2

36

Hidrogen peroksida (H2O2) diproduksi oleh enzim pernafasan yang bersifat racun

bagi organisme yang memproduksinya, maka enzim katalase akan sangat penting

peranannya dalam menguraikan zat yang bersifat racun bagi sel menjadi molekul

air dan oksigen yang tidak bersifat racun bagi sel.

Keempat isolat terpilih (7n, 25n, 27n, 34n) diduga bersifat anaerob

fakultatif karena bersifat katalase positif dan terdapat dalam saluran pencernaan

ayam yang tidak ada oksigen. Didalam saluran pencernaan ternak secara umum

jumlah bakteri anaerobik lebih besar di banding bakteri anaerobik fakultatif

dengan perbandingan 1000:1 (Utomo 2002). Didapatkannya bakteri anaerob

fakultatif merupakan hal yang sangat menguntungkan karena dapat diproduksi

dengan mudah untuk digunakan sebagai probiotik, sehingga mudah pula

mengadakan kolonisasi untuk membentuk mikroekosistem yang bermanfaat untuk

kesehatan.

Berdasarkan ciri ciri yang dimiliki dan mengacu pada Bergeys Manual of

Determinative Bacteriology (Krieg dan Holt 1984) bahwa isolat 7n, 25n, 27n, dan

34n berbentuk batang, Gram positif, menghasilkan endospora berbentuk oval serta

bersifat katalase positif, isolat tersebut dapat digolongkan kedalam genus Bacillus.

Ciri ciri Bacillus menurut Gordon (1989) sel vegetatif berbentuk batang,

membentuk endospora, dan bersifat katalase positif. Bacillus adalah salah satu

genus bakteri yang berbentuk batang dengan tingkatan takson sebagai berikut:

Kingdom: Bacteria

Divisi : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Didapatkannya bakteri dari kelompok Bacillus ini merupakan hal yang

positif karena bakteri ini secara alami terdapat di mana-mana, dan termasuk

spesies yang hidup bebas atau bersifat patogen. Pada kondisi cekaman

lingkungan, sel-selnya menghasilkan endospora berbentuk oval yang dapat

bertahan dalam periode yang lama. Bacillus lebih adaptif terhadap perubahan

37

lingkungan, jika lingkungan menguntungkan spora berkembang kembali menjadi

sel vegetatif. (Madigan et al. 2003).

Menurut Haddadin et al. (1996); Jin et al. (1996) hasil analisa proksimat

Bacillus spp. kering mengandung protein 11.10%, air 8.3%, abu 0.002%, lemak

0.78% serta serat kasar 0.23 %. Bakteri kelompok asam laktat tidak ditemukan

dalam isolasi ini, karena dalam isolasi tidak menggunakan medium spesifik untuk

bakteri asam laktat.

Esei Antagonis Isolat Terpilih terhadap Pertumbuhan E. coli, Salmonellasubsp.2, EPEC K1-1, Salmonella enteric dengan Metode Kirby-Bauer

Hasil esei antagonis filtrat kultur (ekstrak kasar) isolat terpilih (7n, 25n, 27n,

34n) terhadap EPEC K1-1, E. coli, Salmonella enteric, dan Salmonella subsp.2

terlihat pada tabel 5.

Tabel 5 Hasil uji penghambatan ekstrak kasar isolat 7n, 25n, 27n, 34n terhadapEPEC K1-1, E. coli, Salmonella enteric, dan Salmonella subsp.2

[

Isolat Diameter Penghambatan (mm)

EPEC K1-1 E.coli S.enteric Salmonella subsp 2

7n 24 14 23 9

25n 14 23 14 19

27n 19 23 14 14

34n 6 9 9 2

Dari tabel terlihat bahwa keempat isolat terpilih mampu menghambat

empat bakteri target. Isolat 7n merupakan isolat terbaik dalam menghambat

EPEC K1-1 dan S. Enteric diikuti isolat 27n, 25n dan 34n. Aktivitas

penghambatan ditandai dengan adanya zona bening disekitar cakram kertas Ф

8mm (Gambar 8 dan 9). Pada gambar (8a) terlihat zona bening yang dihasilkan

oleh keempat isolat dalam menghambat EPEC K1-1. Isolat 7n (24mm) dan 27n

(19mm) diikuti isolat 25n (14mm) dan 34n (6mm). Sementara untuk kontrol

ditetesi media NB steril ternyata tidak ada zona yang dihasilkan setelah

diantagonis dengan EPEC K1-1. Pada gambar (8b) uji antagonis dengan E. coli

isolat 25n dan 27n (23mm) menghasilkan zona yang lebih terang dan hampir sama

besar, sementara isolat 7n (14mm) dan isolat 34n zona (9mm) yang dihasilkan

lebih kecil. Kontrol tidak ada zona yang dihasilkan.

38

[[

[[

(a) (b)

Gambar 8 Aktivitas penghambatan isolat terpilih terhadap bakteri target(a) EPEC K1-1, (b) E.coli Ф cakram kertas 8mm

Adanya zona disekitar cakram kertas mengindikasikan bahwa filtrat kultur

dari keempat isolat mengandung senyawa anti bakteri yang mampu menghambat

EPEC K1-1 dan E.coli. Daya anti bakteri dari keempat isolat tidak sama dalam

menghambat kedua bakteri target. Metabolit yang dihasilkan isolat 7n dan 27n

mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan EPEC K1-1 dan E.coli

dengan kualitas yang berbeda. Daya antibakteri isolat 7n dan 27n terhadap EPEC

K1-1 besar tetapi kurang terang dan zona yang dihasilkan terhadap E. coli lebih

kecil tetapi terang. Ini diduga ada hubungannya dengan efek bakteriostatik dan

bakterisida.

Dari gambar (9a) menunjukkan isolat 7n mempunyai aktivitas

penghambatan yang paling bagus terhadap Salmonella enteric.

(a) (b)Gambar 9 Aktifitas penghambatan isolat terpilih terhadap bakteri target

(a) Salmonella enteric (b) Salmonella subsp.2, Ф cakram kertas 8mm

27n

34n

27n7n

25n

34n

k

7n

k25n

25n

34n

34n

27nk 25n

7n

7n

k27n

39

0

5

10

15

20

25

30

35

7n 25n 27n 34n

Isolat

Zo

na

ben

ing

(mm

)

Zona bening yang dihasilkan isolat 7n (23mm) diikuti oleh isolat 27n (14mm) dan

25n (14mm), sementara isolat 34n (9mm). Aktivitas penghambatan terhadap

Salmonella subsp.2. asal ayam seperti pada gambar (9b) menunjukkan bahwa

aktivitas tertinggi dimiliki isolat 25n (19mm) diikuti isolat 27n (14mm) , isolat 7n

(9mm) dan 34n (2mm). Senyawa aktif yang dihasilkan isolat 7n, 25n, dan 27n

untuk menghambat pertumbuhan Salmonella enteric dan Salmonella

subsp.2.memiliki kekuatan penghambatan beragam tergantung bakteri patogennya.

Kekuatan penghambatan dapat dilihat dari zona yang dihasilkan. Semakin besar

dan terang zona bening yang dihasilkan mengindikasikan kekuatannya semakin

kuat.

Gambar 10 menunjukkan perbandingan aktivitas penghambatan antara sel

langsung dan filtrat kultur.

Gambar 10 Perbandingan aktivitas penghambatan antara sel dan filtrat kultur dariisolat 7n, 25n, 27n, 34n terhadap E.coli

sel filtrat

Hasil uji antagonis sel isolat 7n, 25n, 27n, dengan E.coli memperlihatkan aktivitas

penghambatan sel lebih besar dibanding filtrat kulturnya. Untuk isolat 34n

aktifitas penghambatan se lebih rendah dibandingkan filtrat kultur. Rendahnya

aktivitas filtrat kultur kemungkinan terjadi karena konsentrasi senyawa aktif

dalam filtrat kultur (15µl) tidak cukup kuat menghambat bakteri target

dibandingkan senyawa antibakteri yang dihasilkan sel secara langsung. Isolat 34n

memiliki aktivitas penghambatan filtrat kultur lebih tinggi dari sel. Hal ini

kemungkinan dikarenakan kecepatan dan jenis metabolit yang dihasilkan antar

isolat berbeda. Menurut Sudirman (1997) satu spesies mikroba dapat

40

menghasilkan banyak antimikrob dan banyak mikrob yang berbeda dapat

menghasilkan jenis antimikrob yang sama.

Keempat isolat uji dapat menghasilkan senyawa antibakteri, yang dihasilkan

secara ekstraseluler, terbukti dengan adanya kemampuan filtrat kultur yang

mampu menghambat pertumbuhan empat bakteri target. Kemampuan keempat

isolat (7n, 25n, 27n, 34n) dalam menghambat pertumbuhan EPEC K1-1, E. coli

asal ayam, Salmonella enteric, dan Salmonella subsp.2. asal ayam, diharapkan

dapat dipergunakan untuk membantu penanggulangan salmonelosis dan

kolibasililosis pada ayam secara in vivo. Aktivitas isolat 7n, 25n, 27n, 34n akan

lebih bagus apabila digunakan secara bersama sama karena kemampuannya dalam

menghambat keempat patogen tidak sama.

Menurut Barrow (1992) Bacillus tidak umum ditemukan pada saluran

pencernaan tetapi mempunyai kemampuan untuk mengendalikan bakteri patogen

(competitive exclusion). Bacillus subtilis di dalam saluran pencernaan dapat

berfungsi untuk pengontrolan bakteri patogen. Ini merupakan konsep penting bagi

kesehatan hewan/manusia karena pencegahan kolonisasi mikroba patogen seperti

Salmonella dan E. coli adalah kunci dalam lingkungan saluran pencernaan ayam

akan dapat memperbaiki pertumbuhan.

Optimasi Produksi Senyawa Bioaktif

Optimasi dalam menghasilkan senyawa bioaktif dari isolat 7n, 25n, 27n, 34n

perlu dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum yang harus diperhatikan

dalam proses produksi. Optimasi dilakukan terhadap media, aerasi, waktu

produksi, suhu inkubasi, dan pH inkubasi.

Optimasi Media.

Aktivitas penghambatan ke empat isolat terpilih pada media de Mann

Rogosa Sharpe (MRS) dan media Tripton Glucosa Yeast ekstract (TGY) berbeda

dan dipengaruhi oleh perlakuan agitasi (100 rpm) dan tanpa agitasi (Gambar 11

dan 12). Dipilihnya media MRS dan TGY yang memiliki kandungan nutrisi yang

berbeda (Lampiran 1) karena kedua media tersebut dapat ditumbuhi keempat

isolat bakteri terpilih. Kandungan media MRS memiliki lebih banyak mineral

yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri dibandingkan media TGY.

41

Perlakuan agitasi dan tidak diagitasi untuk melihat homogenitas media

maupun mikroorganisme. Sistem agitasi memungkinkan distribusi tersebut

dengan meniadakan gradien konsentrasi seperti unsur media, pH, temperatur dan

sebagainya. Selain itu agitasi juga berfungsi memecah gelembung udara besar

menjadi gelembung yang lebih kecil untuk menambah area permukaan gas dan

membantu mentransfer oksigen ke dalam biakan serta menyebarkan oksigen pada

pertumbuhan aerob.

Dalam produksi senyawa aktif keempat isolat terpilih menunjukkan ada

isolat yang memerlukan agitasi dan ada yang kurang untuk menghasilkan

senyawa antibakteri. Keempat isolat dalam menunjukkan kemampuan

penghambatan beragam tergantung pada jenis media dan perlakukan agitasi

(Gambar 11 dan gambar 12).

Pada gambar (11a) terlihat aktivitas tertinggi antagonis dengan EPEC K1-1

oleh isolat 7n diikuti isolat 27n dan 25n pada media MRS tanpa agitasi, ini diduga

karena isolat 7n, 25n dan 27n berasal dari saluran pencernaan yang

mikrolingkungannya kurang oksigen sehingga isolat tersebut dapat tumbuh

dengan baik pada kondisi pertumbuhan tanpa diagitasi (terdapat keterbatasan

oksigen).

(a) (b)Gambar 11 Aktivitas penghambatan isolat terpilih terhadap (a) EPEC K1-1

(b) E. coli asal ayam7n 25n 27n 34n

Pada gambar (11b) aktivitas penghambatan tertinggi dimiliki isolat 7n

pada media TGY yang diagitasi dan isolat 27n, 25n pada MRS yang diagitasi

terhadap pertumbuhan pertumbuhan E. coli. Hal ini mengindikasikan bahwa

produksi senyawa antibakteri dari keempat isolat tersebut dapat diproduksi dengan

0

5

10

15

20

25

30

35

TA T an M A M an

Perlakuan

Zona

benin

g(m

m)

0

5

10

15

20

25

30

35

T A T an M A M an

Perlakuan

Zona

benin

g(m

m)

42

baik pada kondisi pertumbuhan yang diaerasi dan nutrisi yang cukup.

Kemampuan penghambatan isolat terpilih terhadap EPEC K1-1 dan E. coli

dipengaruhi oleh jenis media dan aerasi. Hal ini menimbulkan dugaan bahwa

senyawa antibakteri yang dihasilkan kemungkinan berbeda.

(a) (b)Gambar 12 Aktivitas penghambatan isolat terpilih terhadap (a) Salmonella

enteric (b) Salmonella subsp.2 asal ayam7n 25n 27n 34n

[

Dari gambar (12a) aktivitas penghambatan terhadap Salmonella enteric

tertinggi berturut-turut dimiliki isolat 25n dan 27n yang ditumbuhkan pada media

TGY yang tidak di agitasi. Isolat 34n menghasilkan aktivitas sangat kecil pada

media MRS yang tidak diagitasi, ini diduga karena keterbatasan aerasi (oksigen)

pada kondisi pertumbuhan tersebut . Pada gambar (12b) aktivitas penghambatan

terhadap Salmonella subsp.2. paling baik oleh isolat 25n diikuti isolat 27n dan 34n

kemudian 7n pada media TGY tanpa diagitasi. Isolat 34n mempunyai aktivitas

yang sangat kecil pada media MRS yang tidak diagitasi. Hal ini diduga bahwa

senyawa penghambat Salmonella enteric dan Salmonella sub sp 2. ini dapat sama

karena isolat yang menghambat Salmonella enteric dan Salmonella subsp.2 yang

tertinggi pada isolat yang sama. Berbeda karena ada beberapa isolat yang dapat

menghambat Salmonella enteric tetapi tidak dapat menghambat Salmonella

subsp.2 atau sebaliknya.

Media produksi terbaik dari hasil optimasi akan digunakan sebagai dasar

untuk membuat media modifikasi dengan mengganti beberapa bahan dengan yang

lebih murah dan mudah didapat seperti molase dan tepung kedelai. Hasil optimasi

media menunjukkan bahwa isolat 7n, 25n, 27n, 34n yang ditumbuhkan pada

media MRS dan TGY dapat menghasilkan aktivitas penghambatan dengan

0

5

10

15

20

25

30

35

TA T an M A M an

Perlakuan

Zona

benin

g(m

m)

0

5

10

15

20

25

30

35

TA T an M A M an

Perlakuan

Zona

benin

g(m

m)

43

kondisi pertumbuhan yang memerlukan agitasi dan ada yang tidak. Senyawa

antibakteri yang dihasilkan oleh setiap isolat terpilih kemungkinan dapat lebih

dari satu mengingat kondisi yang dibutuhkan juga bebeda beda.

Media MRS dan TGY modifikasi molase-kedelai adalah media yang

menggunakan komposisi MRS dan TGY dengan mengganti sumber karbon

dengan molase, sumber nitrogen dengan tepung kedelai dan urea, sumber pospor

dengan TSP. Setelah diuji aktivitas penghambatannya terhadap EPEC K1-1,

E. coli asal ayam, Salmonella enteric, dan Salmonella sub sp 2. asal ayam, isolat

7n, 25n, 27n, hasilnya menunjukkan bahwa keempat isolat yang ditumbuhkan

pada media modifikasi masih mempunyai aktivitasnya tetapi tidak sebesar kalau

ditumbuhkan pada media MRS/TGY. Hal ini diduga karena media MRS dan TGY

menggunakan dekstrosa dan kasein sebagai sumber karbon dan nitrogen untuk

penghasil ATP yang mudah diserap sel, karena mudah larut dalam air serta

molekulnya sederhana. Isolat 7n, 25n, 27n, dan 34n dapat dengan mudah

diproduksi pada media yang mengandung molase dan tepung kedelai hanya saja

aktivitas agak rendah.

Mikroorganisme heterotrof untuk menghasilkan energi memanfaatkan

senyawa karbon organik sebagai sumber energi utama. Penggunaan molase

sebagai sumber karbon dapat digunakan karena mengandung beberapa gula

sederhana seperti glukosa, sukrosa, fruktosa dan gula pereduksi yang lain dengan

kandungan yang paling tinggi adalah sukrosa. Hanya saja penggunaan molase

sebagai sumber ATP perlu waktu untuk adaptasi. Molase merupakan hasil

samping dari proses pembuatan gula tebu yang masih mengandung kadar gula

sekitar 48-58 % (Novita 2001).

Tepung kedelai dapat digunakan sebagai sumber nitrogen bagi pertumbuhan

bakteri karena mengandung 42.9% protein, 19-20% lemak dan 6.1% nitrogen

(Sukmadi 1996) diacu dalam (Suryanti 1998). Pada kondisi media tersebut maka

butuh waktu untuk menguraikan protein supaya bisa dimanfaatkan oleh keempat

bakteri tersebut.

Pertumbuhan bakteri sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu,

pH, dan oksigen, dan faktor nutrisi yaitu karbon, nitrogen, mineral (unsur makro

dan mikro), dan vitamin (Stainer et al. 1976; Fardiaz 1989). Pada dasarnya semua

44

mikrooganisme memerlukan karbon sebagai sumber energi untuk aktivitasnya dan

pembentukan material sel-sel bakteri untuk prertumbuhan, reproduksi dan

pembentukan produk (Prescott et al. 2000). Penggunaan sumber karbon yang

cepat digunakan dapat mengurangi produksi metabolit sekunder. Nitrogen

berperan dalam penyusunan asam nukleat, asam amino dan enzim enzim. Sumber

nitrogen dapat dalam bentuk anorganik dalam bentuk garam garam amonium dan

organik dalam bentuk asam amino, protein dan urea. Unsur P berperan dalam

pembentukan asam nukleat dan fosfolipid. Ketiga unsur ini harus ada dalam rasio

yang tepat agar tercapai pertumbuhan bakteri yang optimal karena unsur C, N, dan

P merupakan tiga nutrisi utama (makronutrien) yang dibutuhkan oleh bakteri

dalam melakukan metabolism sel untuk menghasilkan senyawa-senyawa.

Rasio C:N yang rendah (kandungan unsur N yang tinggi) akan

meningkatkan emisi dari nitrogen sebagai amonium yang dapat menghalangi

perkembangbiakan bakteri. Sedangkan rasio C:N yang tinggi (kandungan unsur N

yang relatif rendah) mengakibatkan nitrogen akan menjadi faktor penghambat

(growth-rate limiting factor) (Alexander 1994). Beberapa penelitian menunjukkan

bahwa rasio C:N:P optimum adalah 100:10:1 (Shewfelt et al. 2005).

Kebutuhan sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri tergantung pada jenis

bakteri. Kelompok bakteri yang tidak mengandung klorofil memerlukan senyawa

organik sebagai sumber karbon dan senyawa yang diperlukan tergantung jenis

bakteri. Kelompok selulolitik dapat memanfaatkan selulosa, sedangkan amilolitik

memanfaatkan pati (Fardiaz 1989). Walaupun karbohidrat dapat dipergunakan

sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan, produksi sel yang paling baik

diperoleh dari sumber karbon sederhana seperti glukosa. Namun, penggunaan

glukosa memerlukan biaya tinggi, oleh karena itu untuk produksi sel, pada

umumnya digunakan sumber karbon lain seperti molase.

Penggunaan mikroba sebagai probiotik akan bersifat ekonomis kalau dapat

ditumbuhkan dengan baik pada sumber karbon dan nitrogen yang mudah didapat

dan berharga murah seperti molase dan tepung kedelai. Kemampuan molase

sebagai sumber karbon menguntungkan karena molase merupakan hasil ampas

tebu sehingga tidak terlalu mahal dan mengandung zat pengaya seperti vitamin.

Begitu juga kedelai merupakan hasil pertanian yang banyak di Indonesia.

45

Optimasi Waktu Produksi

Hasil optimasi terhadap waktu produksi (12 jam, 24 jam, 36 jam, 48 jam

dan 72 jam) untuk mendapatkan aktivitas tertinggi berdasarkan parameter zona

bening. Waktu produksi terbaik terbaik adalah jam ke-48 (Gambar 13). Pada

gambar 13 (a) terlihat aktivitas penghambatan ekstrak kasar keempat isolat terlihat

waktu inkubasi jam ke-24 belum ada aktivitas, waktu inkubasi jam ke-48

aktivitas penghambatan oleh isolat 7n sudah mencapai 27mm, 25n (26mm), dan

27n (18mm), 34n (23mm). Pada waktu inkubasi jam ke-72 aktivitas

penghambatan oleh isolat 7n bertambah mencapai 30mm dan untuk tiga isolat

lainnya aktivitas menurun. Pada waktu inkubasi jam ke-96 isolat 25n aktivitas

bertambah mencapai 27mm sementara isolat lainnya mengalami pertambahan

aktivitas sedikit.

(a) (b)Gambar 13 Hubungan lama inkubasi dengan aktivitas penghambatan terhadap

E.coli (a) filtrat kultur (b) sel7n 25n 27n 34n

Untuk aktivitas penghambatan yang dihasilkan oleh filtrat kultur waktu

inkubasi optimum adalah 48 jam, selanjutnya pertambahan zona bening yang

dihasilkan pada waktu inkubasi 72 jam dan 96 jam tidak seimbang dengan

efisiensi waktu dan efisiensi substrat yang digunakan.

Pada gambar 13 (b) aktivitas penghambatan sel keempat isolat pada waktu

inkubasi jam ke-24 belum ada aktivitas. Waktu inkubasi jam ke-48 jam aktivitas

penghambatan oleh isolat 7n sudah mencapai 30mm, 25n (26mm), dan 27n

(18mm), 34n (16mm). Aktivitas penghambatan yang dilakukan sel pada waktu

inkubasi jam ke-72 dan jam ke 96 tidak menunjukkan perubahan yang berarti,

dimana aktivitas hampir sama sehingga waktu inkubasi untuk sel yang terbaik

0

5

10

15

20

25

30

35

24 48 72 96

Waktu inkubasi (jam)

Zo

na

be

nin

g(m

m)

0

5

10

15

20

25

30

35

24 48 72 96

Waktu inkubasi (jam)

Zo

na

be

nin

g(m

m)

46

adalah 48 jam. Diduga senyawa aktif yang dihasilkan sebagai zat antibakteri ini

dihasilkan pada akhir fase eksponensial atau awal fase stationer.

Pertumbuhan Isolat

Berdasarkan kurva tumbuhnya, keempat isolat menunjukkan fase lag

terjadi sampai jam ke-24 dan fase log hingga jam ke- 48 jam bersamaan dengan

awal fase stasioner. Fase kematian dimulai jam ke 60 (Gambar 14).

Gambar 14 Kurva tumbuh Isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada media NBisolat 7n isolat 25n isolat 27n isolat 34n

Keempat isolat mempunyai pola pertumbuhan yang sama. Terlihat bahwa

produksi senyawa aktif terjadi pada akhir fase log dan awal fase stasioner, sesuai

dengan waktu panen yaitu jam ke-48. Fase pertama (lag) pada kurva pertumbuhan

adalah fase lambat. Pada fase ini, bakteri melakukan adaptasi pada lingkungannya.

Fase yang kedua (log) adalah fase eksponensial. Fase ini merupakan fase dimana

bakteri telah dapat beradaptasi dengan lingkungannya sehingga laju pertumbuhan

bakteri menjadi sangat cepat. Laju pertumbuhan keempat bakteri pada 48 jam

pertama, memiliki laju pertumbuhan tercepat. Fase berikutnya adalah fase

stasioner dimana laju bakteri yang mati sama dengan laju pertumbuhan bakteri

yang dihasilkan oleh pembelahan sel. Fase terakhir adalah fase kematian, pada

fase ini laju pertumbuhan negatif (lebih banyak bakteri yang mati) disebabkan

semakin berkurangnya nutrisi yang dibutuhkan untuk metabolisme bakteri

Dari grafik terlihat isolat 7n pertumbuhan sel yang paling rendah diikuti

isolat 27n, 25n dan yang tertinggi isolat 34n. Akan tetapi isolat 7n mempunyai

aktivitas yang penghambatan paling tinggi terhadap EPEC K1-1 dan E. coli

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 12 24 36 48 60

jam

OD

47

dibanding isolat yang lain diiringi isolat 25n dan 27n. Isolat 34n mempunyai

aktivitas penghambatan tertinggi terhadap Salmonella enteric.

Optimasi Suhu

Optimasi suhu bertujuan mendapatkan suhu optimum dalam menghasilkan

senyawa bioaktif oleh isolat 7n, 25n, 27n, dan 34n (Gambar 15 dan 16).

(a) (b)Gambar 15 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) EPEC K1-1 (b) E. coli,

7n 25n 27n 34n

Dari hasil optimasi aktivitas penghambatan tertinggi terhadap EPEC K1-1

adalah isolat 7n, diikuti 34n, 25n, 27n pada suhu 500C (Gambar 15a). Aktivitas

penghambatan tertinggi antagonis dengan E. coli ditunjukkan oleh isolat 7n pada

suhu 370C, diikuti isolat 34 suhu 500C , 25 suhu 400C dan 27 suhu 370C

(Gambar 15b). Aktivitas penghambatan isolat terpilih terhadap EPEC K1-1 dan

E. coli mempunyai rentang suhu yang sama yaitu antara 370C hingga 500C.

Dimana suhu optimum produksi senyawa antibakteri dalam menghambat

EPEC K1-1 adalah suhu 500C oleh keempat isolat. Waktu optimum untuk

produksi senyawa antibakteri dalam menghambat pertumbuhan E. coli berbeda

beda tiap isolat. Isolat 7n dan 27n optimum pada suhu 370C, isolat 25n optimum

pada suhu 400C dan isolat 34n optimum pada suhu 500C.

Aktivitas penghambatan tertinggi terhadap Salmonella enteric terjadi pada

isolat 7n diikuti 34n pada suhu 300C dan 25n, 27n pada suhu 500C (Gambar 16a).

Aktivitas penghambatan terhadap Salmonella sp. asal ayam oleh isolat 34n pada

suhu 370C, 400C , 300C, diikuti isolat 27n suhu 300C dan 500C (Gambar 16b).

Suhu optimum untuk menghasilkan senyawa antibakteri dalam menghambat

Salmonella enteric dan Salmonella subsp.2. berbeda dan isolat yang

0

5

10

15

20

25

30

35

25o 30o 37o 40o 50o

Suhu (oC)

Zo

na

ben

ing

(mm

)0

5

10

15

20

25

30

35

25 30 37 40 50

Suhu (oC)

Zo

na

ben

ing

(mm

)

48

menghambatnya juga berbeda. Diduga senyawa yang dihasilkan juga oleh isolat

ini juga berbeda.

(a) (b)Gambar 16 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) Salmonella enteric, (b)

Salmonella subsp.2 asal ayam7n 25n 27n 34n

Keempat isolat mampu menghambat empat bakteri target pada rentang

suhu antara 300C dan 500C dan suhu yang paling optimum untuk antagonis dengan

EPEC K1-1 pada suhu 50OC. E. coli suhu 370C, Salmonella enteric 300C,

Salmonella subsp.2 asal ayam 370C. Komplang (2000) menyatakan bahwa

Bacillus spp. mampu tumbuh pada suhu lebih dari 500C dan kurang dari suhu 50C,

dan mampu menghasilkan spora. Dari hasil optimasi terhadap suhu menunjukkan

bahwa kemampuan produksi senyawa antibakteri pada suhu 300C merupakan hal

yang positif dimana dalam produksi dalam skala besar tidak menaikkan biaya

produksi (cost) dan kemampuan produksi pada suhu 500C juga berdampak positif

karena tidak akan merusak selnya ketika menggunakan alat alat yang mempunyai

suhu lebih tinggi.

Bacillus subtilis toleran terhadap panas telah dicobakan pada pakan ayam

broiler di beberapa negara. Hasil yang diperoleh menunjukkan peningkatan yang

terus menerus terhadap konversi pakan dan pertambahan berat badan. Percobaan

yang dilakukan di Brazil dan USA membuktikan bahwa performance broiler dapat

ditingkatkan dengan menggunakan bakteri tunggal strain Bacillus subtilis

sepanjang periode produksinya.

0

5

10

15

20

25

30

35

25 30 37 40 50

Suhu (oC)

Zo

na

ben

ing

(mm

)

0

5

10

15

20

25

30

35

25 30 37 40 50

Suhu (oC)

Zo

na

ben

ing

(mm

)

49

0

5

10

15

20

25

30

35

3 4 5 6 7 8 9

pH

Zo

na

be

nin

g(m

m)

0

5

10

15

20

25

30

35

3 4 5 6 7 8 9

pH

Zo

na

be

nin

g(m

m)

Optimasi pH

Hasil optimasi pH menunjukkan bahwa isolat 7n, 25n, 27n, 34n mampu

menghambat EPEC K1-1 pada pH yang bersifat alkali (Gambar 17). Dari gambar

17a terlihat bahwa aktivitas penghambatan tertinggi terhadap EPEC K1-1 oleh

isolat 27n pada pH 8.0 dikuti isolat dan isolat 25n pada pH 7.0 diikuti isolat isolat

34n pada pH 6.0, isolat 7n pada pH 7.0 dan pH 8.0. Antagonis dengan E. coli

(Gambar 17b) menunjukkan bahwa pH 8.0 merupakan pH optimum untuk

menghasilkan aktivitas penghambatan untuk isolat 7n, 25n, 27n. untuk isolat 34n

menghasilkan aktivitas penghambatan pada pH 9.0 tetapi tidak terlalu besar

(a) (b)Gambar 17 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) EPEC K1-1 (b) E. coli

7n 25n 27n 34n

Dari kedua bakteri patogen diatas ternyata aktivitas penghambatan akan

lebih baik apabila isolat terpilih ditumbuhkan pada pH 8, dan dapat memberikan

penghambatan pada pH 6.0, 7.0, 9.0. Barrow (1963) menyatakan bahwa

perubahan pH dapat menyebabkan perubahan aktivitas antimikroba hingga

menjadi tidak aktif. Dalam aplikasinya dilapang menunjukkan bahwa senyawa

antibakteri yang dihasilkan oleh isolat 7n, 25n dan 27n akan aktif bekerja pada

saluran ternak yang mempuntai pH alkali seperti usus besar. Dalam produksi

senyawa antibakteri ini, pH inkubasi dapat diatur hingga 8.0 sehingga bakteri

bakteri terpilih ini dapat menghasilkan senyawa aktif untuk menghambat EPEC

K1-1 dan E.coli.

Aktivitas penghambatan terhadap Salmonella enteric terjadi pada pH 4.0

dan pH 5.0 untuk semua isolat. Aktivitas tertinggi diperlihatkan oleh isolat 25n,

pada pH 4.0 diikuti isolat 27n pada pH 4.0 dan isolat 7n dan 34n pada pH 5.0

50

0

5

10

15

20

25

30

35

3 4 5 6 7 8 9

pH

Zo

na

be

nin

g(m

m)

0

5

10

15

20

25

30

35

3 4 5 6 7 8 9

pH

Zo

na

be

nin

g(m

m)

(Gambar 18a). Aktivitas penghambatan terhadap Salmonella subsp.2 oleh isolat

27n pada pH 7.0 diikuti isolat 34n dan isolat 7n pada pH 9.0 (Gambar 18b).

(a) (b)Gambar 18 Aktivitas penghambatan isolat terhadap (a) Salmonella enteric

(b) Salmonella subsp.2. asal ayam .7n 25n 27n 34n

Isolat terbaik dalam menghambat Salmonella enteric adalah isolat 25n, 27n,

7n, diikuti 34n. Keempat isolat diatas mempunyai aktivitas penghambatan

terhadap Salmonella enteric pada pH 4 dan 5. Untuk penghambatan terhadap

Salmonella subsp.2. isolat yang paling baik pertumbuhannya adalah 34n pada pH

9.0 diikuti oleh isolat 27n pada pH 7.0, dan 7n, 25n. Pada pH 9.0. Ini

memberikan informasi bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh keempat isolat

untuk menghambat Salmonella enteric memerlukan kondisi yang asam. Dan

untuk menghambat Salmonella subsp.2 memerlukan kondisi alkali. Berdasarkan

data ini diperkirakan senyawa yang dihasilkan keempat isolat dalam menghambat

pertumbuhan kedua patogen adalah senyawa yang berbeda.

Dari hasil optimasi media, suhu dan pH terlihat bahwa aktifitas hambatan

terhadap EPEC K1-1 yang terbesar diperlihatkan oleh isolat 7n (23mm), media

MRS modifikasi, tanpa agitasi, suhu 500C, pH 7.0 dan diikuti oleh isolat 34n

(21.5mm), media TGY modifikasi, tanpa agitasi, suhu 370C, pH 6.0. Aktivitas

hambatan terhadap E. coli asal ayam yang terbesar diperlihatkan isolat 7n

(13.5mm) media MRS modifikasi, tanpa agitasi, suhu 370 dan pH 8.0 diikuti oleh

isolat 34n (12mm), media TGY modifikasi tanpa agitasi, suhu 500C, pH 8.0.

Pada Salmonella enteric aktivitas hambatan yang terbesar diperlihatkan

oleh isolat 7n pada media MRS modifikasi (18.875mm), tanpa agitasi, suhu 500C,

51

pH 5.0 diikuti oleh isolat 25n (14.25mm) dan pada media MRS modifikasi. tanpa

agitasi, suhu 500C, pH4.0 dan 34n (14.25mm), tanpa agitasi,suhu 300C pH 5.0.

Antagonis terhadap Salmonella subsp.2 asal ayam aktifitas hambatan terbesar

pada isolat 34n pada media TGY modifikasi, tanpa agitasi, suhu 370C, pH 9.0

diikuti oleh isolat 27n pada media MRS modifikasi, tanpa agitasi, suhu 300C,

pH 7.0. Keempat isolat merupakan bakteri potensial sebagai probiotik yang

diharapkan dapat digunakan dalam pakan ayam guna mengendalikan penyakit

seperti salmonelosis dan kolibasilosis. Bakteri dari genus Bacillus dapat

memproduksi zat antimikrob berupa bakteriosin (Irina et al. 2001), antibiotik, dan

proteinase (Torkar & Matijasic 2003).

Aktivitas Amilase, Protease, Lipase, Selulase

Untuk melihat kemampuan isolat terpilih dalam menghasilkan enzim

degradatif maka dilakukan uji kualitatif amilase, protease, lipase, selulase. Nilai

indeks uji enzim dapat dilihat dalam tabel 6.

Tabel 6 Indeks amilolitik, proteolitik, lipolitik, selulolitik isolat 7n, 25n, 27n, 34n

Isolat Indeksamilolitik

Indeksproteolitik

Indekslipolitik

Indeksselulolitik

7n 0.67 1.50 1.00 2.00

25n 0.25 1.50 1.00 1.08

27n 0.50 1.50 - 1.25

34n 0.50 1.25 0.66 0.75

Isolat 7n, 25n, 27n, 34n mempunyai aktivitas amilolitik berdasarkan adanya zona

bening pada media yang berwarna biru (Gambar 19a). Degradasi yang terjadi

pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine, untuk

mendeteksi adanya enzim α amilase yang berfungsi menghidrolisis α-1,4-glikogen

dan poliglukosa lainnya. Pada awal perlakuan terjadi penurunan berat molekul

pati secara cepat akibat dari pewarnaan iodine. Produk akhir yang utama dari

degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah seperti

glukosa. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis secara exolitik dan

mendegradasi pati dengan cara memecah maltosa dari ujung rantai pati. [[

52

(a) (b)

Gambar 19 Zona bening yang dihasilkan isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada uji enzim(a) amilase (b) protease

Keempat isolat diduga menghasilkan enzim α amilase yang mempunyai

kemampuan dalam menghidrolisis ikatan α-1,4 glikogen. Kemampuan dalam

menghasilkan enzim amilase sangat ditentukan oleh gen penghasil enzim dan

lingkungan seperti sumber nitrogen, karbon sodium dan garam potassium, ion

metal, dan detergen juga akan mempengaruhi produksi amilase dan pertumbuhan

mikroorganisme (Srivastava 2008).

Kemampuan isolat 7n, 25n, 27n, 34n dalam menghasilkan enzim amilase

tidak sama. Isolat 7n mempunyai kemampuan yang paling tinggi dengan indeks

amilasenya (0.67) diikuti isolat 27n, 34n, (0.5) sementara isolat 25n nilai

indeksnya 0.25 (tabel 6). Enzim amilase yang dihasilkan oleh isolat 7n, 25n, 27n

dan 34n ini tergolong eksoenzim sehingga dapat digunakan untuk membantu

mencerna pakan oleh inangnya, sehingga pakan dapat tercerna lebih sempurna.

Pati merupakan substansi yang terlebih dahulu harus diubah menjadi molekul

lebih sederhana agar dapat diserap oleh sel. Mikroorganisme memproduksi enzim

untuk memecah substansi di dalam sel, salah satunya adalah amilase (Black 2005)

Enzim α-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai

macam makanan, minuman dan industri tekstil. Sehingga Alfa amilase yang

dihasilkan oleh isolat terpilih ini diharapkan dapat diproduksi dalam skala besar

guna kepentingan diatas. Alfa amilase ekstra seluler telah dihasilkan dari beberapa

bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan

B.licheniformis (Biogen, 2008).

7n25n

7n25n

27n34n

27n34n

53

Aktivitas proteolitik dapat dilihat pada gambar (19b) mengindikasikan

kemampuan protease menghidrolisis ikatan peptida pada protein menjadi asam

amino. Protease termasuk kedalam kelompok enzim hidrolase karena dalam

reaksinya melibatkan air pada ikatan substrat spesifik. Berdasarkan cara

hidrolisisnya, protease dibedakan menjadi proteinase dan peptidase. Proteinase

menghidrolisis molekul protein menjadi polipeptida, sedangkan peptidase

menghidrolisis fragmen polipeptida menjadi asam amino.

Isolat 7n, 25n, 27n, 34n mempunyai aktivitas enzim proteolitik yang tinggi

dimana terlihat nilai indeks protease sangat tinggi dan hampir sama pada keempat

isolat. Isolat 7n, 25n, 27n nilai indeks protease 1.5 sedangkan indeks protease 34n

1.25 (tabel 6). Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel

makhluk hidup.

Keempat isolat berpotensi digunakan sebagai feed additive untuk memacu

pertumbuhan menggantikan antibiotik, karena protease yang dihasilkan keempat

isolat ini tergolong ekstraseluler. Protease ekstraseluler yang dihasilkan keempat

isolat akan sangat menguntungkan kalau dikembangkan karena dapat membantu

memecahkan protein dalam saluran pencernaan ternak menjadi molekul peptida

yang sederhana. Hal ini akan meningkatkan absorpsi nutrisi dan konsumsi pakan

untuk pertumbuhan, serta produksi dan reproduksi, dan akan memberikan

keuntungan bagi peternak karena terjadinya efisiensi pakan.

Bacillus spp. mempunyai kemampuan proteolitik yang tinggi dibanding

mikroba yang lain. Kelompok bakteri ini selain mempunyai kemampuan

membentuk spora, juga dapat menghasilkan enzim yang berguna dalam

pencernaan seperti amilase dan protease.

Aktivitas lipolitik dan selulolitik isolat 7n, 25n, 27n, 34n terlihat pada

gambar 20a. Dari hasil uji aktivitas lipolitik oleh isolat 7n, 25n, 27n, 34n terlihat

bahwa tiga isolat (7n, 25n, 34n) mempunyai aktivitas lipolitik yang ditandai

adanya zona bening disekitar koloni sementara isolat 27n tidak ada aktivitas.

Didapatkannya isolat yang tidak dapat memecah lemak akan sangat baik sekali

dalam penerapannya bagi peternak yaitu untuk membuat ternak yang rendah

kandungan lemak dan tinggi kandungan protein dagingnya.

54

(a) (b)Gambar 20 Zona bening yang dihasilkan isolat 7n, 25n, 27n, 34n pada uji enzim

(a) lipase (b) selulase

Lipid (seperti lemak dan minyak) merupakan senyawa dengan molekul

kompleks yang berukuran besar. Lipase akan memecah ikatan trigliserida menjadi

molekul yang lebih sederhana seperti reaksi dibawah ini:

Enzim lipase ini spesifik akan memutus rantai fatty acid trigliserol pada posisi

sn-1 dan sn-3, sering disebut dengan lipase spesifik regio 1,3. Asam lemak dan

gliserol akan diserap oleh tubuh untuk digunakan dalam metabolisme tubuh.

Enzim ini juga digunakan dalam hidrolisis triasilgliserol (TAG) menghasilkan

diasilgliserol (DAG) dan asam lemak bebas (Winarno 1986). DAG adalah ester

gliserol dengan dua molekul asam lemak. DAG digunakan sebagai bahan

pengemulsi dan penstabil produk-produk makanan, kosmetika, dan farmaketika.

Lipase terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis untuk meningkatkan kualitas

crude palm oil (CPO) yang lebih baik yaitu minyak sehat (healthy oil).

Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan

enzim lipase, karena bakteri memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan

yang terdapat kandungan makanan atau nutrisi yang kompleks. Isolat 7n dan 25n

mempunyai nilai indeks lipolitiknya 1 dan isolat 34n nilai indeks lipolitiknya 0.66

( tabel 6). Isolat bakteri yang dapat menghasilkan lipase ini dapat digunakan

untuk mencerna lemak lebih efisien dan juga dapat digunakan dalam industri

sebagai biokatalis. Lipase sebagai biokatalis untuk reaksi reaksi hidrolisis,

esterifikasi, alkoholisis, asidolisis dan aminolisis. Selain itu isolat yang mampu

menghasilkan lipase ekstraseluler dapat juga digunakan sebagai starter untuk

34n27n

34n

25n

27n

27n

7n25n

55

biodegradasi limbah minyak. penerapannya sangat ramah lingkungan

(Suryadipura, 2001). Menurut Feliatra (1996) dalam Dharmawibawa (2004),

biodegradasi oleh mikroorganisme merupakan salah satu cara yang tepat, efektif

dan hampir tidak ada efek sampinganya pada lingkungan karena tidak

menghasilkan racun atau blooming karena mikroba ini akan mati seiring dengan

habisnya minyak.

Hasil uji selulolitik dari keempat isolat terpilih menunjukkan adanya enzim

selulase yang dihasilkan oleh keempat isolat, enzim ini mampu memecah senyawa

selulosa menjadi molekul sederhana seperti glukosa gambar (20b). Pada pengujian

selulolitik ternyata dari empat isolat, tiga isolat memiliki kemampuan selulolitik

yang tinggi yaitu isolat 7n dengan nilai indeksnya 2, isolat 25n nilai indeksnya

1.083 dan isolat 27n dengan nilai indeksnya 1.25. Untuk isolat 34n nilai

indeksnya rendah sebesar 0.75 (tabel 6). Carboxy methyl cellulose (CMC) adalah

substrat yang digunakan dalam deteksi awal untuk screening enzim selulase

khususnya endoglukanase. Enzim selulase merupakan kelompok enzim glikosil

hidrolase yang menghidrolisis oligosakarida dan polisakarida (Henrissat 1991).

Selulase digunakan oleh bakteri untuk pertahanan diri dari lingkungan serta untuk

kelangsungan hidupnya. Genus Bacillus merupakan salah satu kelompok bakteri

yang mampu mendegradasi selulosa (Lynd et al. 2002).

Secara umum terdapat tiga enzim selulose, yaitu endonuklease yang

memutuskan ikatan non kovalen pada struktur kristal selulosa, eksoselulose yang

menghidrolisis individu selulosa menjadi gula lebih sederhana, β-glukosidase

yang menghidrolisis disakarida dan tetrasakarida menjadi glukosa (Criquet 2002).

Glukosa yang dihasilkan dari proses hidrolisis selulosa selanjutnya dimetabolisme

oleh mikroorganisme lain, dalam kondisi aerob glukosa dikonversi menjadi CO2 ,

sedangkan pada kondisi anaerob glukosa dikonversi menjadi asam organik dan

alkohol yang selanjutnya menjadi CH4 dan CO2 (Rao 1982).

Pada hasil uji enzim secara kualitatif ditemukan bakteri kelompok Bacillus

yang dapat memproduksi amilase dan protease, lipase dan sellulase sehingga

terdapat kemungkinan berperan dalam mencerna pakan lebih efisien. Beberapa

spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler seperti protease, lipase,

56

amilase, dan selulase yang bisa membantu pencernaan dalam tubuh hewan

(Wongsa dan Werukhamkul 2007).

Berdasarkan hasil indeks yang dihasilkan, keempat bakteri ini memiliki

kemampuan sebagai pemacu pertumbuhan ( Growth promotant) terutama dalam

mendegradasi senyawa kompleks seperti amilum, protein, lipid dan selulosa.

Isolat 7n kemampuan degradasinya paling tinggi dengan nilai IA 0.67, IP 1.5,

IL 1, IS 2 diikuti isolat 25n IA 0.25, IP 1.5, IL 1, IS 1.083, Isolat 34n IA 0.5,

IP1.25, IL 0.66. Isolat 27n IA 0.5, IP 1.5, IS 1.25 dan kemampuan degradasi

lemak tidak ada.

Kemampuan bakteri asal saluran pencernaan (isolat 7n, 25n, 27n, 34n)

dalam menghasilkan enzim enzim ekastraseluler dapat dimanfaatkan oleh

inangnya untuk membantu mengkonversi pakan lebih efisien sehingga dapat

masuk ke dalam sel untuk digunakan sebagai sumber karbon dan elektron donor

(Madigan et al. 2003). Keempat bakteri asal saluran pencernaan memiliki

potensi sebagai probiotik. Hasil identifikasi empat bakteri asal saluran pencernaa

ayam ini termasuk kelompok Bacillus yang dapat memproduksi amilase dan

protease lipase dan selulase.

Dari beberapa hasil penelitian dilaporkan bahwa pemberian Bacillus spp.

yang dicampurkan dalam pakan dapat meningkatkan produksi telur dan FCR.

(Feed Convertion Ratio) (Komplang 2000). Bacillus spp. sebagai probiotik yang

berasal dari kultur campuran Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus

cereus yang dapat berfungsi sebagai growth promotor dalam pertumbuhan hewan

dapat menggantikan penggunaan antibiotik (Komplang et al. 2002;

Komplang 2000). Penggunaan Bacillus spp sebesar 0,2% dalam pakan ayam

broiler secara nyata dapat meningkatkan daya cerna serat kasar, peningkatan

bobot hidup, konsumsi dan konversi pakan menjadi efisien (Yuguchi et al. 1992).

Bacillus spp. dapat meningkatkan aktivitas berbagai enzim hidrolitik protease,

lipase dan amilase dalam usus ayam petelur (Sjofyan 2003). B. subtilis dicobakan

pada ayam pedaging dan memberikan hasil yang positif (Jin et al. 1996).

Keuntungan yang dihasilkan dari bakteri Bacillus ini ada kaitannya dengan

keseimbangan mikroflora di dalam saluran gastrointestinal, meningkatnya

kesehatan usus dan memberikan kesehatan menyeluruh dan pada akhirnya akan

57

memperbaiki performance. Probiotik terbukti mampu meningkatkan produksi

ternak tanpa mempunyai efek samping bagi ternak dan konsumen.

Dari hasil penelitian, keempat isolat terpilih berpotensi sebagai probiotik

yang dapat menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen penyebab penyakit

pada hewan dan manusia dan juga dapat digunakan sebagai makanan imbuhan

dengan kemampuannya menghasilkan beberapa enzim ekstraseluler.

Penggunaanya kedepan mampu menggantikan antibiotik yang banyak digunakan

peternak untuk menghambat bakteri patogen dan mampu mengkonversi pakan

lebih efisien dengan enzim enzim yang dihasilkannya, tanpa menimbulkan efek

samping bagi ternak dan konsumen. Selain itu dapat menciptakan ternak yang

rendah kolesterol dan tinggi proteinnya dengan meberikan isolat isolat yang

mampu mendegradasi protein dan isolat yang tak mampu mendegradai lemak,

sehingga protein dapat diserapnya dalam bentuk asam amino semetara lemak

tidak dapat diserap karena tidak mampunya menguraikan lemak menjadi asam

lemak dan gliserol.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

- Diperoleh 72 isolat hasil solasi bakteri asal saluran pencernaa ayam broiler

yang tidak diberi antibiotik, terdiri dari 38 isolat yang tumbuh pada pH 7.0

dan 34 isolat yang tumbuh pada pH 4.5.

- Empat isolat terpilih (7n, 25n, 27n, 34n) memiliki aktivitas penghambatan

cukup bagus terhadap EPEC K1-1, E .coli, Salmonella enteric, Salmonella

subsp.2 asal ayam. Dimana Isolat 7n diperoleh pada bagian duodenum. isolat

25n, 27n, 34n pada bagian intestinum crassum.

- Hasil identifikasi keempat isolat termasuk kelompok Bacillus.

- Aktivitas penghambatan tertinggi terhadap EPEC K1-1 oleh isolat 7n (9mm)

pada media MRS modifikasi dengan suhu dan pH inkubasi 500C dan pH 7.0.

- Penghambatn tertinggi terhadap E. coli oleh isolat 25n (29 mm) pada media

MRS modifikasi,dengan suhu dan pH inkubasi 400C pada pH 8.0.

- Aktivitas penghambatan terhadap Salmonella enteric oleh isolat 7n

pada media MRS modifikasi pada suhu dan pH ingkubasi 300C dan pH 5.0.

- Penghambatan terhadap Salmonella subsp.2 asal ayam oleh isolat 34n

sebesar 19mm pada media MRS modifikasi suhu 370C dengan pH 9.0.

- Isolat 7n, 25n, dan 34n menghasilkan enzim amilase, protease, lipase,

selulase ekstraseluler. Isolat 27n meghasilkan ketiga enzim kecuali lipase.

- Isolat 7n mempunyai nilai indeks paling tinggi dengan indeks amilase 0.67,

indeks protease 1.5, indeks lipase 1,dan indeks selulase 2.

Saran

- Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas enzim

ekstraseluler secara kuantitatif dari keempat isolat dan karakterisasi senyawa

antibakteri yang dihasilkannya.

- Penelitian lanjutan secara in vivo kemampuan isolat menghambat mikrob

patogen dan konversi pakan yang paling tepat untuk memperoleh efektivitas

penghambatan terhadap EPEC K1-1, E. coli asal ayam, Salmonella enteric,

Salmonella subsp.2 asal ayam.

DAFTAR PUSTAKA

Alagaratnam R. 1977. Production of high fruktose syrup from starch. Di dalamTan K (ed.). Papers of first International Sagi Symp. Kualalumpur.

Alexander M. 1994 Biodegradation and Bioremediation. United States ofAmerica : Academic Press, Inc.

Anderson A.K. 1958. Esentials of Phisiologi Chemistry. Jhon Wiley dan Sons,New York.

Anonim. 2006. Bakteri Poteolitik. http://www.wikepedia.org.com . 25 juli 2008

Anonim. 2007. Pencernaan dan Penyerapan Protein http://www. chickaholic.co.cc. 25 mei 2009.

Anonim. 2008. Soybean. http://www.wikepedia.org.com . 25 juli 2008

Anonim. 2008. Salmonellosis. http://www.unbc.ca/nlui/wildlife_ desease_bc/salmonellosis. htm, diakses pada tanggal 11 Maret 2008.

Barnes HJ, Gross WB. 1997. Collibacillosis. In:Diseases of Poultry. 10th edCalnek BW, Barnes HJ, Beard CW, MC Dougald LR, Saif YM. (Eds.).Ames. IA.: Iowa State University Press.pp. 131−141.

Barrow W J. 1963. Hot vs. cold extraction methods for making a pH .Barrow W J.Research Laboratory Publications. no. 1. Richmond. Virginia.

Barrow PA 1992. Probiotics for Chickens. In: Probiotics the Scientific Basis. RFuller (Ed). Chapman & Hall, London. pp. 225-259.

Beauchemin KA, Colombatto D, Morgavi DP, Yang WZ. 2003. Use of exogenousfibrolytic enzymes to improve feed utilization by ruminants. J. Anim. Sci.81 (E. Suppl. 2): E37-E47.

Benoit V, Mathias R, Lefebure G. 1994. Characterization of Breviscin 27,Bacteriocin Syinthetized by Lactobacillus brevis SB 27. Curr. Microbiol 28:53-61.

Bergman, E. 1981. Starch Hydrolysate:Improved Sweetness. Obtained by the useenzyme. Novo Industry A/s, Denmark.

Biogen. 2008. Amilase. http://biogen.litbang.deptan.go.id/terbitan/agrobio/abstrak/agrobio_vol. 05 Mei 2008.

Black JG. 2005. Microbiology Principles And Explorations. John Wiley and Sons,Inc. United States America.

Brander GM, Pugh DM Baywater RJ. 1991. Veterinary Apllied Pharmacologyand Terurapeutics. 5th Ed. Bailieve Tindal London.

Budiarti S, Triwahyudi A, Rachmania N. 1998. Telaah Faktor Adhesitas E. coliEnteropatogenik Dalam penanggulangan Diare di Indonesia (laporan akhirhibah bersaing III). Bogor: FMIPA, IPB.

60

Cai YJ, Chapman, Buswell JA, Chang ST. 1999. Production and distribution ofendoglucanase, cellobiohydrolase, and -glucosidase components of thecellulolytic system of Bajpai Volvariella volvacea, the edible strawmushroom. Appl. Environ. Microbiol. 65: 553-559.

Charlton BR, Bermudez AJ, Halvorson DA, Jeffrey JS, Newton LJ, Sander JE,Wakkernell PS.2000. Avian Diseases Manual. Fifth Edition. AmericanAssociation of Avian Pathologist. Poultry Pathology Laboratory Universityof Pennsylvania. New Bolton Center. USA.

Chen PJ, Wei TC, Chang YT, Lin LP. 2004. Purification and characterization ofcarboxymethyl cellulase. Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 111-118.

Cowan, Steel’s. 1973. Manual for the Identification of Medical Bacteri.Cambridge University Press.

Criquet S. 2002. Measurement and characterization of cellulase activity insclerophyllus forest litter. J. Microbiol. Meth. 50: 165-173.

Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology A Textbook of IndustrialMicrobiology. USA : Science Tech, Inc.

De Man JM. 1997. Kimia Makanan. Terjemahan Kosasih Padmawinata.ITB.Bandung.

Dharmawibawa ID. 2004. Isolasi Identifikasi dan Uji Kemampuan BakteriPengurai Minyak Solar dari Perairan Pelabuhan Benoa Bali. UniversitasUdayana. Bali.

Ding SJ, Ge W, Buswell JA. 2001. Endoglucanase I from the edible strawmushroom, Volvariella volvacea. Eur. J. Biochem. 268: 5687-5695.

Dirjen Peternakan. 1990 Ketentuan dan Tata Cara Usaha Peternakan DirektoratBina Usaha Petani dan Pengelolaan Hasil Peternakan. Direktorat JendralPeternakan Jakarta.

Drassar BS, Barrow PA. 1985. Intestinal Microbiology. Am Soc for Microbiol.

Duc LH, Hong HA, Barbosa TM, Henriques AO, Cutting SM. 2004.Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use. J ApplEnviron Microbiol 70(4): 2161–2171.

FAO/WHO.1992. Residues of Veterinary Drug in Foods. Report of a jointFAO/WHO Experts Consultation. Rome.

Fardiaz S. 1985. Keamanan Pangan I Mikrobiologi. Fakultas TekhnologiPertanian . Institut Pertanian Bogor.

Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan,Bogor.

Feliatra. 1996. Biodegradasi petroleum oleh bakteri di perairan Dumai selatMalaka. Kumpulam Makalah Seminar Maritim Indonesia 1996. KonvensiNasional. Pembangunan Benua Maritim Indonesia dalam rangkamengaktualisasikan Wawasan Nusantara BPPT dan Dewan HankamnasMakasar.

61

Fogarty WM. 1983. Microbial amylase. Di dalam WM Fogarty (ed). MicrobialEnzyme and Biotechnology. Applied Science Publishers, London.

Fuller R. 1989. Probiotic in man and animal. J.Appl Bacteriol 66:365-378.

Fuller R. 1991. Probiotic The Scientific Basis. Chapman and Hall. London .P:1-8.

Fuller R. 1992. History and development of probiotics. In:Probiotic The ScientificBasis R. Fuller (ed). Chapman and Hall, London. P:1-8

Fuller R. 1997. Probiotics 2. Aplication and Practical Aspects. 1st. Ed.. Chapmanand Hall, London.

Giannella RA. 1996. Salmonella. In: Baron's Medical Microbiology (Barron Set al. eds.) 4th ed. Univ of Texas Medical Branch

Grisham, Charles M. Reginald H. Garrett .1999. Biochemistry. Philadelphia:Saunders College Pub, 426–7.

Grizard D, Barthomeuf C.1999. Non–digestible oligosaccharides used as prebioticagents : mode of production and beneficial effects on animal and humanhealth. Reprod Nutr Dev 39 (5-6) 563-88.

Gsianturi. 2002. Probiotik dan Prebiotik untuk kesehatan. http//www.gizinet/arsip/arc0-2002.html-26k

Gordon RE. 1989. The genus Bacillus. In LearyWO. Ed. Practical Handbook ofMicrobiology. CRC Press. Boston. p. 109-126.

Gupte S. 1990, Mikrobiologi Dasar, Alih bahasa oleh Suryawidjaya, J.E.Binarupa Aksara. Jakarta

Haddadin MSY, S M Abdulrahim, E A R Hashlamoun, and R K Robinson. 1996.The effect of Lactobacillus acidophilus on the production and chemicalcomposition on hen’s eggs. Poult. Sci. 75: 491-494.

Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia Jakarta.

Hasono A. 2002. Mencari anti kanker dan anti kolesterol dari bakteri probiotik.http//www.cybermed cbn,Net,Id/(15 oktober 2003).

Henrissat B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acidaequence aimilarities. J. Biochem. 280 : 309-316.

Hobson P N. 1988. The Rumen Microbial Ecosystem.Elsevier Applied Science,London.

[

Hurst A. 1981. Nisin. Adv. Appl. Microbiol., 27: 85–122.

Hyronimus B, Marrec CL, and Urdaci MC. 1998. Coagulin, a Bacteriocin-likeInhibitory Substance Produced by Bacillus coagulans I4. J Appl Microbial85: 42-50.

Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F. 2001. In Vitro Anti Helicobacterpylori Activity of The Probiotic Strain B. Subtilis 3 is Due to Secretion ofAntibiotic. J Antimicrob Agent Chemother 45:3156-3161.

62

Jay JM. 1986. Modern Food Microbiology second Edition Van Norstand.Reinhold Company. New York.

Jin LJ, Ho YW, AbdullahN, Ali MA, Jalaludi S. 1996. Effect of adderentLactobacillus spp. On in vitro adherence of Salmonella to the intestinalepithelial cells chikens. J Appl Bacteriol 81:201-206.

Karyadi E. 2003. Prebiotik Memiliki Manfaat yang Sangat Besar . http//www.Kompas.com/kesehatan/news/0308/26/084340.htm .15 oktober 2003.

Klein C, Kaletta C, Entian KD. 1993. Biosynthesis of The Lantibiotic subtilin isRegulated by a Histidin Kinase/Response Regulator System. J Appl EnvironMicrobiol 59: 296-303.

Komplang I P. 2000. Pengaruh suplementasi kultur Bacillus spp. melalui pakanatau air minum terhadap kinerja ayam petelur. JITV. 5: 205-209.

Komplang I P, Zainuddin D, Supriyati. 2002. Pengaruh suplementasi Bacillusappiarius atau Toluraspora delbrueckii terhadap penampilan ayampedaging. Komplang, I. P. 2000. Pengaruh suplementasi kultur Bacillus spp.melalui pakan atau air minum terhadap kinerja ayam petelur. JITV. 7:139-143.

Kone K, Fung YC. 1992. Understanding Bacteriocins and Their Uses in Food.J Food and Environ Sanit 12: 282-285.

Kosugi Y, Tanaka H, & Tomizuka N. 1990. Continuous hydrolysis of oil byimmobilized lipase in a countercurrent reactor. Biotechnol. & Bioengin.,36 (6), 617-622. [

Krieg NR. Holt JG. 1984. Bergey's manual of systematic bacteriology. Williams& Wilkins, Baltimore and London.

Lay BW, Hastowo S. 1992. Mikrobiologi. Edisi Pertama. Rajawali Pers. Jakarta.

Lee MD, Lawrence HA. 1998. Colibacillosis. In A Laboratory Manual For theisolation an identification of avian pathogen. American Association of AvianPathologist. Fourth Ed. Pennsylvania: pp: 14−16.

Legowo AM 2003. Yoghurt untuk Kesehatan. [email protected][15 januari 2008]

Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006.Characterization of a bacteriosin-like substance produced by Bacillusamyloliquefaciens isolated from the Brazillian Atlantic forest. InternMicrobiol 9: 111-118.

Lilley D M , Stilwell R H. 1965. Probiotics growth promoting factor produced byMicroorganism animal. J. Dairy Sci. 147:747-748.

Lozano JCN, Meyer JN, Sletten K, Relaz C, Nes IF. 1992. Purification andAmino Acid Sequence of a Bacteriocin Produced by Pediococcus acidilatic.J Gen Mikrobiol 138: 1986-1990.

63

Lumyong S, Norkaew N, Ponputhachart D, Lumyong P, dan Tomita F, 2001.Isolation, Optimitation and Characterization of Xylanase from Endophyticfungi. Biotechnology for Sustainable Utilization of Biological Resources.The Tropic, 15.

Lynd LR, Weimer P J, Van Zyl WH van Zyl, Pretorius IS. 2002. MicrobialCellulose Utilization : Fundamentals and Biotechnology. Microbiol andMol Biol Rev. 66(3) : 506-577.

Macrae AR. 1983, Extracelullar microbial lipases. In “Microbial Enzymes andBiotecknology’, ed. Fogarty, W.M., Applied Science Publiser Ltd, England,p.225-250.

Madigan MT, Martiko JM, Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganism.(10th ed). New Jersey. Prenticel-Hall.

Martin RG. 1995. Using yeast culture and lactic acid bacteria in broiler breederdiets. In: Biotechnology in The feed industry. TP. Lyons & KA Jacques(Eds). Proc. Alltech’s Eleventh Annual Symp. pp. 371-378.

Mc Cracken VJ, Gaskin HR, 1999; Probiotics and the immune system. HorizonScientific press. http://horizonpress.com/hsp/pro.html 16 Nov 1999.

Mc Donald P, Edwardr RA r, Greenhalgh JFD, Morgan CA. 2002. AnimalNutrition. 6th ed. Ashford Colour Press, Gosport.

Mc farlane GT, Cummings JH. 1999; Probiotics and Prebiotics : can regulatingthe activities of intestinal bacteria benefit health? Br. Med.J, 318: 999-1003.

[

Meyer LH. 1978 Food Chemistry. The AVI Publ. Co., Inc., Westport, Connecticut.

Mujiasih. 2001. Performan ayam broiler yang diberi antibiotik zinc bacitracin,probiotic Bacillus sp. Dan berbagai level Saccharomyces cerevisiae dalamransumnya (Skripsi). Fakultas peternakan – Institut Pertanian Bogor.

Naim R. 2007. Pilih Sidal atau Statik Pahami Cara Kerja Antibiotik. InfovetEdisi 155.

Natalia L, Priadi A. 2005. Penggunaan probiotik untuk pengendalian clostridialnecrotic enteritis pada ayam pedaging. JITV 10(1): 71 – 78.

Nataro JP, Kaper JB, 1998. Diarheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiol Rev,11(1):142-201.

Nakazawa Y. 1992. Function of fermented milk: Challenges for the healthsciences. Hasono A (eds.). Elsevier Science Publisher Ltd., University Press,Cambridge.

Novita E. 2001. Optimasi proses koagulasi flokulasi pada limbah cair yangmengandung melanoidin. J. Ilmu Dasar 2(1):61-67.

Oliveira. 2004. Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substancesas Carbon Substrates. http://www.scielo.br/pdf/bjm/v31n4/a11v31n4.pdf.tanggal akses 05 Mei 2008.

64

Oscariz JC, Pisabarro AG. 2000. Characterization and Mechanism of Action ofCerein 7, a Bacteriocin Produced by Bacillus cereus Bc 7. J Appl Microbiol89: 361-369.

Paik HD, Bae SS, Park SH. 1997. Identification and Partial Characterization ofTochicin a Bacterion Produced by Bacillus thuringiensis subsp.tochingiensis. J Indust Microbiol Biotechnol 19: 294-298.

Panigraphy B, Ling Y. 1990. Differentiation of pathogenic and nonpathogenicEscherichia coli isolated from poultry. Avian Dis. 34: 941– 943.

Paturau JM. 1982. By-Pruducts of the cane Sugar Industry. Amsterdam: ElsevierScientivic Publishing Company.

Pelzar M.J and Chan ECS. 1986. Elements of Microbiolosgy. McGraw-HillCompany.

Prangdimurti E. 2001. Probiotik dan efek perlindungannya terhadap kanker kolon.Makalah Falsafah Sains (PPs 702) Bogor. Sekolah Pascasarjana, InstititutPertanian Bogor.

Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 2000. Microbiology. Ed ke-5. USA: Mcgraw-Hill Companies.

Pridmore D, Rekhif N, Pitet AC, Suri B, Mollet B. 1996. Variacin, a NewLanthyonine-Containing Bacteriocin Produced by Micrococcus varians:Comparison to Lactin 481 of Lactococcus lactis. J Appl Environ Microbiol62(5): 799-802.

Rao S. 1982. Biofertilizer in Agriculture. Oxford & IBH Published. New Delhi.

Reddy BS. 1998. Prevention of colon cancer by pro-and prebiotics “: evidencefrom laboratory studies. Br J Nutr 80 (4): S219-23.

Reddy BS. 1999. Possible mechanism by which pro-and prebiotics influencecolon carcinogenesis and tumor growth. Br J Nutr 129 (7 Suppl):1478s-82S.

[

Robson, LM, Chambliss G H. 1989. Enzymes Microb. Technol. 11 : 626-644.

Rose A.H. 1980. Microbial enzymes and bioconversion. Academic Press, London,New York, San Fransisco.

Rusiana, Iswanti DN. 2008 . Mengerikan sebanyak 85% daging ayam broilermengandung antibiotik. Pada Seminar SEAMO (Southeast Asian Ministersof Education Organization) dan Tromed RCCN (Tripical MedicineRegional Center of Cummunity Nutrition). Universitas Indonesia . Jakarta.www.poultryindinesia.com 12:35 25 juli 2009.

[

Salminen S, Ouwehand A, Benno Y, lee YK. 1999. Probiotic: how should they bedefined. Trends food Sci techol 10:107-110.

Sartika TT, Rahayu C, Dwiyanto K. 1994. Penggunaan probiotik dalam ransumdengan tingkat protein yang berbeda terhadap performan ayam broiler[Laporan Penelitian]. Balitnak Ciawi Bogor.

65

Saxena IM, Brown RM. 2005. Cellulose Biosynthesis: Current Views andEvolving Concepts. Ann of Bot 96: 9-21.

Seifert HSH, Gessler F. 1997. Continous oral application of probiotic B.cereus analternative to prevention of enteroxamia? Anim Res and Dev. 46:30-38.

[[

Shewfelt, Kirsten, Lee H, Richard, Zytner G. 2005. Optimization of nitrogen forbioventing of gasoline contaminated soil. J. Environ. Eng. Sci. 4: 29–42.NRC Canada.

Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik daritanaman obat sambung nyawa (Gynura procambens) dan analisispotensinya sebagai antimikroba. Pusat Penelitian Bioteknologi, LembagaIlmu Pengetahuan, LIPI, Cibinong Bogor.

Siswono. 2002. Probiotik, bakteri pencegah ragam penyakit.http://www.mediando.co.id/. (10 oktober 2008).

Sjofyan O. 2003. Kajian probiotik AB (Aspergillus niger dan Bacillus spp.)sebagai imbuhan ransum dan implikasi effeknya terhadap mikroflora ususserta penampilan produksi ayam petelur. (Disertasi). Universitas PajajaranBandung.

Sjofjan O. 2009. Aspek Keamanan Pakan untuk Menghasilakan Kualitas ProdukPeternakan yang Aman. Jurusan Nutrisi Dan Manakan Ternak, FakultasPeternakan Universitas Brawijaya. Malang

Soebiyanto T. 1986. HFS dan Industri Ubi Kayu. Gramedia.

Srivastava 2008. Culture Conditions for Production of Thermostable Amylase byBacillus stearothermophilus. http://www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf. tanggal akses 05 Mei 2008.

[

Stanier RY, Adelberg EA, Ingraham J. 1976. The Microbial World. 4th ed.Prentice-Hall Inc. Englewood Cliffs, New Jersey.

Sukmadi B. 1996. Pemamfaatan sumber karbon dan nitrogen lokal sebagaisubstrat untuk produksibahan aktif bioinsektisida Bacillus thuringiensissubsp.aizawai. Tesis Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Sudirman LMI. 1997. Potensi keragaman hayati mikroorganisme dalammenghasilkan senyawa antimikroba. Kumpulan Abstrak Konas 7Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia; Denpasar, 8-10 Desember 1997.

Sudirman LMI. 1994. Antibiotik. Kursus Singkat Biologi Cendawan. FMIPA.IPB.Bogor.

Suryadipura P. 2001. Lingkungan Hidup Permasalahan dan Pengelolaannya.Universitas Udayana. Denpasar

Suryanti H. 1998. Pengaruh tepung jagung dalam medium molase tepung-tepungkedelai terhadap kinerja Bacillus thuriensis susb sp. Aizawai (skripsi).Bogor.Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor.

66

Suzuki T, Mushiga Y, Yamane T, dan Shimizu S. 1988. Mass production oflipase by fedbatch culture of Pseudomonas fluorescens. Appl.Microbiol.Technol., 27, 417-422.

Tabbu CR. 2000. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya.Vol. I. Kanisius.Yogyakarta.

Tagg JR, Dajani A S, and Wannamaker L W. 1976. Bacteriocin of Gram PositifPacteria. Bacteriol Rev 40: 722-756.

Tannock GW. 1999. Introduction. In: Probiotics: A Critical Review (Tannock,GW ed.) pp. 1–4. Horizon Scientific Press, Norfolk, England.

Todar K. 2005. The Genus Bacillus. Todar’s Online Textbook of Bacteriology.University of Wisconsin-Medison.

Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial Characterization of Bacteriocin Producedby Bacillus cereus Isolated from Milk and Milk Products. Food Technol 41(2): 121-129.

Turnbull PCB. 1996. Bacillus: Barron's Medical Microbiology. Univ of TexasMedical Branch. ISBN 0-9631172-1-1.

[

Utomo D. 2002 Apakah probiotik itu?. Infovet, Ed ke 94:38-39.[

Wahyuni WT, 2006. Isolasi, pemurnian dan identifikasi senyawa antiβ-laktamase dari Streptomyces sp. IVNF1-1 (Penghambat pertumbuhanbakteri penyebab diare, EPEC K1-1) [Skripsi], Bogor: FMIPA, IPB.

Ward OP.1983. Proteinases. In microbial Enzymes and Biotechnology.Ed WMForgaty. Applied Science Publication. New York. Pp 251-317.

[

Winarno FG. 1983. Enzim Pangan .Jakarta, PT. Gramedia.

Winarno FG. 1986. Kimia Pangan dan Gizi.Jakarta, PT. Gramedia. 253 p.

Wongsa P, Werukhamkul P. 2007. Product Development and Technical Service,BioSolution International. Thailand: Bangkadi Industrial Park 134/4.

Wiryosuharto SD.1990. Tinjauan Pcnggunaan Antibiotika di Indonesia Saat inidan yang Akan Datang. Bull of Anim Sci.

Yughuchi H, Goto T, Okonogi S. 1992. Fermented milk, lactic drinks andintestinal microfloral. In: Function of Fermented Milk: Challenges for theHealth Science. Y. and A. Hosono (eds). Elsevier Appl.Sci. Publishers Ltd.London.

Zanella G, Alboralli AG, Bardotti P, Candotti F, Guadagnini, Martino PA,Stonfer M. 2000.Severe E. coli O111 septichemia and polyserositis in hensat the start of lay. Avian Pathol. 29: 311−317.

LAMPIRAN

68

Lampiran 1 Komposisi kimia molase

No Komponen Kisaran %) Rata-ata

1 Air 17 – 25 20

2 Sukrosa 30 – 40 35

3 Glukosa 4 – 9 7

4 Fruktosa 5 – 12 9

5 Gula pereduksi 1 – 5 3

6 Karbohidrat lain 2 – 5 4

7 Abu 7 – 15 12

8 Komponen nitrogen 2 – 6 4.5

9 Asam bukan nitrogen 2 – 6 5

10 Lilin, steroid dan fosfolipid 0.1 – 1 0.4

Lampiran 2 Komposisi kimia tepung kedelai

No Komponen Kadar komponen(%)

1 Protein 42.59

2 Nitrogen 6.81

3 Air 4.64

4 Lemak 19.74

5 Magnesium 0.15

6 Mangan 0.16

7 Besi 0.05

8 Seng 0.15

9 Fosfor 1.48

10 Kalsium 0.45

69

Lampiran 3 Komposisi media peremajaan, produksi, serta uji daya hambat isolatasal saluran pencernaan ayam broiler terhadap EPEC K1-1, E. coliasal ayam, Salmonella enteric, Salmonella sp. asal ayam

No Nama media KomposisiJumlah

(g/l)

1 Nutrient agar (NA) Beef extract 3

Bacto peptone 5

Bacto agar 15

2 Nutrient agar (NA) 50% semipadat Beef extract

Bacto peptone

3

5

Bacto agar 9

3 Nutrent Broth (NB) Beef extract 3

Bacto peptone 5

4 Trypticase Soy Agar (TSA) Pangkreatic digest ofcasein

Enzymatic digest ossoybean meal

17

3

Dextrosa 2.5

Sodium chlorida 5

Dipotasium phosphate 2.5

Bacto agar 10

5 Trypticase Soy Broth (TSB) Pangkreatic digest ofcaseinEnzymatic digest ofsoybean meal

17

3

Dextrosa 2.5

Sodium chlorida 5

Dipotasium phosphate 2.5

6 Tripton Glucosa Yeas ekstract

(TGY)

Pangkreatic digest of

casein

5

2.5

70

Yeast ekstract

Dekstrose 1

7 De Mann Rogosa Sharpe (MRS) Glukose 20

Pepton casein 10

Beef ekstract 8

Natrium acetate 3H2O 5

Yeast ekstract 4

K2 HPO4 2

Triamonium sitrat 0.2

MgSO47H2O 0.2

MnSO44H2O 0.05

Sorbitan monooleat /

Tween 80

1

8 TGY modifikasi Soybean meal 5

Yeast ekstract 2.5

Molase 1

9 MRS modifikasi Molase 20

Soy bean meal 10

Beef ekstract 8

Natrium acetate 3H2O 5

Yeast ekstract 4

TSP 2

Urea 0.2

MgSO47H2O 0.2

MnSO44H2O 0.05

71

Lampiran 4 Komposisi Pereaksi Pewarnaan

No. Nama media Komposisi Jumlah (g/l)

1 Pewarnaan Gram

A. Ungu kristal (Hucker’s))

Larutan A Ungu kristal (90%) 2.0 g

Etil alkohol (95%) 20.0 ml

Larutan B Amonium oksalat 0.8 g

Aquades 80.0 ml

B. Iodium Gram Iodium 1.0 g

Kalium iodida ( KI) 2.0 g

Aquades 300.0 ml

C. Etil alkohol 95% Etil alkohol 100% 95.0 ml

Aquades 5.0 ml

D. Safranin Safranin O 0.25ml

Etil alkohol 95% 10.0 ml

Aquades 100.0 ml

2 Pewarnaan spora

A. Malakit Hijau Malakit hijau 50.0 g

Aquades 100.0 ml

B. Safranin Safranin O 0.25ml

Etil alkohol 95% 10.0 ml

Aquades 100.0 ml

72

Lampiran 5 Hasil isolasi dan identifikasi bakteri asal saluran pencernaan ayambroiler pada media NA pH 7

Bakteri target

KodeIsolat

Warnakoloni

Karakteristikkoloni

PewarnaanGram

Bentuk seldan

penataanEndospora

E.coli

S.enteric

EphecK1-1

pH 7

PN.I.3.6 (1) putih b, lc, d tu tu 0 0 0

PN.I.3.2 (2) putih b, ld, c tu tu 0 0 0

PN.I.3.4 (3) putih b, lc, d tu tu 0 0 0



PN.II.2.1 (6) putih b, lc, c tu tu 0 0 0

PN.II.3.1 (7) putih b, ld, c positif steptobasil 1 0 0

PN.II.2.2 (8) putih b, lc, d positif basil 1 0 0

PN.II.3.3 (9) putih tb, lc, d tu tu 1 0 0

PN.II.3.2 (10) putih b, ld, c tu tu 1 0 0

PN.I.3.5 (11) putih b, d, lc tu tu 0 0 0

PN.III.3.1 (12) putih b, lc, c tu tu 1 0 0

PN.III.2.3 (13) putih b, lc, c tu tu 1 0 0

PN.III.3.3 (14) putih b, lc, d tu tu 0 0 0

PN.III.3.4 (15) putih b, lc, c negatif bacilus 1 1 0

PN.I.2.4 (16) bening tb, lc, c tu tu 0 1 0

PN.III (17) krem b, lc, c negatif cocus 1 1 1

PN.III.3.1 (18) Krem sk, lc, bt tu tu 0 0 1

PN.III (19) putih t, tb, tb tu tu 1 0 1

AN.I.2.2 (20) putih b, lc, c tu tu 1 0 1

PN.III.3.5 (21) putih t, lc, b tu tu 1 1 1

PN.III (22) putih t, lc, b tu tu 1 0 0

PN.III (23) putih st, lc, b tu tu 0 0 1

PN.III (24) putih t, lc, b tu tu 1 0 1

PN.III.2.2 (25) putih c, lc, b positif bacilus 1 1 1

PN.III (26) putih st, lc, b tu tu 1 0 1

PN.III (27) putih sk, bo, bt positif basil kecil 1 1 1

PN.III (28) putih t, lc, b negatif cocus 0 0 1

AN.II.3.3 (29) putih t, lc, b tu tu 0 0 1

AN.III.3.3 (30) putih d, bo, tb tu tu 0 0 1

AN.III.3.1 (31) putih d, bo, d tu tu 0 0 1

AN.III.2.3 (32) putih d, lk, tb tu tu 0 0 0

AN.III.1.1(33)a putih c, lc, b tu tu 0 0 1

AN.III.2.2 (34) putih c, lc, b positif bacilus 0 0 1

AN.III.3.1(35) krem tua c, lc, b tu tu 0 0 1

PN.III (36) putih c, lc, b tu tu 0 0 0

PN.III (37) putih c, lc, b tu tu 0 1 0

PN.III (38) krem t, lc, b tu tu 1 0 0

*PN=pengenceran menambahkan pepton pH 7, AA=pengenceran tanpa penambahan pepton, pH 7,I=duodenum, II=ileum, III=intestinum crasum b = bulat; tb = tidak beraturan; lk = berlekuk; lc = licin; ld =berlendir; d = datar; c = cembung; bk = berbukit; sk = seperti kawah; t = timbul; st = seperti tombol; bo =berombak; bl = bentuk L; bt = bundar dengan tepian timbul; k = keriput, tu=tidak diuji/tidak diamati 0=tidakada aktivitas penghambatan, 1=ada aktivitas penghambatan

73

Lampiran 6 Hasil isolasi dan karakterisasi bakteri asal saluran pencernaan ayambroiler yang ditumbuhkan pada pH 4.5

Bakteri targetKodeIsolat

Warnakoloni

KarakteristikKoloni

PewarnaanGram

Bentuk seldan

penataan

Endospora E.

coliS.

entericEphecK1-1

Media pH4.5

PA.III.1.1 (1a) putih b, lk, bk tu tu 0 0 0

PA.III.3.1 (2a)) putih t, bo, bt negatif diplococus 0 1 0

PA.II.3.3(3a)2 putih t, lc, b tu tu 0 0 0

PA.III.4 (4a)) putih t, lc, b negatif cocus 0 1 0

PA.III.1.1 (5a) krem t, lc, b negatif cocus 1 1 0

PA.II.3.2(6a) krem d, bo, bl tu tu 1 0 0

PA.III.1.2 (7a) putih d, bo, bl negatif cocus 1 1 0

PA.III.3.4(8a) putih d, bo, bl tu tu 1 0 0

PA.III.1.5 (9a) krem c, lc, b tu tu 0 0 0

PA.IIII.1.5(10a) putih t, lc, b tu tu 0 1 0

PA.III.1.3 (11a) putih t, lc, b positif cocus 0 1 0

PA.III (12a) putih t, bo, b tu tu 0 0 0

PA.III.1.4 (13a) putih c, lc, b tu tu 0 1 0

PA.III.1.3 (14a) putih c, lc, b tu tu 0 0 0

PA.I.2 .1(15a) putih t, lc, b tu tu 0 1 0

PA.I.2.3 (16a) putih t, lc, bt negatif cocus 0 1 0

PA.III.1.3.4(17a) putih t, lc, b negatif cocus 1 1 0

PA.II.2.7 (18a) putih c, lc, b positif streptobasil 0 1 0

PA.I.3.5 (19a) putih st, lc, b tu tu 0 0 0

PA.III.1.6 (20a) putih b, lk, bk tu tu 1 0 0

PA.I.3.3 (21a) putih b, lc, bk tu tu 1 0 0

PA.II.2.8 (22a) putih b, lc, bk negatif cocus 1 1 0

PA.II (23a) putih b, ld, c tu tu 0 0 0

PA.II (24a) putih b, d, lc tu tu 0 0 0

PA.III.2.2 (25a) putih b, lc, c tu tu 1 0 0

PA.III(26a) putih b, lc, c tu tu 1 0 0

PA.III (27a) putih b, lc, d tu tu 1 1 0

PA.III (28a) putih b, lc, c tu tu 1 0 1

AA.II.3.3 (29a) putih b, lk, bk tu tu 1 1 1

AA.III.3.3 (30a) putih b, lc, bk negatif cocus 1 1 1

AA.II.3.1 (31a) putih b, lc, c tu tu 0 1 0

AA.II.2.3 (32a) putih c, lc, b negatif bacilus 0 1 0

AA.III.1.1(33a) putih st, lc, b tu tu 0 0 1

AA.III.2.2 (34a) putih b, lc, c tu tu 0 0 1

*PA=pengenceran menambahkan pepton pH 4.5, AA=pengenceran tanpa penambahan pepton, pH 4.5,I=duodenum, II=ileum, III=intestinum crasum b = bulat; tb = tidak beraturan; lk = berlekuk; lc = licin; ld =berlendir; d = datar; c = cembung; bk = berbukit; sk = seperti kawah; t = timbul; st = seperti tombol; bo =berombak; bl = bentuk L; bt = bundar dengan tepian timbul; k = keriput, tu=tidak diuji/tidak diamati 0=tidakada aktivitas penghambatan, 1=ada aktivitas penghambatan

74

Lampiran 7 Kurva Standar Isolat 7n

Pengenceran OD Cfu/ml Log

1:1 0.282 1.07 x 10 6 6.029384

1:2 0.22 0.535 x 10 6 5.728354

1:4 0.18 0.2675 x 10 6 5.427324

1:8 0.129 0.103375 x 10 6 5.126294

1:16 0.076 0.066875 x 10 6 4.825264

1:32 0.035 0.034375 x 10 6 4.536243

1:64 0.01 0.016718 x 10 6 4.223204

Kurva standar Isolat 7n pada media NB

y = 0.1534x - 0.6537

R2 = 0.9905

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

4 4.5 5 5.5 6 6.5

log jumlah sel

Ke

rap

ata

ns

el(

OD

)

75

Lampiran 8 Kurva standar isolat 25n

Pengenceran OD Cfu/ml Log1:1

0.394 3.57 x 10 8 8.5526681:2

0.31 1.785 x 10 8 8.2516381:4

0.251 0.8925 x 10 8 7.9506081:8

0.164 0.44625 x 10 8 7.6495781:16

0.11 0.223125x 10 8 7.3485481:32

0.032 0.1115625 x 10 8 7.0475181:64

0.003 0.05578125 x 10 8 6.746488

Kurva standar isolat 25n pada media

NB

y = 0.2219x - 1.5165

R2 = 0.9902

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

6.5 7 7.5 8 8.5

Log jumlah sel

Kera

pata

nsel(O

D)

76



0.291 0.5 x 10 8 7.698971:2

0.217 0.25 x 10 8 7.397941:4

0.154 0.125 x 10 8 7.096911:8

0.11 0.0625 x 10 8 6.795881:16

0.034 0.03125 x 10 8 6.494851:32

0.002 0.015625 x 10 8 6.19382

Kurva standar isolat 27n pada media NB

y = 0.1934x - 1.209

R2 = 0.99

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

6 6.5 7 7.5 8

Log jumlah sel

OD

77



0.318 2.1 x 10 8 8.3222191:2

0.264 1.05 x 10 8 8.0211891:4

0.185 0.525 x 10 8 7.7201591:8

0.131 0.2625 x 10 8 7.4191291:16

0.097 0.133125 x 10 8 7.124261:32

0.036 0.0684375 x 10 8 6.8352941:64

0.007 0.03421875 x 10 8 6.534264

Kurva standar Isolat 34n pada media NB

y = 0.1773x - 1.1686

R2 = 0.9866

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

6 6.5 7 7.5 8 8.5

Log jumlah sel

OD

78

Lampiran 11 Diameter (Ф) zona bening Isolat 7n, 25n, 27n, 34n yang diantagonisdengan EPEC K1-1diinkubasi pada berbagai tingkatan suhu

Isolat 25o

C 30o

C 37o

C 40o

C 50o

C7n 0 0 14.25 14 2325n 0 0 0 14.25 14.2527n 0 0 0 0 1434n 0 0 14.5 14 21.5

Lampiran12 Diameter (Ф) zona bening Isolat 7n, 25n, 27n, 34n yangdiantagonis dengan E. coli diinkubasi pada berbagai tingkatansuhu

Isolat 25o

C 30o

C 37o

C 40o

C 50o

C7n 0 0 13.5 0 025n 0 0 0 11.75 027n 0 0 10 0 034n 0 0 0 0 12

Lampiran 13 Diameter (Ф) zona bening Isolat 7n, 25n, 27n, 34n yangdiantagonis dengan Salmonella enteric diinkubasi pada berbagaitingkatan suhu

Isolat 25o

C 30o

C 37o

C 40o

C 50o

C7n 0 18.5 0 0 18.87525n 0 0 0 0 14.2527n 0 0 0 0 9.534n 0 14.25 4 0 14

Lampiran 14 Diameter (Ф) zona bening Isolat 7n, 25n, 27n, 34n yangdiantagonis dengan Salmonella sp. diinkubasi pada berbagaitingkatan suhu

Isolat 25o

C 30o

C 37o

C 40o

C 50o

C7n 0 0 0 0 025n 0 0 0 0 027n 0 4 0 0 234n 0 8.5 13.5 8 0

[jurnal]...

Documents