ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

STANDARISASI BAHAN ALAMDiajukan Untuk Memenuhi Ujian Mata Kuliah Standarisasi Bahan Alam Program Studi S-1 Farmasi

Oleh:Hilmi NurhidayatNIM. 31112022

PROGRAM STUDI S-1 FARMASISEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATANBAKTI TUNAS HUSADA TASIKMALAYA2015

1. Deskripsi Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)Tanaman sirih merah tumbuh merambat seperti halnya sirih hijau, dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai, yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilat. Sirih merah tumbuh merambat di pagar atau pohon. Ciri khas tanaman ini adalah berbatang bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Yang membedakan dengan sirih hijau adalah selain daunnya berwarna merah keperakan, bila daunnya disobek maka akan berlendir serta aromanya lebih wangi. Tanaman sirih merah ini merupakan famili Piperaceae. Kedudukan tanaman sirih merah dalam taksonomi tumbuhan adalah sebagai berikut:Kingdom: PlantaeSub Kingdom: TracheobiontaSuper Divisio: SpermatophytaDivisio: MagnoliophytaKelas: MagnoliopsidaSub Kelas: MagnolidaeOrdo: PiperalesFamilia: PiperaceaeGenus: PiperSpecies: Piper crocatum Ruiz & Pav.Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia yakni minyak atsiri, alkoloid, saponin, tanin dan flavonoid. Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah minyak atsiri, hidroksikavikol, kavikol, dan lain- lain. Karena banyaknya kandungan zat/senyawa kimia bermanfaat inilah, daun sirih merah memiliki manfaat yang sangat luas sebagai bahan obat. Karvakrol bersifat desinfektan, antijamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau mulut dan keputihan. Eugenol dapat digunakan untuk mengurangi rasa sakit, sedangkan tanin dapat digunakan untuk mengobati sakit perut. Banyak pengalaman bahwa menggunakan sirih merah dalam bentuk segar, simplisia maupun ekstrak kapsul dapat menyembuhkan penyakit diabetes militus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol, mencegah stroke, asam urat, hipertensi,

2. Preparasi Sampel2.1 Determinasi Bahan AwalDeterminasi tanaman yang akan digunakan dilakuakan berdasarkan ciri fisiologis tanaman seperti daun, bunga, batang serta akar. Identifikasi dan determinasi dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan.2.2 Persiapan simplisia daun Sirih MerahDaun sirih dibersihkan, dicuci, kemudian dikeringkan pada suhu kamar atau diangin-angin kurang lebih 1 minggu.

3. Isolasi Minyak Atsiri menggunakan Destilasi Stahl3.1 Skrining FitokimiaSkrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder dalam simplisia yang akan dianalisis yaitu simplisia buah mengkudu. Untuk melakukan skrining fitokimia, simplisia mengkudu diekstraksi agar dapat direaksikan dengan reagen yang digunakan untuk melakukan skrining fitokimia. Ekstraksi simplisia mengkudu dilakukan dengan cara simplisia dihaluskan terlebih dahulu unutk memperkecil partikel sehingga luas permukaan sentuh semakin besar yang akan mempercepat proses ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut air yang dipanaskan, kemudian simplisia halus dimasukkan kedalam air panas sambil diaduk hingga proses ekstraksi selesai. Ekstrak yang didapat dipisahkan dari residunya dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat (sampel) yang diperoleh dapat di reaksikan dengan berbagai reagen untuk melakukan skrining fitokimia.Skrining Senyawa AlkaloidSkrining senyawa golongan alkaloid dilakukan dengan cara sampel dibasakan dengan menggunakan ammonia encer kemudian ditambahkan beberapa mL kloroform, filtrate dikocok dengan HCl 2N dan lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi 3 bagian, bagian pertama digunakan sebagai blanko, bagian kedua direaksikan dengan pereaksi mayer dan bagian ketiga direaksikan dengan pereaksi dragendorf. Setelah diamati terbentuk endapan putih dengan penambahan pereaksi mayer sedangkan terbentuk endapan jingga coklat sehingga kunyit dinyatakan positif mengandung alkaloid. Panambahan basa pada sampel dilakukan untuk membentuk alkaloid dalam bentuk basanya karena pada tumbuhan alkaloid terdapat dalam bentuk garamnya, alkaloid dalam bentuk basa tersebut dapat larut dalam pelarut organic seperti kloroform sehingga ditambahkan beberapa mL kloroform. Kemudian penambahan asam dilakukan untuk membentuk kembali alkaloid kedalam bentuk garamnya karena terjadi reaksi netralisasi antara alkaloid basa dengan asam klorida yang ditambahkan sehingga alkaloid akan larut pada asam klorida tersebut. Apabila dilakukan pengujian alkaloid yang terlarut dalam pelarut organic maka reaksi tidak akan terjadi karena terdapat perbedaan kepolaran antara kloroform (yang nonpolar) dengan pereaksi uji yang digunakan yaitu pereaksi mayer dan dragendorf yang bersifat polar. Pada bagian yang ditetesi peraksi mayer hasil positif ditandai dengan terbentuknya endapan putih, endapan putih tersebut merupakan kompleksi klium-alkaloid. Pereaksi mayer dibuat dengan cara larutan merkurium (II) klorida ditambah kalium iodide yang akan bereaksi membentuk endapan merah merkurium(II) iodide. Jika kalium iodide yang ditambahkan berlebih makan akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat (II). Peraksi mayer dibuat dengan cara mencmpur larutan bismuth nitrat dalam asam nitrat dengan larutan kalium iodide. Alkaloid memiliki atom nitrogen yang biasanya heterosiklik yang mempunyai pasangan elktron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam. Pada uji alkaloid dengan menggunakan pereaksi mayer atom nitrogen pada alkaloid bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodomerkurat (II) membentuk komplek kalium-alkaloid yang mngendap. Skrining Senyawa FlavonoidSkrining fitokimia flavonoid sampel dipanaskan dengan campuran logam magnesium dan HCl 5N kemudian disaring, apabila filtrate yang dihasilkan berwarna merah yang dapat ditarik dengan menggunakan amil alcohol. maka sampel positif mengandung alkaloid, namun pada sampel simplisia kunyit filtrate yang dihasilkan tidak berwarna merah yang artinya kunyit tidak mengandung flavonoid. Penambahan logam Mg dan HCl akan terjadi reaksi eksoterm yaitu reaksi yang melepaskan panas yang ditandai dengan terbentuknya gelembung gas dan pelepasan kalor pada permukaan tabung reaksi. Skrining Senyawa Tanin dan PolifenolSkrining fitokimia senyawa tannin dan polifenol dengan cara sampel ditetesi dengan pereaksi FeCl3, apabila terbentuk warna biru hitam maka positif untuk tannin dan polifenol. Penambahan FeCl3 berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tannin merupakan ligan yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks yang stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat Fe3+ dengan ligan tannin. Untuk membedakan tannin dan polifenol digunakan sifat tannin yang dapat mengendpkan larutan gelatin 1 % karena tannin dapat mengendapkan protein pada gelatin. Tanin bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air.Skrining Senyawa saponinSkrinig senyawa saponin dialakukan dengan cara sampel dimsukkan kedalam tabung reaksi kemudian dikocok kuat selama 30 detik. Pembentukan busa sekurang kurang nya 1 cm dan tidak hilng dengan penambahan asam klorida menunjukan adanya saponin. Uji saponin diatas dinamakan uji forth. Timbulnya busa pada uji Forth menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya. Saponin merupakan senyawa yang mempunyai gugus hidrofilik dan hidrofob. Pada saat digojok gugus hidrofil akan berikatan dengan air sedangkan gugus hidrofob akan berikatan dengan udara sehingga membentuk buih. Penambahan HCl bertujuan untuk menambah kepolaran sehingga gugus hidrofil akan berikatan lebih stabil dan buih yang terbentuk menjadi stabil. Apabila buih hilang maka sampel tidak mngndung saponin.Skrining Senyawa Monoterpenoid dan SeskuiterpenoidSkrining senyawa monoterpenoid dan seskuiterpenoid dilakukan dengan cara simplisia disari dengan eter kemudian disaring dan eter di uapkan. Pada residu ditambahkan vanillin asam sulfat, apabila terbentuk warna warna menunjukan hasil positif untuk monoterpenoid dan seskuiterpenoid. Skrining Senyawa Steroid dan TriterpenoidSkrining senyawa steroid dan triterpenoid dilakukan dengan cara simplisia disari dengan eter kemudian disaring dan eter diuapkan. Pada residu ditambahkan pereaksi liberman bourchard apabila terbentuk warna ungu makan positif unutk triterpenoid sedangkan apabila terbentuk warna hijau biru positif untuk steroid. Uji Lieberman-Burchard yang merupakan uji karakteristik untuk sterol tidak jenuh dan triterpe. Hasil positif pada uji Lieberman-Burchard ditandai dengan terbentuknya warna ungu untuk triterpenoid dan hijau biru untuk steroid yang berasal dari reaksi antara sterol tidak jenuh atau triterpen dengan asam (CH3 COOH dan H2SO4).Skrining Senyawa KuinonSkrining fitokimia kuinon dialkuakn dengan caara sampel ditetesi dengan naoH, apabila terbentuk warna kuning hingga merah maka postif kuinon. Pengenalan senyawa ini didasarkan pada kemampuannya membentuk garam berwarna antara hidrokuinon dengan larutan alkali kuat seperti NaOH atau KOH. Reaksinya adalah sebagai berikut:

3.2 Ekstraksi menggunakan Destilasi StahlSebanyak 25 gram simplisia daun sirih merah didestilasi stahl dengan aquades 2/3 volume labu selama kurang lebih 4 jam, selanjutnya minyak atsiri dipisahkan. Minyak atsiri yang masih bercampur dengan sedikit air dihilangkan dengan menambahkan Na2SO4 anhidrous sampai jenuh kemudian dipisahkan. Minyak atsiri yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk proses selanjutnya.Daun sirih merah sebelum didestilasi perlu diperlakukan dengan cara perajangan. Perajangan bertujuan agar kelenjar minyak dapat terbuka sebanyak mungkin, sehingga memudahkan penguapan minyak atsiri saat destilasi berlangsung, karena minyak atsiri dikelilingi oleh kelenjar minyak, pembuluh-pembuluh, dan kantung minyak. Menurut Yuliani (2006) perajangan dimaksudkan untuk memecahkan sel minyak dan memperluas permukaan bahan, sehingga mempercepat proses difusi dan minyak mudah terekstraksi oleh uap air. Perajangan daun sirih merah ini dilakukan sesaat sebelum didestilasi atau setelah pengeringan untuk menghindari agar selama pengeringan minyak atsiri yang menguap tidak banyak. Prinsip kerja destilasi stahl sama dengan destilasi dengan air (hidrodestilasi). Namun destilasi stahl memiliki beberapa kelebihan. Kelebihan penggunaan destilasi stahl antara lain: minyak atsiri yang dihasilkan tidak berhubungan langsung dengan udara luar sehingga tidak mudah menguap dan volume minyak atsiri yang dihasilkan dapat langsung diketahui jumlahnya karena alatnya dilengkapi dengan skala. 4. Parameter Kualitas Minyak Atsiri Beberapa parameter yang biasanya dijadikan standar untuk mengenali kualitas minyak atsiri adalah sebagai berikut :4.1 Berat JenisBerat jenis merupakan salah satu kriteria penting dalam menentukan mutu dan kemurnian minyak atsiri. Nilai berat jenis minyak atsiri didefinisikan sebagai perbandingan antara berat minyak dengan berat air pada volume air yang sama dengan volume minyak pada yang sama pula. Berat jenis sering dihubungkan dengan fraksi berat komponen-komponen yang terkandung didalamnya. Semakin besar fraksi berat yang terkandung dalam minyak, maka semakin besar pula nilai densitasnya. Biasanya berat jenis komponen terpen teroksigenasi lebih besar dibandingkan dengan terpen tak teroksigenasi. 4.2 Indeks BiasIndeks bias merupakan perbandingan antara kecepatan cahaya di dalam udara dengan kecepatan cahaya didalam zat tersebut pada suhu tertentu. Indeks bias minyak atsiri berhubungan erat dengan komponen-komponen yang tersusun dalam minyak atsiri yang dihasilkan. Sama halnya dengan berat jenis dimana komponen penyusun minyak atsiri dapat mempengaruhi nilai indeks biasnya. Semakin banyak komponen berantai panjang seperti sesquiterpen atau komponen bergugus oksigen ikut tersuling, maka kerapatan medium minyak atsiri akan bertambah sehingga cahaya yang datang akan lebih sukar untuk dibiaskan. Hal ini menyebabkan indeks bias minyak lebih besar. Menurut Guenther, nilai indeks juga dipengaruhi salah satunya dengan adanya air dalam kandungan minyak jahe tersebut. Semakin banyak kandungan airnya, maka semakin kecil nilai indek biasnya. Ini karena sifat dari air yang mudah untuk membiaskan cahaya yang datang. Jadi minyak atsiri dengan nilai indeks bias yang besar lebih bagus dibandingkan dengan minyak atsiri dengan nilai indeks bias yang kecil.4.3 Putaran optikSifat optik dari minyak atsiri ditentukan menggunakan alat polarimeter yang nilainya dinyatakan dengan derajat rotasi. Sebagian besar minyak atsiri jika ditempatkan dalam cahaya yang dipolarisasikan maka memiliki sifat memutar bidang polarisasi ke arah kanan (dextrorotary) atau ke arah kiri (laevorotary). Pengukuran parameter ini sangat menentukan kriteria kemurnian suatu minyak atsiri.4.4 Bilangan AsamBilangan asam menunjukkan kadar asam bebas dalam minyak atsiri. Bilangan asam yang semakin besar dapat mempengaruhi terhadap kualitas minyak atsiri. Yaitu senyawa-senyawa asam tersebut dapat merubah bau khas dari minyak atsiri. Hal ini dapat disebabkan oleh lamanya penyimpanan minyak dan adanya kontak antara minyak atsiri yang dihasilkan dengan sinar dan udara sekitar ketika berada pada botol sampel minyak pada saat penyimpanan. Karena sebagian komposisi minyak atsiri jika kontak dengan udara atau berada pada kondisi yang lembab akan mengalami reaksi oksidasi dengan udara (oksigen) yang dikatalisi oleh cahaya sehingga akan membentuk suatu senyawa asam. Jika penyimpanan minyak tidak diperhatikan atau secara langsung kontak dengan udara sekitar, maka akan semakin banyak juga senyawa-senyawa asam yang terbentuk. Oksidasi komponen-komponen minyak atsiri terutama golongan aldehid dapat membentuk gugus asam karboksilat sehingga akan menambah nilai bilangan asam suatu minyak atsiri. Hal ini juga dapat disebabkan oleh penyulingan pada tekanan tinggi (temperatur tinggi), dimana pada kondisi tersebut kemungkinan terjadinya proses oksidasi sangat besar.

4.5 Kelarutan dalam AlkoholTelah diketahui bahwa alkohol merupakan gugus OH. Karena alkohol dapat larut dengan minyak atsiri maka pada komposisi minyak atsiri yang dihasilkan tersebut terdapat komponen-komponen terpen teroksigenasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Guenther bahwa kelarutan minyak dalam alkohol ditentukan oleh jenis komponen kimia yang terkandung dalam minyak. Pada umumnya minyak atsiri yang mengandung persenyawaan terpen teroksigenasi lebih mudah larut daripada yang mengandung terpen. Makin tinggi kandungan terpen makin rendah daya larutnya atau makin sukar larut, karena senyawa terpen tak teroksigenasi merupakan senyawa nonpolar yang tidak mempunyai gugus fungsional. Hal ini dapat disimpulkan bahwa semakin kecil kelarutan minyak atsiri pada alkohol (biasanya alkohol 90%) maka kualitas minyak atsirinya semakin baik.

5. Karakterisasi Isolat menggunakan Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (GC-MS)Kondisi operasi GC-MS saat analisis sampel minyak atsiri daun sirih merah sebagai berikut: Jenis pengion : EI (Electron Impact) Gas pembawa : Helium 14,0 KpaJenis kolom : HP-5MS Panjang kolom : 30 meter Diameter kolom : 0,25 mm Suhu kolom : 60 290C Suhu injektor : 290C Suhu detektor : 250C Kecepatan kenaikan suhu : 5C / menit

6. Uji Antibakteri Minyak Atsiri6.1 Sterilisasi AlatAlat yang digunakan untuk aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan temperatur 121C selama kurang lebih 15 menit6.2Pembuatan Media Agar MiringSebanyak 1 gram NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 50 ml aquades, kemudian dipanaskan dengan stirer sampai warna kuning bening. Masukkan ke dalam tabung reaksi masing masing sebanyak 5 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil. Sterilisasi pada suhu 121C selama 20 menit. Tempatkan ditempat yang miring dan diamkan sampai padat pada suhu kamar.6.3 Pembuatan biakan bakteriSebanyak 1 ose isolat bakteri ditempelkan pada media miring agar NA dengan pola zig zag, masing masing bakteri dibuat 3 biakan bakteri. Lakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan sinar UV. Kemudian inkubasi biakan pada suhu 37 C selama 24 jam.6.4 penyiapan Larutan StandarSebanyak 100 mg amoksisilin dilarutkan dalam 10 mL n-heksan. Larutan ini merupakan larutan amoksisilin 0,01 mg/L. Larutan tersebut diambil menggunakan mikropipet dan dengan metode pengenceran dibuat berbagai konsentrasi standar amoksisilin yang diinginkan.6.5 Uji Antibakteri Minyak AtsiriSebanyak 1 gram NA dilarutkan dalam aquades 50 ml., panaskan sampai kuning bening. Masukkan ke dalam botol duran masing masing sebanyak 15 ml. Siapkan aquades steril untuk membuat bakteri dalam bentuk suspensi dengan memasukkan 3 ml aquades ke dalam tabung reaksi dan tutup rapat dengan kapas, dengan catatan 1 tabung untuk 1 bakteri. Sterilisasi aquades, cawan petri yang telah dibungkus kertas, media NA dalam duran dan alat alat yang dibutuhkan dalam uji antibakteri (pervorator, tip, spatula) pada suhu 121C selama 20 menit. Untuk membuat suspensi bakteri, ambil 1 ose bakteri kemudian masukkan dalam aquades steril dan aduk, sampai larutan keruh. Ambil 100 l suspensi bakteri lalu taruh dalam cawan petri yang steril. Ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri, kemudian tuangkan media NA steril dalam suhu tubuh sekitar 30 - 37C (tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin), goyangkan cawan petri dengan pola angka delapan sehingga kedua larutan tercampur rata. Diamkan campuran tersebut sampai beku (diamkan 15 menit). Setelah itu, buatlah sumuran dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Isikan sumuran tersebut dengan 20 l sampel atau bahan yang diujikan. Bungkus kembali dengan kertas dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37C.