isolasi dan skrining fitokimia bakteri endofit dari...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN SKRINING FITOKIMIA BAKTERI

ENDOFIT DARI DAUN RAMBUTAN (Nephelium

lappaceum L.) YANG BERPOTENSI SEBAGAI

ANTIBAKTERI

SKRIPSI

BRASTI EKA PRATIWI

1111102000061

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN SKRINING FITOKIMIA BAKTERI

ENDOFIT DARI DAUN RAMBUTAN (Nephelium

lappaceum L.) YANG BERPOTENSI SEBAGAI

ANTIBAKTERI

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

BRASTI EKA PRATIWI

1111102000061

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Brasti Eka Pratiwi

Nim : 1111102000061

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit Dari Daun

Rambutan (Nephelium Lappaceum L.) Yang Berpotensi

Sebagai Antibakteri

Disetujui oleh :

v

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :


NIM : 1111102000061


Judul Skripsi : Isolasi dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit Dari

Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.) Yang

Berpotensi Sebagai Antibakteri

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Brasti Eka Pratiwi.


Judul : Isolasi dan skrining fitokimia Bakteri Endofit Dari Daun

Rambutan (Nephelium lappaceum L.) Yang Berpotensi

Sebagai Antibakteri.

Tanaman merupakan salah satu sumber daya alam yang digunakan oleh

masyarakat dalam bidang pengobatan. Salah satu tanaman yang digunakan oleh

masyarakat adalah daun rambutan atau dengan nama ilmiah Nephelium

lappaceum L. Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang hidup di dalam

jaringan tanaman dan dapat memproduksi metabolit sekunder. Penelitian ini

bertujuan untuk mengisolasi bakteri endofit dari daun Nephelium lappaceum L.

yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri dan dilakukan skrining metabolit

sekunder dengan reaksi warna pada isolat yang diperoleh. Isolat bakteri endofit

diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis. Hasil dari isolasi bakteri

endofit yang diperoleh diujikan terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 35218,

Salmonella thypimurium ATCC 14028, Stapylococcus aureus ATCC 6633, dan

Bacillus subtilis ATCC 6538 dengan metode difusi agar. Hasil dari penelitian ini

didapatkan 4 isolat bakteri, yaitu DR1, DR2, DR3 dan DR4. Pada isolat DR1,

DR2, dan DR4 menunjukan aktivitas antibakteri dengan adanya zona bening

terhadap semua bakteri uji, dan isolat DR3 tidak memberikan aktivitas

antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Isolat DR1, DR2, DR3 dan

DR4 memberikan hasil negatif terhadap uji terpenoid/steroid, alkaloid, fenolik,

flavonoid, dan tanin.

Kata kunci : Bakteri Endofit, Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.),

Antibakteri, Metabolit Sekunder

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Brasti Eka Pratiwi.

Major : Pharmacy

Title : Isolation and Phytochemical Screening of Bacteria Endophytic

from Rambutan Leaves (Nephelium lappceum L.) Which is a

Potential as Antibacterial Agent

Plants are the resources that often used as the main material of medical

treatment. One of the plants is Rambutan leaves or Nephelium lappaceum L.

Endophytic microbes are microorganism that live within the living tissue of host

plant and can produce its secondary metabolic. The purpose of this research are

to isolate endophytic bacteria from Rambutan leaves as antibacterial agent and

screen the secondary metabolic with colour reaction. Bacterial endophytic was

identified by macroscopic and microscopic method. The result of bacterial

endophytic isolation was examined against Escherichia coli ATCC 35218,

Salmonella thypimurium ATCC 14028, Stapylococcus aureus ATCC 6633, and

Bacillus subtilis ATCC 6538 with diffusion method agar. The result of this

research were 4 isolates, these are DR1, DR2, DR3 and DR4. Isolates DR1, DR2

and DR4 showed antibacterial activity with inhibition zone to all bacteria

pathogens, and isolate DR3 showed no antibacterial activity to Staphylococcus

aureus. Isolates DR1, DR2, DR3 and DR4 showed negative result for

terpenoids/steroids, alkaloids, phenolics, flavonoids, and tannin test.

Keyword: Endophytic Bacteria, Rambutan Leaves (Nephelium lappaceum L.),

Antibacterial, Secondary Metabolic

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamiin, segala puji dan syukur bagi Allah SWT

yang telah melimpahkan rahmat dan ridho-Nya serta shalawat serta salam tak

lupa penulis ucapkan yang terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW, yang

begitu besar sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini

hingga selesai.

Skripsi yang berjudul “Isolasi dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit

Dari Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.) yang Berpotensi Sebagai

Antibakteri” disusun dalam rangka memenuhi persyaratan untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih dan

penghargaan sebesar-besarnya kepada :

1. Dr. Arief Sumantri, S.KM., M.KM, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Jakarta.

2. Yardi, Ph.D., Apt, selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Jakarta.

3. Ibu Eka Putri, M.Si.,Apt, selaku pembimbing I dan Bapak Saiful

Bahri, M.Si selaku pembimbing II yang telah tulus ikhlas serta

kesabaran dalam membimbing, memberikan nasehat serta ilmu

kepada saya sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.

4. Bapak serta Ibu Dosen Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, terima kasih atas ilmu dan nasehat selama ini yang telah

diberikan kepada penulis.

5. Kedua orangtuaku tercinta, Papa Mochamad Basuki dan Mama Entik

Sumartini, dan kakakku tersayang Mas Barri Eko Pratama, terima

kasih atas doa dan dukungan baik moral maupun material dari mulai

kuliah hingga akhir sampai terwujudnya skripsi ini.

6. Mbak Puji, Mbak Festi, Kak Amal, Kak Rama, Kak Tiwi, Kak Lisna,

Kak Eris dan Pak Rachmadi, terimakasih atas semua saran dan

bantuannya selama penelitian.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Fio, Fiza, Astri, Mahar, Diyah, Achi, Rhesa, Haidar, Reza, Sutar,

Novi, Henny dan Irun, terima kasih atas bantuan secara moral dan

tenaga selama kuliah dan penelitian, sehingga skripsi ini dapat

selesai.

8. Arini, Meri, Ambar, Ati, Rachma, Puput, Imeh dan teman-teman

Mikrobiologi 2011 lainnya, terima kasih atas kerja sama kalian

selama ini serta suka dan duka yang telah kita lalui sehingga skripsi

ini selesai.

9. Tatiana, Prasasti, Dilla dan teman-teman IPA DUA lainnya, terima

kasih karena telah memotivasi, memberi canda, dan tawa.

10. Teman-teman seperjuangan Farmasi 2011 yang tidak dapat

disebutkan satu persatu, terima kasih telah membantu menyemangati

penulis hingga skripsi ini terselesaikan.

11. Serta pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang

telah memberikan dukungan hingga terwujudnya skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, namun

penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahun pada umumnya dan ilmu Farmasi pada

khususnya.

Jakarta, 12 Juni 2015

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1111102000061


Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi kepentingan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul :

Isolasi dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit Dari Daun Rambutan

(Nephelium lappaceum L.) Yang Berpotensi Sebagai Antibakteri

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak

Cipta.

Demikian persyaratan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .......................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................ vi

ABSTRACT .................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR .................................................................................. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................. x

DAFTAR ISI .................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv

BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ............................................................ 3

1.3 Hipotesis ............................................................................................... 3

1.4 Tujuan Penelitian ................................................................................. 3

1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 4 2.1 Rambutan (Nephelium lappaceum L.) ................................................. 4

2.2 Tinjauan Tentang Bakteri ..................................................................... 6

2.2.1 Bakteri Gram Positif dan Negatif ................................................ 6

2.2.2 Tahapan Siklus Bakteri ............................................................... 6

2.2.3 Teknik Pewarnaan ....................................................................... 7

2.3. Metabolit Sekunder .............................................................................. 8

2.3.1 Metabolit Sekunder Tanaman ..................................................... 8

2.3.2 Metabolit Sekunder Mikroorganisme ........................................ 11

2.4 Bakteri Endofit ................................................................................... 12

2.4.1 Interaksi Mikroba Endofit Dengan Tanaman ............................ 13

2.4.2 Peranan Bakteri Endofit ............................................................ 13

2.4.3 Mikroba Endofit Penghasil Metabolit Sekunder ....................... 14

2.4.4 Isolasi Bakteri Endofit .............................................................. 15

2.4.5 Fermentasi Bakteri Endofit ....................................................... 15

2.5 Bakteri Uji .......................................................................................... 16

2.6 Uji Aktivitas Antimikroba ................................................................. 21

2.6.1 Metode Difusi ........................................................................... 21

2.7 Antibakteri Pembanding .................................................................... 22

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 23

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 23

3.2 Alat dan Bahan ................................................................................... 23

3.2.1 Alat ............................................................................................ 23

3.2.2 Bahan ........................................................................................ 23

3.2.3 Determinasi Tanaman ............................................................... 24

3.3 Metode Penelitian .............................................................................. 24

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.1 Skrining Fitokimia Daun Nephelium lappaceum Segar ............ 24

3.3.2 Sterilisasi Alat ........................................................................... 26

3.3.3 Pembuatan Media ...................................................................... 26

3.3.3.1 Nutrient Agar (NA) ........................................................... 26

3.3.3.2 Nutrient Broth (NB) .......................................................... 26

3.3.3.3 Mueller-Hinton Agar (MHA) ............................................ 27

3.3.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ............................. 27

3.3.5 Isolasi Bakteri Endofit .............................................................. 27

3.3.6 Pemurnian Isolat Bakteri ........................................................... 27

3.3.7 Pembuatan Stock Culture dan Working Culture ........................ 28

3.3.8 Identifikasi Bakteri Endofit ....................................................... 28

3.3.9 Identifikasi Bakteri Uji .............................................................. 29

3.3.10 Fermentasi Bakteri Endofit ..................................................... 29

3.3.11 Uji Fitokimia Isolat Hasil Fermentasi (Adiarti, 2013) ............ 29

3.3.12 Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................... 30

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 32

4.1 Determinasi Daun Rambutan ................................................................ 32

4.2 Skrining Fitokimia Daun Nephelium lappaceum L. Segar .................... 32

4.3 Isolasi, Pemurnian dan Peremajaan Bakteri Endofit ............................. 36

4.4 Identifikasi Bakteri Endofit ................................................................... 38

4.5 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ............................................................ 38

4.6 Fermentasi Isolat Bakteri Endofit .......................................................... 40

4.7 Skrining Fitokimia Bakteri Endofit ....................................................... 40

4.8 Uji Aktivitas Antibakteri ....................................................................... 42

BAB V. PENUTUP ......................................................................................... 46

5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 46

5.2 Saran ...................................................................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 47

LAMPIRAN .................................................................................................... 52

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.) ..................................... 4

Gambar 2. Struktur Utama Flavonoid ................................................................ 9

Gambar 3. Staphylococcus aureus Perbesaran 1000x ....................................... 17

Gambar 4. Bacillus subtilis Perbesaran 1000x .................................................. 19

Gambar 5. Escherichia coli Perbesaran 1000x ................................................. 20

Gambar 6. Salmonella thypimurium Perbesaran 1000x .................................... 21

Gambar 7. Daun Segar Rambutan .................................................................... 32

Gambar 8. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Segar dengan n – heksana ......... 35

Gambar 9. Isolasi Daun Rambutan Hari ke – 0 ................................................ 37

Gambar 10. Pemurnian Isolat Bakteri Endofit ................................................. 37

Gambar 11. Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ................................................... 39

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Ciri Bakteri Gram positif dan Gram negatif ........................................ 6

Tabel 2. Tabel Pewarnaan Gram ......................................................................... 8

Tabel 3. Hasil Uji Skrining Metabolit Sekunder Daun Segar .......................... 33

Tabel 4. Identifikasi Bakteri Endofit ................................................................ 38

Tabel 5. Skrining Metabolit Sekunder Bakteri Endofit ................................... 41

Tabel 6. Zona Hambat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Uji .......................... 43

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Determinasi Daun Rambutan ........................................................ 52

Lampiran 2. Skema Kerja Penelitian ............................................................... 53

Lampiran 3. Sterilisasi Permukaan Daun ......................................................... 54

Lampiran 4. Pemurniaan dan Identifikasi Isolat ............................................... 55

Lampiran 5. Fermentasi Bakteri Endofit .......................................................... 56

Lampiran 6. Uji Aktivitas Antibakteri ............................................................. 57

Lampiran 7. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Pada Daun Rambutan .................... 58

Lampiran 8. Hasil Pemurnian Isolat Bakteri Endofit ....................................... 59

Lampiran 9. Skrining Fitokimia Daun Segar ................................................... 60

Lampiran 10. Uji Katalase Isolat ..................................................................... 61

Lampiran 11. Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................... 62

Lampiran 12. Identifikasi Isolat Bakteri Endofit ............................................. 64

Lampiran 13. Identifikasi Bakteri Uji .............................................................. 65

Lampiran 14. Karakteristik Koloni Bakteri Pada Media Agar ......................... 66

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman merupakan salah satu sumber daya yang sangat penting dalam

upaya pengobatan dan upaya mempertahankan kesehatan pada masyarakat.

Masyarakat masih sering menggunakan pengobatan tradisional yang berasal dari

tanaman obat. Indonesia dikenal sebagai salah satu negara yang mempunyai

keanekaragaman hayati yang tinggi, maka dari itu nilai potensial untuk

mengembangkan obat herbal yang berasal dari tanaman obat sangat besar. Sudah

banyak tanaman obat yang digunakan untuk bahan baku obat, karena tanaman

tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas biologis yang

beraneka ragam, serta mempunyai potensi besar untuk digunakan dan

dikembangkan menjadi obat untuk berbagai penyakit, seperti contohnya pada

tanaman rambutan.

Tanaman Rambutan atau dengan nama Latin Nephelium lappaceum

(Sapindaceae), merupakan tanaman buah yang tumbuh pada daerah iklim tropis.

Rambutan berasal dari Indonesia dan Malaysia, dan mulai berkembang ke

Filipina, Singapura, Thailand, Vietnam, India, Syria, Zaire, Afrika Selatan,

Madagaskar dan Australia (Tindall, 1994 dan Arenas dkk., 2010). Buah rambutan

banyak dikonsumsi dan digunakan oleh masyarakat, baik buahnya atau bagian lain

dari tanaman tersebut. Secara tradisional, seluruh bagian tanaman rambutan

mempunyai khasiat tersendiri. Seperti pada bagian biji buah rambutan yang bisa

digunakan sebagai anti diabetes, batang yang dapat digunakan sebagai pengobatan

kanker, daun digunakan sebagai antidiare serta digunakan untuk menghitamkan

rambut, dan akar untuk menurunkan demam (Muhtadi dkk., 2013).

Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan uji aktivitas antibakteri dan

skrining metabolit sekunder pada daun rambutan. Menurut penelitian yang

dilakukan oleh Maradona (2013) pada ekstrak etanol 70% daun rambutan

mengandung saponin, tanin, dan flavonoid, dengan zona hambat 15 mm pada

konsentrasi 100 ppm. Sementara menurut penelitian Dharmadewi

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(2014) dikatakan bahwa pada daun rambutan mengandung metabolit sekunder

yaitu steroid, flavonoid, polifenol, saponin dan tanin.

Metabolit sekunder adalah senyawa yang dihasilkan oleh tanaman, yang

mempunyai peran biologis dan ekologi, terutama digunakan sebagai pembawa

pesan dan senyawa pelindung untuk tanaman itu sendiri (Jones dkk., 2012). Pada

umumnya, tanaman yang mempunyai metabolit sekunder diharapkan mempunyai

fungsi sebagai obat. Metabolit sekunder diproduksi oleh tanaman bukan sebagai

kebutuhan hidup utamanya atau senyawa ini biasanya diproduksi oleh tanaman

sebagai bagian dari sistem pertahanan dirinya, baik terhadap perubahan

lingkungan maupun serangan penyakit (Tisnadjaja, 2006). Pada manusia,

metabolit sekunder dapat digunakan untuk menangani berbagai macam penyakit,

seperti saponin digunakan sebagai antikolesterol (Forester, 2006), flavonoid

sebagai anti diare (Schuier, 2005).

Pada tanaman terdapat mikroorganisme yang dapat memproduksi berbagai

metabolit sekunder yang mempunyai kemampuan sebagai antibakteri. Sumber

daya mikroorganisme yang terdapat di dalam jaringan tanaman mulai dikenal

dengan sebutan mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroorganisme yang

seluruh atau sebagian hidupnya berada dalam jaringan tumbuhan (batang, cabang

atau ranting tumbuhan), dimana diantara keduanya terjalin hubungan yang saling

menguntungkan (Kumala dkk., 2006). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa

biologi atau metabolit sekunder. Kemampuan mikroba endofit memproduksi

senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, merupakan peluang

yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder

dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman tersebut (Radji, 2005). Maka,

apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman dapat menghasilkan metabolit

sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih

tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai

simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu yang relatif lama untuk dipanen

(Radji, 2005).

Dari latar belakang tersebut, maka akan dilakukan penelitian tentang

isolasi mikroba endofit dari daun Rambutan dan akan diuji aktivitas

3


antibakterinya. Isolat yang mempunyai aktivitas antibakteri akan dilakukan

skrining fitokimia untuk membuktikan bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan

pada daun rambutan berasal dari bakteri endofit.

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah

Hingga saat ini, belum adanya penelitian mengenai isolasi, skrining

fitokimia dan uji aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit dari daun Rambutan

(Nephelium lappaceum L.).

1.3 Hipotesis

1. Didapatkan bakteri endofit dari isolasi Daun Rambutan (Nephelium

lappaceum L.)

2. Bakteri endofit mempunyai kandungan senyawa metabolit sekunder yang

sama dengan tanaman aslinya

3. Zat antimikroba dari bakteri endofit yang diisolasi dari daun rambutan

mampu menghambat pertumbuhan mikroba patogen Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Salmonella thypimurium.

1.4 Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan isolat bakteri endofit dari daun Rambutan (Nephelium

lappaceum L.).

2. Mengetahui metabolit sekunder dari daun Rambutan dan isolat bakteri

endofit.

3. Mengetahui kemampuan zat antibakteri dari isolat bakteri endofit terhadap

bakteri patogen.

1.5 Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi aktivitas antibakteri yang poten dari isolat bakteri

endofit daun rambutan yang tumbuh di Indonesia terhadap bakteri

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Salmonella

thypimurium.

2. Mengetahui metabolit sekunder yang dihasilkan oleh isolat bakteri daun

rambutan.

3. Sebagai informasi tambahan pada peneliti lain mengenai bakteri endofit.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rambutan (Nephelium lappaceum L.)

Menurut Rukmana dkk., (2002), taksonomi tumbuhan rambutan

dikelompokan dalam klasifikasi :

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Sapindales

Famili : Sapindaceae

Genus : Nephelium

Spesies : Nephelium lappaceum L.

Rambutan berasal dari Malaysia dan Indonesia, namun lokasi tepatnya

tidak diketahui. Rambutan mulai menyebar ke Asia Tenggara, dan banyak

terdapat di daerah tropis seperti India, Sri Lanka, Zanzibar, bagian dataran

rendah Amerika Selatan, Australia Selatan, Papua Nugini, Kepulauan Pasifik,

dan Hawai (Lim, 2013).

Gambar 1. Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.) (Dokumentasi pribadi)

Nephelium lappaceum tergolong tanaman yang berbunga banyak.

Bunganya dapat berbentuk bunga jantan atau bunga sempurna yang tersusun

dalam suatu malai bunga atau panicula. Tanaman rambutan merupakan jenis

pohon berukuran sedang dengan tinggi 12-25 meter. Pohon rambutan menyukai

5


suhu tropika hangat (Kalie, 1994). Suhu optimum pertumbuhan pohon rambutan

yaitu antara 20-32oC, dan kelembapan harus sekitar 80% (Lim, 2013).

Rambutan mempunyai nama daerah antara lain : Rambot (Aceh,

Sumatra), Barangkasa (Maluku), Buiuwan (Bali), Jailan Rambutan (Batak),

Rambuta (Bima, Timor), Rambuten (Gajo, Sumatra), Rambutan (Jawa), Buwa

Buluwan (Kambang), Puru Bianjak (Kubu, Kalimantan), Hayuham, Kakapas,

Likes, Rabut, Rambuta, Rambutan, Takuyung alu (Lampung, Sumatra) (Lim,

2013).

Pada buah rambutan mempunyai aktivitas sebagai antihiperglikemi

dengan senyawa aktif yang teridentifikasi adalah geraniin dan ellagitanin

(Palanisamy dkk., 2011). Pada daun rambutan terdapat senyawa metabolit

sekunder antioksidan yaitu fenol (Sidker dkk., 2013). Sedangkan penelitian yang

dilakukan Dalimartha (2003) bahwa daun rambutan mengandung senyawa tanin

dan saponin. Menurut penelitian Maradona (2013) dengan menggunakan etanol

70%, bahwa ekstrak daun rambutan mengandung senyawa steroid, flavonoid,

polifenol, hidrokuinon, saponin dan tanin.

Secara tradisional, daun rambutan digunakan oleh masyarakat Ulu

Legong, Kedah, Malaysia, sebagai sebagai obat penurun panas yang disebabkan

oleh penyakit flu dengan cara menumbuk daun rambutan (Mohammad dkk.,

2012). Kegunaan lain adalah kulit buah digunakan sebagai penurun panas dan

disentri, biji digunakan sebagai penurun gula darah (anti diabetes), daun

digunakan sebagai pengobatan diare dan penghitam rambut, akar digunakan

sebagai penurun panas (Muhtadi dkk., 2013), kulit kayu digunakan untuk

mengatasi sariawan (Dalimartha, 2003).

Pada penelitian yang dilakukan Maradona (2013) tentang aktivitas

antibakteri daun rambutan menggunakan ekstrak pelarut etanol 70% terhadap

bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25926 yang memberikan zona hambat

pertumbuhan rata-rata sebesar 15 mm pada konsentrasi 100 ppm.

6


2.2 Tinjauan Tentang Bakteri

Bakteri merupakan sel prokariot yang khas, uniseluler dan tidak

mengandung struktur yang membatasi membran di dalam sitoplasmanya.

Reproduksi utama dengan pembelahan biner sederhana yaitu suatu proses

aseksual. Morfologi bakteri terdiri dari tiga bentuk, yaitu sferis (kokus), batang

(basil) dan spiral. Ukuran bakteri bervariasi tetapi pada umumnya berdiameter

sekitar 0.5-1.0 µm dan panjang 1.5-2.5 µm (Pelczar & Chan, 2008).

2.2.1 Bakteri Gram Positif dan Negatif

Berdasarkan komposisi dinding selnya, bakteri dibagi menjadi dua

golongan : bakteri Gram positif dan Gram negatif (Goering dkk., 2008).

Tabel 1. Ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Pelczar & Chan, 2008).

Ciri Perbedaan Relatif

Gram Positif Gram Negatif

Struktur dinding sel Tebal (15-80 nm)

Berlapis tunggal (mono)

Tipis (10-15 nm)

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%)

Peptidoglikan ada sebagai lapisan

tunggal; komponen utama lebih dari

50% berat kering pada beberapa sel

bakteri

Asam tekoat

Kandungan lipid tinggi (11-

22%)

Peptidoglikan ada di dalam

lapisan kaku sebelah dalam;

jumlahnya sedikit, merupakan

sekitar 10% berat kering

Tidak ada asam tekoat

Kerentanan Terhadap

penisillin

Lebih rentan Kurang rentan

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak spesies Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

2.2.2 Tahapan Siklus Bakteri

Waktu generasi adalah waktu yang diperlukan oleh mikroorganisme

untuk meningkatkan jumlah sel menjadi dua kali lipat jumlah semula.

Pertumbuhan bakteri dinyatakan secara grafik dengan logaritma jumlah sel

terhadap waktu. Terdapat empat macam fase pertumbuhan mikroorganisme,

7


yaitu fase lag, fase log (fase eksponensial), fase stasioner dan fase kematian

(Pelczar, 2008 dan Pratiwi, 2008).

a. Fase lag

Merupakan fase adaptasi, yaitu fase penyesuaian mikroorganisme pada

suatu lingkungan baru. Ciri fase lag adalah tidak adanya peningkatan

jumlah sel, yang ada hanyalah peningkatan ukuran sel dan sel mengalami

perubahan dalam komposisi kimiawi.

b. Fase log (eksponensial)

Merupakan fase dimana mikroorganisme tumbuh dan membelah pada

kecepatan maksimum, tergantung pada genetika mikroorganisme, sifat

media, dan kondisi pertumbuhan. Sel baru terbentuk dengan laju konstan

dan massa yang bertambah secara eksponensial. Aktivitas metabolik yang

dihasilkan seimbang. Bila nutrisi dalam kultur habis, laju pertumbuhan

dapat terhambat, sehingga hasil metabolisme yang bersifat racun akan

tertimbun dan menghambat pertumbuhan.

c. Fase stasioner

Pertumbuhan mikroorganisme berhenti dan terjadi keseimbangan antara

jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati. Pada fase ini

terjadi akumulasi produk buangan yang toksik.

d. Fase kematian

Yaitu jumlah sel yang mati lebih cepat daripada terbentuknya sel baru.

Faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi

produk buangan yang toksik.

2.2.3 Teknik Pewarnaan

Tujuan dilakukan pewarnaan adalah (Pelczar & Chan, 2008) :

1. Mengamati dengan lebih baik bentuk sel mikroorganisme secara kasar

2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme

3. Membantu mengindetifikasi dan membedakan organisme yang serupa.

a. Pewarnaan Gram

Merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling

penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Pertama kali diuraikan

8


dalam publikasi pada tahun 1884 oleh ahli bakteriologi Christian Gram

yang berasal dari Denmark. Bakteri yang diwarnai dengan metode Gram

dibagi menjadi dua kelompok. Pada kelompok bakteri Gram positif

mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan tampak berwarna ungu

tua. Sedangkan pada kelompok bakteri Gram negatif akan terjadi

kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi

warna merah safranin, tampak berwarna merah.

Tabel 2. Tabel Pewarnaan Gram (Pelczar & Chan, 2008)

Larutan Dan

Urutan

Penggunaannya

Reaksi pada Bakteri

Gram Positif Gram Negatif

1. Ungu kristal

(UK)

Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu

2. Larutan

yodium (Y)

Komplek UK-Y terbentuk di dalam sel;

sel tetap berwarna ungu

Kompleks UK-Y tebentuk di dalam

sel; sel tetap berwarna ungu

3. Alkohol Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-

pori menciut; daya rembes dinding sel

dan membran menurun, UK-Y tak

dapat keluar dari sel; sel tetap berwarna

ungu

Lipid terekstraksi dari dinding sel,

pori-pori mengembang, kompleks

UK-Y keluar dari sel; sel menjadi

tak berwarna

4. Safranin Sel tak terpengaruhi, tetap ungu. Sel menyerap zat pewarna, menjadi

merah.

2.3 Metabolit Sekunder

2.3.1 Metabolit Sekunder Tanaman

Metabolit sekunder diproduksi tanaman sebagai bagian dari sistem

pertahanan diri, baik terhadap perubahan lingkungan atau serangan penyakit

(Tisnadjaja, 2006). Fungsi dari metabolit sekunder mulai menarik perhatian

karena bisa digunakan sebagai sistem pertahanan diri dari herbivora dan infeksi

mikroba, sebagai atraktan untuk penyerbukan, agen alelopati, penghalang sinar

UV dan molekul sinyal dalam pembentukan nitrogen pada nodul akar di tanaman

kacang-kacangan. Metabolit sekunder juga menarik penggunaannya sebagai

pewarna, serat, perekat, minyak, lilin, agen penyedap, obat-obatan dan parfum.

Metabolit sekunder dipandang sebagai sumber potensial alami untuk obat batu

9


ginjal, antibiotik, insektisida dan herbisida (Croteau dkk., 2000 dan Dewick,

2002).

a. Flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa yang paling kuat dan sebagai

antioksidan paling efektif untuk digunakan oleh manusia, dan karena

manusia tidak dapat memproduksi flavonoid, maka bisa didapatkan dari

suplemen makanan. Penelitian dilakukan bahwa konsumsi makanan

secara normal dari buah dan sayuran, cukup untuk kebutuhan radikal

bebas yang dibutuhkan oleh manusia. Kegunaan flavonoid dirangkum

oleh Patel (2008) adalah sebagai antioksidan, antiatherosklerosis,

antiplatelet, antitrombogenik, antivirus, antiinflamasi, antiartritis,

antidiare, dll.

Flavonoid banyak terdapat pada jaringan epidermis daun dan kulit

buah dengan kegunaan yang bervariasi dan bersifat penting. Pada

tumbuhan, flavonoid berguna sebagai pelindung sinar UV, pigmentasi,

stimulasi pembentukan nitrogen di nodul dan ketahanan terhadap

penyakit (Koes dkk, 1994; Pierpoint, 2000). Flavonoid dibagi menjadi

flavon, flavonol, 3-flavanol, isoflavon, flavanon dan antosianidin

(Crozier, 2006).

Gambar 2. Stuktur utama flavonoid (Crozier, 2006)

b. Tanin

Tanin merupakan kelompok besar senyawa kompleks yang

didistribusikan merata pada berbagai tanaman (Harbone, 1987). Menurut

10


Makkar (2003), tanin biasa terdapat pada bagian tanaman yang spesifik

seperti daun, buah, kulit dahan dan batang. Tanin merupakan senyawa

polifenolik, yang secara garis besar dibagi menjadi dua kelompok, yaitu :

i. Tanin terhidrolisa yang mempunyai inti pusat karbohidrat dengan

asam karboksiklat fenolik berikatan dengan ester, potensial

beracun ke hewan karena dapat menyebabkan toksisitas pada

ginjal dan hati bila terakumulasi banyak dan menyebabkan

kematian pada hewan;

ii. Tanin terkondensasi atau protoantosianin yang mempunyai

oligomer 2- atau 3-flavanol, seperti katekin, epikatekin, atau

gallokatekin.

Tanin memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk protein dan

komplek tanin-protein (McSweeney, 2003). Tanin adalah polifenol

tanaman yang berfungsi mengikat dan mengendapkan protein. Tanin juga

digunakan untuk menyamak kulit (Harbone, 1987).

c. Saponin

Saponin merupakan senyawa yang secara struktural mempunyai

steroid dan triterpenoid aglikon (sapogenin) yang berikatan dengan satu

atau lebih oligosakarida dengan ikatan glikosida. Aktivitas biologi

saponin adalah untuk interaksi dengan komponen seluler dan membran.

Contohnya adalah saponin dapat menghemolisis sel darah merah dengan

interaksi nonspesifik dengan protein membran, fosfolipid, dan kolesterol

di eritrosit (Croizer, 2006).

Saponin dikarakteristik berdasarkan aktivitas homolitik dan foaming,

dan memberikan rasa pahit dan menggigit (astrigensia) pada tanaman

dengan kandungan saponin tinggi. Saponin mempunyai permeabilitas

terhadap sel mukosa usus halus dan sebagai transpor nutrisi. Saponin juga

dapat menghambat enzim pencernaan, seperti tripsin dan kimotripsin, dan

juga menghambat degradasi protein dengan membentuk komplek

saponin-protein (Makkar dkk., 2006).

11


d. Alkaloid

Alkaloid adalah senyawa pertama dan paling banyak digunakan

dalam farmasi, sebagai senyawa tumbuhan yang mengandung nitrogen

(Meissner, 1819). Menurut Ladenburg, alkaloid adalah senyawa yang

berasal dari tumbuhan yang mempunyai sifat dasar dan mengandung

sedikitnya satu nitrogen pada cincin heterosiklik. Fungsi alkaloid pada

tumbuhan yaitu :

i. Agen beracun pada tanaman yang digunakan sebagai agen

pelindung dari hewan herbivora atau serangga

ii. Sebagai faktor pertumbuhan tanaman

iii. Cadangan makanan pada tumbuhan untuk pasokan nitrogen dan

unsur-unsur lain.

Pada manusia, alkaloid berguna untuk analgesik narkotik (morfin),

ekspektoran, analgesik (kodein), stimulan SSP (brusin, striknin),

midriatik (atropine, homotropin), miotik (pilokarpin, fisostigmin),

hipertensi (efedrin), hipotensi (reserpin) (Kar, 2003).

e. Fenolik

Fenolik memiliki cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus

hidroksi (OH) dan gugus-gugus lain penyertanya. Senyawa ini diberi

nama berdasarkan nama senyawa induknya, yakni fenol. Sebagian besar

senyawa fenol memiliki gugus hidroksi lebih dari satu sehingga disebut

polifenol.

Fenolik dapat diklasifikasikan ke dalam komponen yang tidak larut

seperti lignin dan komponen yang larut seperti asam fenolik,

phenylopropanoids, flavonoid dan kuinon (Indrawati, 2013).

2.3.2 Metabolit Sekunder Mikroorganisme

Metabolit sekunder adalah suatu molekul atau produk metabolik yang

dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme di mana produk

metabolit tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok mikroorganisme untuk

hidup dan tumbuh.

12


Fungsi metabolit sekunder bagi mikroorganisme penghasil itu sendiri

sebagian besar belum jelas. Metabolit sekunder dibuat dan disimpan secara

ekstraseluler. Metabolit sekunder banyak dimanfaatkan oleh manusia dan

makhluk hidup lain karena banyak diantaranya bersifat sebagai obat, pigmen,

vitamin, ataupun hormon.

Metabolit sekunder tidak diproduksi pada saat pertumbuhan sel secara

cepat (fase logaritmik), tetapi disintesis pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu

pada fase stasioner saat populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama

dengan jumlah sel yang mati. Pada fase ini sel mikroorganisme lebih tahan

terhadap keadaan ekstrem, misalnya suhu yang lebih panas atau dingin, radiasi,

bahan-bahan kimia, dan metabolit yang dihasilkannya sendiri (misalnya

antibiotik). Ciri-ciri metabolit sekunder adalah :

1. Dibuat melalui proses metabolisme sekunder;

2. Diproduksi selama fase stasioner;

3. Fungsi bagi organisme penghasil belum jelas, diduga tidak berhubungan

dengan sintesis komponen sel atau pertumbuhan;

4. Dibuat dan disimpan secara ekstrseluler;

5. Hanya dibuat oleh spesies tertentu dan dalam jumlah terbatas;

6. Umumnya diproduksi oleh fungi filamentus dan bakteri pembentuk

spora;

7. Merupakan kekhasan bagi spesies tertentu;

8. Biasanya berhubungan dengan aktivitas antimikroba, enzim spesifik,

penghambatan, pendorongan pertumbuhan dan sifat-sifat farmakologis.

2.4 Bakteri Endofit

Endofit berasal dari bahasa Yunani, “endo” berarti di dalam dan “fit”

(phyte) berarti tumbuhan. Bakteri endofit hidup dalam jaringan vaskular

tumbuhan tanpa menyebabkan efek negatif. Hubungan simbiosis metabolisme

antara bakteri dan tumbuhan memungkinkan bakteri menghasilkan senyawa

bioaktif yang sama seperti terkandung di dalam tumbuhan inangnya (Barbara

dan Christine, 2006).

Mikroorganisme endofit tersebut merupakan mikroorganisme yang dapat

diekstrak dari bagian dalam tanaman atau diisolasi dari biji, akar, batang dan

13


ranting, serta kulit kayu dari berbagai macam jenis tanaman (Tarabily dkk.,

2003).

Awalnya keberadaan mikroba endofit diduga bersifat netral, maksudmya

tidak memberikan pengaruh baik manfaat maupun kerusakan yang ditimbulkan

terhadap tanaman. Ternyata setelah para peneliti mulai mempelajari lebih

mendalam, ada hubungan simbiosis mutualisme antara mikroba endofit dengan

tanaman inang terutama peranannya yang sangat penting dalam melindungi

tanaman inang terhadap predator dan patogen (Prasetyoputri dan Atmosukarto,

2006).

2.4.1 Interaksi Mikroba Endofit Dengan Tanaman

Interaksi mikroba endofit dengan inangnya yang ditemukan pada bagian

organ tumbuhan tertentu, berhubungan erat dengan siklus hidup yang dilaluinya.

Masuknya mikroba endofit pada jaringan tanaman inang tergantung pada

keberhasilan mikroba tersebut menembus lapisan eksternal inangnya. Proses

masuknya mikroba endofit ini dicapai melalui mekanisme pemecahan atau

degradasi jaringan pelindung pada lapisan kutikula dan epidermis (Bacon dan

Siegel, 1990).

Proses masuknya mikroba endofit ke dalam jaringan tanaman inang

terjadi secara langsung dan tidak langsung. Secara langsung ditandai dengan

masuknya endofit ke dalam bagian internal jaringan pembuluh tanaman dan

diturunkan melalui biji, sedangkan secara tidak langsung mikroba endofit hanya

menginfeksi bagian eksternal yaitu pada bagian pembungaan (Bacon, 1985).

2.4.2 Peranan Bakteri Endofit

Senyawa antimikroba tidak hanya dapat dihasilkan oleh tumbuhan

maupun hewan, akan tetapi dapat juga berasal dari mikroba. Salah satu yang

berpotensi tersebut adalah bakteri endofit (Nursanty, 2012). Bakteri endofit

berperan untuk stimulasi pertumbuhan tumbuhan melalui sekresi regulator

hormon pertumbuhan seperti asam indol-asetat, mensuplai vitamin esensial yang

dibutuhkan tumbuhan, fiksasi nitrogen dan induksi ketahanan terhadap patogen

tanaman (Rodoles, 1993 dan Hung, 2004).

14


2.4.3 Mikroba Endofit Penghasil Metabolit Sekunder

Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba

endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder

yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic

recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan dkk.,

2001). Sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-

masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari

bakteri dan jamur (Strobel dkk., 2003). Apabila endofit yang diisolasi dari suatu

bagian tanaman dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman

aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi. Contoh mikroba endofit

yang menghasilkan aktivitas :

a. Antibiotika : Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh

mikroba endofit Cryptosporiopsis quercina yang diisolasi dari tanaman

obat Tripterigeum wilfordii dan berkhasiat sebagai antijamur yang

patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton sp.

(Strobel dkk., 1999 dalam Radji, 2005).

b. Antivirus : jamur endofit Cytonaema sp. dapat menghasilkan metabolit

cytonic acid A dan B dengan struktur molekul isomer p-tridepside, yang

berkhasiat sebagai anti virus. Cytonic acid A dan B merupakan protease

inhibitor dan dapat menghambat pertumbuhan cytomegalovirus manusia

(Guo dkk., 2000 dalam Radji, 2005).

c. Antidiabetes : endofit Pseudomassaria sp. yang diisolasi dari hutan

lindung, menghasilkan metabolit sekunder yang bekerja seperti insulin

(Zhang dkk. 1999 dalam Radji, 2005).

d. Antimalaria : Colletotrichum sp. merupakan endofit yang diisolasi dari

tanaman Artemisia annua, menghasilkan metabolit artemisinin yang

sangat potensial sebagai anti malaria (Lu dkk., 2000 dalam Radji, 2005).

e. Antikanker : Paclitaxel dan derivatnya merupakan zat yang berkhasiat

sebagai antikanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh

mikroba endofit, diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang

diisolasi dari tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana

(Strobel dkk, 2002 dalam Radji, 2005).

15


f. Antioksidan : Pestacin dan isopestacin merupakan metabolit sekunder

yang dihasilkan oleh endofit P. microspora. Endofit ini berhasil diisolasi

dari tanaman Terminalia morobensis, yang tumbuh di Papua Nugini.

Baik pestacin atau isopestacin berkhasiat sebagai antioksidan, dimana

aktivitas ini diduga karena struktur molekulnya mirip dengan flavonoid

(Strobel dkk., 2002 dalam Radji, 2005).

2.4.4 Isolasi Bakteri Endofit

Prosedur untuk mengisolasi endofit pada umumnya relatif mudah. Salah

satu hal yang penting dalam mengisolasi bakteri endofit adalah mempertahankan

kesegaran sampel. Bila sampel disimpan dalam waktu yang cukup lama, akan

terjadi kematian jaringan. Meskipun demikian, masih memungkinkan untuk

mengisolasi sejumlah kapang endofit dari jaringan yang telah layu setelah

penyimpanan beku (Freezing) dalam waktu lebih dari satu tahun.

Isolasi bakteri endofit diawali dengan sterilisasi permukaan. Sterilisasi

permukaan bertujuan untuk mengeliminasi mikroba yang terkandung pada

permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dilakukan dengan cara mencuci

keseluruhan tanaman dengan air bersih yang mengalir selama 10 menit.

Kemudian bagian – bagian tanaman, seperti daun, batang, buah, akar atau

rimpang dipisahkan dan dipotong – potong sepanjang kurang lebih 1 cm. Proses

sterilisasi selanjutnya dilakukan dengan merendam potongan tanaman sampel di

dalam larutan alkohol 75%, Natrium hipoklorit 5.25% dan aquades steril.

2.4.5 Fermentasi Bakteri Endofit

Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba

untuk menghasilkan metabolit primer dan metabolit sekunder dalam suatu

lingkungan yang dikendalikan. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan

kondisi medium, komposisi medium, suplai O2, dan agitasi (Anonim, 2012).

Pada fermentasi terjadi perubahan struktur kimia dari bahan - bahan organik

dengan memanfaatkan agen-agen biologis terutama enzim sebagai biokatalis.

Produk fermentasi dapat digolongkan menjadi 4 jenis, yaitu : produk biomassa,

produk enzim, produk metabolit (Anonim, 2012).

16


Medium yang digunakan dalam fermentasi harus memenuhi syarat antara

lain : mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel mikroba,

mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi mikroba,

tidak mengandung zat yang dapat membahayakan pertumbuhan sel, dan tidak

terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan

substrat (Anonim, 2012).

2.5 Bakteri Uji

Pada penelitian digunakan 4 spesies bakteri uji yang diketahui bersifat

patogen terhadap manusia. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri kelompok

Gram positif (Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis) dan kelompok Gram

negatif (Escherichia coli dan Salmonella sp.).

a. Morfologi dan Klasifikasi Staphylococcous aureus (S. aureus)

Klasifikasi S. aureus sebagai berikut :

Divisio : Protophyta

Subdivisio : Schizomycetea

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteria

Famili : Micrococcacae

Genus : Staphylococcus

Species : Staphylococcus aureus (Brooks dkk., 2007).

Nama Staphylococcus aureus berasal dari bahasa Yunani, yaitu

staphyle yang berarti kumpulan anggur dan cocci yang berarti bulat.

Sedangkan nama aureus berasal dari bahasa Latin yang berarti emas,

karena pada koloni terlihat berwarna emas (Freeman dkk., 2005).

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif dengan sel

berbentuk bulat yang menyerupai anggur. S. aureus mempunyai ukuran

sel dengan diameter 1 µm, bersifat patogen, tidak bergerak (non-motil)

dan tidak membentuk spora (Brooks dkk. 2007).

Staphylococcus tumbuh pada kondisi aerobik atau mikroaerofilik,

dengan suhu optimum 37oC. batas suhu pertumbuhan Staphylococcus

adalah 15oC - 45

oC, dengan pH optimum untuk pertumbuhan ialah 7,4

17


(Freeman dkk., 2005). Pada permukaan media, bentuk koloni terlihat

bulat, permukaan halus, cembung, berkilau, dan terbentuk koloni

berwarna abu-abu hingga kuning keemasan.

Staphylococcus bersifat relatif resisten terhadap pengeringan,

panas (bisa bertahan hingga suhu 30oC selama 30 menit), dan 9% NaCl

tetapi akan terhambat dengan beberapa bahan kimia, seperti

heksaklorofen 3% (Brooks dkk., 2007).

S.aureus merupakan bakteri patogen yang bersifat invasif, dapat

memproduksi koagulase, mampu membentuk pigmen kuning emas dan

dapat menghemolisis sel darah merah.

Penyakit yang disebabkan oleh S. aureus seperti pneumonia,

meningitis, endokarditis, dan infeksi kulit. Beberapa antibiotik yang

dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan S. aureus antara lain

ampisilin, penisilin, tetrasiklin, kloksasilin, sefalosporin, vankomisin, dan

metisilin (Jawetz dkk., 1996).

Gambar 3. Staphylococcus aureus perbesaran 1000x

(Dokumentasi pribadi)

b. Morfologi dan Klasifikasi Bacillus subtilis (B. subtilis)

Klasifikasi Bacillus menurut Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology, 8th

edition (1985) :

Kingdom : Procaryotae

Divisi : Bacteria

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Baciliaceae

Genus : Bacillus

18


Species : Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan bakteri Gram positif, berbentuk

batang yang membentuk rantai, beberapa spesies aerob obligat dan

bersifat anaerob fakultatif, memiliki endospora sebagai struktur bertahan

saat kondisi lingkungan tidak mendukung (Backman dkk., 1994). Suhu

optimum pertumbuhan Bacillus subtilis yaitu 30-37oC, dengan suhu

minimum 18oC dan maksimum 43

oC (Korsten dkk., 1996).

Banyak dari genus Bacillus bersifat saprofit dan berasal dari tanah

(banyak karbohidrat dan polisakarida), air, dan udara dan tanaman.

Beberapa bersifat patogen, dan berkembang di dalam makanan lalu

menghasilkan enterotoksin atau toksin emetic dan menyebabkan

makanan menjadi beracun. Bacillus subtilis dapat menyebabkan penyakit

pada manusia, seperti meningitis, endokarditis, endophalmitis,

konjungtivitis atau gastroenteritis akut (Jawetz dkk., 1996).

Pada Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, edisi ke-2

(2004) Sel Bacillus subtilis berukuran 1 x 3.4 µm, berbentuk batang dan

tersusun menjadi rantai panjang. Mempunyai spora yang terletak di

tengah sel, tidak bergerak (Jawetz dkk., 1996), serta mempunyai flagela.

Spesies Bacillus memperlihatkan morfologi koloni yang sangat

bervariasi, dan komposisi media yang digunakan sangat mempengaruhi

bentuk morfologi yang akan terlihat. Koloni Bacillus subtilis setelah

inkubasi 24-48 jam, ukuran koloni berkisar antara 2-4 mm, permukaan

kasar, berlendir, dan bergelombang pada bagian pinggir koloni. Bacillus

dapat tumbuh pada media Nutrient Agar, Trypticase Soy Agar dan paling

cocok pada media Blood Agar.

Bacillus subtilis yang bersifat patogen dapat menyerang manusia,

dan menyebabkan penyakit seperti meningitis yang disebabkan trauma

kepala, kolangitis yang berhubungan dengan penyakit ginjal dan hati,

pneumonia, infeksi nekrotic axillary pada pasien kanker payudara. Bila

terinfeksi Bacillus subtilis akan muncul gejala seperti diare dan muntah.

19


Gambar 4. Bacillus subtilis perbesaran 1000x (Dokumentasi pribadi)

c. Morfologi dan Klasifikasi Eschericia coli (E. coli)

Klasifikasi dari E. coli adalah sebagai berikut :

Divisio : Bacteria

Subdivisio : Schizomycetes

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Enterobactericeae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli (Krieg dkk., 1984)

Escherichia coli pertama kali ditemukan di usus bayi oleh seorang

dokter penyakit anak German, yaitu Theodor Escherich (1885). E. coli

merupakan bakteri anaerob fakultatif Gram negatif dengan sel berbentuk

batang yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae. Bakteri ini

merupakan penghuni normal usus, selain berkembang biak di lingkungan

sekitar manusia (Arisman, 2009).

Sel Bakteri E. coli berbentuk batang yang single atau pairs,

berukuran sekitar 2.5 µm, dengan diameter 0.8 µm. Bila ditumbuhkan

pada media Nutrient Broth yang kaya nutrisi hanya memerlukan waktu

20 menit untuk tumbuh (Berg, 2004), dengan suhu antara 10-40oC

(optimum 37oC) dan pH 7,2.

Pada media, koloni E.coli akan terlihat besar, sirkular, sedikit

cembung, berwarna putih keabu-abuan, permukaan halus, terlihat basah,

buram, atau sedikit tembus cahaya (translucent). Media tumbuh pada

berbagai media, termasuk Mueller-Hinton Agar, Nutrient Agar, Blood

20


Agar, dan MacConkey agar. Isolasi utama dapat ditemukan pada Nutrient

Agar dan Blood Agar (Parija, 2009).

E. coli dikenali sebagai bakteri yang sedikit membahayakan dan

juga patogen. E. coli dapat menyebabkan penyakit dengan spectrum luas

pada manusia, seperti Traveler’s diarrhea, disentri, hemoragik colitis,

neonatal meningitis dan sindrom hemolitik uremik (Parija, 2009).

Gambar 5.Escherichia coli perbesaran 1000x (Dokumentasi pribadi)

d. Morfologi Salmonella enterica sv Thypimurium (S. thypimurium)

Klasifikasi dari Salmonella thypimurium adalah sebagai berikut :

a. Divisio : Bacteria

b. Kelas : Gammaproteobacteria

c. Ordo : Enterobacterial

d. Famili : Enterobactericeae

e. Genus : Salmonella

f. Spesies : Salmonella enterica

g. Subspesies : S. enterica sv typimurium (S. typimurium)

Salmonella thypimurium merupakan bakteri Gram negatif dan

merupakan bakteri anaerob fakultatif. Salmonella merupakan bakteri

tidak berspora, dengan panjang yang bervariasi.

Salmonella tyhpimurium merupakan bakteri patogen, karena dapat

menyerang pada manusia dan hewan mamalia. Salmonella tyhpimurium

menyebabkan penyakit gastroenteritis dan diare hingga menyebabkan

penyakit sistemik (demam tifoid). Untuk penanganannya dapat digunakan

21


antibiotik kloramfenikol, ciprofloksasin, sefalosporin dan sefotaksim

(Carrica, 2011).

Gambar 6. Salmonella thypimurium perbesaran 1000x (Dokumentasi Pribadi)

2.6 Uji Aktivitas Antimikroba

Antimikroba adalah substansi yang menghambat pertumbuhan atau

membunuh bakteria atau mikroorganisme lain (organisme mikroskopik termasuk

bakteria, virus, jamur, protozoa, dan riketsia) (Kee dkk., 1996). Kegunaan uji

antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan

efisien.

Antibiotik dinyatakan sebagai metabolit sekunder mikroorganisme yang

mempunyai massa molekul rendah, sehingga pada konsentrasi rendah dapat

menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain (Sudjaji, 2008). Pengukuran

aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi dengan menggunakan kertas

cakram.

2.6.1 Metode Difusi

Merupakan metode tes Kirby & Bauer untuk menentukan aktivitas agen

antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar

yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar

tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan

mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi,

2008).

22


2.7 Antibakteri Pembanding

Karakteristik kloramfenikol digunakan sebagai antibakteri pembanding

adalah sebagai berikut (Farmakope Indonesia, 1995) :

1. Rumus bangun :

2. Rumus kimia : C12H12Cl2N2O5

3. Pemerian : hablur halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang; putih

hingga putih kelabu atau putih kekuningan; larutan praktis netral terhadap

lakmus P; stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam

4. Kelarutan : sukar larut dalam air; mudah larut dalam etanol, dalam

propilen glikol, dalam aseton dan dalam etil asetat

5. Penyimpanan : dalam wadah tertutup rapat

Kloramfenikol merupakan sediaan bakteriostatik alamiah berspektrum

luas golongan amphenicol, yang berasal dari jamur Streptomyces venezuelae dan

sekarang telah dapat dibuat secara sintetik di laboratorium. Kloramfenikol

bersifat bakteriostatis terhadap hampir semua bakteri Gram positif dan sejumlah

bakteri Gram negatif, namun pada konsentrasi tinggi dapat bersifat bakterisid

terhadap bakteri – bakteri tertentu (Ganiswarna, 1995). Kloramfenikol dipakai

untuk pengobatan demam tifoid, infeksi Salmonella atau infeksi lain, dan

meningitis yang resisten terhadap penisilin (Schwartz, 2000).


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Februari sampai bulan Juni 2015 di

Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium Terpadu (PLT), Laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia dan Laboratorium Penelitian I, UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : cawan petri

bulat (Petriq), gelas ukur (Pyrex), labu Erlenmeyer (Pyrex), beaker glass (Pyrex),

tabung reaksi (Pyrex), jarum ose, pinset, batang L, pipet mikro (Socorex), tip

biru, tip kuning, tip putih, spatula, jangka sorong (Tricle), kaca objek, cover

glass, kertas label, paper disk 6 mm (Oxoid), autoklaf otomatis (ALP), shaker

(Stuart), vortex (Thermolyne), hot plate stirrer (Heidolph), mikroskop

(Olympus), Laminar Air Flow, inkubator (Memmert), oven (Memmert),

sentrifugasi (Peqlab), pembakar spiritus.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun rambutan

(Nephelium lappaceum). Daun rambutan diperoleh dari kebun depan Kampus

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Jakarta,

Pisangan, Ciputat, Tangerang Selatan pada bulan Februari 2015.

Bakteri uji yang digunakan meliputi bakteri Staphylococcus aureus

ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 35218 dan

Salmonella thypimurium ATCC 14028. yang diperoleh dari Laboratorium

Mikrobiologi FMIPA UI dan PT DIPA PUSPA.

Medium Nutrient Agar (Merck), medium Mueller-Hinton Agar (Merck),

Nutrient Broth (Merck), alkohol 70%, alkohol 96%, Natrium hipoklorit 5.25%,

aquades, aquades steril, larutan kloroform, larutan amoniak, larutan asam asetat

24


anhidrat, larutan NaCl 0.9%, FeCl3, HCl, H2SO4, pereaksi Lieberman-

Bourchardat, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, logam magnesium, gentian

violet, larutan lugol, safranin, kertas saring, antibiotik kloramfenikol (Oxoid),

kapas, aluminium foil.

3.2.3 Determinasi Tanaman

Sampel tanaman daun rambutan (Nephelium lappaceum) diidentifikasi di

Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit Biologi, LIPI Cibinong.

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Skrining Fitokimia Daun Nephelium lappaceum Segar

a. Pembuatan ekstrak daun segar dan uji saponin

Daun rambutan sebanyak 2 g dibersihkan dengan menggunakan

air. Daun dipotong dengan ukuran sedang atau kecil, dimasukan kedalam

mortar dan tambahkan pasir bersih, lalu disaring dengan menggunakan

kasa. Tambahkan akuades sambil dikocok kuat-kuat selama 1 menit,

saponin positif ditunjukan dengan adanya bisa yang stabil selama 30

menit (Harbone, 1996).

b. Pembuatan ekstrak daun segar dan uji alkaloid


air. Daun dipotong dengan ukuran kecil, dimasukkan kedalam mortar dan

tambahkan kloroform amoniak 10 ml dan pasir bersih. Campuran

disaring kedalam tabung reaksi dengan diperas menggunakan kain kasa.

Kemudian tambahkan 0.5 mL 1 M H2SO4 dan di homogenkan. Pisahkan

antara lapisan asam (atas) dan lapisan kloroform (bawah). Uji alkaloid

dengan metode Culvenor-Fitzgerald

Lapisan asam (atas) dibagi menjadi 2 tabung reaksi, masing-

masing diberikan pereaksi Dragendorff dan pereaksi Mayer. Reaksi

positif apabila menunjukan endapan kuning jingga dengan pereaksi

Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer.

25


c. Pembuatan ekstrak daun segar untuk uji terpenoid/steroid, fenolik dan

flavonoid


air. Daun dipotong dengan ukuran sedang atau kecil, dimasukkan

kedalam mortar dan tambahkan alkohol 80%, saring dengan kain kasa

dan keringkan diatas penangas air. Kemudian lemaknya dihilangkan

dengan pencucian heksan beberapa kali sehingga warna pigmen hilang

atau larutan heksana tidak berwarna lagi.

i. Terpenoid dan steroid. Tambahkan residu dengan 10 mL

kloroform amoniak dan aduk campuran selama 5 menit, lalu

saring dan tambahkan natrium sulfat anhidrat, dan bagi menjadi

dua tabung reaksi. Masing- masing tabung ditambahkan pereaksi

Liberman-Bourchardat (3 tetes asam asetat anhidrat + 1 tetes

asam sulfat pekat). Hasil positif apabila terbentuk warna merah

merupakan terpenoid dan warna hijau-biru merupakan steroid.

ii. Fenolik. Tambahkan residu dengan 3 mL pereaksi FeCl3 dan 1

mL larutan H2SO4 pekat. Hasil positif bila terbentuk warna dari

merah-kecoklatan menjadi biru atau lembayung.

iii. Flavonoid. Tambahkan residu dengan 20 mL alkohol dan

pindahkan masing-masing 10 mL kedalam 2 tabung reaksi.

Masing-masing tabung ditambahkan 0.5 mL asam klorida pekat.

Dilakukan uji dengan pereaksi Willstatter. Pada pereaksi

Willstatter ditambahkan 3-4 butir logam Magnesium (Mg). Bila

terjadi perubahan warna, tambahkan 1 mL amil alkohol, kocok

kuat-kuat dan amati perubahan warna.

d. Pembuatan ekstrak eter untuk uji terpenoid/steroid dan flavonoid



mortar dan tambahkan eter saring dengan kain kasa dan keringkan diatas

penangas air.

i. Residu ditambahkan asam asetat anhidrat 3 tetes dan H2SO4 pekat

1 tetes. Hasil positif terpenoid bila terbentuk warna oranye, merah

26


atau kuning dan positif steroid bila terbentuk warna hijau (Arifin,

2006).

ii. Residu ditambahkan dengan NaOH pekat, warna akan berubah

menjadi kuning pekat. Bila ditambahkan dengan asam pekat atau

asam lemah, maka warna kuning akan menghilang (Singh, 2013).

e. Pembuatan ekstrak dan uji tanin



mortar dan tambahkan alkohol 80%, saring dengan kain kasa dan

keringkan diatas penangas air. Residu ekstrak dilarutkan dengan 20 mL

air panas, ditambahkan 5 tetes larutan NaCl dan 3 tetes pereaksi ferri

klorida (FeCl3), bagi kedalam 2 tabung reaksi. Hasil positif tanin

terhidrolisa memberikan warna biru atau biru-hitam, sedangkan

kondensasi tanin memberikan warna biru-hijau.

3.3.2 Sterilisasi Alat

Alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan. Alat

kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah itu dilakukan sterilisasi.

Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada 121oC.

3.3.3 Pembuatan Media

3.3.3.1 Nutrient Agar (NA)

NA ditimbang sebanyak 23 g dilarutkan dalam 1 liter aquades. Setelah

semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut sempurna, lalu

disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

3.3.3.2 Nutrient Broth (NB)

NB ditimbang sebanyak 9 g dilarutkan dalam 1 liter aquades. Bahan

medium dicampur dengan pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate

dan stirrer hingga warna media terlihat bening dan mendidih, kemudian

disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

27


3.3.3.3 Mueller-Hinton Agar (MHA)

Serbuk MHA sebanyak 38 g dilarutkan dalam 1 liter aquades, kemudian

dipanaskan sampai mendidih sehingga semuanya larut, kemudian disterilkan

dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

3.3.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Biakan bakteri uji yang telah tumbuh pada agar miring NA ditambahkan

dengan 5 mL NaCl 0.9% steril. Sebanyak 0.1 % suspensi bakteri uji dimasukkan

ke dalam 200 mL NB steril. Spektrofotometer UV-vis diatur dengan panjang

gelombang 600 nm, kuvet dibersihkan kemudian diukur absorban awal NB steril

sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri pada menit ke-0 (t0). Setelah

absorban awal ditentukan, media NB digojog pada 120 rpm menggunakan

shaker, suhu 27oC. Setiap interval 30 menit dilakukan pengukuran absorban

untuk mendapatkan kurva pertumbuhan. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah

melewati fase stastioner.

3.3.5 Isolasi Bakteri Endofit

Daun rambutan dari lokasi pengumpulan segera dicuci dengan

menggunakan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada

permukaan daun. Daun selanjutnya dikeringkan dan dimasukan ke kantong

plastik dan dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium Terpadu

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Tahap awal isolasi adalah memotong bagian

daun sepanjang ± 2 cm dan selanjutnya disterilisasi bagian permukaan

menggunakan larutan alkohol 70% selama 1 menit, Natrium hipoklorit 5.25%

selama 5 menit, dan terakhir dengan larutan alkohol 70% selama 30 detik.

Setelah itu sampel daun dibilas dengan air steril 2 kali masing-masing 1 menit

dan ditanam di dalam media agar NA, diletakan pada posisi tertelungkup. Cawan

petri yang sudah mengandung sampel daun diinkubasi dalam inkubator pada

suhu 35oC selama 2-7 hari (Kumala dkk., 2006).

3.3.6 Pemurnian Isolat Bakteri

Pemurnian isolat bakteri menggunakan metode cawan gores (Streak

Plate) untuk mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang

lain. Isolat yang tumbuh diinokulasi menggunakan ose dengan cara digoreskan

28


pada media NA. Media diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24

jam.

3.3.7 Pembuatan Stock Culture dan Working Culture

Pembuatan Stock Culture dan Working Culture dilakukan dengan

menginokulasi koloni tunggal hasil pemurnian ke dalam 2 tabung reaksi. Koloni

yang membentuk satu koloni dan tidak menempel dengan koloni lain dipisahkan

dari isolat majemuk dengan menggunakan ose dan ditanam pada media NA

miring. Media diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam. Stock

disimpan pada suhu 4oC dalam lemari pendingin.

3.3.8 Identifikasi Bakteri Endofit

a. Makroskopis

Pengamatan makroskopis dilakukan dengan menggunakan metode streak

plate. Identifikasi secara visual meliputi pengamatan bentuk koloni,

bentuk tepi koloni dan warna koloni.

b. Mikroskopis

i. Pewarnaan Gram : Identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan

mengamati morfologinya dengan pewarnaan Gram. Isolat pada agar

miring diambil sebanyak satu ose diletakkan di atas kaca objek yang

telah ditetesi dengan NaCl fisiologis. Sebarkan bakteri pada kaca

objek dengan menggunakan ose bulat kemudian dilewatkan di atas api

(difiksasi).

Larutan gentian violet diteteskan diatas preparat yang telah disiapkan

kemudian dibiarkan selama 1 menit. Preparat dicuci dengan akuades.

Kemudian cairan lugol diteteskan pada preparat dan dibiarkan selama

1 menit. Preparat dicuci dengan akuades, Preparat diteteskan dengan

alkohol 96%, digoyang-goyangkan selama 30 detik. Preparat dicuci

dengan akuades. Terakhir, preparat diteteskan dengan safranin dan

dibiarkan selama 1 menit. Preparat dicuci dengan akuades dan

dikeringkan dengan menggunakan tisue. Preparat ditetesi dengan

minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop pada perbesaran

1000x.

29


ii. Uji Katalase : Pengujian aktivitas enzim katalase dilakukan dengan

cara menginokulasikan satu ose koloni bakteri pada kaca objek,

kemudian ditetesi dengan H2O2 3%. Timbulnya gelembung gas

menunjukan reaksi positif terhadap uji katalase.

3.3.9 Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji secara mikroskopis dilakukan dengan

menggunakan pewarnaan Gram.

3.3.10 Fermentasi Bakteri Endofit

Untuk fermentasi, digunakan isolat yang telah disuspensikan dengan

menggunakan 5 mL NaCl 0.9% steril. Suspensi bakteri endofit sebanyak 0.1%

ditumbuhkan dalam media NB sebanyak 10 mL, lalu digojog dengan kecepatan

170 rpm, pada suhu 27oC, selama 48 jam. Hasil fermentasi disentrifugasi pada

kecepatan 3000 rpm, pada suhu 4oC selama 20 menit untuk memisahkan

supernatan dan biomassa. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai uji

aktivitas antimikroba dan skrining fitokimia (Kumala dkk., 2006).

3.3.11 Uji Fitokimia Isolat Hasil Fermentasi (Adiarti, 2013)

a. Uji terpenoid/steroid

Supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dicampurkan

kloroform beramoniak kemudian ditambahkan H2SO4 2 N ke dalam

tabung dan dikocok kuat. Campuran didiamkan hingga terbentuk dua

lapisan yaitu lapisan asam (atas) dan lapisan kloroform (bawah). Lapisan

kloroform diletakkan di plat tetes dan dibiarkan menguap lalu

ditambahkan dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (pereaksi

Lieberman-Burchardat). Apabila terbentuk warna merah menandakan

adanya senyawa terpenoid, dan hijau menandakan steroid.

b. Uji alkaloid

Supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan

dengan kloroform. Bagi tabung menjadi dua, dan masing – masing

tabung ditambahkan pereaksi Dragendorff dan pereaksi Mayer. Hasil

dinyatakan positif bila terjadi perubahan warna menjadi jingga setelah

30


penambahan pereaksi Dragendorff dan warna putih setelah penambahan

pereaksi Mayer.

c. Uji fenolik

Supernatan diletakkan di atas plat tetes dan ditambahkan larutan

besi (III) klorida. Hasil positif dinyatakan dengan adanya perubahan

warna larutan menjadi biru-hitam.

d. Uji flavonoid

Supernatan dimasukan kedalam tabung reaksi kemudian

ditambahkan alkohol 70% dan dipanaskan. Campuran ditambahkan

lempeng logam magnesium dan setetes asam klorida pekat. Hasil positif

mengandung flavonoid bila terjadi perubahan warna larutan menjadi

kuning.

e. Uji saponin

Supernatan ditambahkan aquades dan dipanaskan hingga

mendidih. Kemudian larutan dikocok kuat dan apabila terbentuk busa

yang stabil selama 10 menit maka sampel dinyatakan mengandung

saponin.

f. Profil KLT

Fase gerak dibuat campuran alkohol – etil asetat (8:2) dimasukkan

ke dalam chamber dan dibiarkan sampai jenuh. Pada plat KLT ditotolkan

supernatan dan dimasukkan ke dalam chamber, dielusi sampai tanda

batas atas dan dibiarkan sampai kering. Plat diamati pada sinar UV 254

nm dan 366 nm.

3.3.12 Uji Aktivitas Antibakteri

Inokulum bakteri uji (OD600nm ~ 0.1) setara 107 CFU/mL diambil

sebanyak 1 mL, kemudian dituang pada permukaan cawan petri. Kemudian pada

cawan dituangkan media MHA yang masih cair dengan suhu sekitar 45oC –

50oC. Campur antara media dengan suspensi bakteri uji dengan cara cawan

dimiringkan dan diputar. Tunggu hingga media memadat.

31


Masing-masing supernatan bakteri endofit diserapkan ke cakram steril

sebanyak 20 µl. Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri

yaitu kloramfenikol. Cakram lalu diletakkan pada permukaan media uji. Kontrol

negatif yaitu media steril Nutrient Broth. Sebanyak 20 µl larutan kontrol negatif

diserapkan ke cakram steril. Cakram isolat, kontrol positif, dan kontrol negatif

yang sudah kering diletakkan pada permukaan media uji kemudian diinkubasi

pada suhu 37oC, selama 24 jam. Diamati zona hambat yang terbentuk setelah

inkubasi dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Daun Rambutan

Dalam penelitian ini dilakukan determinasi tanaman, terutama pada daun

rambutan yang digunakan untuk penelitian isolasi bakteri endofit. Determinasi

tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan untuk

penelitian.

Dari hasil identifikasi terhadap daun rambutan (Nephelium lappaceum L.)

yang dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit Biologi, LIPI

Cibinong, menunjukkan bahwa sampel yang digunakan adalah daun rambutan

(Nephelium lappaceum L.). Hasil determinasi dapat dilihat di Lampiran 1.

4.2 Skrining Fitokimia Daun Nephelium lappaceum L. Segar

Pada penelitian dilakukan skrining fitokimia pada daun segar Nephelium

lappaceum. Untuk melakukan skrining metabolit sekunder pada daun segar,

diperlukan pembuatan ekstrak daun segar, yang dilakukan dengan cara

menghaluskan daun segar menggunakan blender hingga halus lalu ditambahkan

dengan pelarut eter atau alkohol (Gambar 7).

Gambar 7. Daun segar rambutan (Dokumentasi pribadi)

33


Tabel 3. Hasil Uji Skrining Metabolit Sekunder Daun Segar

Uji Pereaksi Perubahan Warna Keterangan

Saponin Ekstrak + akuades

kocok kuat

busa stabil +

Alkaloid Meyer, Dragendorf Tidak ada endapan -

Terpenoid/

Steroid

Residu etanol 80% +

kloroform + asam asetat

anhidrat (3 tetes) + asam

sulfat pekat (1 tetes)

Merah +

Residu eter + asam

asetat anhidrat (3 tetes) +

asam sulfat pekat (1

tetes)

Kuning kehijauan +

Flavonoid Residu alkohol 80% +

etanol + logam Mg +

HCl pekat + amil

alkohol

Abu-abu -

Residu eter + NaOH

pekat kuning pekat +

asam pekat/encer

warna hilang

Kuning pekat warna

hilang

+

Fenolik Residu alkohol 80% +

FeCl3

Ungu tua +

Tanin Residu alkohol 80% +

FeCl3 + NaCl

Hijau-hitam +

Dari hasil diatas, diketahui bahwa daun Nephelium lappaceum positif

mengandung metabolit sekunder yaitu saponin, terpenoid, steroid, fenolik dan

tannin.

Dari hasil diketahui bahwa pada daun segar positif mengandung saponin.

Pengujian saponin dilakukan dengan cara penambahan akuades pada ekstrak

daun, lalu dikocok kuat-kuat selama 10 detik, hasil postif ditunjukan dengan

adanya busa yang stabil selama 30 menit. Pada penelitian ini, busa yang

dihasilkan stabil selama lebih dari 1 jam.

Pada skrining alkaloid ekstrak daun segar ditambahkan pelarut kloroform,

kemudian ditambahkan dengan H2SO4 pekat, lalu dihomogenkan. Kloroform

berguna dalam memutuskan ikatan antara asam tanin-alkaloid yang terikat secara

34


ionik, saat ikatan terputus alkaloid akan bebas lalu diikat oleh H2SO4 pekat dan

asam tanin terikat oleh kloroform. Lapisan asam (atas) dibagi menjadi 2, dan

masing-masing ditambahkan dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff. Hasil

menunjukan bahwa ekstrak daun segar tidak mengandung alkaloid

Pada skrining terpenoid/steroid, fenolik dan flavonoid dilakukan proses

penghilangan lemak atau pigmen klorofil dari ekstrak daun segar. Ektrak daun

segar ditambahkan dengan alkohol 80%, lalu dilakukan partisi pelarut-pelarut

dengan menggunakan n-heksan digunakan untuk menghilangkan pigmen warna

klorofil pada daun, akan terlihat 2 lapisan yaitu lapisan n-heksan dan alkohol

hingga n-heksan tidak berwarna lagi (Gambar 8). Residu yang didapat akan

dilanjutkan untuk diuji terpenoid/steroid, fenolik dan flavonoid. Pada uji skrining

terpenoid/steroid didapatkan hasil bahwa daun Nephelium lappaceum

mengandung terpenoid yang dilihat dari adanya warna merah dengan

menggunakan pereaksi Lieberman-Bouchardat.

Pada penelitian Dharmadewi (2014) diketahui bahwa ekstrak metanol 95%

daun rambutan mengandung senyawa steroid, namun pada penelitian didapatkan

hasil bahwa daun rambutan mengandung terpenoid. Maka, dilakukan metode

pengujian lain berdasarkan Arifin (2006), dengan cara daun segar ditambahkan

dengan eter, lalu saring dengan menggunakan kasa. Residu ekstrak daun segar

dikeringkan diatas penangas air, lalu tambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1

tetes asam asetat anhidrat. Hasil positif terpenoid yaitu warna oranye, merah atau

kuning, dan positif steroid yaitu warna hijau. Pada hasil penelitian didapatkan

warna kuning dengan sedikit kehijauan, maka disimpulkan bahwa daun rambutan

mengandung terpenoid/steroid.

35


Gambar 8. Pembuatan ekstrak etanol daun segar dengan n – heksana

(Dokumentasi pribadi)

Pada uji fenolik, residu yang ditambahkan dengan FeCl3 dan H2SO4 akan

menghasilkan warna biru atau lembayung bila positif mengandung fenolik.

Namun, pada literatur lain disebutkan bahwa untuk menguji fenolik dengan

menambahkan FeCl3 akan menghasilkan warna ungu tua (Kar, 2003) dan

didapatkan hasil warna ungu tua-hitam yang menunjukan daun positif

mengandung fenolik.

Pada uji flavonoid dilakukan uji dengan pereaksi Wilstatter, yang

dilakukan dengan cara residu ditambahkan dengan alkohol, logam magnesium dan

HCl pekat. Bila positif mengandung flavonoid akan menghasilkan warna merah,

kuning dan jingga. Namun, pada pengujian dihasilkan warna hijau pucat (abu-abu

pucat) yang berarti ekstrak daun segar negatif flavonoid. Menurut penelitian

Dharmadewi (2014) dan Maradona (2013), bahwa daun rambutan mempunyai

flavonoid, sedangkan pada hasil penelitian didapatkan hasil negatif pada daun

rambutan. Maka dari itu, dilakukan metode lain untuk pengujian flavonoid. Pada

literatur Farnsworth (1966) diketahui bahwa kandungan flavonoid pada tanaman

segar akan menghilang apabila dilakukan ekstraksi menggunakan metanol atau

alkohol, maka dari pelarut bisa diganti dengan menggunakan petroleum eter.

Untuk pengujian flavonoid dilakukan dengan metode uji NaOH (Audu,

2007). Daun segar yang telah dihancurkan ditambahkan dengan pelarut eter, lalu

disaring dengan menggunakan kasa. Ekstrak daun segar ditambahkan dengan

NaOH dan adanya perubahan warna dari hijau menjadi kuning intens. Lalu

ditambahkan dengan asam encer (CH3COOH), maka didapatkan warna kuning

menghilang. Menurut Cowan (1999) senyawa flavonoid dan terpenoid bisa

36


diekstraksi dengan menggunakan eter, karena itu digunakan eter untuk pengujian

ini.

Pada penelitian ini didapatkan hasil daun rambutan segar mengandung

senyawa metabolit sekunder saponin, terpenoid/steroid, flavonoid, fenolik, dan

tanin.

4.3 Isolasi, Pemurnian dan Peremajaan Bakteri Endofit

Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat bakteri endofit berasal dari

daun rambutan yang diperoleh dari kebun depan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Jakarta, Pisangan, Ciputat, Tangerang

Selatan.

Daun rambutan yang digunakan merupakan daun tua dan daun muda.

Pemilihan berdasarkan letak daun yang dipetik, yaitu daun yang berada diujung

ranting (daun muda) dan daun yang berada di pangkal ranting (daun muda). Daun

yang telah dipetik dicuci dengan menggunakan air mengalir hingga bersih untuk

menghilangkan kotoran yang menempel pada permukaan daun, lalu dilakukan

sterilisasi permukaan untuk menghindari kontaminan atau adanya pertumbuhan

dari bakteri lain yang bukan berasal dari daun rambutan, sehingga pada saat

isolasi didapatkan isolat murni bakteri endofit.

Sterilisasi permukaan daun dilakukan dengan merendam daun kedalam

larutan alkohol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5.25% selama 5 menit,

larutan alkohol 70% selama 30 detik, dan terakhir dibilas menggunakan aquades

steril selama 1 menit sebanyak 2 kali. Alkohol dan Natrium hipoklorit yang

digunakan bertujuan untuk dekontaminasi permukaan daun dan merupakan

kombinasi yang sesuai karena alkohol mempunyai spektrum afinitas yang relatif

sempit, sehingga perlu ditambahkan dengan Natrium hipoklorit. Setelah proses

dekontaminasi, daun tersebut dilakukan pembilasan dengan menggunakan

aquades steril, hal ini bertujuan untuk menghilangkan sisa alkohol dan Natrium

hipoklorit yang masih menempel pada daun rambutan yang dapat mengganggu

pertumbuhan bakteri endofit.

Daun steril tersebut kemudian dipotong dengan menggunakan pisau steril

sepanjang 1x1 cm. Daun steril yang sudah dipotong ditanam dengan posisi

menelungkup kearah media Nutrient Agar yang telah padat. Cawan petri yang

37


telah berisi daun rambutan kemudian diinkubasi selama 2 – 7 hari pada suhu 35oC

(Gambar 9).

Gambar 9. Isolasi daun rambutan hari ke – 0 (Dokumentasi pribadi)

Sebagai kontrol, digunakan aquades bilasan terakhir dari proses isolasi.

Hal ini dilakukan untuk menguji keefektifan sterilisasi permukaaan. Jika tidak

terdapat kontaminasi pertumbuhan mikroba pada kontrol, maka proses sterilisasi

sudah sempurna.

Setelah proses inkubasi selama 4 hari, bakteri endofit yang tumbuh pada

sekitar daun dimurnikan dengan menggunakan metode streak plate pada media

Nutrient Agar untuk mendapatkan koloni yang terpisah dari koloni yang lain

(Gambar 10).

Gambar 10. Pemurnian isolat bakteri endofit (Dokumentasi pribadi)

Koloni yang terpisah tersebut diinokulasikan ke media NA miring yang

digunakan sebagai Stock Culture dan Working Culture. Dari hasil isolasi

diperoleh sebanyak 4 isolat bakteri endofit dengan kode yaitu, DR1, DR2, DR3

dan DR4 (Lampiran 9).

38


4.4 Identifikasi Bakteri Endofit

Isolat yang diperoleh, yaitu DR1, DR2, DR3 dan DR4 dilakukan

identifikasi secara makroskospis yaitu karakteristik bentuk koloni dan

mikroskopis dengan cara pewarnaan Gram dan uji Katalase.

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan diketahui bahwa isolat DR1,

DR3 merupakan bakteri Gram negatif, bentuk sel kokus dan positif terhadap uji

katalase. Isolat DR2 merupakan bakteri Gram negatif, bentuk sel batang dan

positif terhadap uji katalase, dan isolat DR4 merupakan bakteri Gram positif,

bentuk sel kokus, dan positif terhadap uji katalase yang ditandai dengan adanya

gelembung pada isolat saat ditetesi dengan H2O2 3% (Tabel 4).

Tabel 4. Identifikasi Bakteri Endofit

Isolat Morfologi Koloni Gram Morfologi Sel

Bentuk Elevasi Tepi Warna Bentuk Katalase

DR1 Bulat Konveks Halus Putih Negatif Kokus +

DR2 Konsentrik Rata Bergelombang Putih Negatif Basil +

DR3 Bulat Timbul Halus Kuning Negatif Kokus +

DR4 Bulat Gunung Halus Putih Positif Kokus +

Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada

isolat. Hasil uji menunjukan bahwa semua isolat mempunyai enzim katalase yang

ditandai dengan adanya gelembung gas. Gelembung gas tersebut berasal dari

penguraian hidrogen peroksida (H2O2) yang terbentuk dari proses respirasi aerob

dan bersifat toksik terhadap bakteri, menjadi air (H2O) dan O2 oleh aktivitas

enzim katalase dari isolat yang tidak bersifat toksik.

4.5 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri gram positif

(Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis) dan bakteri gram negatif

(Escherichia coli dan Salmonella thypimurium). Tujuan pembuatan kurva

pertumbuhan ini adalah untuk mengetahui fase logaritmik dari masing-masing

bakteri uji. Fase logaritmik merupakan fase yang cocok untuk pengujian

antibakteri, karena pada fase ini mikroorganisme tumbuh dan membelah secara

konstan. Kurva pertumbuhan bakteri uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 11.

39


Gambar 11. Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Berdasarkan hasil kurva yang didapatkan, diketahui bahwa bakteri Gram

negatif Escherichia coli mengalami fase logaritmik pada jam ke-4 sampai jam ke-

15. Untuk melakukan uji aktivitas antibakteri, maka E. coli ditumbuhkan sampai

jam ke-4. Sedangkan untuk bakteri Salmonella thypimurium mengalami fase

logaritmik pada jam ke-10 sampai jam ke-15. Untuk melakukan uji aktivitas

antibakteri, maka S.thypimurium ditumbuhkan sampai jam ke-10.

Untuk bakteri Gram positif, yaitu bakteri Staphylococcus aureus

mengalami fase logaritmik pada jam ke-3 sampai jam ke-9. Untuk melakukan uji

aktivitas antibakteri, maka S. aureus ditumbuhkan sampai jam ke-3. Sedangkan

untuk bakteri Bacillus subtilis mengalami fase logaritmik pada jam ke-13 sampai

jam ke-15. Untuk melakukan uji aktivitas antibakteri, maka Bacillus subtilis

ditumbuhkan sampai jam ke-13.

Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan hingga nilai OD600nm (Optical

Density) mencapai 0.08 – 0.1 (Cappucino & Sherman, 2011) atau setara dengan

107 CFU/mL (Martins, 2011).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 3 4 5 7 9 10 11 13 15 17 19 21

Ab

sorb

ansi

(O

D)

Waktu (Jam)

E. coli

S. thypimurium

S. aureus

B. subtilis

40


4.6 Fermentasi Isolat Bakteri Endofit

Untuk mendapatkan hasil fermentasi bakteri endofit, diperlukan proses

fermentasi yang bertujuan untuk memproduksi senyawa antimikroba. Fermentasi

isolat dilakukan dengan cara menggojog menggunakan media Nutrient Broth,

kecepatan 170 rpm, suhu 27oC, selama 48 jam. Fermentasi dengan cara digojog

merupakan metode pemanfaatan medium oleh mikroorganisme yang hasilnya

lebih efisien, mempercepat pertumbuhan isolat, dan pertumbuhan yang dihasilkan

lebih homogen (Rante, 2013). Penggunaan 48 jam untuk fermentasi dikarenakan,

pada 24 jam isolat masih berada dalam fase logaritmik maka kandungan

metabolitnya masih rendah. Sedangkan pada waktu fermentasi 48 jam, isolat

berada pada fase akhir logaritmik dan pada fase ini bakteri menghasilkan

metabolit (Khairani, 2009). Menurut Pratiwi (2008), metabolit sekunder tidak

diproduksi pada saat fase logaritmik, tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus

pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner. Pada fase ini sel mikroorganisme lebih

tahan terhadap keadaan ekstrem, misalnya suhu yang lebih panas atau dingin,

radiasi, bahan – bahan kimia, dan metabolit yang dihasilkannya sendiri (misalnya

antibiotik).

Hasil fermentasi isolat tersebut disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm,

suhu 4oC, selama 20 menit untuk memisahkan supernatan dan biomassa.

Supernatan dipisahkan dengan biomassanya, lalu supernatan yang diperoleh

digunakan untuk uji aktivitas antibakteri dan skrining fitokimia. Pada penelitian

digunakan suhu 4oC pada saat fermentasi yang bertujuan untuk menahan

perubahan zat yang ada didalamnya. Pemisahan supernatan dan biomassa

dikarenakan mikroorganisme dapat mensekresikan metabolit sekunder selama

proses fermentasi ke luar sel yang terdapat pada filtrat atau medium biakan

(Suswandi, 1989 dan Rante, 2013), sehingga setelah disentrifugasi segera

dipisahkan antara supernatan dan biomassa.

4.7 Skrining Fitokimia Bakteri Endofit

Skrining metabolit sekunder dilakukan terhadap supernatan bakteri endofit

isolat DR1, DR2, DR3 dan DR4 yang telah digojog selama 48 jam. Skrining ini

dilakukan untuk mengetahui adanya kesamaan senyawa metabolit sekunder yang

41


dihasilkan oleh bakteri endofit, dengan senyawa metabolit sekunder yang

dihasilkan oleh daun segar (Agusta, 2009 dalam Fitriyah, 2013).

Metabolit sekunder merupakan suatu molekul atau produk metabolit yang

dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme dimana produk

metabolit tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok mikroorganisme untuk

hidup dan tumbuh. Metabolit sekunder tidak diproduksi pada saat fase logaritmik,

tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada fase

stasioner saat populasi sel tetap (Pratiwi, 2008). Metabolit sekunder pada

mikroorganisme disekresikan ke dalam media biakan (Suwandi,1989), maka dari

supernatan hasil fermentasi digunakan untuk skrining fitokimia.

Dari hasil yang didapat, bahwa dari semua isolat memberikan hasil negatif

terhadap uji terpenoid/steroid, alkaloid, saponin, flavonoid dan tanin (Tabel 5).

Tabel 5. Skrining Fitokimia Metabolit Sekunder Bakteri Endofit

Isolat Terpenoid/

Steroid

Alkaloid Fenolik Flavonoid Saponin

DR1 - - - - -

DR2 - - - - -

DR3 - - - - -

DR4 - - - - -

Tidak terdeteksinya metabolit diduga karena dari keempat isolat yang

didapat tersebut memiliki gen yang mengkode pembentukan senyawa metabolit

sekunder, namun tidak terekspresi pada media produksi yang telah digunakan.

Gen tersebut akan muncul apabila diberikan induksi terlebih dahulu, proses

induksi dapat berupa penambahan suatu senyawa prekursor atau penambahan

sejumlah tertentu inokulum isolat pada proses fermentasi (Nofiani, 2009).

Sedangkan dalam penelitian ini, diduga media produksi yang digunakan tidak

dapat memberikan induksi untuk mengekspresikan gen pembentuk senyawa

metabolit, serta penambahan sumber karbon dapat digunakan agar metabolit

sekunder dapat terekspresi.

Dugaan lainnya yaitu tidak adanya proses ekstraksi, pemekatan atau

metabolit yang dihasilkan oleh isolat sangat sedikit pada supernatan, sehingga

42


sulit untuk menentukan metabolit sekunder apa yang diekskresikan oleh isolat

sehingga sulit dideteksi dengan penggunaan reagen.

Untuk menguji keberadaan metabolit pada supernatan isolat, maka

dilakukan pengujian menggunakan metode KLT. Pengujian dilakukan dengan

cara mentotolkan supernatan isolat DR1, DR2, DR3 dan DR4 diatas plat KLT,

kemudian dielusi dengan menggunakan pelarut etanol – etil asetat (8:2). Plat KLT

yang sudah dilakukan proses elusi, diamati pada sinar UV biru 254 nm dan sinar

UV hijau 366 nm. Hasil yang diperoleh yaitu adanya noda berpendar pada sinar

UV 254 nm dengan nilai Rf 0.85 pada isolat DR1, dan nilai Rf 0.75 pada isolat

DR2, DR3 dan DR4 (Gambar 12). Dengan adanya noda berpendar tersebut,

diduga bahwa keempat isolat mempunyai suatu metabolit, namun belum bisa

ditentukan senyawa apa yang terkandung didalamnya. Spot yang terlihat pada plat

KLT memiliki polaritas yang tinggi karena eluen yang digunakan adalah pelarut

etanol yang bersifat polar.

(a) (b)

Gambar 13. Hasil KLT Ekstrak Kasar Bakteri Endofit (a) Hasil monitor

dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm (b) Hasil monitor

dengan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm.

Keterangan Gambar : (1) DR1 (2) DR2 (3) DR3 (4) DR4

4.8 Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dilakukan pada isolat bakteri endofit terhadap

bakteri Escherichia coli, Salmonella thypimurium, Bacillus subtilis, dan

Staphylococcus aureus menggunakan metode dilusi agar. Keuntungan dari

penggunaan metode dilusi adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji

dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).

Spot hasil KLT

43


Untuk pengujian aktivitas antibakteri digunakan hasil fermentasi yang

telah digojog selama 48 jam. Pada pengujian, isolat dan media fermentasi steril

diserapkan pada kertas cakram steril sebanyak 20 µL. Kontrol positif yang

digunakan adalah antibiotik Kloramfenikol 30 µg, sedangkan kontrol negatif yang

digunakan adalah media NB steril. Kertas cakram yang telah diserapkan, lalu

dibiarkan kering dibawah sinar UV selama kurang lebih 30 menit. Kertas cakram

yang telah kering lalu diletakkan diatas media agar yang sudah berisi bakteri uji,

lalu diinkubasi pada suhu 35oC. Hasil diameter zona hambat bakteri endofit dapat

dilihat pada Tabel 6. Penyinaran sinar UV pada cakram yang telah di serapkan

media hasil fermentasi dikarenakan, pada hasil fermentasi tidak dilakukan proses

penyaringan menggunakan milipore, sehingga dikhawatirkan isolat tumbuh diatas

agar.

Tabel 6. Zona Hambat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Uji

Rata-rata diameter zona hambat (mm)

Uji E. coli S. thypimurium S. aureus B. subtilis

DR1 7.9 7.1 7.1 8.0

DR2 7.6 6.8 7.0 7.7

DR3 7.6 7.0 - 7.9

DR4 7.5 7.0 7.0 8.3

Kloramfenikol 9.5 16.1 16.5 9.4

Kontrol negatif - - - -

Hasil penelitian menunjukan bahwa isolat yaitu DR1, DR2, dan DR4

memiliki aktivitas penghambatan terhadap semua bakteri uji. Sedangkan pada

isolat DR3 tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri

Staphylococcus aureus (Lampiran 12).

Menurut Davis Stout (1971) dalam Hardiningtyas (2009), zona hambat

dengan diameter 20 mm atau lebih memiliki potensi antibakteri sangat kuat, zona

hambat dengan diameter 10-20 mm memiliki potensi antibakteri kuat, zona

hambat dengan diameter 5-10 mm memiliki potensi antibakteri sedang, dan zona

hambat dengan diameter 5 mm atau kurang memiliki potensi antibakteri lemah.

Pada hasil uji aktivitas antibakteri isolat DR1 memberikan diameter zona

hambat sebesar 7.9 mm terhadap bakteri E.coli, 7.1 mm terhadap bakteri

44


S.thypimurium dan S.aureus dan 8.0 mm terhadap bakteri B. subtilis. Hal ini

menunjukan bahwa isolat DR1 mempunyai potensi antibakteri yang sedang.


hambat sebesar 7.6 mm terhadap bakteri E. coli, 6.8 mm terhadap bakteri

S.typimurium, 7.0 mm terhadap bakteri S.aureus dan 7.7 mm terhadap bakteri

B.subtilis. Hal ini menunjukan bahwa isolat DR2 mempunyai potensi antibakteri

yang sedang.



S.thypimurium, dan 7.6 mm terhadap bakteri B.subtilis. Hal ini menunjukan

bahwa isolat DR3 mempunyai potensi antibakteri yang sedang. Isolat DR3 tidak

memberikan zona hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus, hal ini

dikarenakan bakteri S.aureus merupakan bakteri Gram positif yang memiliki

peptidoglikan pada dinding sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan Gram

negatif, sehingga senyawa dari bakteri endofit sulit masuk ke dalam sel bakteri

(Pelczar dan Chan, 1986).



S.typhimurium dan S.aureus dan 8.3 mm terhadap bakteri B.subtilis. Pada hasil

terlihat bahwa isolat DR4 memberikan zona hambat yang cukup besar, bila

dibandingkan dengan isolat lain. Hal ini menunjukan bahwa isolat DR4

mempunyai potensi antibakteri yang sedang.

Dari data diameter zona hambat pada bakteri Gram negatif dan Gram

positif memberikan hasil yang berbeda-beda. Bakteri B.subtilis dan S. aureus

merupakan bakteri Gram negatif, namun memiliki diameter zona hambat yang

berbeda, hal ini dikarenakan komposisi protein pada permukaan sel S. aureus

dapat berubah secara dramatis tergantung pada kondisi pertumbuhan dan

kebutuhan sel bakteri (Pollack dan Neuhaus, 1994 dalam Silhavy, 2010). Selain

itu, adanya perbedaan struktur peptidoglikan khususnya perbedaan crosslink

peptida pada rantai glikan. Pada S.aureus mempunyai beberapa crosslink peptida

dengan beberapa asam amino, sedangkan pada B.subtilis tidak (Silhavy, 2010),

hal ini yang menyebabkan hasil fermentasi bakteri endofit lebih mudah masuk ke

45


dalam sel bakteri dan memberikan zona hambat yang lebih besar pada bakteri

B.subtilis. Crosslink peptida ini serupa pada struktur sel bakteri E. coli, yang

berdampak pada perbedaan zona hambat pada bakteri Gram negatif.

Bakteri endofit juga memberikan zona hambat yang berbeda antara bakteri

Gram positif dan Gram negatif. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya

perbedaan struktur dan komposisi pada dinding sel masing-masing bakteri Gram.

Pada bakteri Gram negatif, kandungan peptidoglikan lebih sedikit dibandingkan

dengan bakteri Gram positif, dan kandungan lipid yang lebih tinggi dibandingkan

dengan Gram positif yang dapat memperbesar permeabilitas dinding sel (Pelczar

dan Chan, 1986).


BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Bakteri endofit yang di isolasi dari daun rambutan Nephelium lappaceum

L. sebanyak 4 isolat, dengan kode DR1, DR2, DR3, dan DR4

2. Isolat DR1, DR2, DR3 dan DR4 memberikan hasil negatif terhadap uji

terpenoid/steroid, alkaloid, fenolik, flavonoid, saponin.

3. Daun segar Nephelium lappaceum L. mempunyai senyawa metabolit

sekunder saponin, terpenoid, flavonoid, fenolik dan tanin.

4. Uji aktivitas antibakteri isolat DR1, DR2, dan DR4 menggunakan metode

difusi cakram menunjukan aktif terhadap bakteri Escherichia coli,

Salmonella thypimurium, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis.

Sedangkan isolat DR3 aktif terhadap bakteri Escherichia coli, Salmonella

thypimurium, dan Bacillus subtilis.

5.2 Saran

Dari hasil penelitian yang telah diperoleh maka disarankan untuk

melakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi dan cara ekstraksi isolat

bakteri endofit, sehingga senyawa metabolit sekunder yang terkandung

didalamnya dapat terekspresi.


DAFTAR PUSTAKA

Adiarti, Retno. 2013. Aktivitas Bakteri Endofit Batang Mangrove Avicenna

marina Sebagai Penghasil Antibiotik. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan. Universitas Padjadjaran. Jatinangor.

Anonim. 2012. Modul Teknik Fermentasi Departemen Kimia ITB.

http://akademik.che.itb.ac.id/labtek/wp-content/uploads/2012/05/fer-teknik-

fermentasi.pdf.1 Juni 2015, pk 04.00

Arenas, MGH, Daniel NA, Maria TMD, Daniel TO, Cristian ND, Nestor BM.

2010. Characterization of Rambutan (Nephelium lappaceum) Fruits From

Outstanding Mexican Selections.

Audu, S.A., Ilyas M, Haruna AK. 2007. Phytochemical Screening of The Leaves

of Lophira lanceolata (Ochanaceae). Life Science Journal 4(4)

Bacon, C.W and M.R. Siegel. 1990. Isolation of Biotechnological Organisms

from Nature. Mc Graw-Hill Environtment Biotechnology Series. US. Hlm :

259-279.

Bacon, C.W. 1985. A Chemical Defined Medium for The Growth and Synthetis

of Ergot Alkaloids by the Spesies of Balansia. Mycologia 77 : 418-423.

Barbara J. E. S., and Christine J. C. B. 2006. What are Endophytes. In Microbial

Root Endophytes (Eds: Thomas N. Sieber). Springer-Verlag, Berlin.

Berg, C. Howard. 2004. E. coli in motion. Amerika : Springer

Cappucino, James G. 1999. Microbiology : A Laboratory Manual, Fifth Edition.

California : Benjamin Cummings.

Cappucino, JG dan Sherman N. 2011. Microbiology a Laboratory Manual, Ed 9.

San Francisco : Benjamin Cummings.

Carrica, Mariela C, Patricio O.C, Victor A.G, Andes A, Eleonora G, Fernando

A.G, Silvio L.C. 2011. YqiC of Salmonella enterica serovar Typhimurium is

a Membrane Fusogenic Protein Required for Mice Colonization. BMC

Microbiology 11(95)

Croteau, R., Kutchan, T.M. and Lewis, N.G. 2000. Natural products (secondary

metabolites. In B.B. Buchannan, W. Gruissem and R.L. Jones (eds),

Biochemistry and Molecular Biology of Plant. American Society of Plant

Physiologists, Rockville, MD. Hlm : 1250–1318.

Crozier, Alan., Jaganath, Indu B., Clifford, Michael N. 2006. Phenol, Polyphenols

and Tannins : An Overview. In : Plant Secondary Metabolites : Occurrence,

Structure and Role in Human Diet. Blackwell Publishing

Dalimartha, Setiawan. 2003. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 3. Jakarta :

Trubus Agriwidya.

http://akademik.che.itb.ac.id/labtek/wp-content/uploads/2012/05/fer-teknik-fermentasi.pdf

http://akademik.che.itb.ac.id/labtek/wp-content/uploads/2012/05/fer-teknik-fermentasi.pdf

48


Dewick, P.M. 2002. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 2nd

ed. Chichester : JohnWiley and Sons

Fansworth, Norman R. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants.

Journal of Pharmaceutical Sciences. 55(3).

Forester, H. 2006. American Journal Clinical Nutrition 103(15) : 66-71

Freeman-Cook, Lisa., Freeman-Cook, Kevin. 2005. Deadly Diseases and

Epidemics Staphylococcus aureus Infection. Amerika : Chelsea House

Publishers.

Ganiswarna, V.H.S. 1995. Farmakologi dan Terapi Edisi ke-4. Jakarta: Bagian

Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Guo B., J. Dai, S. Ng, Y. Huang, C. Leong, W.Ong, and BK. Carte. (2000).

Cytonic acid A and B, novel tridepside inhibitor of hCMV protease from the

endophytic fungus Cytonaena sp. J.Nat.Prod 63 : 602-604.

Harborne, J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penerjemah: Padmawinata, K. dan I.

Sudiro. Bandung: ITB Press.

Hung, PQ., K, Annapurna. 2004. Isolation and characterization of endophytic

bacteria in soybean (GLYCINE sp.). Omonrice 12 : 92-101.

Indrawati, Ni Luh., Razimin. 2013. Bawang Dayak Si Umbi Ajaib Penakluk

Aneka Penyakit. Jakarta : Agromedia Pustaka

Jauhari, Lendra Tantowi. 2010. Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba Penghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen. Skripsi. Fakultas

Sains dan Teknologi. UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta

Jones, William P., Kinghorn, A. Douglas. 2012. Extraction of Plant Secondary

Metabolites. Methods in Biotechnology, Natural Product Isolation, 2nd

ed

20

Kalie, M.B. 1994. Budidaya Rambutan Varietas Unggul. Yogyakarta : Penerbit

Kanisius.

Kar, Ashutosh. 2003. Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology (Revised-

Expanded Second Edition. New Delhi : New Age International (P) Limited

Publisher.

Kee, Joyce L., Hayes, Evelyn R. 1996. Farmakologi : Pendekatan Proses

Keperawatan. Jakarta : EGC

Khairani, Gustin. 2009. Isolasi dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil

Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Akar Tanaman Jagung (Zea mays

L.). Skripsi. Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara. Medan.

49


Korsten, L., Cook, N. 1996. Optimizing Culturing Condition for Bacillus subtilis.

South African Avocado Growers’ Assosiaciation Yearbook 19 : 54-58.

Kumala, S., Fransisca S, Priyo W. 2006. Aktivitas Antimikroba Metabolit

Bioaktif Mikroba Endofitik Tanaman Trengguli (Casska fistula L.). Jurnal

Farmasi Indonesia 3(2) : 97 – 102

Lim, T.K. 2013. Edible Medicinal and Non – Medicinal Plants, Volume 6, Fruits.

New York : Springer.

Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. 2000. New Bioactive metabolites

produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua.

Plant Sci 151 : 76-73

Makkar, H.P.S, Siddhuraju P, Becker K. 2007. Saponin. In : Methods in

Molecular Biology, Plant Secondary Metabolites 393

Maradona, Doni. 2013. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Durian

(Durio zibenthinus L), Daun Lengkeng (Dinocarpus longan Lour), dan Daun

Rambutan (Nephelium lappaceum L) Terhadap Bakteri Staphylococcus

aureus ATCC 25925 dan Escherichia coli ATCC 25922. Skripsi. Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta

McSweeney, C.S., Makkar, H.P.S., dan Reed, J.D. 2003. Modification of rumen

fermentation to reduce adverse effects of phytochemicals. In: Proceedings

of the Sixth International Symposium on the Nutrition of Herbivores,

Mannetje, L.’t, Ramirez-Aviles, L., Sandoval-Castro, C., and Ku-Vera, J.C.,

(eds.). Mexico. Hlm : 239–270.

Mohammad, N.S., Milow, P. and Ong, H.C. 2012. Traditional Medicinal Plants

Used by the Kensiu Tribe of LubukUlu Legong, Kedah, Malaysia. Ethno.

Med 6 : 149-153.

Muhtadi, A., Rini H, Resmi M. 2013. Pharmacological Screening of Various

Indonesian Herbals Potentially Used As Antidiabetic. Pharmaceutical and

Applied 3(2) : 90 – 95.

Nursanty, Risa., Suhartono. 2012. Isolasi, Karakterisasi dan Uji Antimikroba

Bakteri Endofit Asal Tumbuhan Johat (Cassia siamea Lamk.). Jurnal

Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi Universitas Syiah Kuala 4(1)

Palanisamy, U.D., Ling, L.T., Manaharan, T. dan Appleton, D. 2011. Rapid

isolation of geranin from Nephelium lappaceum rind waste and its anti-

hyperglycemic activity. Food Chemistry 127 : 21–27.

Parija, Subhash Chandra. 2009. Textbook of Microbiology & Immunology. India :

Elsevier

Patel, Jay M. 2008. A Review of Potential Health Benefits of Flavonoids.

Lethbridge Undergraduate Research Journal 3(2).

50


Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan

Obat. Majalah Ilmu Kefarmasian 2(3) : 113 – 126

Rante, Herlina., Burnahudin T, Soendaria Intan. 2013. Isolasi Fungi Endofit

Penghasil Senyawa Antimikroba dari Daun Cabai Katokkon (Capsicum

annuum L. var. chinensis) dan Profil KLT Bioautografi. Majalah Farmasi

dan Farmakologi 17(2) : 39 – 46.

Rodoles, B., V. Salmeron, M.V. Martinez-Toledo dan J. Gonzalez-Lopez. 1993.

Production of vitamins by Azospirillum brazilense in chemically-defined

media. Plant and Soil 153: 97-101.

Rukmana, Rahmat., Oesman, Yuyun Yuniarsih. 2002. Rambutan Komoditas

Unggul dan Prospek Agribisnis. Yogyakarta : Kanisius

Schuier, M., Sies H., Illek B. 2005. Cocoa-Related Flavonoids Inhibit CFTR-

Mediated Chloride Transport Across T84 Human Colon Epithelia. J Nutr

135 : 2320-2325

Schwartz, Seymour I. 2000. Intisari Prinsip-prinsip Ilmu Bedah Edisi ke 6.

Jakarta : EGC

Sidker, Md.Al Amin, Tasnuva S, AFM Mustafizur, Rahman, Mohammad RH,

Mohammad SR, Mohammad AR. 2013. Screening of Four Medicinal Plants

of Bangladesh for Bioactivities. Journal of Pharmacy and Science 12(1) :

59-62

Silhavy, Thomas J., Daniel, K dan Suzanne, W. 2010. The Bacterial Cell

Envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. Artikel.

Singh, Kh. Lemino., G.C. Bag. 2013. Phytochemical Analysis And Determination

of Total Phenolics Content in Water Extracts of Three Species of

Hedychium. International Journal of PharmTech Research 5(4) : 1516-

1521.

Strobel GA., RV. Miller, C. Miller, M. Condron, DB. Teplow, and WM. Hess.

1999. Cryptocandin, a potent antimycotic from endo phytic fungus

Cryptosporiopsis quercina. Microbiology 145 : 1919-1926.

Strobel, GA., E. Ford. J. Woapong, JK. Harper, AM. Arif, DM. Grant, PCW.

Fung, and K. Chan. 2002. Isopestacin, an isobenzopuranone from

Pestalotiopsis microspora, possessing antifungal and antioxidant activities.

Pytochemistry 60 : 179-183.

Strobel.G & B.Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their

Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews. Microbiol

67 : 491-502

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius : Yogyakarta

Suwandi, Usman. 1989. Mikroorganisme Penghasil Antibiotik. Cermin Dunia

Kedokteran 58

51


Tan, RX dan WX Zou. 2001. Endophytes : a rich source of functional metabolites.

Nat Prod.Rep 18 : 448-459

Tarabily, K, A. H. Nassar, K. Sivasithamparam. 2003. Promotion of Plant Growth

By An Auxin-Producing Isolat of The Yeast Williopsis Saturnus Endophytic

In Maize Roots. The Sixth U.A E University Research Conference. Hlm :

60-69

Tindall, H.D. 1994. Rambutan cultivation. Roma : FAO. Page 163

Tisnadjaja, Djadjat. 2006. Bebas Kolesterol dan Demam Berdarah dengan

Angkak. Niaga Swadaya : Jakarta

Zhang,B., G.salituro, D.Szalkowski, Z. Li, Y. Zhang, I. Royo, D. Vilella, M. Dez,

F. Pelaes, C. Ruby, RL. Kendall, X. Mao, P. Griffin, J. Calaycay, JR.

Zierath, JV. Heck, RG. Smith, and DE. Moller. 1999. Discovery af small

molecule insulin mimetic with antidiabetic activity in mice. Journal of

Science 284: 974-981.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Daun Rambutan

53


Lampiran 2. Skema Kerja Penelitian

Daun Rambutan Segar

Sterilisasi Permukaan Daun Rambutan

Isolasi Bakteri Endofit

Pemurnian dan Peremajaan Isolat

- Pembuatan Stock Culture dan

Working Culture

Fermentasi

Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas

Antibakteri

Identifikasi Bakteri Endofit

- Makroskopis

- Mikroskopis

Skrining Fitokimia Determinasi

54


Lampiran 3. Sterilisasi Permukaan Daun

Alkohol

70%

1 menit

NaOCl

5.25 %

5 menit

Alkohol

70%

30 detik

Akudes

steril

1 menit

Akudes

steril

1 menit

Daun

Rambutan

Cuci

Bersih

Kontrol

Daun

55


Lampiran 4. Pemurnian dan Identifikasi Isolat

Metode Streak Stock

Makroskopis

- Bentuk koloni

- Bentuk tepi koloni

- Warna koloni

Mikroskopis

- Pewarnaan Gram

- Uji katalase Stock Isolat

56


Lampiran 5. Fermentasi Bakteri Endofit

Media NB Isolat

digojog 170 rpm, 27oC, 48 jam

Sentrifugasi 3000 rpm,

20 menit, 4oC

Supernatan

Uji Aktivitas

Antibakteri

Skrining Fitokimia

KLT Reagen

57


Lampiran 6. Uji Aktivitas Antibakteri

Supernatan

Bakteri uji

NaCl 0.9%

5 mL

0.1 % suspensi

bakteri

digojog 120 rpm, 27oC

E. coli

4 jam

S. thypimurium

10 jam

S. aureus

3 jam

B. subtilis

13 jam

1 ml suspensi

bakteri

Metode

Pour Plate

Media NB

58


Lampiran 7. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Pada Daun Rambutan

Hari ke – 1 Hari ke – 7 Hari Ke – 7

59


Lampiran 8. Hasil Pemurnian Isolat Bakteri Endofit

DR1 DR2

DR3 DR4

60


Lampiran 9. Skrining Fitokimia Daun Segar

Kontrol Saponin Alkaloid Tanin

Hasil : Positif Hasil : Negatif Hasil : Positif

Busa Stabil (a) Dragendorff Hitam-hijau

(b) Meyer

Fenolik Terpenoid/Steroid Flavonoid

Hasil : Positif Hasil : Positif Hasil : Positif

Ungu tua (a) Merah (bawah) (a) Abu-abu

(b) Kuning-kehijauan (b) Warna hilang

(a) (b)

(b) (a) (b) (a)

61


Lampiran 10. Uji Katalase Isolat

Gambar Keterangan

+

+

+

+

DR

1

DR

2

DR

3

DR

4

62


Lampiran 11. Uji Aktivitas Antibakteri

Uji Keterangan

Escherichia coli

(a) DR1

(b) DR2

(c) DR3

(d) DR4

(-) Media steril

(+) Kloramfenikol

Salmonella thypimurium

(a) DR1

(b) DR2

(c) DR3

(d) DR4

(-) Media steril

(+) Kloramfenikol

Staphylococcus aureus

(a) DR1

(b) DR2

(c) DR3

(d) DR4

(-) Media steril

(+) Kloramfenikol

(a)

(a)

(b)

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(c)

(d)

(d)

(d)

(+)

(+)

(+) (-)

(-)

(-)

63


Bacillus subtilis

(a) DR1

(b) DR2

(c) DR3

(d) DR4

(-) Media steril

(+) Kloramfenikol

(b) (c)

(d)

(-) (+)

(a)

64


Lampiran 12. Identifikasi Isolat Bakteri Endofit

Isolat Pewarnaan Gram Keterangan

DR1

Pewarnaan Gram : Gram negatif

Bentuk Sel : Kokus

Skala : Perbesaran 1000x

DR2


Bentuk Sel : Batang


DR3


Bentuk Sel : Kokus


DR4

Pewarnaan Gram : Gram positif

Bentuk Sel : Kokus


65


Lampiran 13. Identifikasi Bakteri Uji

No. Bakteri Keterangan

1.

Bakteri : Staphylococcus aureus


Bentuk Sel : kokus

2.

Bakteri : Bacillus subtilis


Bentuk Sel : basil

3.

Bakteri : Escherichia coli


Bentuk Sel : kokus

4.

Bakteri : Salmonella thypimurium


Bentuk Sel : basil

66


Lampiran 14. Karakteristik Koloni Bakteri Pada Media Agar

Sumber : Cappucino (1998)

isolasi dan skrining fitokimia bakteri endofit dari...

Documents