guia para a anÁlise transcriptÔmica: potencial ... 01. revisÃo . 06 - 2018 … · encontrado...

Ciência Animal, v.28, n.3, p.56-68, 2018.

56 *Endereço para correspondência: [email protected]

GUIA PARA A ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA: POTENCIAL TOXICOLÓGICO

E MECANISMOS DE AÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL

(Guide to transcriptomic analysis: toxicological potential and

mechanisms of natural products action)

Thiago Silva de ALMEIDA¹; Ana Fontenele Urano CARVALHO2

1Dpto de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará (UFC),

Campus do Pici, CEP: 60.020-181, Fortaleza, CE; 2Dpto de Biologia da UFC.

*E-mail: [email protected]

RESUMO

Nas últimas décadas houve um grande avanço nos ensaios in vitro, na tentativa de prever

resultados de tratamentos in vivo e, com isso, reduzir a utilização de animais de

laboratório. A toxicogenômica, que é a integração entre a toxicologia, a bioinformática e as

tecnologias ômicas, tem se mostrado preditiva para os mecanismos de ação e toxicidade.

Esta ferramenta possibilita a investigação da expressão de milhares de genes, permitindo a

visualização de diferentes perfis de alteração e de assinatura gênica. A utilização da

toxicogenômica se torna adequada para a compreensão de mecanismos genéticos de

resposta de organismos expostos a formulações de origem natural que são capazes de

modular múltiplos genes. Este trabalho objetivou destacar os pontos críticos das etapas que

devem ser seguidas para se realizar, apropriadamente, uma análise toxicogenômica. Dentre

essas etapas estão a análise das características desejáveis para os compostos, a escolha

apropriada das linhagens celulares para realizar a exposição, a seleção das concentrações

das amostras a serem testadas e dos controles que devem ser utilizados nos ensaios

biológicos, a escolha do princípio a ser utilizado para o ensaio de viabilidade celular, a

seleção dos procedimentos para tratar os dados gerados e avaliação dos resultados

encontrados. As sugestões apresentadas têm a intenção de divulgar a técnica de

toxicogenômica, bem como, estimular e facilitar o desenvolvimento de um estudo que

utilize a análise toxicogenômica como ferramenta alternativa na investigação da toxicidade

e de mecanismos/modo de ação de produtos de origem natural.

Palavras-chaves: Expressão gênica; técnica alternativa, tecnologias ômicas.

ABSTRACT

In the last decades there has been a great advance in the in vitro tests, in the attempt to

predict results of treatments in vivo and, with that, to reduce the use of laboratory animals.

Toxicogenomics, which is the integration between toxicology, bioinformatics and atomic

technologies, has been shown to be predictive of mechanisms of action and toxicity. This

tool allows the investigation of the expression of thousands of genes, allowing the

visualization of different profiles of gene signature and change. The use of toxicogenomics

becomes suitable for the understanding of genetic mechanisms of response of organisms

mailto:[email protected]




exposed to formulations of natural origin that are able to modulate multiple genes. This

work aimed to highlight the critical points of the steps that must be followed to carry out,

properly, a toxicogenomic analysis. Among these steps are the analysis of the desirable

characteristics for the compounds, the appropriate choice of the cell lines to carry out the

exposure, the selection of the concentrations of the samples to be tested and the controls to

be used in the biological assays, the choice of principle to be used for the cell viability

assay, the selection of procedures to treat the generated data and evaluation of the results

found. The suggestions presented are intended to stimulate and facilitate the development

of a study that uses toxicogenomic analysis as an alternative tool in the investigation of the

toxicity and mechanisms / mode of action of products of natural origin.

Keywords: Gene expression; alternative technique, omics technologies.

INTRODUÇÃO

Existe uma demanda crescente para medicamentos à base de plantas, mas apenas

10% desse tipo de produto são verdadeiramente padronizados e possuem informações

sobre seus componentes ativos, mecanismos de ação e toxicidade (IFEOMA;

OLUWAKANYINSOLA, 2013), ignorando assim o risco do uso de ervas e seus potenciais

efeitos adversos e nocivos quando usados como medicamentos. Os testes toxicológicos

para compostos bioativos são realizados em etapas, iniciando por ensaios in vitro, seguidos

de ensaios in vivo com animais e avaliação clínica para que seja provada a eficácia e a

segurança de uso (ANVISA, 2018). Nas últimas décadas houve um grande avanço nos

ensaios in vitro, na tentativa de se aproximar cada vez mais de respostas que prevejam

resultados de tratamentos in vivo e, com isso, reduzir a utilização de animais, ao mesmo

tempo que procuram ampliar os conhecimentos das bases bioquímicas e mecanismos de

ação das amostras que estão sendo testadas (TONG et al., 2009).

O advento das tecnologias ômicas, como a genômica, proteômica,

transcriptômica, fenômica, e metabolômica, proporcionaram grande progresso na

compreensão dos mecanismos moleculares de vários tipos de toxicidade (CAETANO,

2014). As ômicas têm como objetivo a análise completa de sistemas biológicos,

caracterizando, identificando e quantificando produtos de uma determinada classe. Desta

forma, a genômica estuda a expressão de genes de uma determinada célula, tecido ou

organismo, enquanto a proteômica estuda as proteínas presentes em uma célula, tecido

organismo e as demais tecnologias ômicas seguem o mesmo raciocínio (RAJA et al.,

2017).

Utilizando as tecnologias ômicas como base, novas ferramentas surgiram por

associações, por exemplo, a toxicogenômica que é a integração entre a toxicologia, a

bioinformática e as tecnologias ômicas. Essa tecnologia tem recebido a atenção e os

investimentos da indústria farmacêutica por estar se mostrando preditiva no quesito de

mecanismos de ação e toxicidade, além de vislumbrar a possibilidade de identificar

medicamentos em potencial, de forma mais rápida, segura e econômica (BOVERHOF e

ZACHAREWSKI, 2006). A utilização de microarranjos de DNA, a base da

toxicogenômica, possibilita a investigação da expressão de dezenas de milhares de genes




simultaneamente, permitindo a visualização de diferentes perfis de alteração e de

assinatura gênica (CHEN et al., 2012).

Por se tratarem de misturas complexas os extratos e outras formulações de origem

vegetal são quimicamente diversos e são capazes de modular múltiplos alvos biológicos

simultaneamente, incluindo a alteração de vários genes. Logo, a utilização de uma

ferramenta como a toxicogenômica se torna adequada para melhorar a compreensão sobre

os mecanismos genéticos de resposta de organismos frente a esse tipo de amostra (LO et

al., 2012; YOUNS et al., 2010). Pode ser verificado através dos índices gerados em bancos

de artigos científicos, que o número de trabalhos que utilizam essa ferramenta para a

análise de compostos de origem natural é pequeno. Utilizando o site de busca Pubmed, que

faz parte do banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information), pode

ser visto que o termo “toxicogenomics” ocorre em 2110 (dois mil, cento e dez) publicações

correlacionadas, no entanto, o cruzamento da palavra “toxicogenomics” com “natural

product” gera 71 resultados e o cruzamento com a palavra “plant” gera apenas 61

resultados, esses valores representam apenas 3,36 e 2,89%, respectivamente, do total

encontrado nesse banco de dados (buscas realizadas no dia 07/03/18), que são quantidades

pequenas em relação ao total de publicações.

Este trabalho teve por objetivo descrever um passo-a-passo da utilização da análise

toxicogenômica para divulgar a técnica, bem como estimular e facilitar o desenvolvimento

de estudos que utilizem essa ferramenta como alternativa na investigação da toxicidade e

dos mecanismos/modo de ação de produtos de origem natural.

DESENVOLVIMENTO

Uma análise rigorosa do passo-a-passo necessário a ser seguido na utilização da

abordagem toxicogenômica foi realizada, baseando-se na experiência do grupo com esta

ferramenta alternativa à experimentação animal (FARIAS, 2013; SOUSA, 2014;

ALMEIDA, 2016). Os pontos críticos foram observados em cada uma das etapas

envolvidas no processo, pontos esses observados para evitar erros no desenho experimental

que, consequentemente, poderão interferir negativamente com os resultados ou acabar

dificultando a publicação dos dados gerados.

Detalhes das metodologias específicas, como volumes de reagentes e tempos de

incubação serão evitados, isso porque alguns dos ensaios podem ser realizados de formas

distintas, mas serão apresentadas alternativas e sugestões para melhor direcionar o fluxo do

desenho experimental.

Obtenção do material de origem natural

A forma de obtenção do material vegetal, seja extrato de metabólitos secundários,

extrato de proteínas ou compostos isolados, de qualquer classificação química, inclui

milhares de técnicas alternativas e é basicamente exclusiva de cada pesquisa. Desta forma,

e particularmente para esta etapa, não serão feitas muitas sugestões, apenas destacaremos

que, de preferência, o material obtido deve ser solúvel em água ou tampão para facilitar a




utilização nos ensaios biológicos que, normalmente, utilizam meios aquosos em suas

metodologias (FARIAS, 2013; SOUSA, 2014; ALMEIDA, 2016).

Seleção da linhagem de células para o ensaio de viabilidade

A escolha da linhagem celular será norteada por dois aspectos, o primeiro são as

atividades biológicas identificadas para a amostra em ensaios anteriores ou em

levantamentos bibliográficos e o segundo será a finalidade para o qual a sua amostra

pretende ser utilizada. Em relação ao primeiro aspecto, por exemplo, se o composto em

estudo possui capacidade de fotoproteção, não faz sentido que se faça um teste de

toxicidade em células de adenocarcinoma de mama, o ideal seria utilizar uma linhagem de

células de melanoma como, por exemplo, a linhagem de MNT1 de células humanas de

pele. Exemplificando o segundo aspecto, se o composto testado possui capacidade anti-

inflamatória e antialérgica comprovada e é visado o desenvolvimento de um produto

direcionado para asma seria interessante utilizar células mrc-5 de adenocarcinoma humano

de pulmão (SHIPTON et al., 2017).

Quando se pensa em exposição in vitro de uma linhagem a um composto é preciso

ter em mente a biologia do organismo alvo e as características químicas dos compostos que

estão sendo testados. Por exemplo, é contraproducente avaliar a toxicidade in vitro de um

composto sobre uma linhagem de neurônios, quando este é degradado na digestão ou não

consegue atravessar a barreira hematoencefálica, ou seja, é uma exposição com resultados

pouco úteis, uma vez que tecnicamente não ocorreria em um organismo vivo (PEREIRA,

2007).

A maioria dos produtos de origem vegetal são ministrados na forma oral, então as

células dos tecidos intestinais ficam em exposição prolongada e constante ao material

ingerido, desta forma, uma sugestão seria a utilização de células Caco-2 de

adenocarcinoma de colón humano (SAMBUY et al., 2005). Além de ter células intestinais

como alvo é interessante, por exemplo, utilizar células hepg2 de fígado humano, isso por

que a grande maioria dos metabólitos são processados nesse órgão.

Em relação à toxicogenômica, uma característica desejável da linhagem celular

que será utilizada é que esta já possua uma boa base de mapeamento genético e um bom

histórico de exposição a outros compostos, isso irá facilitar a comparação dos resultados

encontrados com os presentes nos bancos de dados, possibilitando assim, a determinação

de resultados mais embasados e confiáveis (WATERS, 2016).

Determinação das concentrações que serão utilizadas

A escolha das concentrações das amostras para o teste de viabilidade celular segue

o pensamento da escolha da linhagem das células. É preciso atentar para os ensaios

biológicos prévios e os dados encontrados na literatura, além disso é necessário pensar

sobre as características do composto testado, e.g., solubilidade e estabilidade e sobre o

objetivo final que será dado ao composto (WATERS, 2016).

Em um trabalho realizado por nosso grupo, utilizando extratos ricos em

compostos fenólicos, surgiu um obstáculo que impedia a exposição das células a

concentrações de extrato maiores do que 250 µg/mL, acima desta concentração ocorria a




complexação dos compostos presentes no extrato com as proteínas do meio de cultura de

crescimento celular, reduzindo a disponibilidade dos nutrientes e formando um precipitado.

O teste se tornava inviável porque as células morriam por falta de nutrientes e a leitura era

prejudicada pela presença do precipitado. Nesse caso, a concentração mais alta foi limitada

por características do ensaio, então, a solução foi testar concentrações inferiores à limítrofe

e, constantemente, monitorar a formação de precipitados (ALMEIDA, 2016). Se o

composto é mais ácido, da mesma forma, é necessário realizar uma análise e identificar

qual seria o limite de tamponamento suportado pelo meio de cultura, em relação ao

composto testado e, em seguida, ajustar as concentrações para serem sempre inferiores a

esse limite.

Quando a amostra não é inteiramente solúvel em água ou tampão, é costumeiro a

utilização de facilitadores da solubilização, como o DMSO (dimetil sulfato de sódio) e o

Polissorbato 80. Esses compostos também apresentam toxicidade e podem acabar por

interferir no resultado do ensaio. Desta forma, preconiza-se uma faixa segura, onde o uso

desses compostos não deve ultrapassar uma concentração maior do que 1% do volume

total da solução de exposição (CHEN e THIBEAULT, 2013).

Escolha dos controles utilizados nos ensaios biológicos

O ensaio de viabilidade celular dever ser sempre acompanhado de um controle

negativo, cujo o conteúdo seja apenas o meio de cultura de crescimento celular, também

dever ser realizado um controle utilizando qualquer substância que tenha sido utilizada

para auxiliar a solubilização da amostra no meio de cultura e na mesma concentração

utilizada para tal fim, seja etanol, DMSO ou polissorbato 80. Alguns ensaios de viabilidade

comercial sugerem um controle positivo específico, ou seja, um composto que seja

citotóxico e capaz de apresentar uma resposta “concentração dependente”. É bom

selecionar também uma substância padrão quimicamente semelhante ao composto alvo

para fins comparativos dos resultados (MAGKOUFOPOULOU et al., 2011).

Existe ainda um controle que muitas vezes é desconsiderado, mas que para a

transcriptômica é essencial. Trata-se do controle químico, que consiste em considerar todos

os possíveis contaminantes que podem estar presentes na amostra a ser testada.

Basicamente, para obter o controle químico, todo o processo de obtenção da amostra deve

ser realizado sem a amostra. Exemplificando melhor, durante o processo de extração

alcoólica de metabólitos de folhas de uma planta deve ser realizado, em paralelo, o mesmo

processo sem utilizar a planta. Esse processo paralelo deve utilizar exatamente o mesmo

álcool, na mesma quantidade e ser filtrado e evaporado de um modo semelhante ao qual a

amostra foi submetida (FARIAS, 2013; SOUSA, 2014; ALMEIDA, 2016).

Geralmente o controle químico praticamente não é visível, mas deve ser tratado e

testado exatamente como a amostra principal, isso porque a transcriptômica é muito

sensível e é preciso garantir que as alterações que forem encontradas sejam derivadas da

interação com os compostos e não de algum contaminante. A importância dos controles é

tão alta para a transcriptômica, que enquanto as amostras são geralmente testadas em

quadruplicatas, os controles são testados, pelo menos, em sextuplicatas para garantir que os

resultados serão confiáveis e que possíveis erros possam ser detectados (FARIAS, 2013;

SOUSA, 2014; ALMEIDA, 2016).




Ensaio de viabilidade celular

Existem algumas opções para ensaios de viabilidade celular já consolidadas para

uso laboratorial, tanto na forma de protocolos eficientes como na forma de kits pré-

fabricados, que possuem alta sensibilidade e capacidade de reprodução de resultados. Um

dos testes pioneiros e mais utilizados na rotina laboratorial para a verificação de

viabilidade celular é o método do MTT [3-(4,5-dimethylthiazol, 2-yl)-2,5-diphenyl-212

tetrazolium bromide], esse método quantifica a redução do MTT (sal de coloração amarela

e solúvel em água) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) através de

desidrogenases celulares. Dessa forma, a redução do MTT a formazan, será diretamente

proporcional à atividade mitocondrial e à viabilidade celular (MOSMAN, 1983).

O ATP foi amplamente aceito como um marcador válido de células viáveis. O

ensaio, que usa essa molécula como base, detecta a luminescência emitida quando o ATP

das células metabolicamente ativas fornece a energia necessária, para a enzima luciferase

converter luciferina em oxiluciferina (MANDIMIKA et al., 2007). Em estudo anterior

(ALMEIDA, 2016), esse método foi eficiente para amostras proteicas e para extratos ricos

em compostos fenólicos. Existem ainda outros marcadores que possibilitam a

quantificação da viabilidade celular, uma descrição detalhada pode ser encontrada no

Assay Guidance Manual (BRAY e CARPENTER, 2013). Esta coletânea de ensaios é

constantemente atualizada e é disponibilizado na internet pela Eli Lilly & Company e the

National Center for Advancing Translational Sciences.

Uma vez selecionado o método de investigação da viabilidade celular um

screening inicial deve ser realizado para melhor determinar o tempo de exposição das

células. A transcrição de genes é controlada através de muitos níveis de regulação, onde a

escolha de caminhos específicos afeta o tempo de expressão gênica. Um grupo de genes

pode responder rapidamente a sinais regulatórios, no entanto, outros podem levar horas

para serem ativados (BAHRAMI e DRABLØS, 2016).

Normalmente os tempos utilizados são de 6, 12, 24, 48 h de exposição. O tempo

mínimo é estipulado em 6 h, para que as células tenham o tempo necessário para interagir

com o composto e desencadear uma resposta, os tempos seguintes irão verificar o

comportamento com o aumento da exposição. Podem ocorrer dois fenômenos, o aumento

do tempo de exposição poderá aumentar a taxa de morte celular devido ao prolongamento

da exposição ao composto ou com o aumento do tempo de exposição, o composto irá,

eventualmente, perder o potencial de ação citotóxica e as células irão aumentar novamente

em número. É interessante escolher dois tempos de exposição, um inicial, normalmente de

6h, para verificar o início do mecanismo de resposta genética e um segundo em algum

momento onde o composto esteja bastante ativo, normalmente 24 h, para verificar as

alterações após exposição prolongada (WATERS, 2016).

Depois de realizado o ensaio de viabilidade, se escolhe a maior concentração do

composto que não atinja mais do que 20% de inviabilidade celular, isso garante que as

células certamente estarão em contato com a amostra e que ainda existirão células

metabolicamente ativas (ALMEIDA et al., 2017).




Isolamento e purificação de material genético

Com todos os parâmetros definidos, de concentrações, controles, linhagem celular

e tempo de exposição, o próximo passo é a obtenção e a purificação do material genético

que irá seguir para a análise transcriptômica. O objetivo é, especificamente, coletar RNA,

isso por que na etapa seguinte o RNA mensageiro será o ponto de partida da

transcriptômica (MANDIMIKA et al., 2007 e 2008).

Uma nova exposição deve ser realizada, e ao final do período de incubação,

inicia-se o processo de isolamento. Assim como para os ensaios de viabilidade, já existem

kits comerciais para esta etapa. Normalmente, o meio de cultura é removido, as células são

lisadas e substâncias desnaturantes inativam as RNAses e garantem a purificação de RNA

intacto. O lisado celular é armazenado a -80 °C até o momento da extração e isolamento do

RNA total (ALMEIDA, 2016; FARIAS, 2013; MANDIMIKA et al., 2007; MANDIMIKA

et al., 2008; SOUSA, 2014).

O procedimento de purificação envolve várias etapas de lavagens (com tampões

específicos e etanol) e centrifugações para forçar a passagem através de micro colunas,

onde o RNA se liga por afinidade. Os kits comerciais também são uma ótima ferramenta

no processo de purificação do RNA. É importante realizar um rigoroso controle de

qualidade, verificando o grau de pureza do RNA total das amostras testadas e dos

controles, o método que utilizamos em nosso grupo é simples, uma alíquota é retirada de

cada solução de RNA isolado, e segue para a leitura em espectrofotômetro para dosagem

da concentração de RNA e avaliação do grau de pureza, sendo considerados valores ideais

razões entre 1,9 e 2,1 para as leituras em comprimento de onda 260/280 e valores entre 2,0

e 2,2 para 260/230. Se os valores estiverem dentro dessa faixa ideal o material pode ser

armazenado a -80 ºC até que seja submetido ao processo de hibridização (MANDIMIKA et

al., 2007; 2008).

Análise Transcriptômica

Tendo em mãos o RNA total purificado, o próximo passo é o isolamento do

RNAm a partir do RNA total. Isso garantirá que apenas genes que estão sendo expressos

serão identificados. O processo de isolamento do RNAm também pode ser realizado com o

auxílio de kits comercias. O RNAm que foi isolado será então utilizado para a construção

de uma biblioteca de cDNA, ou seja, todos os fragmentos de RNAm obtidos serão

submetidos a um processo de transcriptase reversa, para a produção de suas respectivas

sequências de DNA de origem. Os fragmentos da biblioteca de cDNA são, então, marcados

com um fluoróforo e serão colocados sobre um chip de microarranjos para que a

hibridização ocorra. Um chip de microarranjo é uma superfície de vidro, plástico ou

silicone que possui uma coleção de pontos microscópicos que possuem grupos de

sequências de DNA de um gene. Esses segmentos de DNA são chamados de sondas. Se

um gene da biblioteca de cDNA encontrar uma sequência correspondente no chip, ele irá

se hibridizar fazendo a sonda ficar marcada com o fluoróforo. A intensidade luminosa

apresentada pelo chip de micro arranjo pode então ser lida e quantificada, sendo que, se

uma determinada sequência encontrar vários correspondentes, implicará que esse gene foi

expresso muitas vezes e a intensidade do sinal luminoso será maior, o contrário também




pode ocorrer, onde uma sequência não encontra um correspondente no chip, não gerando

um sinal luminoso (ILLUMINA, 2012a,b).

O volume de informações geradas vai depender da quantidade de spots presentes

no chip de microarranjos. O NGS (New Generation Sequencing) possui uma alta

sensibilidade, conseguindo verificar, simultaneamente, a realização da hibridização de

mais de 60 mil genes, ampliando, consideravelmente, as possibilidades de determinação de

possíveis alterações no momento do processamento dos dados, uma das etapas

subsequentes (ILLUMINA, 2015).

Leitura do chip e processamento dos dados

Uma vez conduzido os procedimentos do microarranjo, uma imagem será

formada onde cada ponto corresponde a um valor de fluorescência que representa a

expressão relativa de cada gene. A imagem formada é, então, processada seguindo as

seguintes etapas: 1) identificação dos spots e sua distinção de sinais ruídos; 2)

determinação da área do spot a ser explorada e identificação da área correspondente a

ruídos de hibridização e 3) obtenção de um sumário de estatísticas e subtração do sinal

ruído. Ao final dessa etapa, obtêm-se os valores da mediana de expressão de cada gene

calculados. O próximo passo é transformar os níveis de expressão encontrados, utilizando

o método da transformação logarítmica, onde se calcula o logaritmo base 2 de cada valor

de expressão gênica. Este tipo de transformação permite um espaço de mapeamento

contínuo e as regulações (para cima ou para baixo) na expressão dos genes podem ser

comparadas. Para eliminação de variáveis a normalização dos dados pode ser conduzida

utilizando o método Robust multiarray average (BOLSTAD et al., 2003; IRIZARRY et

al., 2003). Os valores P podem ser calculados pelo método Intensity-based moderated t-

statistic (IBMT) (SARTOR et al., 2006) gerado pelo pacote Limma Bioconductor (Smyth,

2004). Os genes modulados serão selecionados de acordo com a alteração em seus valores

de expressão relativa, de preferência maior do que 1.2 (valor de log2) e um valor q menor

que 0,05.

Análise de bioinformática

Construção de mapas de expressão gênica: Os dados, agora normalizados, podem ser

utilizados em diferentes ferramentas de bioinformática para serem analisados sob

diferentes ângulos. Uma das primeiras análises consiste na formação de um mapa de

expressão que mostra, de forma gráfica, os genes que aumentaram e reduziram a

expressão, utilizando cores, semelhantes a um mapa de calor. Para tanto, os dados podem

ser hierarquicamente agrupados, utilizando o programa “Cluster” (correlação

descentralizada e agrupamento por ligação de médias) (EISEN et al., 1998). Os dados

organizados em clusters podem ser analisados pelo programa “Treeview” para gerar as

imagens dos mapas de expressão gênica (ALLAM e GUMPENY, 2012).

Vias metabólicas diferencialmente expressas: Para a definição das vias metabólicas que

foram significativamente alteradas nas células tratadas com as amostras, pode ser utilizado

um software (“Consensus Path Data Base”, 2018). Trata-se de uma plataforma virtual




gratuita para análise funcional dos genes. Uma vez apresentada uma lista de genes, a

plataforma identificará vias metabólicas celulares e as funções que são controladas por

genes presentes na lista informada. Além disso, informará quantos genes tem cada via

alterada, quantos genes da lista informada participam de uma mesma via e o percentual do

total de genes que regulam a via (KAMBUROV, 2008). Todas as informações ficam

disponíveis na forma de uma tabela, um valor de “q” é gerado e, com isso, é possível filtrar

quais vias foram significativamente alteradas (q<0,05).

Esse banco de dados também possibilita a construção de imagens que representam

graficamente a rede de conexão entre as principais vias alteradas por cada amostra. Para

obter informações sobre cada via, o próprio banco de dados está conectado a outros bancos

de informações como o NCBI (National Center for Biotechnology information) e o KEGG

(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes).

Identificação de funções biológicas e riscos apresentados pelos tratamentos: Para a

análise de possíveis riscos desencadeados pelas alterações de expressão gênica nas células

expostas, pode-se utilizar o software Ingenuity (Qiagen®), uma plataforma virtual para

análise funcional dos genes. Ao se informar uma determinada lista de genes, a plataforma

identifica diversas variáveis, como: funções celulares e moleculares alteradas, principais

vias alteradas, sistemas fisiológicos alterados, doenças e bio-funções relacionadas e os

principais efeitos toxicológicos esperados (KRÄMER et al., 2013).

Assinatura de expressão gênica das amostras e de compostos conhecidos: O conjunto de

alterações na expressão de uma determinada linhagem celular, em resposta a um exógeno

específico, é denominado de assinatura de expressão. Analisando a assinatura de expressão

de compostos que já possuem mecanismo/modo de ação conhecido é possível sobrepor

dados, caso o objeto de estudo possuir uma assinatura de expressão semelhante. O

programa Mapa Conectivo (Connectivity Map database – Cmap) atribui um escore para o

perfil de expressão da amostra que esteja sendo o objeto das análises, esse escore vai de

“1” a “-1,” onde quanto maior a semelhança da assinatura gênica do objeto de análise, com

a assinatura de expressão de algum composto do banco de dados, mais próximo de “1” será

o escore; e quanto mais discrepante for a assinatura de expressão, mais próximo de “-1”

será o escore. O banco de dados contém informações de mais de 60.000 compostos

expostos às linhagens celulares MCF 7 (adenocarcinoma de mama), HL-60 (células de

leucemia promielocítica humana) e PC3 (células de câncer de próstata) (LAMB et al.,

2006; LAMB, 2007).

Análise dos resultados

Como foi demonstrado, existem várias opções para a realização de análises, o que

gera um grande volume de informação que forma um difícil quebra cabeça. Uma sugestão

é observar os genes mais representativos, ou seja, os que foram modulados de forma mais

efetiva. Normalmente, os mecanismos de ação mais fortemente apontados estão

relacionados a esses genes. Algumas ferramentas acabam por apontar na mesma direção,

por exemplo, o Consensus pode apontar para a regulação de vias relacionadas à proteção




contra o câncer e, ao mesmo tempo, o CMAP indica similaridade do composto em questão,

com drogas já utilizadas para o tratamento do câncer. Essas sobreposições são importantes,

pois mostram que mais de uma ferramenta está seguindo na mesma direção, no processo de

desvendar o mecanismo de ação do composto. Genes marcadores de resposta a compostos

tóxicos também devem ser observados, considerando seus níveis de expressão e as vias em

que estão envolvidos (FARIAS, 2013; SOUSA, 2014; ALMEIDA, 2016).

Testes de confirmação

Apesar da toxicogenômica ser um processo muito eficiente e com resultados

altamente reprodutíveis ainda é uma ferramenta que produz resultados considerados

preliminares. Desta forma, o uso apenas da toxicogenômica não é considerado como

suficiente para comprovar a toxicidade ou não de um composto, bem como é insatisfatório

para esclarecer totalmente os mecanismos de ação envolvidos na resposta celular à

exposição aos compostos. A menos que o composto que esteja sendo analisado já possua

na literatura informações que se correlacionem positivamente com os dados gerados com o

uso da toxicogenômica, não será necessário realizar ensaios que possam vir a comprovar os

resultados (NATIONAL RESEARCH COUNCI, 2007).

CONCLUSÕES

O uso da toxicogenômica é uma ferramenta viável para a análise de indícios de

toxicidade, sendo capaz de auxiliar no esclarecimento do mecanismo de ação. Compostos

de origem natural podem ser normalmente analisados sob as circunstâncias exigidas para

esse tipo de análise, de forma confiável e reprodutível. É provável que, com a redução dos

custos e com o avanço do desenvolvimento das técnicas, no futuro seja possível integrar

mais ferramentas ômicas, como proteômica e metabolômica, para obter respostas ainda

mais completas e acuradas, reduzindo assim a necessidade do uso da experimentação in

vivo para a verificação de toxicidade e outras respostas biológicas.

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