Hibridisasi Asam Nukleat

Hibridisasi asam nukleat merupakan metode yang digunakan untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA dalam genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetik, dan sidik jari DNA.

Macam-macam hibridisasi berdasarkan pembentukan dupleks antara dua untai asam nukleat yang komplemen, antara lain:

1. Hibridisasi Southern merupakan proses antara perpasangan DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. Contohnya untuk megetahui integrasi transgen di dalam organisme transgenik. Pada hibridisasi ini DNA genom dipotong dengan enzim restriksi endonuklease, dan fragmen yang dihasilkan dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarosa. Setelah itu, DNA didenaturasi in situ dan dipindahkan dari gel ke membran nilon atau membran nitroselulosa. Posisi DNA dalam gel sama dengan posisi pada membran. DNA yang menempel pada filter dihibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif dan autoradiografi yang digunakan untuk menentukan letak pita yang komplemen dengan pelacak.2. Hibridisasi Nothern merupakan modifikasi metode Southern dengan target RNA yang telah dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa dengan menggunakan pelacak DNA berlabel.3. Hibridisasi dot yaitu target asam nukleat (DNA atau RNA) ditotolkan pada membran dan keberadaan target dilacak dengan pelacak DNA atau RNA berlabel.

4. Hibridisasi in situ merupakan hibridisasi antara pelacak DNA atau RNA dengan target DNA atau RNA pada preparat sitologis.

Strategi HibridisasiPrinsip sistem hibridisasi yaitu terjadinya pasangan secara tepat antara dua untai DNA yang komplemen. Cara hibridisasi asam nukleat secara garis besar dapat dilakukan sebagai berikut:

1. Pengikatan DNA untai tunggal (target) pada membran

2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah berlabel pada kondisi tertentu (temperatur dan konsentrasi ion) sehingga dapat terjadi pasangan antara DNA target dan pelacak

3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak yang tidak menempel pada DNA target yang spesifik

4. Deteksi adanya hibrid antara DNA target dan pelacak

Tiga komponen yang menjadi perhatian pada hibridisasi asam nukleat yaitu DNA pelacak, DNA target, dan deteksi sinyal. Langkah awal dalam proses hibridisasi DNA adalah denaturasi fragmen DNA sehingga DNA berubah menjadi untai tunggal. Selanjutnya, DNA dipindah pada membrane nitroselulosa atau nilon dan dipanasi pada 80 0C atau dengan sinar uv sehingga DNA dapat berikatan dengan membrane. Selanjutnya pelacak yang berupa DNA untai tunggal dengan urutan basa yang spesifik dan berlabel diberi kesempatan untuk mencari pasangannya membentuk dupleks dengan target komplemen yqng dapat ditentukan oleh dua hal utama yaitu dua fragmen yang membentuk dupleks harus memiliki tingkat komplementasi yang tinggi dan dupleks yang terbentuk harus stabil. Terjadinya dupleks ini dapat dideteksi dengan memaparkan pada film x-ray untuk pelacak berlabel radioaktif atau dengan reaksi warna untuk pelacak non-radioaktif. Hibridisasi dengan RadioaktifHibridisasi asam nukleat radioaktif menggunakan pelacak berlabel radioaktif 32P. Pada sistem deteksi yang baku, pelacak berlabel radioaktif dicampur dengan DNA target yang menempel pada membran. Setelah pencucian, tidak ada pelacak yang tersisa kecuali berikatan dengan DNA target. Adanya pelacak yang menempel pada DNA target ditunjukkan dengan film sinar X (autoradiografi) seperti gambar dibawah ini:

Gambar 1. Skema teknik hibridisasi dot untuk koloni dengan pelacak radioaktif

Hibridisasi Non-radioaktif32P merupakan hibridisasi radioaktif dengan waktu paro pendek, serta berbahaya karena radiasi dan memerlukan peralatan khusus untuk menggunakan dan membuangnya. Sehingga dilakukan pengembangan sistem nonradioaktif yang dapat menghasilkan signal dengan cara mengubah senyawa tidak berwarna menjadi berwarna tau berfluorosensi. Signal tersebut dapat dideteksi dengan cara menggabungkan nukleotida berlabel biotin dalam sintesis pelacak. Prosedur hibridisasi nonradioaktif sebagai berikut:

1. Hibridisasi pelacak berlabel biotin pada DNA target

2. Tambahkan avidin atau streptavidin

3. Tambahkan enzim berlabel biotin, misanya fosfatase alkali

4. Tergantung pada enzim yang digunakan, tambahkan substrat kromogenik atau kemiluminesen maka akan terjadi perubahan warna atau pancaran sinar sebagai akibat dari perubahan substrat menjadi produk yang dapat diukur. Apabila digunakan fosfatase alkali maka dapat menggunakan substrat BCIP (5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat) dan NTB (nitrobleu tetrazolium) sehingga akan menghasilkan warna biru.

Gambar 2. Deteksi kemiluminesen dari DNA target, B. biotin; AP. Fosfatase alkali

Keterangan: A: Pelacak berlabel biotin berikatan dengan DNA target

B: Streptavidin berikatan dengan molekul biotin

C. Fosfatase berlabel biotin berikatan dengan streptavidin

D. Fosfatase alkali mengubah substrat menjadi senyawa yang memancarkan sinar

Sistem non radioaktif memiliki beberapa kelebihan daripada sistem radioaktif yaitu DNA berlabel biotin dapat stabil selama satu tahun pada temperatur kamar, alat yang digunakan untuk mendeteksi kemiluminesen sangat peka, deteksi sinar perubahan warna dengan film sinar X atau luminometer dapat diselesaikan dalam beberapa jam. Serta penggunaan kemiluminesen yang lebih peka daripada kromogenik diduga akan menjadi sistem pilihan untuk deteksi signal. Hibridisasi AntibodiHibridisasi antibodi yaitu antibodi akan mengikat antigen pada lokus yang sangat spesifik. Cara untuk menetapkan apakah antibodi telah berikatan dengan antigen target menggunakan metode ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) yaitu metode untuk deteksi diagnosis. Gambaran umum sistem ELISA adalah penempelan antibodi primer pada bagian tertentu dari molekul target. Apabila terdapat molekul target misalkan protein, maka protein tersebut diisolasi sehingga murni. Kemudian protein tersebut digunakan untuk menghasilkan antibodi yang akan digunakan untuk mendeteksi target. Sistem ELISA dapat digambarkan sebagi berikut:

Gambar 3. Prinsip ELISA tak langsung

Daftar Pustaka

Sudjadi, 2008, Bioteknologi Kesehatan Cetakan Pertama, Kanisius, Yogyakarta