32

IV. METODE PENELITIAN

4.1. Lokasi Penelitian

Pelaksaanan Penelitian ini dilakukan di beberapa Laboratorium diantaranya :

Laboratorium Biokimia dan laboratorium Teknologi Hasil Pertanian Universitas

Brawijaya Malang, Laboratorium Produksi PusVetMa Surabaya, Laboratorium UPT

Scanning Electron Microscope Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Dasar Bersama

(LDB) Universitas Airlangga Surabaya serta Laboratorium Pengolahan Hasil Pertanian

Universitas Widyagama Malang. Pelaksanaan penelitian laboratorium dimulai sejak 25

Juli 2004.

4.2. Pelaksanaan Penelitian

4.2.1. Bahan Dasar Penelitian

Bahan dasar yang digunakan dalam penelitian berupa biji komak hitam, pepsin

dan gum xanthan Biji komak hitam varietas uceng diperoleh dari hasil penanaman di

Desa Sukoiber Gudo Jombang dan dipilih biji yang sudah masak optimal (35-40 hari

pasca pembungaan ) umur panen seragam bebas hama dan penyakit. Gum xanthan

yang digunakan adalah Vanzan yang diproduksi oleh R.T. Vanderbilt Company. Enzim

pepsin 64271 produksi Merck Jerman

4.2.2. Tahapan Penelitian

Penelitian dibagi dalam 4 tahap, masing-masing tahapan dijelakan sebagai

berikut :

A. Tahap I. Ekstraksi protein biji komak hitam dan evaluasinya

Ektraksi protein biji komak hitam dilakukan dengan langkah-langkah sebagai

berikut :

33

Pembebasan sisa lemak .

Biji komak hitam dikeringkan pada suhu 60oC hingga mencapai kadar air 12-14

persen. Selanjutnya dihancurkan hingga menjadi tepung dengan ukuran butiran 65

mesh. Butiran ayakan selanjutnya dihancurkan lagi dengan plate mill dan diayak

dengan ukuran 100 mesh ( Sumner, Nielson dan Young, 1980). Ekstraksi lemak

tepung biji komak hitam dilakukan dengan heksana (Sathe et al. 1982 dalam Herastuti

1990). Tepung komak hitam direndam dalam larutan heksana dengan perbandingan 1

: 5 b/v dan diaduk dengan mixer kecepatan medium selama 30 menit. Selanjutnya

disaring dengan kertas saring kasar dan dicuci ulang 2 kali dengan heksana. Tepung

ditiriskan pada suhu kamar selama 24 jam.

Tepung biji komak hitam bebas lemak dievaluasi kadar lemak yang tersisa

menggunakan metode solvent extraction (AOAC,1970).

Pemisahan Isolat Protein

Pemisahan isolat protein dari tepung biji komak hitam yang telah bebas lemak

dilakukan dengan cara seperti yang dilakukan oleh Puppo dan Anon (1998) yang

dimodifikasi sebagai berikut :

Tepung biji komak hitam dilarutkan larutan alkali NaOH 0,1 M pH 8,0 ± 0,5

dengan perbandingan 1 : 10 b/v diaduk dengan mixer kecepatan rendah pada suhu

ruang selama 30 menit. Selanjutnya fraksi protein biji komak hitam yang terlarut

dipisahkan dengan cara sentrifugasi kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan

ditambah air destilat dengan perbandingan 1 : 5 dan disentrifugasi fraksi protein

dipisahkan lagi ( pekerjaan ini dilakukan 2 kali ). Fraksi protein terlarut ditampung

dalam beaker glass dan diendapkan pada pH 4,0 ± 0,2 dengan cara menambahkan

HCL 0,1 M. Hasil endapan dipisahkan dari supernatan dengan menggunakan kertas

34

saring SS, pencucian dilakukan dengan air destilat sebanyak 3 kali. Endapan

ditampung sebagian dan sebagian dikeringkan di pengering beku untuk dievaluasi sifat

fungsionalnya.

Evaluasi Isolat Protein

Produk Isolat protein dievaluasi tentang

1. Berat molekul isolat protein dievaluasi menggunakan elektroforesis SDS-

PAGE ( Aulanni’am, 2005)

2. Kadar protein dengan metode Lowry ( Aulanni’am, 2005)

3. Kelarutan Isolat protein pada berbagai pH ( Aluko dan Yada, 1994

dimodifikasi).

4. Oil holding capacity dan water holding capacity ( Subagyo, 2006)

5. Emulsion activity index dan emulsion stability index ( Pedrosa, et al., 1997)

6. Foam capacity index dan foam stability index ( Subagyo, 2006)

B. Tahap II. Isolasi dan Karakterisasi Isolat Globulin Tujuan penelitian tahap kedua adalah untuk mendapatkan isolat globulin

menggunakan teknik invitro digestion dengan enzim pepsin

Penelitian tahap II dititik beratkan untuk memisahkan fraksi protein yang tidak

dapat dihidrolisis oleh pepsin dalam isolat protein komak hitam yang diduga kuat

sebagai globulin.

Penelitian menggunakan teknik in-vitro digestibility dengan enzim pepsin.

Langkah-langkah penelitian disusun sebagi berikut :

1. Isolat protein dipersiapkan sebagaimana dalam penelitian tahap 1.

2. Proses digestion.

35

Proses digestion dilakukan seperti metode Chavan, et al., (2001) dengan beberapa

modifikasi sebagai berikut :

1) Buffer enzim pepsin dipersiapkan dari HCl 0,05 M. pada pH 3,0 ± 0,2.

2) Konsentrasi digesti dibuat dengan pengenceran 20 kali 5g/100ml dalam

erlenmeyer 200 cc menggunakan buffer 0,05 M HCl pH 3,0 – 3,5.

3) Mempersiapkan campuran enzim pepsin yang telah diencerkan dan

dicampurkan dengan isolat protein komak hitam dengan rasio 100 : 1, ( Isolat

protein : enzim ) (Venckatachalam, et al., 2002).

4) Semua digestion dikondisikan pada suhu 37oC dalam waterbath dengan suhu

terkontrol. Proses digestion dilakukan selama 30 menit.

5) Protein yang mengendap merupakan protein yang tidak terhidrolisis oleh

pepsin, sementara supernatan adalah hasil hidrolisis.

3. Pemisahan protein yang tidak terhidolisis oleh pepsin

Pemisahan endapan protein yang tak terhidrolisis oleh pepsin dilakukan

dengan cara sebagai berikut :

1) Contoh hasil digesti disentrifugasi 3500 rpm selama 30 menit.

2) Supernatan dipisahkan dari endapan.

3) Endapan ditampung dan ditambah air destilat dengan perbandingan endapan :

air (1 : 5 ) dan disentrifugasi (pekerjaan ini dilakukan 3 kali).

4). Isolat protein yang tak terhidrolisis oleh pepsin dipindahkan kedalam kertas

saring Whatman no 4 dan dicuci lagi dengan air destilat 3 kali.

36

4. Evaluasi

Evaluasi dilakukan untuk mengetahui perubahan protein selama proses

digestion serta dominasi globulin dalam isolat yang tak terhidrolisis oleh pepsin

Evaluasi tersebut meliputi :

1). Jumlah isolat yang dihasilkan

2). Berat molekul menggunakan SDS-PAGE ( Aulanni’am, 2005), pemeriksaan

dilakukan terhadap isolat protein yang tak terhidrolisis oleh pepsin, supernatan

hasil digestion, dan enzim pepsin.

C. Tahap III. Fraksinasi Globulin 7S dan 11S

1. Fraksinasi 7S dan 11S globulin dari isolat globulin.

Tujuan penelitian adalah mendapatkan fraksi globulin 7S dan 11S globulin

menggunakan teknik pengendapan pada titik isoelektriknya.

Protein memiliki kelarutan minimum pada titik isoelektriknya, sehingga akan

mudah mengendap pada pH tersebut. Fraksi 7S mempunyai titik isoelektrik pada pH

4,8 dan fraksi 11S pada pH 6,4. (Tanh dan Shibasaki, 1976)

Langkah-langkah pelaksanaan fraksinasi disusun berdasarkan modifikasi

metode Tanh dan Shibasaki (1976) seperti alur berikut :

1) Isolat protein dipersiapkan sebagaimana pada penelitian tahap I

2) Fraksionasi Isolat globulin dari isolat protein dipersiapkan dengan

menggunakan teknik invitro digestion seperti pada penelitian tahap II

3) Penurunan pH menjadi pH titik isoelektrik dilakukan dengan menambahkan HCl

0,1 M.

4) Hasil endapan dipisahkan dengan sentrifugasi kecepatan 3000 rpm selama 15

menit. Endapan yang diperoleh ditampung dalam beaker glass dan ditambah

37

air dengan perbanding isolat : air (1 : 5) dan disentrifugasi lagi dengan

kecepatan 3000 rpm selama 15 menit ( pekerjaan ini dilakukan 3 kali ) sampai

garam-garam terlarut dapat dibebaskan.

5) Endapan dipindahkan kedalam kertas saring whatman no 4 dan dicuci lagi

dengan air destilat sebanyak 3 kali.

6) Isolat yang dihasilkan dikeringkan dengan pengering beku dan selanjutnya

dikarakterisasi dan dikonfirmasi menggunakan KIT-glikoprotein

Karakterisasi dan konfirmasi terhadap produk Isolat globulin 7S dan 11S

meliputi :

1. Berat molekul menggunakan elektroforesis SDS-PAGE (Aulanni’am, 2005)

2. Struktur mikro diamati dengan menggunakan Scanning Electron

Microscope (SEM) ( Gustaw, et al., 2003 )

3. Glikoprotein menggunakan KIT-glikoprotein ( Aulanni’am, 2005)

2. Deteksi Gugus Fungsional dan Susunan Asam amino

Tujuan percobaan untuk mengetahui jenis-jenis gugus fungsional dan

susunan asam amino dari fraksi globulin 7S dan 11S.

a. Deteksi Gugus Fungsional

Gugus fungsional dideteksi dengan langkah-langkah percobaan yang disusun

sebagai berikut :

Pembentukan lempeng KBr dan sampel fraksi globulin 7S dan 11S dilakukan sebagai

berikut :

1. Melakukan penimbangan serbuk KBr seberat 95 mg dan sampel

seberat 5 mg ( sesuai sifat sampel )

38

2. Sampel bersama KBr dimasukkan dalam cawan mortir agat dan

dihaluskan dengan penempa hingga halus dan merata.

3. Diambil 50 mg serbuk yang sudah dihaluskan dan dimasukkan dalam

alat pencetak yang sudah disusun, ditutup dengan lempeng dan diputar

searah jarum jam sebanyak kurang lebih 5 kali.

4. Diletakkan perangkai pencetak tadi dibawah alat penekan hidrolis dan

dilakukan penekanan 5 -10 ton.

5. Dihubungkan dengan selang penghisap dari mesin penghisap

kesusunan alat penghisap tadi, mesin penghisap dihidupkan dan

ditunggu hingga 5 menit.

6. Dilakukan penekanan hingga mencapai 5 ton atau sesuai dengan sifat

sampel dan ditunggu dalam waktu sampai 5 menit lagi. Setelah waktu

mencapai 10 menit tombol mesin penghisap dihentikan.

7. Perangkat pencetak pelet sampel dan KBr diambil dengan cara

mengkempeskan mesin penekan pencetak.

8. Susunan pencetak dibuka satu persatu dan lempeng KBr diambil

dengan hati-hati dengan menggunakan skapel.

9. Lempeng KBr dan sampel diletakkan dalam holder, dan ditutup dengan

penutup holder selanjutnya gugus fungsional dideteksi menggunakan

Fourier Transform Infrared Spectrofotometer Jasco( FT-IR-5300)

( Nusantoro, 2005).

10. Hasil panjang gelombang dan intensitas dikorelasikan dengan jenis

vibrasi dari macam-macam gugus fungsional.

39

b. Deteksi susunan asam amino

Susunan asam amino dalam fraksi globulin 7S dan 11S dideteksi dengan

langkah-langkah percobaan disusun sebagai berikut :

Sebanyak 100 mg fraksi globulin (7S dan 11S) ditambah 4 ml HCl 6N

dipanaskan 24 jam selanjutnya didinginkan. Dinetralkan dengan NaOH 6 N sampai pH

7. ( Catatan penambahan NaOH dilakukan tetes demi tetes hingga mencapai volume

toritis ). Campuran selanjutnya diencerkan hingga 10 ml dan disaring dalam filter

HPLC. Setelah derivatisasi post column asam amino ditambah dengan 20 μl larutan

OPA . Reaktan selanjutnya diinjeksikan ke dalam Diode Array Detector HPLC

Shimadzu 10 A. Intensitas flluorescence dari OPA-derivatisasi asam amino dimonitor

pada panjang gelombang eksitasi 345 nm dan panjang gelombang emisisi 450nm

Susunan dan jumlah asam amino hasil kromatogram dikonfirmasi dengan pada tabel

PDA 1/340nm 4nm ( Settle, 1997)

3. Evaluasi Sifat Fisik-Kimia dan Sifat Fungsioanal dari Fraksi Globulin 7Sdan 11S Tujuan percobaan adalah untuk mengetahui sifat-sifat fisiko kimia dan sifat

fungsional pada masing-masing fraksi.

Evaluasi sifat fisik - kimia meliputi

a. Kadar protein dengan metode Lowry ( Aulanni’am, 2005)

b. Kelarutan isolat menggunakan metode Aluko dan Yada, (1994) yang

dimodifikasi.

c. Water Holding Capacity (WHC), dan Oil Holding Capacity (OHC)

serta warna isolat (Subagyo, 2006) .

40

d. Emulsion Activity Index (EAI) dan Emulsion Stability Index (ESI)

( Pedrosa, et al., 1997)

e. Stabilitas busa (Foam Stability/FS) dan kapasitas busa (Foam

Capacity /FC ) ( Subagyo, 2006)

D. Tahap IV. Interaksi 7S dan 11S globulin dengan gum xanthan

Tujuan Penelitian untuk melakukan dan menemukan interaksi antara isolat

globulin 7S dan 11S dengan gum xanthan dan mengetahui perubahan-perubahan

karakter, sifat fisiko-kimia dan fungsional yang dipersiapkan sebagai calon ingredients

pangan.

Bahan dasar yang digunakan dalam penelitian berupa Isolat globulin 7S dan

11S biji komak hitam hasil penelitian tahap III, gum xanthan, HCl, NaOH,

1. Penetapan kurva equilibrium dari isolat globulin

Tujuan untuk mendapatkan nilai pH isoelektrik (PII), pH asam (pK1) dimana

isolat globulin mempunyai kelarutan tertinggi dan pH basa (pK2) dimana isolat globulin

mempunyai kelarutan tertinggi.

Langkah-langkah pelaksanaan

1. Isolat globulin diencerkan 10% menggunakan aquades dan diukur pH awal.

2. Diambil sebanyak 10 ml isolat globulin yang telah diencerkan.

3. Dititrasi dengan menggunakan HCl 0,01 M dan diukur nilai pH dan jumlah sisa

endapan pada setiap penambahan 1 ml. Titrasi diakhiri sampai nilai pH

mencapai < 2.

4. Titrasi yang sama juga dilakukan dengan menggunakan NaOH 0,01 M, Setiap

volume penambahan NaOH 0,01 M diukur nilai pH dan sisa endapan. Titrasi

diakhiri setelah pH mencapai angka ≥ 9.

41

5. Kurva hubungan antara nilai pH dengan jumlah persentase kelarutan

merupakan kuva equilibrium. Nilai pK1 merupakan nilai pH dimana isolat

globulin memiliki persentase kelarutan terbesar pada kondisi asam, sedangkan

pK2 merupakan nilai pH dimana isolat globulin memiliki persentase kelarutan

terbesar pada kondisi alkali.

2. Pengaturan pH untuk membentuk muatan positif globulin

Pengaturan pH asam dalam pelarutan isolat globulin sebelum dilakukan

interaksi dengan gum xanthan bertujuan untuk membentuk muatan positif.

Pelaksanaan percobaan dilakukan dengan cara sebagai berikut.

1. Isolat globulin diencerkan pada konsentrasi 10% dengan menggunakan air

destilat. Selanjutnya dikondisikan pada pK1 (pH = 2,95) dengan menggunakan

larutan HCl 0,01 M ( Kondisi asam )

2. Supernatan merupakan positif charge globulin dipisahkan selanjutnya

diinteraksikan dengan larutan gum xanthan. dengan konsentrasi (0,25%; 0,50

%; 0,75%; 1 % dan tanpa gum xanthan)

3. Penginteraksian isolat globulin dengan gum xanthan

Tujuan percobaan untuk melakukan interaksi antara isolat globulin dengan gum

xanthan guna mengembangkan sifat fisiko-kimia dan sifat fungsional produk interaksi.

Pelaksanaan percobaan dilakukan sebagi berikut :

1. Isolat globulin yang telah dilarutkan pada kondisi asam (pH 2,95) direaksikan

dengan gum xanthan dengan konsentrasi ( 0,25%; 0,50 %; 0,75%; 1 % dan

tanpa gum xanthan ). Rasio larutan isolat : larutan gum xanthan adalah 1 : 1

2. Hasil reaksi dikondisikan dalam waterbath pada suhu 37o C selama 120 menit

(Gustaw, et al.,2003)

42

3. Hasil interaksi dikeringkan dengan pengering beku pada suhu – 40oC tekanan

60 micron.

4. Evaluasi hasil interaksi meliputi :

a. Pengamatan interaksi yang dicapai menggunakan Scanning electron

microscope (SEM), Sodium Dodecyl Sulphonate Poly Acrylamide Gel

Electroforesis (SDS-PAGE) dan KIT Glycoprotein estimation.

b. Sifat fisiko kimia dan sifat fungsional fungsional : Kelarutan ,

kemampuan menyerap dan mempertahankan minyak (Oil holding

capacity /OHC), Kemampuan menyerap dan menahan air ( Water

Holding Capacity/WHC), Kapasitas busa (foam capacity/FC), stabilitas

busa ( foam stability index /FSI), kapasitas emulsi (emulsion capacity

/EC), dan indeks stabilitas emulsi (emulsion stability index /ESI).

c. Analisis statistik

Percobaan diulang 3 kali dan nilai tengahnya (mean) yang dilaporkan.

Data dianalisis menggunakan analisis variasi (analyzed of variance) dan

untuk mengetahui perbedaan dilanjutkan dengan uji Duncan yang

dideterminasi pada level P≤ 0,05 ( Steel & Torrie, 1980 )..