ABSTRACT :

Penetapan Spektroflourometri, Spektrometri Serapan Atom danSpektrofotometri UV-VISdari

Fluoroquinolones.

Metode spektroflourometri, spektrometri serapan atom, dan spektrofotometri UV-VIS

merupakan metode yang simple, akurat, sensitif dan selektif untuk analisiskuantitatif sepuluh

turunan fluoroquinolones yaitu : amifloxacin , ciprofloxacin hidroklorida , difloxacin

hidroklorida , enoxacin , enrofloxacin , lomefloxacin hidroklorida , levofloxacin , norfloksasin ,

ofloksasin dan pefloxacin mesylate .

1. Metode Spektroflourometri :

setiap sampel dilarutkan dengan 0,1 N H2SO4sampe tanda. Menunjukkan fluoresensi pada

panjang gelombang 450 nm dan tereksitasi pada panjang gelombang 290 nm. Menggunakan

larutan blanko yang berisi 0,1N H2SO4 lalu diukur dan dikalibrasi sehingga didapatlah kurva

kalibrasi membentuk garis lurusdengan konsentrasi 0,3-1,4 µg/ml-1.

2. Spektrometri Serapan Atom :

Cobalt sulfat (Penghelat) digunakan untuk mengendapkan kumpulan ion yang

terbentukselama reaksi. Metode ini bergantung pada penentuan langsung dari ion yang

terbentuk di dalam endapan dan juga pada penentuan yang tidak langsung. Kurva kalibrasi

menunjukkan garis lurus pada range konsentrasi 3-30 µg/ml -1 dari setiap obat. Rasio molar

dari khelat yang terbantuk dapat di tentukan dengan metode Job’s.

3. Spektrofotometri UV-VIS :

Amonium vanadate di gunakan untuk spektrofotometri dari 10 turunan floroquinolon.

Amonium vanadate digunakan untuk pembentukan warna karena ketika ditambahkan

dengan sampel dalam asam sulfat (p) akan terjadi reaksi redoks.

Absorbansi dikur pada panjang gelombang 766nm. Hal ini menunjukkan bahwa sampel

dideteksi dengan spektrofotometri visibel karena panjang gelombang yang digunakan dalam

range 400-800nm. Penentuan spektrofotometri dari fluoroquinolones diperoleh dari oksidasi

dalam asam sulfatsehingga terbentuk warna biru kehijauan.Akurasi dan presisi dari spektro

UV ini diukur pada range 10-40 µg/ml-1 untuk masing-masing obat yang diselidiki dengan

koefisien korelasi (r) tidak kurang dari 0.9994 untuk obat yang analisis.

Kata kunci : floroquinolon, spektroflourometri, 0,1 N H2SO4, AAS, Cobalt Sulfat,

Spektrofotometri, Amonium Vanadate,

BAB I

PENDAHULUAN

Antibiotika ( latin : anti = lawan, bios = hidup ) adalah segolongan senyawa, baik alami

maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di

dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Antibiotik dapat diklasifikasikan

berdasarkan spectrum atau kisaran kerja, mekanisme aksi, strain penghasil, cara biosintesis

maupun berdasarkan struktur biokimianya. Berdasarkan spektrum atau kisaran kerjanya

antibiotik dapat dibedakan menjadi antibiotik berspektrum sempit (narrow spectrum) dan

antibiotik berspektrum luas (broad spectrum). Antibiotik berspektrum sempit hanya mampu

menghambat segolongan jenis bakteri saja, contohnya hanya mampu menghambat atau

membunuh bakteri gram negative saja atau gram positif saja. Sedangkan antibiotik berspektrum

luas dapat menghambat atau membunuh bakteri dari golongan gram positif maupun gram

negatif.

Berdasarkan mekanisme aksinya, antibiotik dibedakan menjadi lima :

1. Antibiotik dengan mekanisme penghambatan sintesis dinding sel

2. Perusakan membran plasma

3. Penghambatan sintesis protein

4. Penghambatan sintesis asam nukleat

5. Penghambatan sintesis metabolit esensial.

Antibiotika digunakan untuk mengobati berbagai jenis infeksi akibat kuman atau juga

untuk prevensi infeksi, misalnya pada pembedahan besar. Secara profilaktis juga diberikan pada

pasien dengan sendi dan klep jantung buatan, juga sebelum cabut gigi. Penghambatan pada

sintesis asam nukleat berupa penghambatan terhadap transkripsi replikasi mikroorganisme.

Yang termasuk antibiotik penghambat sintesis asam nukleat ini adalah antibiotik golongan

kuinolon dan rifampin atau rifampisin.

Fluorokuinolon merupakan senyawa golongan kuinolon yang memiliki daya antibakteri

dan telah dikenal sejak 1980. Golongan Fluorokuinolon adalah antibiotik yang sangat aktif,

memiliki spektrum luas dan banyak digunakan baik pada manusia maupun hewan.

Fluorokuinolon memiliki kelebihan karena dapat melawan berbagai jenis patogen multiresisten

disebabkan cara kerjanya yang melalui target – target yang berbeda dari golongan antimikroba

lain. Mekanisme resistensi fluorokuinolon juga tidak seperti kebanyakan mekanisme resistensi

dari antibiotik lain, yaitu tidak melalui plasmid atau integron.

Fluorokuinolon membunuh bakteri melalui dua mekanisme, yakni melalui DNA kinase

yang aktif pada gram negatif dan melalui tocoisomerase-4 yang mempengaruhi sel inhibisi dan

aktif pada gram positif. Dua mekanisme ini menyebabkan Fluorokuinolon sulit menjadi resisten.

Beberapa metode telah diketahui untuk penentuaan kuinolon dalam bentuk murni, dosis

dan dalam Cairan biologis. Asam analidiksat, norfloksasin ,siprofloksasin dan hidroklori adalah

resmi di kedua USP XXIV dan BP 1998, sedangkan ofloksasin adalah resmi di USP hanya

XXIV. Kedua USP XXIV dan BP 1998 merekombinasikan metode HPLC untuk penentuan

siprofloksasin dalam bahan baku dan dalam sediaan. USP XXIV merekombinasikan metode

titrasi untuk penentuan nalidiksat, norfloksasin dan ofloksasin dalam bahan baku, semntara

metode HPLC dijelaskan untuk analisis fluoroquinolon dalam bentuk sediaan. BP 1998

merekomendasikan berair metode titrasi untuk penentuan asam nalidiksat dan norfloksasin dalam

bahan baku dan metode spektrofotometri untuk menetapkan norfloksasin dalam bentuk sediaan.

Beberapa metode untuk penentuan kuinolon termasuk : titrimetri, spektrootometri,

spektrofluorometri, elekrokimia, elektroforesis dan metode kromatografi. Beberapa metode

termasuk khelasi dari fluoroquinolon dengan Fe (III), Cu (II), Al (III), Mg (II), Ca (II), dan Tb

(III) yang dilaporkan. Sebagian besar analitis metode yang digunakan untuk penentuan yang

diteliti obat dalam cairan biologis metode HPLC yang memerlukan peralatan yang rumit dan

mahal.

Meskipun spektrometri serapan atom merupakan metode yang cepat dan memiliki batas

deteksi yang sangat rendah yang tidak dapat dicapai oleh sebagian besar metode lain, belim

ditetapkan dalam metode ini. Penelitian ini merupakan metode langsung dan tidak langsung baru

unuk penentuan amlloxacin, ciprofloxacin hidroklorida, difloxacin, levofloxacin, norfloxacin.

Penelitian ini merupakan pemanfaatan kobalt sulfat sebagai reagen untuk penentuan suatu obat

dengan sejumlah atom secara langsung dan tidak langsung pengukuran spektrometri.

Spektrofluorimetri, metode spektrometri serapan atom,dan spektrofotometri terbukti

menjadi sangat sensitif dan akurat untuk penentuan senyawa ini dalam bentik serbuk, dalam

bentuk sediaan,dan dalam cairan biologis.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.FLUOROKUINOLON

a. Pengertian

Fluorokuinolon merupakan derivat kuinolon adalah obat-obat yang efektif untuk organisme

gram negatif dan gram positif. Fluorokuinolon memiliki atom Fluor pada sistem cincin pusat,

biasanya pada posisi C-6 atau C-7.

Antibakterial dari golongan kuinolon sangat efektif terhadap bakteri Gram negatif, akan

tetapi kurang efektif terhadap bakteri Gram positif. Generasi terbaru dari kuinolon yaitu

fluorokuinolon diproduksi untuk meningkatkan aktifitas antibakterial terhadap bakteri Gram

positif dikarenakan adanya penambahan gugus fungsi amino dan atom fluorin (2). Seperti yang

ditunjukkan pada Gambar 1, struktur dasar FQ memiliki beberapa fitur sebagai berikut: sebuah

atom nitrogen pada posisi 1 pada struktur cincin aromatik bisiklik, kelompok asam karboksilat

pada posisi 3 penting untuk aktivitas antimikroba dan atom fluor pada posisi 6 berfungsi untuk

meningkatkan efektivitas dan spektrum aktivitas terhadap bakteri Gram negatif dan positif.

Gambar 1. Struktur kimia umum fluorokuinolon

Kuinolon, merupakan bakterisida karena menghambat lepasnya untai DNA yang terbuka

pada proses superkoil dengan menghambat DNA girase (enzim yang menekan DNA bakteri

menjadi superkoil). Untuk memasukkan DNA untai ganda yang panjang kedalam sel bakteri,

DNA diatur dalam loop (DNA terrelaksasi) yang kemudian diperpendek oleh proses superkoil.

Sel eukariotik tidak mengandung DNA girase. Sifat penting dari Kuinolon adalah penetrasinya

yang baik ke dalam jaringan dan sel (bandingkan dengan Penisilin), efektivitasnya bila diberikan

secara oral, dan toksisitasnya relatif rendah.

Pada saat perkembang biakkan kuman ada yang namanya replikasi dan transkripsi

dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA kuman menjadi 2 utas DNA. Pemisahan ini

akan selalu menyebabkan puntiran berlebihan pada double helix DNA sebelum titik pisah.

Hambatan mekanik ini dapat diatasi kuman dengan bantuan enzim DNA girase. Peranan

antibiotika golongan Kuinolon menghambat kerja enzim DNA girase pada kuman dan bersifat

bakterisidal, sehingga kuman mati.

b. Struktur kimia

6-fluoroquinolon dikenal juga sebagai 4-kuinolon berasal dari asam nalidiksat dan asam

oksolinik. Beberapa subtitusi dari struktur FQ adalah subtitusi R1, biasanya gugus alkil

(misalnya siklopropil, etil, fluoro etil metilamino, kelompok fluorofenil, thiazine atau cincin

okazin. Subtitusi R2 sering merupakan turunan piperazin ( piperazin-1-il,4-metilpiperazinil-1,3-

metilpiperazinil-1) dan subtitusi X baik atom karbon ataupun nitrogen.

c. Efek Samping dan interaksi Obat

Golongan antibiotika Kuinolon umumnya dapat ditoleransi dengan baik. Efek sampingnya

yang terpenting ialah pada saluran cerna dan susunan saraf pusat. Manifestasi pada saluran

cerna,terutama berupa mual dan hilang nafsu makan, merupakan efek samping yang paling

sering dijumpai. Efek samping pada susunan syaraf pusat umumnya bersifat ringan berupa sakit

kepala, vertigo, dan insomnia. Efek samping yang lebih berat dari Kuinolon seperti psikotik,

halusinasi, depresi dan kejang jarang terjadi. Penderita berusia lanjut, khususnya dengan

arteriosklerosis atau epilepsi, lebih cenderung mengalami efek samping ini. Enoksasin

menghambat metabolisme Teofilin dan dapat menyebabkan peningkatan kadar Teofilin.

d. Penggunaan klinik

1. Infeksi saluran kemih Seperti Prostatitis, Uretritis, Servisitis dan Pielonfritis.

2. Infeksi saluran cerna Seperti demam Tifoid dan Paratifoid

3. Infeksi saluran nafas bawah Seperti Bronkitis, Pneumonia, Sinusitis Penyakit yang

ditularkan melalui hubungan kelamin Gonore.

e. Mekanisme kerja

Menghambat replikasi DNA bakteri dengan cara mengaggu kerja topoisomerase II selama

pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Ada dua enzim yang memiliki peran penting dalam

replikasi DNA dan proliferasi yaitu girase dan DNA topoisomerase IV. DNA girase adalah

enzim penting yang diperlukan untuk kehidupan bakteri. DNA bakteri umumnya dalam

keseimbangan antara untai konformasi DNA sirkular tertutup ganda ( circular double DNA

strand conformation ) dan struktur superkoil negatif ( highly negatively supercoile structure).

Peran DNA girase adalah untuk mengontroltopologi DNA bakteri dan fungsi kromosom dengan

mempertahankan supercoiling DNA negatif. Selain penting untuk replikasi DNA dan juga

penting untuk menghilangkan supercoling negatif, DNA girase membantu dalam membengkokan

( bending ) dan melipat ( folding ) DNA dan menghapus knot. Topoisomerase IV disisi lain,

bertanggung jawab untuk memisahkan produk dari replikasi DN, yang merupakan bagian

molekul DNA yang saling terkait (interlinked). FQ menghambat DNA gyrase dan ezim

topoisomerase IV yang mengikat kompleks enzim DNA dan mengakibatkan denaturasi enzim.

f. Hubungan struktur aktivitas

Hubungan aktivitas struktur antibiotik FQ telah dipelajari secara intensif untuk

meningkatkan efektivitas dan memperluas spektrum aktivitas antibakteri. Gugus alkil pada posisi

1 (R1) membantu dalam aktivitas antimikroba. Optimasi subtitusi alkil pada kelompok struktur

kuinolon yaitu etil dalam kelompok norfloksasin dan cyclopropyl dari siprofloksasin telah

meningkatkan aktivitas antibakteri dalam sensitivitas dan konsentrasi hambatan minimum

terhadap bakteri. Sebuah atom fluor pada posisi 6 menunjukan peningkatan efektivitas terhadap

bakteri gram negatif dan memperluas spektrumaktivitas terhadap bakteri gram positif. Struktur

yang mengandung nitrotegen yang bersifat basa dapat meningkatkan penetrasi jaringan dan

meminimalkan toksisitas pada sistem saraf pusat. Selanjutnya, perubahan farmakokinetik

senyawa bisa dilakukan dengan memodifikasi kelompok substitusi pada posisi 2,5,7, dari

struktur dasar FQ.

g. Spektrum antimikroba

Semua fluorokuinolon bersifat bakterisidal. Secara umum, efektif terhadap organisme-

organisme gram negatif. Walaupun aktif tehadap beberapa organisme gram positif,

fluorokuinolon tidak boleh dipakai dalam pengobatan infeksi-infeksi pneumokokus atau

enterokokus. Fluorokuinolon menurunkan insidens infeksi saluran kemih postoperatif.

B. SPEKTROFLUOROMETRI

Spektrofluorometri adalah metode analisis kimia kuantitatif yang berdasarkan

flourecence. Flourecence dan phosporecence adalah bagian dari photoluminence, yaitu tipe

spektroskopi optik dimana sebuah molekul tereksitasi dengan mengabsorbsi ultraviolet, sinar

tampak dan radiasi inframerah dekat. Molekul tereksitasi akan kembali kepada keadaan dasar

atau ke tingkat eksitasi lebih rendah, dengan mengemisikan sinar. Sinar yang diemisikan inilah

yang akan diukur.

Karakteristik flourecence spektrometri adalah sensitivitas yang tinggi. Fluorometri dapat

menerima limit deteksi dengan kekuatan sinyal lebih rendah dari teknik lain. Limit deteksi

sekitar 10-10 M atau lebih rendah bisa saja diukur dari sebuah molekul.

Langkah pertama pada pengukuran flourecence adalah eksitasi elektronik dari sebuah molekul

analit yang mengabsorbsi foton. Di flourecence, spin pada keadaan dasar dan tereksitasi adalah

sama. Pada banyak molekul organic, kedaan dasar adalah singlet state (semua spin berpasangan).

Flourecence terjadi ketika sebuah molekul dipromosikan ke keadaan tereksitasi dengan absorpsi,

dan kemudian kembali pada keadaan dasar dengan emisi.

Struktur molekul yang berflouresensi adalah struktur aromatik, atau struktur yang

mengandung ikatan rangkap terkonjugasi, yaitu elektron π dan elektron n dalam dua ikatan

rangkap atau lebih, sehingga dalam molekul tersebut terdapat sejumlah elektron dengan

mobilitas tinggi dibandingkan dengan elektron lainya.

Untuk analisis kuantitatif, pada konsentrasi fluorofor yang rendah, intesitas fluoresensi

sebanding dengan konsentrasi fluorofor dan untuk perhitungan digunakan fluoresensi larutan

sampel dibandingkan dengan larutan baku.

                    Fsampel – Flb

Csampel = ————- x Cbaku

                     Fbaku – Flb

Ada dua peristiwa fotoluminesensi, yaitu fluoresensi dan fosforisensi. Pada fluoresensi,

pemancaran kembali sinar oleh melokul yang telah menyerap energi sinar terjadi dalam waktu

yang sangat singkat setelah penyerapan (10-8 detik). Jika penyinaran kemudian dihentikan,

pemancaran kembali oleh molekul tersebut juga berhenti. Fluoresensi berasal dari transisi antara

tingkat-tingkat energi elektronik singlet dalam suatu molekul.

            Banyak senyawa kimia yang mempunyai sifat fotoluminesensi, artinya senyawa kimia

tersebut dapat dieksitasi oleh cahaya dan kemudian memancarkan kembali sinar yang panjang

gelombangnya sama atau berbeda dengan panjang gelombang semula (panjang gelombang

eksitasi).

            Variable-variabel yang mempengaruhi fluoresensi dan fosforesensi yaitu :

1.      Hasil kuantum (efisiensi kuantum, quantum yield)

Merupakan bilangan yang menyatakan perbandingan antara jumlah molekul yang berfluoresensi

terhadap jumlah total molekul yang tereksitasi. Besarnya quantum (ɸ) adalah : 0 ≤ ɸ ≤ 1. Nilai ɸ

diharapkan adlah mendekati 1, yang berarti efisiensi fluoresensi sangat tinggi.

2.      Pengaruh kekakuan struktur

Fluoresensi dapat terjadi dengan baik jika molekul-molekul memiliki struktur yang kaku

(rigid). Contoh fluoren yang memiliki efisiensi kuantum (ɸ) yang besar (mendekati 1) karena

adanya gugus metilen, dibandingkan dengan binefil yang memiliki efisiensi kuantum yang lebih

kecil (sekitar 0,2).

3.      Pengaruh suhu

Bila suhu makin tinggi maka efisiensi kuantum fluoresensi makin berkurang. Hal ini

disebabkan pada suhu yang lebih tinggi, tabrakan-tabrakan antar molekul atau tabrakan molekul

dengan pelarut menjadi lebih sering, yang mana pada peristiwa tabrakan, kelebihan energy

molekul yang tereksitasi dilepaskan ke molekup pelarut.jadi semakin tinggi suhu maka terjadinya

konversi ke luar besar, akibatnya efisiensi kuantum berkurang.

4.      Pengaruh pelarut

Ada 2 hal yang perlu diperhatikan terkait dengan pengaruh pelarut pada fluoresensi, yaitu:

1. Jika pelarut makin polar maka intensitas fluoresensi makin besar.

2.  Jika pelarut mengandung logam berat (Br, I atau senyawa lain), maka interaksi antara

gerakan spin dengan gerakan orbital elektron-elektron ikatan lebih banyak terjadi dan hal

tersebut dapat memperbesar laju lintasan antara sistem atau mempermudah pembentukan

triplet sehinga kebolehjadian fluorosensi lebih kecil, sedangkan kebolehjadian

fosforesensi menjadi lebih besar

5.      Pengaruh ph

pH berpengaruh pada letak keseimbangan antar bentuk terionisasi dan bentuk tak

terionisasi. Sifat fluorosensi dari kedua bentuk itu berbeda. Sebagai contoh, fenol dalam suasana

asam akan berada dalam bentuk molekul utuh dengan panjang gelombang antara 285-365 nm

dan nilai ε = 18 M-1 cm-1 , sementara jika dalam suasana basa maka fenol akan terionisasi

membentuk ion fenolat yang mempunyai panjang gelombang antara 310-400 nm dan ε = 10 M -

1 cm-1 .

6. Pengaruh oksigen terlarut

            Adanya oksigen akan memperkecil intensitas fluoresensi. Hal ini disebabkan oleh

terjadinya oksidasi senyawa karena pengaruh cahaya (fotochemically induced oxidation).

Pengurangan intensitas fluorosensi disebut pemadaman sendiri atau quenching. Molekul oksigen

bersifat paramagnetik, dan molekul yang bersifat seperti ini dapat mempengaruhi dan

mempermudah lintasan antara sistem sehingga memperkecil kemungkinan fluorosensi,

sebaliknya memperbesar kebolehjadian fosforesensi.

7.      Pemadaman sendiri dan penyerapan sendiri

            Pemadaman sendiri di sebabakan oleh tabrakan-tabrakan antar molekul zat itu sendiri.

Tabrakan-tabrakan itu menyebabkan energi yang tadinya akan dilepaskan sebagai sinar

fluorosensi ditransfer ke molekul lain, akibatnya intensitas berkurang. Salah satu proses

pemadaman sendiri dapat ditulis sebagai berikut:

Molekul analit tereksitas + pemadaman menjadi molekul analit berkeadaan dasar + pemadam+

energi.

            Supaya suatu molekul berfluoresensi, maka molekul tersebut harus menyerap radiasi. Jika

konsenrasi senyawa yang menyerap radiasi tersebut sangat tinggi, maka sinar yang mengenai

sampel akan diabsorbsi oleh lapisan pertama larutan dan hanya sedikit radiasi yang diserap oleh

bagian lain sampel pada jarak yang lebih jauh.oleh karena itu, fluoresensi sampel yang

berkonsentrasi tinggi ini tidak seragam dan tidakakan proporsional dengan konsentrasi senyawa.

Karena kejadian seperti ini tidak diinginkan untuk tujuan analisis kuantitatif, maka konsentrasi

larutan yang berfluoresensi harus dijaga dalam konsentrasi rendah ntuk mencegah terjadinya

penyerapan radiasi yang tidak seragam ini.

            Sistem ikatan rangkap terkonjugasi memiliki struktur yang planar dan kaku sehingga

akan mampu menyerap secara kuat di daerah 200-800 nm pada radiasi elektromagnetik.

Senyawa-senyawa yang mempunyai ikan rangkap terkonjugasi ini merupakan calon senyawa

yang mampu berfluoresensi. Modifikasi struktur terhadap senyawa-senyawa ini dapat

menurunkan atau meningkatkan intensitas fluoresensi, tergantung pada sifat dan letak gugus

substituen.

            Gugus-gugus yang memberikan elektron (elektron donating groups) seperti gugus

hidroksil, aminoatau metoksi yang terikat secara langsung pada sistem ikatan п dapat

memfasilitasi terjadinya proses fluoresensi. Gugus-gugus yang menarik elektron (elektron

withdrawing groups) seperti nitro, bromo, iodo, siano, atau karboksil cenderung mengurangi

intensitas fluoresensi. Untuk obat-obat yang mempunyai gugus fungsional yang dapat terionisasi

yang terikat pada siste konjugasi, pemilihan ph dapat mempengaruhi sensitifitas dan selektifitas

pengujian. Dalam kasus senyawa fenol, ionisasi menjadi anion fenolat biasanya mendorong

fluoresensi; sementara itu perubahan amin aromatis menjadi kation amonium aromatis

menghambat proses fluoresensi.

            Penambahan banyaknya ikatan rangkap terkonjugasi dalam suatu sistem menyebabkan

peningkatan fluoresensi utamanya jika dalam sistem struktur aromatis heterosiklik, yakni suatu

struktur aromatisnyang mengandung gugus N, S, dan O. Intensitas fluoresensi senyawa

heterosiklis yang mengandung gugus –NH seringkali meningkat pada ph asam yang mana gugus

nitrogen mengalami protonasi.

            Jika suatu senyawa tidak berfluoresensi secara interinsik, maka senyawa tersebut harus

dirubah menjadi senyawa yang berfluoresen untuk dapat dianalisis. salah satu pendekatan yang

telah sukses digunakan untuk merupah senyawa menjadi berfluoresen adalah dengan metode

induksi kimia seperti radiasi dengan UV, hidrolisis, dan dengan dehidrasi menggunakan asam

kuat. metode lain adalah dengan pengkoplingan atau penggabungan reaksi antara molekul obat

denagan reagen fluorometrik yang sesuai membentuk senyawa berfluoresensi yang disebut

dengan fluorofor. reaksi yang meningkatkan intensitas fluoresensi juga meningkatkan

perpanjangan sistem elektron п atau kekakuan(rigiditas) molekul yang berarti juga meningkatkan

planaritas struktur. prosedur- prosedur yang menhasilkan fluorofor jga dapat memberikan

peningkatan sensitifitas dan spesifisitas metode pengujian dengan menggeser panjang gelombang

eksitasi dan emisi ke panjang gelombang yang lebih panjang sehingga gangguan-gangguan dari

senyawa lain menjadi minimal atau hilang sama sekali..

            Metode kedua yang digunakan untuk menguah obat yang tdak berfluoresensi atau

metabolitnya menjadi senyawa yang berfluoresensi (fluorofor) adalah metode pengkoplingan

atau penggabungan gugus fungsional molekul organik tertentu dengan reagen fluoresen. diantara

reagen-reagen yang sangat popular yang tersedia di pasaran adalah fluoresamin, o-ftalaldehid,

dansil klorida dan NBD klorida.

            Kerugian metode pembentukan fluorofor dengan pengoplingan adalah: (1) Spesifitasnya

masih kalah bagus jika dibandingkan dengan metode induksi kimia,(2) Adanya fluoresensi dasar

(background) yang tinggi yang disebabkan oleh reagen yang tidak ikut bereaksi, (3) Beberapa

tahap pemisahan terhadap kelebihan reagen biasanya di perlukan sebelum dilakukan pengukuran,

dan (4) Ketersedian reagen untuk gugus fungsional tertentu biasanya terbatas.

            Metode-metode yang melibatkan pembentukan fluorofor yang mengandung ion-ion

anorganik juga menarik terutama untuk analisis sekelumit (trace analysis) ion tertentu.

Prosedurnya ada 2 kategori, kategori pertama melibatkan pembentukan khelat berfluoresensi

antara ion dengan senyawa organik dilanjutkan dengan pengukuran emisinya. Metode ini

bermanfaat untuk ion-ion logam non transisi yang mana kurang begitu kompetitif dengan proses

fluoresensi dalam keadaan tereksitasi. Kategori ke dua pada umumnya digunakan untuk analisis

anion. Penurunan intensitas fluoresensi diamati sebagai peningkatan kuantitas anion yang

ditambahkan. Efek ini disebabkan oleh pengaruh pemadaman (quenching) ion-ion organik pada

emisi fluoresensi senyawa organik.

            Fosforisensi lebih di sukai terjadi pada eksitasi elektronyang tidak berpasangan (non-

bonding elektron, n). Dan juga, adanya substitusi pada struktur molekul dengan halogen, logam

berat, dan gugus-gugus nitro (terutama yang dekat dengan elektron yang tereksitasi) akan

meningkatkan fosforisensi. Hal ini disebabkan adanya gugus-gugus fungsional tersebut yang

dapat mendorong transisi elektron dari keadaan tereksitasi singlet ke keadaan tereksitasi triplet

yang merupakan syarat untuk teramatinya fosforisensi.

            Ada tiga keuntungan analisis fluorometri dan foforimetri dibandingkan dengan

spektrofotometri absorbsi yaitu:

1.      fluorometri lebih peka

2.      fluorometri lebih selektif

3.      pada fluorometri gangguan spektral dapat dikurangi dengan cara merubah panjang

gelombang eksitasi atau emisi.

Fluorimetri

Adalah metode analisa yang erat hubungannya dengan spektrofotometri. Energi yang

diresap oleh molekul untuk transisi elektronik ke level energi yang lebih tinggi (first excited

singlet) harus dilepaskan kembali ke level energi rendah (grount singlet). Energi yang dilepas ini

dapat berupa panas dan untuk beberapa molekul tertentu sebagian dari energi yang diserap

dipancarkan kembali berupa cahaya (fluororesensi). Apabila terjadi transisi dari “first excited

singlet” ke “lowest triplet state” maka elektronik state disebut fosforesensi.

C. AAS (ATOMIC ABSORBTIOAN SPECTROMETRI)

Pengertian

Spektrofotometer Serapan Atom (AAS) adalah suatu alat yang digunakan pada metode

analisis untuk penentuan unsur-unsur logam dan metaloid yang berdasarkan pada penyerapan

absorbsi radiasi oleh atom bebas.

Prinsip Dasar  

Spektrofotometer serapan atom (AAS) merupakan teknik analisis kuantitafif dari unsur-

unsur yang pemakainnya sangat luas di berbagai bidang karena prosedurnya selektif, spesifik,

biaya analisisnya relatif murah, sensitivitasnya tinggi (ppm-ppb), dapat dengan mudah membuat

matriks yang sesuai dengan standar, waktu analisis sangat cepat dan mudah dilakukan. AAS

pada umumnya digunakan untuk analisa unsur, spektrofotometer absorpsi atom juga dikenal

sistem single beam dan double beam layaknya Spektrofotometer UV-VIS. Sebelumnya dikenal

fotometer nyala yang hanya dapat menganalisis unsur yang dapat memancarkan sinar terutama

unsur golongan IA dan IIA. Umumnya lampu yang digunakan adalah lampu katoda cekung yang

mana penggunaanya hanya untuk analisis satu unsur saja.

Metode AAS berprinsip pada absorbsi cahaya oleh atom. Atom-atom menyerap cahaya

tersebut pada panjang gelombang tertentu, tergantung pada sifat unsurnya. Metode serapan atom

hanya tergantung pada perbandingan dan tidak bergantung pada temperatur. Setiap alat AAS

terdiri atas tiga komponen yaitu unit teratomisasi, sumber radiasi, sistem pengukur fotometerik.

Teknik AAS menjadi alat yang canggih dalam analisis. Ini disebabkan karena sebelum

pengukuran tidak selalu memerlukan pemisahan unsur yang ditentukan karena kemungkinan

penentuan satu unsur dengan kehadiran unsur lain dapat dilakukan, asalkan katoda berongga

yang diperlukan tersedia. AAS dapat digunakan untuk mengukur logam sebanyak 61 logam.

Sumber cahaya pada AAS adalah sumber cahaya dari lampu katoda yang berasal dari

elemen yang sedang diukur kemudian dilewatkan ke dalam nyala api yang berisi sampel yang

telah teratomisasi, kemudia radiasi tersebut diteruskan ke detektor melalui monokromator.

Chopper digunakan untuk membedakan radiasi yang berasal dari sumber radiasi, dan radiasi

yang berasal dari nyala api. Detektor akan menolak arah searah arus (DC) dari emisi nyala dan

hanya mengukur arus bolak-balik dari sumber radiasi atau sampel.

Atom dari suatu unsur pada keadaan dasar akan dikenai radiasi maka atom tersebut akan

menyerap energi dan mengakibatkan elektron pada kulit terluar naik ke tingkat energi yang lebih

tinggi atau tereksitasi. Jika suatu atom diberi energi, maka energi tersebut akan mempercepat

gerakan elektron sehingga  elektron tersebut akan tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi

dan dapat kembali ke keadaan semula. Atom-atom dari sampel akan menyerap sebagian sinar

yang dipancarkan oleh sumber cahaya. Penyerapan energi oleh atom terjadi pada panjang

gelombang tertentu sesuai dengan energi yang dibutuhkan oleh atom tersebut.

Panjang gelombang yang diserap oleh atom dalam keadaan dasar akan sama dengan

panjang gelombang yang diemisikan oleh atom dalam keadaan tereksitasi, apabila energi transisi

kedua keadaan tersebut adalah sama tetapi dalam arah yang yang berlawanan.

Lebar pita spektra yang diabsorpsi atau diemisikan akan sangat sempit jika masing-masing

atom yang mengabsorpsi atau memancarkan radiasi mempunyai energi transisi yang sama.

Berdasarkan hukum ketidakpastian Heisenberg, lebar pita alami spektra atom berkisar 10 -

4– 10-5 nm. Akan tetapi, terdapat beberapa proses yang dapat menyebabkan pelebaran pita hingga

0.001 nm yang akan dijelaskan lebih lanjut dalam efek Doppler.

a.       Efek Doppler

Efek Doppler juga terjadi pada atom, dimana dalam suatu kumpulan atom, beberapa atom

akan bergerak maju dan sebagian lagi menjauh dari detektor ketika emisi terjadi, sehingga daerah

panjang gelombang yang diamati menjadi lebih besar. Efek ini akan semakin besar pada

temperatur tinggi karena pergerakan atom akan semakin meningkat yang menyebabkan

terjadinya pelebaran pita absorpsi.

b.      Pelebaran tekanan (Pressure Broadening)

      Jika  suatu  atom  yang  mengabsorpsi  atau  memancarkan radiasi bertumbukan dengan

atom lain, tumbukan tersebut akan mempengaruhi panjang gelombang foton yang diradiasikan

karena terjadi perubahan tingkat energi dalam yang menyebabkan perbedaan keadaan transisi.

Tumbukan yang terjadi antara suatu atom yang mengabsorpsi atau memancarkan radiasi dengan

atom gas lain disebut dengan pelebaran Lorentz (Lorentz Broadening). Jika atom-atom yang

mengabsorpsi dan memancarkan radiasi juga terlibat tumbukan, maka disebut pelebaran

Holzmark (Holzmark Broadening). Dalam semua hal, semakin tinggi temperatur, maka

tumbukan akan semakin sering terjadi sehingga terjadi pelebaran pita yang disebut dengan

pelebaran tekanan (Pressure Broadening).

Hukum absorpsi sinar (Lambert-Beer) yang berlaku pada spektrofotometer absorpsi sinar

ultra violet, sinar tampak maupun infra merah, juga berlaku pada Spektrometri Serapan Atom

(SSA). Perbedaan analisis Spektrometri Serapan Atom (SSA) dengan spektrofotometri molekul

adalah peralatan dan bentuk spectrum absorpsinya:

Setiap alat AAS terdiri atas tiga komponen yaitu:

1.      Unit atomisasi (atomisasi dengan nyala dan tanpa nyala)

2.      Sumber radiasi

3.      Sistem pengukur fotometri

Sistem Atomisasi dengan nyala

Setiap alat spektrometri atom akan mencakup dua komponen utama sistem introduksi

sampeldan sumber (source) atomisasi. Untuk kebanyakan instrument sumber atomisasi ini

adalah nyata dan sampel diintroduksikan dalam bentuk larutan. Sampel masuk ke nyala dalam

bentuk aerosol. Aerosol biasanya dihasilkan oleh Nebulizer (pengabut) yang dihubungkan ke

nyala oleh ruang penyemprot (chamber spray).

Ada banyak variasi nyala yang telah dipakai bertahun-tahun untuk spektrometri atom.

Namun demikian yang saat ini menonjol dan diapakai secara luas untuk pengukuran analitik

adalah udara asetilen dan nitrous oksida-asetilen. Dengan kedua jenis nyala ini, kondisi analisis

yang sesuai untuk kebanyakan analit (unsur yang dianalisis) dapat sintetikan dengan

menggunakan metode-metode emisi, absorbsi dan juga fluoresensi.

Gas pembakar

Gas pembakar pada spektrofotometri nyala sangat penting yang berfungsi untuk

mengubah fase dampel yang cair dalam bentuk tetesan kabut (s) dan selanjutnya segera berubah

menjadi gas. Pada AAS digunkan 2 macam pembakar yaitu :

1. Gas yang bersifat oksidasi udara, udara (O2) dan campuran ) O2 +N2O

2. Gas sebagai bahan bakar gas alam, propana, butana, asetilen dan H2 asetilen

Gas pembakar dalam AAS dapat saja merupakan campuran keduanya: udara dengan propana,

udara dengan asetilen (terbanyak digunakan) dan N2O denagan asitilen. Perlu diperhatikan disini

adalah profil nyala gas pembakar, sebab proses absorbsi radiasi tern=jadi nyala. Profil nyala tiap

unsur berbeda tapi pada umumnya tinggi nyala api gas pembakar dibuat 5cm.

Pemilihan Panjang Gelombang.

Pada penentuan dengan AAS dipilih satu panjang gelombang dengan intensitas yang

cukup tinggi dan memberikan kelurusan rentang dinamik pada penentuan kuantitatif. Sebaiknya

dilakukan pada panjang gelombang di atas 220 nm untuk mencegah absrsi non atomik dan

mencegah radiasi sesat,

Absorbsi Garis Resonansi Atom

Atom-atom netral suatu unsur didalam nyala api mempunyai sifat yang khas yaitu akan

menyerap radiasi yang datang

Gelombang radiasi yang diserap sesuai dengan energi eksitasi ke salah satu tingkat energi

eksitasi

Setiap unsur memerlukan sumber radiasi yang tertentu dan sesuai agar persyaratan

hukum Lambert-Beer terpenuhi.

Analisis Kuantitatif

Keguanaan AAS adalah untuk analisis kuantitatif logam-logam alkali dan alkaloi tanah.

Beberapa hal yang diperhatikan dalah :

Larutan sampel diusahakan sencer mungkin kadar unsur yang dianalisi tidak lebih dari

5% dalam pelarut yang sesuai

Hindari pemakaian pelarut aromatik atau halogenida. Pelarut organik umum : keton,

ester, dan etil asetat. Hendaklah dipakaipelarut-pelarut untuk analisa (p.a)

Dilakukan perhitungan atau kalibrasi dengan zat standar, sama pelaksanannya dengan

spektrofotometri UV-Vis.

D. SPEKTROFOTOMOTRI UV-VIS

Spektrofotometri Visibel

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya

tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh

mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua

sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat

dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak(visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten.

Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W

dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam

lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal

ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna

dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent

yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa.

Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan stabil.

 Spektrofotometri UV 

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan

interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai

sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia

merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom

deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu

proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang

berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.Karena sinar UV tidak dapat

dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan

senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak

berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat

langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus

dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample

harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Spektrofotometri UV

memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian

preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi

dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini

berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa. 

Spektrofotometri UV-VIS 

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.

Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.

Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai

sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem

spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan

metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.

Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis)

melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya

dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR))

kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan

kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi

elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan

transisi dari ground state ke eksited state. 

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu : 

a. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.

b. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks

c.  Penyerapan oleh  perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb : 

E = hv

Dimana , E = energy (joule/second)

h = tetapan plank

v = frekuensi foton

                Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor

(gugus  dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi

yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron.

Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap

sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai

dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron

bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor

akan  

mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar

(bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik). 

1.      Kegunaan spektroskopi UV-VIS 

UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan dari

logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik.  

a) Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya) karena elektron

dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik lainnya. Warna larutan ion

logam sangat dipengaruhi oleh kehadiran spesies lain, seperti anion tertentu atau ligan.

Sebagai contoh, warna larutan encer tembaga sulfat adalah biru yang sangat terang;

menambahkan amonia meningkat dan perubahan warna panjang gelombang serapan

maksimum (λ m a x).  

b)  Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat tinggi konjugasi, juga menyerap

cahaya pada daerah UV atau terlihat dari spektrum elektromagnetik. Pelarut untuk

penentuan ini sering air untuk senyawa larut dalam air, atau etanol untuk senyawa organik

yang larut. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang signifikan; tidak

semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam spektroskopi UV. Ethanol menyerap

sangat lemah di paling panjang gelombang.).Polaritas pelarut dan pH dapat mempengaruhi

penyerapan spektrum senyawa organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan

maksimum dan koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau ketika polaritas

pelarut berkurang.  

c) Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna sering terlalu kuat

untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa

absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi spesies menyerap dalam larutan

dan panjang jalan. Jadi, untuk tetap jalan panjang, UV / VIS spektroskopi dapat digunakan

untuk menentukan konsentrasi dalam larutan penyerap. Perlu untuk mengetahui seberapa

cepat perubahan absorbansi dengan konsentrasi. Ini dapat diambil   dari referensi (tabel

koefisien molar kepunahan), atau lebih tepatnya, ditentukan dari kurva kalibrasi.

Prinsip Kerja UV-Vis

Pada prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang

mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya.Cahaya yang digunakan

merupakan foton yang bergetar dan menjalar secara lurus dan merupakan tenaga listrik dan

magnet yang keduanya saling tagak lurus. Tenaga foton bila mmepengaruhi senyawa kimia,

maka akan menimbulkan tanggapan (respon), sedangkan respon yang timbul untuk senyawa

organik ini hanya respon fisika atau Physical event. Tetapi bila sampai menguraikan senyawa

kimia maka dapat terjadi peruraian senyawa tersebut menjadi molekul yang lebih kecil atau

hanya menjadi radikal yang dinamakan peristiwa kimia atau Chemical event.

Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna. Sehingga sampel yang akan

diidentifikasi harus diubah dalam senyawa kompleks. Analisis unsur berasal dari jaringan

tanaman, hewan, manusia harus diubah dalam bentuk larutan, misalnya destruksi campuran asam

(H2SO4+ HNO3 + HClO4) pada suhu tinggi. Larutan sample diperoleh dilakukan preparasi

tahap berikutnya dengan pereaksi tertentu untuk memisahkan unsur satu dengan lainya, misal

analisis Pb dengan ekstraksi dithizon pada pH tertentu. Sampel Pb direaksikan dengan amonium

sitrat dan natriun fosfit, pH disesuaikan dengan penambahan amonium hidroksida kemudian

ditambah KCN dan NH2OH.HCl dan ekstraksi dengan dithizon.

Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan

menuju monokromator, Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan

sebuah cermin berotasi, Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara

berulang – ulang, Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya,

perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram.

BAB III

BAHAN DAN METODE

A. Aparatur

Rekaman Shimadzu spektrofluorophotometer. Modl RF-540 (P/N204-0- 2900). Sebelum

digunakan dikalibrasi dan dihubungkan ke pencetak perekam.Spectronic TM

GenesysTM,spektrofotometer UV /VIS dihubungkan ke komputer IBM dengan aplikasi

perangkat lunak WInspecTM.Shimadzu nyala spektrofotometer serapan atom Model AA.64C-

13. Untuk AAS, kobalt pada panjang gelombang 240,7 nm, menggorok lebar 0,2 nm, relative

kebisingan 1.0, batas deteksi 0,01 g/mL1 lampu 10 mA dan integrasi waktu saat ini 3 s. Api

yang digunakan adalah campuran asetilena-udara. Nilai pH larutan diukur dengan menggunakan

Orion Penelitian Model 601A digital pH meter.

B. Bahan dan Reagen

Semua pelarut dan reagen adalah reagen analitis, aquabidestilata digunakan untuk melarutkan

fluorokuinolon, masing-masing sampel dari fluorokuinolon yang disediakan berasal dari produk :

amifloxacin (Sterling Winthrop Inc,USA );difloextacin hidroclorida (Abbort Laboratories,north

Chicago,USA),Norfloksasin(eipico,kairo,mesir) ;pefloexacin mesylate (rahone - pulene rorer,

neully / seine, prancis ) ;ofloksasin (Hoechst AG , Frankfurt, jerman) ;ciprofloxsasin

hidroklorida (Miles Inc Farmasi Divisi , West Haven , Jerman) ; lomefloxacin hidroklrida (Searle

, Illinois , USA) ,enoxacin , enrofloxacin , dan levofloxacin (Sigma Chem . Co USA) dan

digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Ammonum vanadate , 5% b / v larutan , dibuat dengan

melarutkan 5gram dan mendidih 50% v/v asam sulfat dan pengenceran 100ml dengan 50% v /v

asam sulfat dan 0,01 M kbalt sulfat (0,2% b/ v solution) adalah produk Aldrich . asam sulfat

(ADWIC) , 0,1 N dan 50% v / v disusun dengan terionisasi air.

C. Sediaan Farmasi

Berikut ini persiapan komersial yang tersedia di analisis : Spectrama tablet , Batch No 814

(Amoun Pharmaceutical Industries Co , Kairo, Mesir ) label untuki mengandung 400 mg

norfloksasin anhidart per tablet ; neofloxacin tablet , batch No 151 alexandria Co untuk

farmasi , Alexandria, Mesir ) label mengandung 400mg norfloksasin anhidrat per tablet ;

Norbactin tablet , batch No 114 ( chem.. Ind co , Giza , Mesir ) berlabel mengandung 400 mg

norfloksasin per tablet, Tarivid tablet , Batch No 12E06 ( Hoechst Orient, kairo , Mesir, di

bawah lisensi dari Hoechst AG , Frankfurt, Jerman ) berlabel mengandung 200 mg ofloksasin per

tablet; Kirol tablet , Batch No 021269A (amoun Pharmaceutical Induatries Co , Kairo , Mesir )

berlabel mengandung 200 mg ofloksasin per tablet ; Mefoxin tablet , Batch No 2011 ( Misr Co

untuk Pharmaceutical Industries , Kairo , Mesir ) label untuk mengandung 250 mg ciprofloxacin

hidroklorida monohydrate per tablet , Serviflox tablet , Batch No 950 ( di bawah lisensi dari

Biochemie Kundi Austria ) , berlabel mengandung 250 ciprofloxacin hidroklorida per tablet ;

Cipro otic tetes , Batch No 1001111 ( Chem. Indus. Co , Giza , Mesir ) berlabel mengandung

3,5 mg ciprofloxacin hidroklorida per mL ; Globacin tablet , Batch No 18501 ( Global Napi

Pharm. Mesir ) berlabel mengandung 400 mg pefloxacin dalam bentuk mesylate dihidrat per

tablet ; Peflacin ampul , Batch No 102 ( rhone – Poulene Rorer , Neuilly / seine , Prancis )

berlabel mengandung 40 mg pefloxacin mesylate dihidrat dan 15,3 mg natrium askorbat per ml

ampul, Tavanic tablet , Batch No 12E07R ( di bawah lisensi dari Aventis Pharma Jerman )

berlabel mengandung 500 mg levofloxacin per tablet.

D. Prosedur

1. Metode Spektrofluorometri ( Metode I)

Ke dalam labu ukur 100 mL ditambahkan 1 mL larutan stok fluoroquinolon dan

ditambahkan dengan H2SO4 0,1 N sampai tanda. Kemudian diencerkan sampai 100 mL

dengan H2SO4. Fluoresensi yang diperoleh sebesar 450 nm dan tereksitasi pada panjang

gelombang 290 nm. Lrutan blanko yang digunakan yaitu H2SO4 0,1 N. kemudian diukur

dan dikalibrasi sehingga mendapatkan grafik seperti bentuk bujur sangkar 0,3-1,4 mg/mL.

2. Metode Spektrofotometri Serapan Atom

Aliquots standar kerja lerutan obat yang kualitatif ditambahkan 25 ml kedalam labu ukur.

Untuk setiap labu ukur ditambahkan 1,0 ml 10-2 M larutan standar kobalt sulfat dan pH

telah disesuaikan menjadi 8,1 dengan menggunakan 1 mL larutan buffer. Larutan

dicampurkan dan dikocok , lalu didiamkan selama 15 ment dengan tujuan untuk waktu

retensi. Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman P/S (12,5). Endapan dicuci

dengan redistilled air deionisasi sampai tidak mengandung logam bebas.

- Metode langsung : endapan yang diperoleh dilarutkan dengan asam asetat encer dan

ditambahkan dengan redistilled air deionisasi sampai volume tepat 25 mL. dari larutan

tersebut diambil 2 mL lalu diencerkan dengan air deionisasi redistilled.

- Metode tidak langsung : filtrate dicuci lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan

diencerkan dengan air deionisasi redistilled sampai tanda. Dari larutan tersebut diambil

10 ml dan diencerkan sampai volume 100 mL dengan air deionisasi redistilled.Blanko

disiapkan dan absorbansi diukur pada kondisi menyala dengan menggunakan flame

AAS.

3. Metode Spektrofotometri ( Metode III)

Untuk aliquots berbeda larutan obat standar yang mengandung 0,2-1,0 mg obat dianalisis,

ditambahkan 3 mL 5% b/v ammonium vanadat dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 2 mL

asam sulfat pekat. Campuran diaduk dan diuapkan diatas waterbath selama 20 menit lalu

didinginkan dan diencerkan dengan aquabidestilata. Absorbansi diukur pada panjang

gelombang 766 nm terhadap blanko . hal tersebut membuktikan bahwa sampel dideteksi

dengan spektrofotometri visibelkarena bekerja pada panjang gelombang 400-800 nm.

4. Sediaan farmasi

- Prosedur untuk tablet : timbang seksama, setara dengan 10 mg masing-masing obat dari

campuran 20 bubuk tablet , dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL lalu dikalibrasi

dan diencerkan sampai tanda dengan pelarut yang sesuai, diultrasonifikasi Selama 20

menit dan disaring untuk mendapatkan 100 mg /mL.

- Prosedur ampul : timbang setara denag 10 mg masimg-masimg obat , dan dipindahkan

ke dalam labu ukur 100 mL , dikalibrasi dan diencerkan untuk mendapatkan

konsentrasi 100 mg/L. pengenceran dilakukan untuk mendapatkan larutan sampel dan

kemudian prosedur umum diikuti.

- Prosedur Drops : 1 mL drops dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL kemudian

diencerkan sampai tanda dengan pelarut yang sesuai untuk mendapatkan konsentrasi

larutan 30 mg/L. pengenceran dilakukan untuk memperoleh larutan sampel dan

kemudian prosedur umum diikuti.

5. Prosedur Cairan Biologi

- Urin pengobatan : sampel urin disentrifugasi pada 4000 rpm selama 5 menit , kemudian

1 ml suprenatan yang dihasilkan ditambahkan pada 1 mL larutan stok obat.

Pengenceran ynag tepat dilakukan untuk memperoleh larutan dalam konsentrasi obat

100, 300, dan 500 mg/L, kemudian dideteksi dengan AAS.

- Plasma Pengobatan : 1 mL plasma deproteinized dengan penambahan 10 mL

asetonitril, disentrifugasi pada 4000 rpm selama 5 menit . 1 ml suprenatan jernih

ditambahkan pada 1 mL larutan stok obat. Campuran tersebut kemudian diekstraksi

dengan 2 bagian. Masing-masing dengan 5 mL kloroform. Kloroform dikumpulkan dan

kemudian diuapkan pada waterbath. Kemudian dilakukan pengaenceran yang tepat utuk

memperoleh larutan yang mengandung 100, 300, dan 500 mg/L . lalu dideteksi dengan

AAS.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Metode spektrofluorometri ( metode I)

Fluoroquinolons menunjukkan floresensi asli di dalam air,alkohol,0,1 N NaOH, 0,1 N Hcl

dan 0,1 N H2S04. Hasil dari fluoroquinolon dalam 0,1 N H2SO4 ditunjukkan floresensinya

terkuat pada panjang gelombang 450nm dan tereksitasi pada panjang gelombang 250nm. Sebuah

korelasi linear didapatkan hubungan antara insensitas fluoresensi dan konsentrasi dalam kisaran

0,3-1,4 mg ml-1 dan korelasi koefisien (r) tidak kurang dari 0,999. Konsentrasi sampel yang

berbeda dari fluoroquinolons dalam bubuk masal dan bentuk sediaan dihitung dari persamaan

regresi linear sebagai berikut:

C= 0,01216 F-0,04213

C: konsentrasi obat dalam mg/ml-1

F: intensitas fluoresensi obat

Fluoresensi asli fluoroquinolon yaitu karena tingkat tinggi konjugasi ditemukan didalam

struktur. Konjugasi ini dapat dilakukan dengan penambahan natrium borohibrida (NaBH4) ke

fluoroquinolons berair hasil dalam konsentrasi molar dengan perbandingan 3:1 dalam rangka

mengurangi gugus ketonik di dalam cincin piridin. Fluoresensi tersebut dalam hal ini menurun

sekitar 50%.

B. Metode spektrometri Serapan Atom (SSA) Metode II

Dengan penambahan sedikit basa beralkohol (pH 8,1) hasil amiflocaxin, ciprofloksasin,

hidroklorida, diflofoxacin hidroklorida, enoxacin, enrofloxacin, lomefloxacin hidroklorida,

levofloxacin, norflokxasin, ofloksasin, dan pefloxacin mesilat member gumpalan (endapan)

dengan kobalt sulfat. Endapan tersebut membentuk dasar penentuan mikro kuantitatif dari obat-

obat asam. Co (II) isinya dapat ditentukan baik secara langsung dalam endapan atau tidak

langsung dalam filtrate dengan SSA.

C. Metode Spektrofotometri Uv-Vis(metode III)

Metode ini telah digunakan untuk analisis kuantitatif 10 fluoroquinolones antibiotik melalui

oksidasi dengan ammonium vanadat dalam medium asam sulfat sehingga terbentuk warna biru

kehijauan di panjang gelombang 766 nm yang ditunjukkan dengan vanadium (IV) dihasilkan

oleh reaksi reduksi vanadium (V) oleh obat yang terpilih.

Optimasi Kondisi Reaksi

a) Untuk Metode Spektrofluorometri

Jenis dan konsentrasi reagen: 0,1 N H2SO4 ditunjukkan fluoresensi terkuat pada 450nm

dan mencolok pada 290nm.

b) Untuk Metode Spektrofotometri Serapan Atom (SSA)

Jenis dan jumlah alkohol:

penambahan jumlah etil alkohol adalah untuk meningkatkan solubilisasi obat dan

koagulasi endapan. Volume yang lebih besar dari alkohol harus dihindari karena untuk

mencegah solubilisasi dari endapan terbentuk.

Pengaruh pH:

untuk mempelajari pengaruh pH terhadap presipitasi, larutan buffer yang meliputi asam

dan basa alkali. Asam mepunyai pelarut yang berpengaruh pada endapan yang mengarah untuk

menurunkan hasil untuk teknik langsung dan yang lebih tinggi untuk teknik tidak langsung,

sementara alkali tinggi endapan logam sebagai oksida atau hidroksida yang mengarah ke yang

lebih tinggi hasil untuk teknik langsung. PH optimum ditemukan pada sedikit basa yaitu pH= 8,1

Konsentrasi Logam:

Mengingat konsentrasi ion logam pada endapan, 1 ml larutan pengendap di tambahkan

untuk membuat sempurna.

Suhu:

Mengenai pengaruh suhu, suhu kamar menjadi paling efisien. Suhu yang lebih tinggi

menimbulkan efek pada endapan pelarut dengna menunjukkan hasil yang lebih rendah untuk

teknik langsung dan lebih tinggi untuk teknik tidak langsung.

Komposisi Pembentukan Kompleks:

Metode Job’s dengan variasi kontinu digunakan untuk mempelajari rasio molar

terbentuknya khelat. Metode ini mengungkapkan rasio 1:2 untuk ion logam Co (II) kuinolon

khelat. Hal ini menjelaskan penggunaan optimum konsentrasi ion logam yang sama untuk semua

obat-obatan. Konstanta stabilitas terbentuknya khelat yang dihitung menggunakan persamaan:

Β= A/AexCx / (CM – A/ Aex Cx) (CL – nA/ Aex Cx)n

Dimana:

β : stabilitasi konstan khelat terbentuk

M: logam

L: ligan

n= X/(1-X)

X: fraksi mol ligan pada max dari kurva variasi kontinu

A/AEX: rasio absorbansi

CM: konsentrasi logam

CL: konsentrasi ligan

Konstanta stabilitas dihitung untuk dibentuk khelat berkisar antara 90,9093x107 untuk

198.0684x 107 yaitu menunjukkan stabilitas yang baik terbentuknya khelat.

c) Untuk Metode Spektrofotometri

Pengaruh waktu pemanasan: pendidihan selama 20-30 menit sudah cukup untuk

menghasilkan intensitas warna yang maksimal.

Pengaruh konsentrasi reagen: ditemukan bahwa 1 ml 5% b/v ammonium vanadat adalah

konsentrasi yang paling sesuai untuk melakukan pengujian tersebut.

Pengaruh konsentrasi ssam Sulfat: berbeda konsentrasi (10,30,50,70,90 dan 98% v/v)

yang dicoba dan ditemukan bahwa 2 ml konsentrasi asam sulfat yaitu 98% memberikan

hasil terbaik.

Metode Validasi

Spectrofluorometri, spektrometri serapan atom, dan spektrofotometri uv-vis sepenuhnya

divalidasi menurut Pedoman Konferensi Internasional harmonisasi dan mematuhi USP validasi

pedoman XXIV.

Linearitas: Kurva kalibrasi memiliki koefisien korelasi (r) lebih tinggi dari 0,999 dan

koefisien determinasi (r2) lebih tinggi dari 0,998 menunjukkan linearitas yang baik.

Linearitas juga diperiksa oleh perhitungan variasi slope dan test untuk intersep.

Akurasi: Keakuratan metode ditentukan dengan menyelidiki pemulihan masing masing

obat dan recovery yang dihasilkan sangat bagus hamper mendekati 100% pada setiap

obat.

LOD dan LOQ: menunjukkan sensivitas yang tinggi pada setiap obat.

Hasil validasi menunjukkan bahwa adanya zat tambahan atau eksipien lain tidak

mempengaruhi atau mengganggu jalannya analisis dilihat dari nilai recovery yang dihasilkan

pada setiap obat-obat floroquinolon tersebut.

Aplikasi

Prosedur yang diusulkan dapat memperoleh keberhasilan untuk menetukan pembelajaran

obat-obatan dalam bentuk sediaan farmasi. 6 replikasi pengukuran dilakukan dalam setiap kasus,

hasil yang diperoleh divalidasi dan dibandingkan dengan baik. Berbagai metode resmi dan

dilaporkan dengan cara tand F-tes pada tingkat kepercayaan 95% dan tidak ada perbedaan yang

signifikan yang ditemukan dan menunjukkan hasil yang baik pada akurasi dan presisi.

Tidak ada gangguan dari eksipien umum yang digunakan seperti pati, bedak, glukosa,

sukrosa dan magnesium stearat. Tidak ada gangguan yang disebabkan oleh adanya natrium

askorbat dengan pefloxacin dalam ampul Pefloxacin ®

Sensivitas yang tinggi dapat dicapai oleh metode spektrometri serapan atom

memungkinkan penentuan kuinolon yang dipelajari dalam cairanbiologis. Oleh karena itu,

metode yang diusulkan diterapkan untuk penentuan mempelajari obat dalam sampel urin

manusia dan plasma serta recovery ditentukan oleh metode kurva kalibrasi. Recovery yang

sangat baik diperoleh pada tiga tingkat konsentrasi masing-masing obat baik dalam urin maupun

sampel plasma. Akurasi dinilai dengan menyelidiki recovery dari masing-masing obat di tingkat

konsentrasi yang mmeliputi kisaran yang ditentukan (3 kali replikasi pada masing-masing

konsentrasi). Hasil penelitian menunjukkan recovery yang sangat baik dengan SD< 2,5% artinya

menunjukkan akurasi dan presisi yang baik. Hanya sampel pada plasma yang diperlukan

deproteinasi dan langkah-langkah ekstrasi sementara tidak terpelihara sampel urin diproses

secara langsung. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang diusulkan cukup selektif untuk

mentolerir kehadiran eksipien umum, konstituen aktif yang lain yang dapat ditemukan dalam

dosis yang berbeda (seperti natrium askorbat dalam ampul Pefloxacin ®) dan matriks cairan

biologis sebagai urin dan plasma. Metode yang diusulkan menguntungkan dibandingkan banyak

metode spektrofotometri lain untuk penentuan obat dalam bentuk sediaan farmasi dan dalam

cairan biologis. Metode-metode tersebut jauh lebih sederhana, murah dan memakan waktu

daripada metode HPLC.

BAB V

PENUTUP

KESIMPULAN

Spektrofluorometri, SSA, dan Spektrofotometri UV-VIS metode yang sederhana, cepat, selektif

dan sangat sensitive sehingga metode ini dapat digunakan untuk menentukan obat-obat dalam

bentuuk serbuk atau dalam dosis tertentu tanpa dipengaruhi atau terganggu oleh eksipien lainnya,

serta dapat digunakan dengan mudah didalam laboratorium untuk analisis kontrol kualitas.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia edisi IV, 1061,1062,1069, Departemen kesehatan

Indonesia, Jakarta.

Anonim,1995, Farmakope Indonesia edisi III, 775,776, Departemen Kesehatan Indonesia,

Jakarta.

Gandjar,Ibnu Ghalib.2007.Kimia Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar

Mulja,1995, Analisis Insrumental,90, Airlangga University Press, Surabaya.

Salem, Hesham. 2005. Spectrofluorimetric, atomic Absorbtion Spectrometric and spectrometric

Determination of some Fluoroquinolones. American Journal Of Applied Sciences.Minia

University,egyp.

Sudjadi dan Abdul Rohman. 2008. Analisis Kuantitatif Obat. Yogyakarta : UGM Press.